UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JÚLIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE SISTEMAS
NANOESTRUTURADOS BIOADESIVOS CONTENDO PEPTÍDEO
ANÁLOGO À ADESINA DO
STREPTOCOCCUS MUTANS
GIOVANA MARIA FIORAMONTI CALIXTO
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marlus Chorilli
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
"JÚLIO DE MESQUITA FILHO"
FACULDADE DE CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS
CÂMPUS DE ARARAQUARA
Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas
DESENVOLVIMENTO E CARACTERIZAÇÃO DE SISTEMAS
NANOESTRUTURADOS BIOADESIVOS CONTENDO PEPTÍDEO
ANÁLOGO À ADESINA DO
STREPTOCOCCUS MUTANS
GIOVANA MARIA FIORAMONTI CALIXTO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas, Área de Pesquisa e Desenvolvimento de Fármacos e Medicamentos, da Faculdade de Ciências Farmacêuticas, UNESP, como parte dos requisitos para obtenção do Título de Mestre em Ciências Farmacêuticas.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Marlus Chorilli
Ficha Catalográfica
Elaborada Pelo Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação Faculdade de Ciências Farmacêuticas
UNESP – Campus de Araraquara
Calixto, Giovana Maria Fioramonti
C153d Desenvolvimento e caracterização de sistemas nanoestruturados
bioadesivos contendo peptídeo análogo à adesina do Streptococcus mutans / Giovana Maria Fioramonti Calixto. – Araraquara, 2013
105 f.
Dissertação (Mestrado) –Universidade Estadual Paulista. “Júlio de Mesquita Filho”. Faculdade de Ciências Farmacêuticas. Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas
Orientador: Marlus Chorilli
1. Sistemas líquido-cristalinos. 2. Bioadesão. 3. Fármacos peptídicos. 4. Cáries. 5. Streptococcus mutans. I. Chorilli, Marlus, orient. II. Título.
Agradecimento Especial
AGRADECIMENTO ESPECIAL
Ao meu orientador e professor educador Prof. Dr. Marlus Chorilli.
“No cotidiano das práticas educativas, duas posturas podem ser observadas naqueles que as conduzem: professores instrutores e os professores educadores. O professor instrutor cumpre obrigações. O professor educador celebra paixões. O professor instrutor superestima o quantitativo, instrumentaliza para ter e tende à “coisificação” do ser humano. O professor educador realça a busca do qualitativo, da globalidade do ser e conduz à vocação. O professor instrutor assume a função de mero transmissor e reprodutor dos saberes instituídos, submetendo os indivíduos aos ditames pré-estabelecidos e ao adestramento. O professor educador passa pelo já instituído e busca instituir novos saberes, instigando a autenticidade, o espírito criador e transgressivo. O professor instrutor repete todo dia os mesmos cacoetes e recursos metodológicos na cadência decadente das rotinas emboloradas e desencantantes. O professor educador reinventa, permanentemente, seus procedimentos, renova e reencanta com o aprendizado vigoroso. O professor instrutor considera-se detentor do saber, pretensamente pronto e acabado. O professor educador concebe-se aprendiz inacabado nos fluxos do cotidiano. O professor instrutor dá aulas previsíveis, insípidas e frias. O professor educador tece aulas imprevisíveis, ruminando o saber com sabor. O professor instrutor dita conteúdos para que os alunos copiem e assimilem de modo reflexo. O professor educador problematiza conteúdos para que os alunos reflitam e compreendam criticamente. O professor instrutor professa voto de fidelidade às alianças cultuadoras das burocracias, que tendem à subjugação. O professor educador concebe a necessidade mínima de burocracia, sendo esta, mero instrumento que deve estar a serviço dos direitos e liberdades fundamentais do ser humano. O professor instrutor tende à intolerância e até ao abuso de poder, fala muito e quase não escuta. O professor educador prima pelos princípios da tolerância, da ética, da solidariedade e da escuta sensível. O professor instrutor habitua-se à rotina das tartarugas. O professor educador,
como a águia, alcança o incomensurável.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e à minha Nossa Senhora de Schoenstatt pela proteção espiritual, essencial nessa etapa da minha vida.
A toda a minha família pelo amor, carinho, respeito, apoio e ensinamentos que conceberam meu caráter e minha satisfação pelos estudos.
A todos meus amigos pelas conversas, carinho e companheirismo.
Aos funcionários, alunos e professores do Laboratório de Farmacotécnica pelos auxílios, instruções e ensinamentos científicos.
Aos funcionários, alunos e professores do Laboratório de Controle de Qualidade, Laboratório de Cosmetologia, Laboratório de Toxicologia, Laboratório de Bioequivalência, Laboratório de Botânica e Laboratório de Parasitologia pelos auxílios.
A todos os professores da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara - UNESP, pelos ensinamentos científicos durante meu curso de graduação e mestrado.
A todos os professores e alunos da Faculdade de Odontologia de Araraquara – UNESP, pela colaboração em meu projeto de mestrado.
Ao Prof. Dr. Eduardo Maffud Cilli e aos seus alunos Lentilha e Paulo, pela colaboração e contribuições que tanto me acrescentaram cientificamente.
Ao Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen e aos seus alunos, em especial, Marcos, pela grande colaboração nos estudos microbiológicos do meu projeto de mestrado.
Ao Prof. Dr. Éder Tadeu Gomes Cavalheiro, à sua aluna Rita e à minha irmã Carolina, pela colaboração nas análises térmicas do meu projeto.
À Profa. Dra. Carla Raquel Fontana, pelas contribuições em meu Exame de Qualificação de Mestrado.
Ao Prof. Dr. Helder Teixeira e à Profa. Dra. Maria Palmira Daflon Gremião por participarem da banca de minha defesa de mestrado.
Resumo
A cárie dentária é um importante problema de saúde coletiva ainda prevalente no Brasil e no mundo. A sua etiologia está ligada principalmente a fatores que permitam condições favoráveis ao crescimento de bactérias, principalmente do Streptococcus mutans. Recentemente, um crescente interesse tem sido observado no estudo de peptídeos, como o p1025, análogo aos fragmentos 1025-1044 da adesina celular do S. mutans, responsável pela adesão e formação do biofilme dental. Sistemas líquido-cristalinos (SLC) de liberação de fármacos, pelo fato de aumentarem a estabilidade e a eficácia de fármacos, modulando a sua ação, podem ser potenciais carreadores de peptídeos. A potencialização da ação destes sistemas pode ser conseguida com a presença de substâncias bioadesivas, para prolongar sua permanência no ambiente bucal O objetivo deste trabalho foi desenvolver e caracterizar SLC bioadesivos contendo peptídeo p1025 e avaliar sua eficácia antimicrobiana e ação sobre o biofilme dental. Foram desenvolvidos SLC constituídos por álcool cetílico etoxilado 20 OE e propoxilado 5 OP como tensoativo (PRO), ácido oleico (AO) como fase oleosa e por 5 diferentes fases aquosas formadas por água (S1), dispersões de Policarbofil® (S2), Carbopol® 974P (S3), Hidroxietilcelulose (S4) e Quitosana (S5) a 0,5%. Foram selecionados três pontos dos sistemas S1, S2, S3 e S5 fixando-se a concentração do tensoativo em 40%. Esses sistemas foram caracterizados por microscopia de luz polarizada, espalhamento de raios-X de baixo ângulo, reologia, análise térmica, análise de textura e ensaios de bioadesão in vitro, que demonstraram que as microemulsões constituídas por dispersões aquosas de Carbopol® 974P formaram mesofases líquido-cristalinas com adição de água significativamente mais estruturadas e bioadesivas, aumentando seu tempo de retenção no ambiente bucal. Foi incorporado o p1025 nesse sistema que demonstrou ação bioadesiva maior, sugerindo aumento da eficácia do peptídeo. Ensaios de liberação in vitro demonstraram a possibilidade de o sistema retardar a liberação do peptídeo, pois ocorreu a liberação de 4,61% de peptídeo em 24 horas. Ensaios microbiológicos de inibição de formação de biofilme realizados com o sistema S3, ao qual se adicionou o peptídeo, demonstraram que a formulação não apresentou diferenças significativas em relação controle. No ensaio de queda de pH, o sistema retardou a queda do pH em 45 minutos, desacelerando o poder acidogênico do S. mutans, o que pode contribuir para diminuição da formação da cárie. Dessa forma, o sistema desenvolvido pode apresentar potencial aplicação para incorporação do peptídeo p1025, podendo, inclusive, ser usado como plataforma tecnológica na liberação de fármacos visando à prevenção da cárie dental.
Dental caries is a significant public health problem still prevalent in Brazil and worldwide. The etiology is related to factors that enhance the growth of bacteria, mainly Streptococcus mutans. Recently, a great interest has been observed in studies of peptides such as peptide p1025, corresponding to residues 1025–1044 of the adhesin of S. mutans, responsible for adherence and formation of biofilm. According to the literature, solutions of this peptide inhibit by competition the bacterial biofilm adhesion to the tooth, preventing the colonization of S. mutans. Drug delivery systems, such as liquid crystalline systems (LCS) may be potential carriers of peptides because SLC can increase their stability and effectiveness. The potential action of these systems can be achieved with the presence of bioadhesive substances to prolong residence time at buccal cavity. The aim of this study was to develop and characterize bioadhesive SLC containing peptide p1025 and evaluate its antimicrobial efficacy and its action on the biofilm. It was developed five different SLC based on PPG-5-Ceteth-20 as surfactant, oleic acid as oil phase and five different aqueous phases based on water, dispersion of 0.5% Polycarbophil® (S1), Carbopol® (S2), hydroxyethylcellulose (S4) or chitosan (S5). It was selected three points of the systems S1, S2, S3 and S5 with 40% surfactant. These systems were characterized physicochemically by polarized light microscopy (MLP), SAXS, rheology, thermal analysis, TPA and in vitro bioadhesion, which showed that microemulsions composed of Carbopol® formed more structured and bioadhesive liquid crystalline mesophases with water than the other systems and it can high the retention time at buccal cavity. The incorporation of p1025 in this system demonstrated higher bioadhesive action and may increase the effectiveness of this peptide. In vitro release assays showed the possibility that the system delay the release of the peptide because it was released 4.61% peptide in 24 hours. Microbiological assays of inhibition of biofilm formation performed with the system S3 with peptide showed that the formulation did not show significant differences from control. At pH drop test, the system delayed pH drop in 45 minutes, decelerating power acidogenic of S. mutans, which may contribute to decreasing the formation of caries. Thus, the developed system can provide potential application for incorporation of the peptide p1025 and can even be used as a platform technology in drug delivery for the prevention of dental caries.
Lista de figuras
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Perfil cromatográfico do peptídeo bruto obtido no tempo 0-90 min. 45 Figura 2 - Perfil cromatográfico do peptídeo p 1025 puro. 46 Figura 3 - Perfil de espectrometria de massas do peptídeo p1025. 47 Figura 4 - Diagramas compostos por Procetyl (PRO), ácido oleico (AO) e (a) água (A),
(b) Carbopol® (C974P), (c) Policarbofil® (PP), (d) hidroxietilcelulose (HEC), (e) quitosana (QS), onde: Cristal líquido (CL), Microemulsão (ME), Emulsão
(EM), Separação de fases (SF). 48
Figura 5 - Fotomicrografia da formulação F1-A. 52
Figura 6 - Fotomicrografia da formulação F2-A. 52
Figura 7 - Fotomicrografia da formulação F3-A. 52
Figura 8 - Fotomicrografia da formulação F1-C. 52
Figura 9 - Fotomicrografia da formulação F2-C. 52
Figura 10 - Fotomicrografia da formulação F3-C. 52
Figura 11 - Fotomicrografia da formulação F1-P. 53
Figura 12 - Fotomicrografia da formulação F2-P. 53
Figura 13 - Fotomicrografia da formulação F3-P. 53
Figura 14 - Fotomicrografia da formulação F1- QS. 53
Figura 15 - Fotomicrografia da formulação F2- QS. 53
Figura 16 - Fotomicrografia da formulação F3- QS. 53
Figura 17 - Avaliação estrutural das amostras F1-A, F1-C e F1-P por SAXS. 55 Figura 18 - Avaliação estrutural das amostras F2-A, F2-C e F2-P por SAXS. 56 Figura 19 - Avaliação estrutural das amostras F3-A, F3-C e F3-P por SAXS. 56 Figura 20 - Reograma das formulações F1-A, F2-A e F3-A. Símbolos cheios curva
Figura 21 - Reograma das formulações F1-C, F2-C e F3-C e C974P 0.5%: Símbolos
cheios curva ascendente e símbolos vazios curva descendente. 60 Figura 22 - Reograma das formulações F1-P, F2-P e F3-P e PP 0.5%. Símbolos cheios
curva ascendente e símbolos vazios curva descendente. 61 Figura 23 - Reograma das formulações F1- QS, F2- QS e F3- QS. Símbolos cheios curva
ascendente e símbolos vazios curva descendente. 61 Figura 24 - Variação do módulo de armazenagem G’ (símbolo cheios) e de perda G’’
(símbolos vazios) em função da frequência para F1-A, F2-A e F3-A. 65 Figura 25 - Variação do módulo de armazenagem G’ (símbolos cheios) e de perda G''
(símbolos vazios) em função da frequência para C974P 0,5%, F1-C, F2-C e
F3-C. 65
Figura 26 - Variação do módulo de armazenagem G’ (símbolos cheios) e de perda G''
(símbolos vazios) em função da frequência para PC 0,5%, F1-P, F2-P e F3-P. 66 Figura 27 - Curvas termogravimétricas das formulações (a) F1A, F2-A e F3-A, (b) F1-C,
F2-C e F3-C; (c) F1P, F2-P e F3-P. 69
Figura 28 - Curvas de DSC das formulações F1-A, F1-C e F1-P. 71 Figura 29 - Curvas de DSC das formulações F2-A, F2-C e F2-P. 72 Figura 30 - Curvas de DSC das formulações F3-A, F3-C e F3-P. 72 Figura 31 - Fotomicrografias das formulações F1-CP (a), F2-CP (b) e F3-CP (c). 77 Figura 32 - Avaliação estrutural das formulações F1-CP, F2-CP e F3-CP por SAXS. 78 Figura 33 - Curvas termogravimétricas das formulações FI-CP, F2-CP e F3-CP. 79 Figura 34 - Comparação das curvas de DSC entre as formulações (a) F1-C e F1-CP, (b)
F2-C e F2-CP, (c) F3-C e F3-CP. 80
Figura 35 - Curva analítica do p1025, equação da reta (y) e o respectivo coeficiente de
correlação (R2). 82
Figura 36 - Influência da formulação F3-CP e do controle F3-C sobre a queda de pH
glicolítico em biofilme de S. mutans. 87
Figura 37 - Imagens por MEV do biofilme de Streptococcus mutans após tratamentos com
Lista de tabelas
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição (%) dos sistemas selecionados para a caracterização
físico-química. 35
Tabela 2 - Valores de qmax (Å) e razão entre as distâncias interplanares para as
formulações. 57
Tabela 3 - Comportamento de fluxo (n) e índice de consistência (K) dos sistemas. 62 Tabela 4 - Valores G’ e G’’ do teste oscilatório para todas as formulações. 66 Tabela 5 - Valores de regressão linear (r), da resistência do gel (S) e do expoente
viscoelástico (n) para as formulações estudadas. 68 Tabela 6 - Perda total e parcial de massa (%) nos intervalos de temperatura para as
formulações. 70
Tabela 7 - Propriedades mecânicas das formulações determinadas através da análise de perfil de textura. Cada valor representa a média ± desvio padrão, à
temperatura de 37º C. 74
Tabela 8 - Trabalho da força bioadesiva (mN.s) das formulações. Os valores representam a média ± desvio padrão, à temperatura de 37ºC. 75 Tabela 9 - Valores de qmax (Å) e razão entre as distâncias interplanares para as
formulações F1-CP, F2-CP e F3-CP. 78
Tabela 10 - Perda total e parcial de massa (%) nos intervalos de temperatura para as
formulações FI-CP, F2-CP e F3-CP. 79
Tabela 11 - Propriedades mecânicas da formulação F1-C e F1-CP determinadas através da análise de perfil de textura. Cada valor representa a média ± desvio padrão, à
temperatura de 37º C. 81
Tabela 12 - Trabalho da força bioadesiva das formulações F1-CP, F2-CP e F3-CP. Os
valores representam a média ± desvio padrão, à temperatura de 37ºC. 81 Tabela 13 - Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima
(CBM) do peptídeo p1025. Valores em Pg/mL. 83
Tabela 14 - Composição bioquímica e viabilidade bacteriana do biofilme após cinco dias
LISTA DE ABREVIATURAS
A - Água Ala - Alanina AO – Ácido Oleico Arg - Arginina Asp - Ácido aspártico Boc - t-butiloxicarbonila C974P – Carbopol C974P
CBM - Concentração bactericida mínima CIM - Concentração inibitória mínima CL – Cristal Líquido
CLAE – Cromatografia líquida de alta eficiência CV – Coeficiente de variação
DIC - Diisopropilcarbodiimida DIEA - N-etildiidopropilamina DMF - dimetilformamida
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DSC – Calorimetria exploratória diferencial EM - Emulsão
ESI+ - Ionização positiva por electrospray Fmoc - 9-fluorenilmetiloxicarboxila G’ – Módulo de armazenamento G” – Módulo de perda
Gln - Glutamina Glu - Ácido Glutâmico Gly - Glicina
HA - Hidroxiapatita
HBTU - Hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilurônico HEC - Hidroxietilcelulose
HOBt - N-hidroxibenzotriazol
IPS - Polissacarídeo iodofílico intracelular; Leu - Leucina
Lista de abreviaturas
kDa – kilodaltons ME – Microemulsão
MEV – Microscopia eletrônica de varreduda MLP – Microscopia de luz polarizada PA - Pascal
PAM – Peptídeo antimicrobiano
PAS - Polissacarídeo extracelular álcali-solúvel Phe - Fenilalanina
PP - Policarbofil PRO – Procetyl® Pro - Prolina PS - Peso seco
PSA - Polissacarídeo extracelular solúvel em água QS - Quitosana
S. mutans – Streptococcus mutans
SAXS – Espalhamento de raios X a baixo ângulo Ser - Serina
SLC – Sistema líquido-cristalino tBu - t-Butila
TFA – Ácido trifluoracético TGA – Análise termogravimétrica Thr - Treonina
TIS - triisopropilsilano
TPA – Análise de Perfil de Textura TRT - Tritila
UCF/mL – Unidades formadoras de colônias por mililitro UV-Vis – Espectro de luz ultravioleta - Visível
Val - Valina
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO 16
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 21
2.1 Cárie dentária 21
2.1.1 Fatores determinantes da cárie 21
2.1.1.1 Consumo de açúcar 22
2.1.1.2 Presença de bactérias cariogênicas 22
2.1.1.3 Características do hospedeiro 23
2.1.2 Perspectiva para o tratamento da cárie dentária 24
2.2 Fármacos peptídicos 24
2.3 Sistemas de liberação de fármacos 25
2.3.1 Sistemas líquido-cristalinos 26
2.3.2 Sistemas bioadesivos 28
3 OBJETIVOS 30
3.1 Objetivo geral 30
3.2 Objetivos específicos 30
4 MATERIAL E MÉTODOS 31
4.1 Materiais 31
4.1.1 Matérias-primas, reagentes e soluções 31
4.1.2 Equipamentos 31
4.2 Métodos 32
4.2.1 Síntese do peptídeo p1025 33
4.2.2 Purificação do peptídeo p1025 33
4.2.3 Caracterização do peptídeo p1025 33
4.2.4 Preparação das dispersões de Carbopol®, Policarbofil® e hidroxietilcelulose. 34
4.2.5 Preparação da dispersão de quitosana 34
4.2.6 Construção dos diagramas de fases ternários 34
4.2.7 Caracterização físico-química dos sistemas selecionados 35
4.2.7.1 Microscopia de luz polarizada 34
4.2.7.2 Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) 36
4.2.7.3 Análises reológicas 36
Sumário
4.2.7.3.2 Análise reológica oscilatória 36
4.2.7.4 Análises térmicas 37
4.2.7.4.1 Análise termogravimétrica (TGA) 37
4.2.7.4.2 Calorimetria exploratória diferencial (DSC) 37
4.2.7.5 Análise de perfil de textura (TPA) 38
4.2.7.6 Bioadesão in vitro em superfície de dente bovino 38
4.2.7.6.1 Preparação de saliva humana 38
4.2.7.6.2 Obtenção do disco de dente bovino 39
4.2.7.6.3 Avaliação in vitro da força bioadesiva 39
4.2.8 Incorporação do peptídeo p 1025 39
4.2.8.1 Caracterização físico-química das formulações contendo peptídeo p1025 40 4.2.9 Avaliação da cinética de liberação in vitro do peptídeo p1025 40
4.2.9.1 Parâmetros analíticos 40
4.2.9.2 Ensaio de liberação in vitro 41
4.2.10 Testes de avaliação antimicrobiana 42
4.2.10.1 Preparação da suspensão bacteriana 42
4.2.10.2 Concentração inibitória mínima (CIM) 42
4.2.10.3 Concentração bactericida mínima (CBM) 43
4.2.10.4 Formação do biofilme 43
4.2.10.5 Teste de inibição de formação de biofilme 43
4.2.10.6 Teste de queda de pH em biofilme 44
4.2.10.7 Avaliação da integridade celular por microscopia eletrônica de varredura
(MEV) 44
4.3 Análise estatística 45
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO 45
5.1 Síntese do peptídeo p1025 45
5.2. Purificação do peptídeo p1025 46
5.3 Caracterização do peptídeo p 1025 46
5.4 Construção dos diagramas de fases ternários 47
5.5 Caracterização físico-química dos sistemas selecionados 51
5.5.1 Microscopia de luz polarizada 51
5.5.2 Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS) 54
5.5.3.1 Análise reológica contínua 57
5.5.3.2 Análise reológica oscilatória 64
5.5.4 Análises térmicas 68
5.4.1 Análise termogravimétrica 68
5.5.4.2 Calorimetria exploratória diferencial 70
5.5.5 Análise do perfil de textura 73
5.5.6 Avaliação in vitro da força bioadesiva 74
5.6 Caracterização físico-química das formulações contendo peptídeo p1025 77 5.7 Avaliação da cinética de liberação in vitro do peptídeo p1025 82
5.7.1 Parâmetros analíticos 82
5.7.2 Ensaio de liberação in vitro 82
5.8 Teste de análise antimicrobiana 83
5.8.1 Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima
(CBM) 83
5.8.2 Teste de inibição da formação de biofilme 84
5.8.3 Teste de queda de pH 85
5.8.4 Avaliação da integridade celular por microscopia eletrônica de varredura
(MEV) 87
6 CONCLUSÕES 88
16
Introdução
1 INTRODUÇÃO
A saúde bucal é muito importante para a manutenção da saúde geral do organismo humano, sendo, portanto, uma parte essencial do seu bem estar. Isto está refletido nas novas abordagens dos protocolos clínicos, que associam cada vez mais a saúde bucal com a saúde sistêmica, uma vez que a boca pode servir como meio de entrada e fonte de contágio para doenças, ou como um local primário para disseminação e manifestações de doenças sistêmicas (BOBETSIS, 2006).
Uma das maiores causas de morbidade no estado de saúde bucal é a cárie. Trata-se de um processo que afeta principalmente os dentes, sendo uma doença extremamente prejudicial e comum em crianças. Isso se deve a vários fatores dessa faixa etária, dentre os quais, a necessidade de ajuda para atividades que requerem coordenação motora, condições da saliva infantil (saliva seca) e dietas ricas em açúcares (KROL, 2007). Porém, estudos têm demonstrado que a cárie dentária tem-se tornado um importante problema de saúde bucal para outras faixas etárias, sobretudo em idosos. Este desenvolvimento se deve em parte ao aumento da longevidade da população, à diminuição da perda de dentes nessa faixa etária, além das condições gerais de saúde, geralmente, comprometidas (SAUNDERS et al., 2005).
A cárie dentária é uma doença infecciosa multifatorial que envolve três fatores: a presença de bactérias cariogênicas, a ingestão de carboidratos fermentáveis e a capacidades de defesas do hospedeiro, particularmente contra a acidez produzida por estas bactérias (FIORETTI et al., 2010), sendo que a presença de micro-organismos no biofilme é o fator de maior importância para o inicio e progressão da doença (MARSH, 2006; FILOCHE et al., 2010).
O biofilme é uma estrutura complexa e dinâmica que se desenvolve pela colonização sequencial e ordenada da superfície dentária por várias bactérias orais, organizando-se funcionalmente no interior de uma matriz extracelular de polissacarídeos (MARSH, 2004; KOLENBRANDER et al., 2006). Estudos relatam que dentre as bactérias presentes no biofilme bacteriano, micro-organismos do gênero Streptococcus, especialmente do grupo mutans, estão relacionados com a gênese e o desenvolvimento da cárie (ALAM, 2000).
A adesão de S. mutans à superfície do dente é feita através da película exógena adquirida (PEA) da superfície dental. Esta película é composta por proteínas e glicoproteínas salivares que se ligam à hidroxiapatita da superfície dos dentes e os protegem de ataques químicos e mecânicos. No entanto, cada proteína salivar é especificamente reconhecida por uma adesina bacteriana e contribuirá para a primeira fase da formação da placa bacteriana: a adesão (FIORETTI et al., 2010).
A adesina do S. mutans é chamada de antígeno I/II (SA I/II). Esse antígeno tem sido muito estudado em vários laboratórios (LEE et al., 1989; CARLÉN, 1995; YOUNSON et al., 2004). Ele medeia a colonização desse micro-organismo na cavidade oral, assim como o desenvolvimento da cárie. Evidências que SA I/II facilita a adesão da bactéria têm sido obtidas por estudos com linhagens de S. mutans deficientes desse antígeno, que demonstraram diminuição da adesão na superfície de hidroxiapatita, modelo in vitro utilizado como superfície dental (YOUNSON et al., 2004).
Ensaios in vitro de atividade de adesão de S. mutans ao dente identificaram que a aglutinina salivar presente na saliva é o receptor do antígeno SA (I/II) e, portanto, medeia a ligação entre esse antígeno e a saliva (CARLÉN, 1995). Este mediador compreende a glicoproteína 440 kDa e componentes de baixo peso molecular (YOUNSON et al., 2004). Estudos de Bikker et al. (2002) descreveram que as glicoproteínas 440 kDa são similares às proteínas gp 340, consideradas células de defesa da superfície do pulmão. Desse modo, esses estudos relataram que a aglutinina salivar pode exercer um papel de defesa, uma vez que os agregados entre a glicoproteína 440 kDa e S. mutans podem ser eliminados, por exemplo, pela deglutição. Por outro lado, quando em condições favoráveis de crescimento, esses agregados podem aderir às superfícies dos dentes, iniciando a formação do biofilme dental.
Extensivos estudos realizados por Kelly e colaboradores (1998) identificaram os resíduos 1025-1044 na região C-terminal de SA I/II como o epítopo de adesão desse antígeno. Nesse estudo, foi demonstrado que o peptídeo sintético (p1025) correspondente a esses resíduos pode inibir a ligação in vitro entre a adesina do S. mutans e a aglutinina salivar. Em estudos in vivo, observou-se que o peptídeo p1025 preveniu também a recolonização de S. mutans (KELLY et al., 1998). Outro estudo realizado por Li e colaboradores (2009) demonstrou que um dentifrício contendo peptídeo p1025 diminui a aderência de S. mutans à superfície de hidroxiapatita coberta por saliva.
18
Introdução
manchamento de dentes, restaurações, próteses e língua, disgeusia e descamação da mucosa bucal, além de possuir um gosto amargo (WEI et al., 2006; MAEKAVA et al., 2010). Portanto, tendências atuais para o tratamento e prevenção da cárie dental envolvem a investigação das propriedades adesivas do antígeno I/II (PETERSEN et al., 2002).
Dessa forma, a busca por fármacos como o peptídeo p1025, que interferem na capacidade das bactérias de aderirem ao tecido do hospedeiro, desde que a adesão seja uma das etapas iniciais do processo infeccioso, como no caso da cárie, pode ser uma estratégia interessante a ser adotada no combate às infecções bacterianas, em virtude do alarmante aumento da resistência bacteriana nos últimos tempos (OFEK et al., 2003). Sabe-se que as bactérias assumem uma maior resistência aos fatores imunológicos inatos, enzimas bactericidas e antibióticos quando estão aderidas às superfícies biológicas, além de terem mais capacidade de adquirirem nutrientes, aumentando, assim, sua sobrevivência e sua capacidade de infectar o hospedeiro. Portanto, como estes agentes anti-adesivos previnem a adesão, não sendo propriamente bactericidas, a propagação e disseminação de bactérias resistentes são muito menos prováveis de ocorrer quando se compara a agentes bactericidas, como a clor (OFEK et al., 2003).
Porém, quando se propõe a utilização da via bucal, a qual é empregada para a terapia anti-adesiva acima descrita, alguns fatores devem ser considerados, como a secreção contínua da saliva (0,5 - 2L/ dia), que pode levar à diluição subsequente do fármaco, a sua possível ingestão e, em última instância, a remoção involuntária da forma farmacêutica (MILLER et al., 2005).
Para contornar essas desvantagens e aproveitar os recursos que essa via oferece, como ambiente favorável para a administração de fármacos, especialmente proteínas e polipeptídeos, devido à ausência da hidrólise ácida e do efeito de primeira-passagem hepático (MILLER et al., 2005), os pesquisadores têm recorrido aos sistemas nanoestruturados de liberação, englobando os lipossomas, cristais líquidos, microemulsões e nanopartículas, que representam uma estratégia interessante para administração bucal de peptídeos, pois esses sistemas podem protegê-los contra degradação e possibilitar liberação no local específico de ação em uma taxa controlada (KANG, 2009).
aspártico-arginina-glicina para o direcionamento de integrinas GPIIb-IIIa envolvidas na doença cardiovascular reestenose. Stevenson e colaboradores (2005) desenvolveram sistemas líquido-cristalinos para a incorporação e liberação controlada de insulina. As microemulsões vêm constituindo um veículo muito mais eficiente que soluções aquosas para a administração oral de vacinas de DNA (KUBIK et al., 2005). As nanopartículas vêm sendo utilizadas no desenvolvimento de sistemas de liberação de hormônio do crescimento (GH ou somatotrofina) e insulina para administração nasal (CHALASANI et al., 2007).
Dentre os sistemas nanoestruturados que podem ser empregados para incorporação de peptídeos, destacam-se os sistemas líquido-cristalinos (SLC), os quais apresentam vantagens relacionadas principalmente ao fato de promoverem liberação controlada de fármacos, protegerem princípios ativos da degradação térmica ou fotodegradação, além de aumentarem a eficácia de fármacos (MOHANRAJ & CHEN, 2006; GUTERRES et al., 2007).
Os SLC apresentam propriedades tanto de sólidos quanto de líquidos. Possuem ordem estrutural, rigidez e ligações definidas como os sólidos e mobilidade, regiões desordenadas e fluidas como os líquidos (CHORILLI et al., 2009). Eles podem ser divididos em duas principais classes: os termotrópicos, formados pela influência da temperatura, e os liotrópicos, constituídos por misturas de compostos anfifílicos em um solvente, em geral a água. Dentre as mesofases liotrópicas, as mais comumente observadas são a lamelar, hexagonal e cúbica (LI et al., 2009).
Os SLC oferecem grande potencial no campo dos peptídeos, apesar dessa aplicação ser ainda pouco explorada. Rizwan e colaboradores (2010) e Angelova e colaboradores (2010) verificaram que peptídeos incorporados em fases cúbicas permaneceram mais estáveis e tiveram sua liberação modulada. Hosmer e colaboradores (2010) desenvolveram uma fase lamelar e hexagonal para aplicação de paclitaxel e verificaram que a estrutura interna interfere e maximiza a liberação cutânea e a obtenção de citotoxicidade controlada deste peptídeo.
Uma estratégia interessante a ser adotada, quando se trata da para a aplicação por via bucal de peptídeos, é a utilização de polímeros bioadesivos nas formulações. O termo bioadesivo é comumente usado para dois materiais, pelo menos um de natureza biológica, mantidos juntos por um período de tempo prolongado, através de forças interfaciais, sendo essenciais para permanência íntima e prolongada da formulação no local de ação (REPKA et al., 2000; PATEL et al., 2011).
20
Introdução
et al., 2001). Também, eles podem competir com enzimas proteolíticas, o que é muito importante para fármacos propensos à degradação enzimática, como fármacos peptídicos (MILLER et al., 2005).
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cárie Dentária
Os grandes investimentos em programas preventivos e socioeducativos pelos profissionais de saúde bucal resultaram em um declínio na taxa mundial de incidência de cárie dentária (BORDIN et al., 2012).
De acordo com estudo realizado por Narvai e colaboradores (2006), entre os anos de 1980 e 2003, foi constatada uma grande redução do desenvolvimento da cárie no Brasil, levando o país a integrar o grupo de países com baixa prevalência de cáries, com declínios de até 61,7%, fato que expõe uma tendência consistente de queda ao longo do período.
Segundo o relatório do Projeto SBBrasil (Saúde Bucal Brasil), divulgado pelo Ministério da Saúde (2010), para integrar neste grupo, o indicador CPO, sigla para dentes cariados, perdidos e obturados, deve estar entre 1,2 e 2,6. Em 2003, o país tinha índice de 2,8, passando, em 2010, para 2,1 — melhor que a média dos países das Américas.
A taxa de incidência tem diminuído, principalmente, devido à consciência na higiene bucal, ao abastecimento municipal de água fluoretada, além de novas abordagens para proteger os dentes, como os selantes, os quais têm sido desenvolvidos e aplicados.
No entanto, a OMS enfatizou em seu relatório Saúde Bucal Mundial (2003), que apesar das grandes melhorias no estado de saúde bucal de populações, problemas graves ainda persistem, sobretudo, nas classes sociais menos favorecidas, pois é a quarta doença mais cara para se tratar (AIMUTIS, 2011; KUSMA et al., 2012).
Desse modo, apesar do significativo declínio de indicadores, a cárie dentária ainda é considerada uma endemia mundial, pois cerca de 100% da população mundial adulta e 60 a 90% da população mundial infantil são afetadas (AIMUTIS, 2011).
Portanto, medidas individuais e coletivas contra as cáries são necessárias, bem como estratégias preventivas para controlá-la e tornar suas sequelas cada vez menos severas.
2.1.1 Fatores determinantes da cárie dentária
Revisão Bibliográfica
externo do desenvolvimento da cárie (FIORETTI, 2010). Sendo assim, esses itens serão abordados a seguir.
2.1.1.1Consumo de açúcar
A prevalência e os custos com a cárie tendem a crescer com o consumo de dietas pouco saudáveis e ricas em açúcares.
O consumo de açúcares tem aumentado gradualmente desde a Idade Média. Até o século XV, os açúcares eram reservados para as classes mais privilegiadas e o consumo médio por pessoa era cerca de um quilo por ano. Atualmente, nos países industrializados, o consumo médio por pessoa é de cerca de cinquenta quilos por ano, sendo 63 Kg para os Estados Unidos e 55 Kg para o Brasil, segundo o IBGE (2009).
A frequência de ingestão de açúcares é um fator determinante para o desenvolvimento de cáries, pois os açúcares são metabolizados pelas bactérias cariogênicas, para suprir suas necessidades energéticas e, desse modo, contribuir com a desmineralização do tecido dental calcificado, favorecendo o desenvolvimento da cárie (FIORETTI, 2010).
2.1.1.2Presença de bactérias cariogênicas
As bactérias Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus e Lactobacillus são mais cariogênicas. Elas apresentam três critérios para a virulência no processo de cárie: elas são acidogênicas, pois produzem ácido pela fermentação lática; são acidófilas, pois seu crescimento é favorecido em pH ácido, e são capazes de sintetizar carboidratos extracelulares (SIXOUS, 2007).
A adesão bacteriana à superfície do dente é através da película exógena adquirida (PEA). Esta película é constituída por proteínas salivares e glicoproteínas que se ligam à superfície mineral de hidroxiapatita para proteger os dentes de ataques mecânicos e químicos. No entanto, diferentes proteínas salivares são reconhecidas especificamente por adesinas bacterianas e contribuirá para a primeira fase da formação de placa dentária: adesão.
a produção extracelular de polissacarídeos pelas bactérias e constitui uma barreira que isola a superfície do dente e proporciona condições anaeróbicas (FIORETTI, 2010).
A maioria das linhagens de Streptococcus mutans possui três genes que codificam as enzimas que sintetizam esses carboidratos. A partir das transferases bacterianas que clivam a sacarose e recuperam um monômero de glicose (glucosiltransferases - GTFs) ou frutose (frutosiltransferase - FTFs) e o transfere para uma cadeia de polissacarídeo de dextrano (solúvel), mutano (insolúvel) ou frutano (solúvel) (NICOLAS, 2011).
Quando ocorre uma deficiência energética para formação das cadeias de polissacarídeo extracelular, a sacarose que não foi utilizada pelas transferases, é catalisada pela ação da enzima α-glicosidase, que libera rapidamente a glicose e a frutose intracelular. Assim, esses monômeros transportados para dentro das bactérias, suprem as suas necessidades energéticas (NICOLAS, 2011).
Estes dados demonstram o papel crítico da ingestão do açúcar na cariogenicidade do biofilme, que resulta no desenvolvimento de uma flora bacteriana mais acidogênica e na formação de um biofilme mais organizado, espesso, e impermeável à defesa do hospedeiro.
2.1.1.3Características do hospedeiro
As características do hospedeiro compreendem as características dos dentes e da saliva.
O dente é o local onde a doença se manifesta. Desse modo, tem sido relatado, na literatura, que os defeitos de esmalte também podem contribuir para uma maior incidência da cárie dentária. Os distúrbios que ocorram durante os primeiros estágios de desenvolvimento do esmalte resultam na redução da quantidade ou espessura do esmalte, ou seja, na sua hipoplasia, podendo ocorrer fissuras ou perdas de áreas grandes de esmalte. Já os distúrbios ocorridos durante o estágio da calcificação e maturação podem levar a deficiências na mineralização, ou seja, hipocalcificação, e geralmente se manifestam como mudanças na opacidade do esmalte (HOFFMANN, 2007).
Revisão Bibliográfica
Deve-se salientar ainda a importância de fatores relacionados à saliva, incluindo taxa de secreção salivar, pH e capacidade tampão. A saliva possui capacidade tampão pela presença de íons de bicarbonato e fosfato que neutralizam os ácidos produzidos pelos micro-organismos cariogênicos. Ela também tem a função de autolavagem e limpeza das superfícies dentárias e possui ação antibacteriana por conter proteínas e imunoglobulinas que atuam contra os micro-organismos cariogênicos (BUXERAUD, 2011).
2.1.2 Perspectiva para o tratamento da cárie dentária
O conhecimento de estreptococos orais e seus comportamentos na colonização in vivo estão crescendo cada vez mais com a revolução genômica e proteômica. Dessa forma, os novos métodos de prevenção contra os micro-organismos que causam a cárie dentária e de outras doenças bucais estão emergindo (FINE et al., 2013).
O desenvolvimento das novas tecnologias permite identificar e entender a atividade dos micro-organismos residentes da cavidade oral saudável ou doente, além de avaliar a proporção de micro-organismos responsáveis pela atividade patogênica dos biofilmes (DO et al., 2013).
Nesse sentindo, uma nova abordagem para o tratamento das cáries é alvejar, especificamente, o S. mutans e impedir o seu crescimento no biofilme oral.
2.2 Fármacos peptídicos
Durante as últimas duas décadas, a tecnologia de DNA recombinante conduziu a um aumento significativo na aprovação de medicamentos biotecnológicos, abrindo, desse modo, o caminho para tratamentos com alta qualidade, resultando em benefício aos pacientes (CROMMELIN, 2003).
Um estudo listou uma série de novos medicamentos biotecnológicos que estão sendo analisados em ensaios clínicos em humanos ou já estão em análise pelos os órgãos reguladores. Segundo esse estudo, tais fármacos tratarão cerca de 150 doenças, incluindo câncer, doenças infecciosas, doenças autoimunes, inclusive a síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS) (FROKJAER et al., 2005).
vez que moléculas biológicas são, em geral, menos tóxicas e tem um comportamento in vivo mais previsível.
Dessa forma, muitos pesquisadores da área de Pesquisa e Desenvolvimento estão se empenhando, cada vez mais, na descoberta de novas moléculas bioativas para uso em terapias. Em razão do progresso da engenharia genética, os peptídeos têm recebido grande atenção, se tornando fármacos de escolha para muitas doenças (RAVAL et al., 2012).
Os peptídeos desempenham papel chave como mediadores das principais funções biológicas e possuem propriedades intrínsecas, como alta atividade biológica associada à baixa toxicidade, baixa imunogenicidade e alta especificidade. Essas características proporcionam vantagens como a baixa probabilidade de ligação às estruturas moleculares que não sejam o alvo desejado, interações medicamentosas minimizadas e baixo acúmulo nos tecidos, o que reduz, portanto, os riscos de complicações pela formação de metabólitos intermediários e de efeitos colaterais, o que os torna extremamente interessante para o tratamento de várias doenças (DASS et al., 2006).
Nos últimos anos, os peptídeos também estão sendo, rigorosamente, estudados como potenciais soluções para a crescente resistência de infecções bacterianas aos antibióticos tradicionais. Uma abordagem atraente é a utilização de peptídeos que interfiram na capacidade de adesão das bactérias aos tecidos do hospedeiro, desde que a adesão seja a fase inicial do processo infeccioso, como no caso da cárie (OFEK et al., 2003).
O futuro da terapia anti-adesão dependerá do conhecimento das propriedades e especificidades de adesinas bacterianas e no desenvolvimento de agentes de aderência apropriados para o uso. Tais agentes podem consistir de combinações de inibidores potentes de uma variedade de diferentes adesinas bacterianas, ou inibidores não específicos e/ou amplamente reativos, que têm várias adesinas como alvo.
Uma vez que esses compostos tornam-se disponíveis, eles podem tornar-se fármacos de escolha para o tratamento de uma série de doenças infecciosas.
No entanto, a estabilidade química e física de peptídeos podem ser comprometidas por fatores externos, como temperatura e pH, bem como por contaminantes e impurezas de excipientes, o que significa que a produção, formulação e manipulação de fármacos peptídicos necessitam de atenção especial para a sua eficácia e segurança (DAILEY, 2005).
Revisão Bibliográfica
2.3 Sistemas de liberação de fármacos
Para ser ideal, um sistema de liberação deve ser biodegradável, ter o mínimo de imunogenicidade, incorporar o fármaco sem perda ou alteração em sua atividade e promover o acúmulo seletivo em células doentes, com ausência ou concentração mínima em células saudáveis (KONAN et al., 2002).
Nesse contexto, a tecnologia farmacêutica enfrenta muitos desafios para o desenvolvimento de sistemas de liberação de fármacos peptídicos, contudo, o desenvolvimento de sistemas de liberação nanoestruturados, com morfologias e características físico-químicas mais vantajosas, seguras e eficazes em relação aos sistemas convencionais, está crescente na área farmacêutica (BARBUGLI, 2010).
Dentre esses sistemas de liberação controlada, destacam-se os sistemas nanoestruturados líquido-cristalinos e sistemas bioadesivos, que promovem uma liberação funcional e eficaz de biomoléculas ativas (YAGHMUR; GLATTER, 2009).
2.3.1 Sistemas líquido-cristalinos
Nas últimas duas décadas, sistemas líquido-cristalinos têm atraído grande atenção devido à possibilidade de criar partículas estruturadas com o uso de métodos instantâneos e modular as forças formadas com estímulos fisiológicos, tais como pH, temperatura e força iônica (KRAINEVA et al., 2005).
Os cristais líquidos pertencem a um estado de matéria com propriedades entre um sólido cristalino e um líquido isotrópico, ou seja, podem ter semelhanças estruturais encontradas tanto nos sólidos cristalinos quanto em líquidos desordenados, evidenciada pela facilidade de fluxo (HYDE et al., 2001; ROSSETTI et al., 2011).
Os sistemas líquido-cristalinos são formados por moléculas de tensoativo que se autoagregam na presença de água, formando uma variedade de estruturas. Quando esses tensoativos são incorporados em uma mistura imiscível de óleo e água, eles podem se situar na interface entre o óleo e a água, resultando em diferentes estruturas líquido-cristalinas.
líquido-cristalinas podem ser formadas, como lamelares, hexagonais e cúbicas, respectivamente (CHORILLI et al., 2011).
A mesofase lamelar consiste em bicamadas alternadas de moléculas ordenadas de tensoativo e de solvente, de modo que as cadeias hidrofóbicas do tensoativo são o centro da lamela e sua parte hidrofílica está em contato com a camada de solvente. Essa fase é caracterizada por sua fluidez e anisotropia na forma de cruz de malta (WANG e ZHOU, 2009).
A fase hexagonal consiste em micelas empacotadas em arranjo hexagonal e são separadas por uma região contínua de água. A fase hexagonal pode ser classificada em fase reversa, formada por canais aquosos circundados pelas cabeças polares do tensoativo, com a porção apolar localizada ao redor dos cilindros, ou pode ser classificada em fase normal, onde as cabeças polares do tensoativo localizam-se na região externa dos cilindros Essa fase apresenta-se anisotrópico ao campo de luz polarizada, com estruturas estriadas e sua menor viscosidade em relação à fase cúbica é uma importante propriedade que facilita suas aplicações práticas (YARAV et al., 2010).
A fase cúbica, também conhecida como fase isotrópica viscosa, é formada por micelas normais (fase contínua polar) ou reversas (fase contínua apolar) empacotadas em arranjo cúbico. Não é birrefringente quando observada em microscópio de luz polarizada como as fases lamelar e hexagonal (TIDDYG, 1980).
A alta viscosidade das mesofases líquido-cristalinas cúbicas torna-se difícil sua administração, mas a aplicação de um sistema precursor de cristal líquido pode levar à formação da rede líquido-cristalina após o contato com o substrato biológico, através de estímulo orgânico, como temperatura ou fluído biológico, por exemplo, a saliva ou muco (SHAH et al. 2001; BRUSCHI et al., 2007).
A grande vantagem de se fazer o uso de cristais líquidos como sistema de liberação é promover uma melhor estabilidade física e um amplo potencial de solubilização dos fármacos (CHORILLI et al., 2011). A incorporação de fármacos pode ser realizada tanto na parte polar quanto na apolar do cristal líquido, dependendo de sua solubilidade, além da possibilidade de incorporação entre as moléculas de tensoativo (OTTO et al., 2009).
Revisão Bibliográfica
2.3.2 Sistemas bioadesivos
A bioadesão pode ser definida como o estado em que dois materiais, sendo pelo menos um de natureza biológica, sejam mantidos juntos por um período prolongado de tempo através de forças interfaciais (SMART, 2005). O processo de bioadesão pode ser descrito basicamente por meio de duas etapas, sendo a primeira etapa a de contato e a segunda etapa a de consolidação. A primeira etapa consiste em um contato intimo entre o material bioadesivo e a membrana biológica e a segunda etapa consiste na consolidação da junção adesiva pelas interações físico-químicas, conduzindo à adesão prolongada (LYRA et al, 2007).
Na década de 1980, o conceito de bioadesão começou a ser aplicado em sistemas de liberação de fármacos Os sistemas bioadesivos consistem na incorporação de moléculas adesivas na formulação farmacêutica, a qual fica em contato íntimo com o tecido de absorção, liberando o fármaco perto do local de ação ou absorção, com o consequente aumento da biodisponibilidade, promovendo efeitos locais e sistêmicos (HÄGERSTRÖM, 2003).
Os materiais adesivos incorporados nas formulações farmacêuticas podem ser moléculas hidrofílicas de origem natural ou sintéticas, contendo numerosas funções orgânicas, tais como grupos carboxilas, hidroxilas e aminas, que geram ligações químicas com a superfície biológica.
Estes moléculas podem ser polímeros catiônicos, aniônicos e não iônicos. A quitosana, um exemplo de polímero bioadesivo catiônico, é obtida por desacetilação de quitina e tem sido extensivamente estudada como sistemas bioadesivos de liberação de fármacos (WOODLEY, 2001). Estudos têm demonstrado que a quitosana pode promover a absorção de moléculas hidrófilas pela reorganização estrutural das proteínas associadas às junções intercelulares (BRAVO-OSUNA et al., 2007). As moléculas catiônicas podem interagir com a superfície da cavidade bucal, que é carregada negativamente a pH fisiológico, por interações eletrostáticas entre os grupos amino do polímero e os resíduos de ácidos aspártico e glutâmico das proteínas salivares carregadas negativamente.
O carbopol C974P e o policarbofil são exemplos de polímeros sintéticos carregados negativamente e são derivados do ácido poliacrílico. O comportamento bioadesivo é devido a processos físico-químicos, como interações hidrofóbicas, ligações de hidrogênio e de van der Waals, que são controladas pelo pH e composição iônica (WOODLEY, 2001).
um polímero com elevado peso molecular e reticulado com divinilglicol. Apresenta excelentes propriedades bioadesivas, portanto, tem sido amplamente utilizado para melhorar a liberação tópica de fármacos (LEE et al. 2000).
A maior parte dos polímeros derivados do ácido poliacrílico, tais como o carbopol C974P e policarbofil, são insolúveis em água, mas formam hidrogéis viscosos in situ quando são hidratados (WOODLEY, 2001). O termo hidrogel é destinado para materiais poliméricos que absorvem uma quantidade significativa de água, enquanto mantém sua estrutura tridimensional. Suas cadeias são flexíveis e têm características não abrasivas, o que diminui o dano tecidual causado pela fricção quando entram em contato com o substrato biológico (HUANG et al., 2000). A bioadesão dos hidrogéis também pode ser explicada pelas propriedades reológicas destes sistemas, pois como aumentam sua viscosidade na presença dos fluídos biológicos, conseguem, portanto, prolongar seu tempo de contato com o substrato biológico (BRUSCHI et al, 2007).
Os polímeros hidroxietilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose e metilcelulose são exemplos de polímeros não iônicos e apresentam forças bioadesivas menores quando comparados com os polímeros carregados negativamente ou positivamente (MORTAZAVI, MOGHIMI, 2003).
Objetivos
3 OBJETIVOS
3.1 Objetivo geral
Desenvolver e caracterizar, sob o aspecto físico-químico, sistemas nanoestruturados bioadesivos para incorporação de peptídeo análogo ao antígeno I/II de S. mutans, a fim de avaliar seu potencial antimicrobiano e ação in vitro sobre o biofilme dental.
3.2 Objetivos específicos
x Sintetizar e purificar peptídeo p1025 de sequência Ac-Gln - Leu - Lys - Thr - Ala - Asp -
Leu - Pro - Ala - Gly - Arg - Asp - Glu - Thr - Thr - Ser - Phe - Val - Leu – Val -NH2,
x Desenvolver sistemas líquido-cristalinos para incorporação do peptídeo sintetizado e
caracterizá-los por meio de microscopia de luz polarizada, espalhamento de raios-X de baixo ângulo (SAXS), análises reológicas, análises térmicas, análise de textura e avaliação da bioadesão;
x Realizar ensaio de liberação in vitro do peptídeo incorporado na formulação escolhida. x Avaliar a atividade antimicrobiana da formulação escolhida e sua ação in vitro sobre o
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Materiais
4.1.1 Matérias-primas, reagentes e soluções
x Acetonitrila – J.T. Baker; x Ácido Oleico P.A. – Synth; x Ácido trifluoracético – Merck;
x Água deionizada em sistema Milli Q com condutividade 18,2μS.cm-1; x Álcool cetílico etoxilado e propoxilado - Procetyl AWS – Croda; x Álcool metílico – Synth;
x Carbopol® 974P NF Polymer – Lubrizol; x Etanol absoluto – Synth
x Hidroxietilcelulose – Synth;
x Membrana de Acetato Celulose para tubos de diálise, 76 mm – Sigma -Aldrich; x Policarbofil® Polymer – Lubrizol;
x Quitosana de baixo peso molecular – Sigma-Aldrich x Trietanolamina – Synth;
4.1.2 Equipamentos
x Analisador de textura TA.XT Plus – Stable Micro Systems®; x Analisador térmico simultâneo SDT Q600 – TA Instruments®; x Agitador mecânico – Marconi®;
x Balança analítica – Owa labor®; x Balança semianalítica – Gehaka®;
x Calorímetro DSC Q10 – TA Instruments®;
x Cromatógrafo analítico – Shimadzu®;
Materiais e Métodos
x Centrífuga – Sorvall TC®;
x Espectrômetro de massas - Fisom Plataform®; x Lavadora Ultrassônica - Unique®;
x Microscópio de luz polarizada Olympus BX41 com Câmara acoplada QColor3 Olympus
America INC;
x Microscopia eletrônica de varredura JSM 5600LV, JEOL®; x Peagômetro – Gehaka®;
x Reômetro, modelo RS-1 – Haake Rheostress®;
x Sistema automático com célula de difusão vertical de Franz – Microette Plus – Hanson
Research Corporation®;
x Sistema de purificação de água MILLIPORE®, Milli - Q Plus.
4.2 Métodos
4.2.1 Síntese do peptídeo p1025
As etapas de síntese, purificação e caracterização do peptídeo p1025 foram realizadas com a colaboração do Prof. Dr. Eduardo Maffud Cilli do Departamento de Bioquímica e Tecnologia do Instituto de Química de Araraquara da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP.
O crescimento da cadeia peptídica ocorreu pela adição de resíduos de aminoácidos à região N-terminal. A síntese ocorreu na direção C-terminal para a N-terminal, sendo que a extremidade C-terminal permaneceu durante todo o processo covalentemente ligada ao suporte polimérico ou resina.
Para a realização do acoplamento dos aminoácidos na cadeia peptídica, os grupos carboxila foram ativados com diisopropilcarbodiimida (DIC) /N-hidroxibenzotriazol (HOBt), ou hexafluorofosfato de O-(benzotriazol-1-il)- 1,1,3,3-tetrametilurônico (HBTU) /N-etildiidopropilamina (DIEA) em caso de reacoplamento. A remoção do grupo Fmoc base-lábil se realizou por meio de lavagem com 20% piperidina/ dimetilformamida (DMF). Para a eliminação do excesso e dos subprodutos foram realizados ciclos de lavagens com DMF e diclorometano (DCM). A comprovação do acoplamento foi monitorada a partir do teste de ninidrina, que em altas temperaturas e na presença de grupos amino livres mostra uma coloração azul.
No final da síntese a clivagem do peptídeo foi realizada pela adição de solução contendo água deionizada, TIS e TFA (proporção de 2,5: 2,5: 95; v, v, v) durante duas horas sob agitação moderada. Posteriormente, o peptídeo junto com a resina foi precipitado com éter etílico gelado e centrifugado, para retirada dos subprodutos resultantes da clivagem. O peptídeo foi solubilizado em solução A (água deionizada/TFA 0,045%, v/v) e extraído da resina novamente por centrifugação. O sobrenadante foi liofilizado, obtendo-se o peptídeo bruto.
4.2.2 Purificação do peptídeo p1025
A purificação foi realizada por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em fase reversa e os peptídeos somente foram utilizados com grau de pureza maior que 95% como descrito por Crusca Jr. e colaboradores (2011). A purificação foi realizada em modo semipreparativo utilizando cromatógrafo Beckman, com coluna de fase reversa C18 de dimensão 2,12 x 25 cm. O grau de pureza das frações foi determinado empregando cromatógrafo Shimadzu LC-10AD, com coluna analítica (0,46 x 25 cm) de fase reversa C18 Ultrasphere. Os solventes utilizados na purificação dos peptídeos e na determinação do teor de pureza foram o solvente A (0,045 % de TFA em água deionizada) e o solvente B (0,036 % de TFA em acetonitrila).
4.2.3 Caracterização do peptídeo p1025
Materiais e Métodos
razão massa molar/carga (MM/z) das amostras analisadas e, assim, calcular as massas moleculares obtidas experimentalmente.
4.2.4 Preparação das dispersões de Carbopol®, Policarbofil® e Hidroxietilcelulose
As dispersões de Carbopol® C974P (C974P), Policarbofil® (PP) e Hidroxietilcelulose (HEC) foram preparadas na concentração de 5,0% (m/m). Os polímeros foram suspensos, separadamente, em água Milli-Q e misturados por agitação mecânica por 10 minutos. Após a completa solubilização, o pH foi ajustado para 7,0 com trietanolamina.
4.2.5 Preparação da dispersão de quitosana
A dispersão de quitosana (QS) foi preparada na concentração de 5% (m/m). A quitosana foi suspensa em solução de ácido acético 0,1M e misturada por agitação mecânica a 150 RPM por 24 horas.
4.2.6 Construção dos diagramas de fases ternários
Cinco diferentes diagramas de fases ternários foram construídos, fixando-se, em todos, ácido oleico como fase oleosa e álcool cetílico etoxilado e propoxilado (Procetyl® AWS) como tensoativo. Foram utilizados cinco diferentes componentes como fases aquosas, dentre os quais água (Diagrama 1), dispersão de C974 0,5% (Diagrama 2), dispersão de PP 0,5% (Diagrama 3), dispersão de HEC 0,5% (Diagrama 4) e dispersão de QS 0,5% (Diagrama 5).
À temperatura ambiente, foi misturado, com agitação em vórtex, 54 diferentes proporções, de 0 a 100% (m/m), de cada fase dos sistemas, resultando, desse modo, na construção do diagrama de fase ternário com 54 pontos.
Para os sistemas ternários com dispersão polimérica como fase aquosa, inicialmente, foram misturados 10% da dispersão polimérica a 5% com água, de modo que resultasse numa porcentagem polimérica final nos sistemas de 0,5%.
Todos os sistemas foram classificados visualmente como sistemas viscosos ou líquidos opticamente transparentes, translúcidos ou opacos, ou ainda separação de fases. Desse modo, foi possível delimitar as diferentes regiões no diagrama de fase.
A partir desses dados, foram selecionadas as regiões dos sistemas para a caracterização físico-química.
4.2.7 Caracterização físico-química dos sistemas selecionados
Para realização da caracterização físico-química, foram selecionados 12 pontos, sendo três deles de cada um dos Diagramas 1, 2, 3 e 5, os quais estão listados na Tabela 1. Em todos os sistemas, a porcentagem de tensoativo foi fixada em 40% e variou-se a razão água/óleo, simulando uma estruturação com a incorporação de água no sistema, de forma a mimetizar o ambiente bucal.
Tabela 1 – Composição (%) dos sistemas selecionados para a caracterização físico-química
Sistemas % AO % PRO % A % C974
5%
% PP 5%
% QS 5%
F1-A 20 40 40 - - -
F2-A 30 40 30 - - -
F3-A 40 40 20 - - -
F1-C 20 40 30 10 - -
F2-C 30 40 20 10 - -
F3-C 40 40 10 10 - -
F1-P 20 40 30 - 10 -
F2-P 30 40 20 - 10 -
F3-P 40 40 10 - 10 -
F1-QS 20 40 30 - - 10
F2-QS 30 40 20 - - 10
F3-QS 40 40 10 - - 10
Materiais e Métodos
4.2.7.1Microscopia de luz polarizada (MLP)
Uma pequena alíquota dos sistemas selecionados foi colocada em uma lâmina, a qual foi coberta com lamínula e em seguida analisada em microscópio sob luz polarizada. Foram utilizadas lentes de aumento de 20 vezes.
4.2.7.2Espalhamento de raios X a baixo ângulo (SAXS)
As medidas de SAXS foram realizadas no Laboratório Nacional de Luz Sincrotron (LNLS-Brasil), na linha SAXS1. Esta linha é equipada com um monocromador (λ= 1.488 Å) e um detector vertical localizado cerca de 1,5 m da amostra e um analisador multicanal para registrar a intensidade do espalhamento I(q), em função do vetor de espalhamento, q. O espalhamento das micas e do ar foram subtraídos da intensidade total espalhada. Cada espectro foi coletado por 45 segundos. Essa instalação permitiu um vetor de espalhamento, q, entre aproximadamente 0,1 e 2,3 Å-1.
4.2.7.3Análises reológicas
Para a caracterização reológica dos sistemas foram realizadas a análise reológica contínua e a análise reológica oscilatória, conforme etapas 4.2.7.3.1 e 4.2.7.3.2.
4.2.7.3.1 Análise reológica contínua
Os reogramas dos sistemas escolhidos foram obtidos através do reômetro RS-1 (Haake) no modo fluency (flow), utilizando geometria cone/placa (C35/2º Ti) e placa/placa de 35 mm, de acordo com a consistência de cada formulação, à temperatura de 37 ºC.
Uma pequena amostra dos sistemas foi colocada, cuidadosamente, na placa inferior do reômetro, e esperou-se o tempo de repouso de 3 minutos para o início da análise. A taxa de cisalhamento utilizada foi de 0 a 100 s-1 para a curva ascendente e de 100 a 0 s-1 para a curva descendente, durante 120 segundos cada. O teste foi realizado em triplicata.
A análise oscilatória foi realizada através do reômetro RS-1 (Haake) utilizando geometria cone/placa (C35/2º Ti) e placa/placa de 35 mm, de acordo com a consistência de cada formulação, à temperatura de 37 ºC, em triplicata.
Primeiramente, colocou-se o reômetro no modo amplitude sweep para a realização do teste de varredura de tensão para determinação da região viscoelástica. Para esse teste foi utilizada uma faixa de tensão de cisalhamento de 0 a 50 Pa e frequência de 1 Hz.
Após a determinação da tensão de 1 Pa da região viscoelástica, colocou-se o reômetro no modo frequency sweep para realização do teste de varredura de frequência para determinação do módulo elástico (G’) e módulo viscoso (G''). Para esse teste foi utilizada a faixa de frequência de 0 a 10 Hz, à tensão de 1 Pa.
4.2.7.4 Análises térmicas
As análises térmicas foram realizadas com a colaboração do Prof. Dr. Éder Tadeu Gomes Cavalheiro do Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo (USP).
4.2.7.4.1 Análise termogravimétrica (TGA)
A análise termogravimétrica foi realizada em um analisador térmico simultâneo SDT Q600 controlado pelo Software Thermal Advantage for Q Series (Release 4.2.1) da TA Instruments. Para a realização desse teste, pesou-se 7 mg dos sistemas selecionados em suporte de amostra aberto de alumina e utilizou-se uma razão de aquecimento de 10 ºC min-1, entre 0 e 600 ºC, em atmosfera dinâmica de ar com vazão de 100 mL min-1.
4.2.7.4.2 Calorimetria exploratória diferencial (DSC)
Materiais e Métodos
vazão de gás nitrogênio de 50 mL min-1. Inicialmente a amostra foi resfriada até -50 ºC, sendo mantida nesta temperatura por três minutos para estabilização térmica. A seguir a amostra foi aquecida de -50 até 20 ºC, seguida de isoterma por três minutos na temperatura final, e resfriada até -50 ºC, encerrando-se o ciclo de resfriamento/aquecimento. Esta programação foi repetida para os demais ciclos. Todas as análises foram feitas em cadinho de alumina tampadas com furo central com 2 mg de amostra.
4.2.7.5Análise de perfil de textura (TPA)
O perfil de textura dos sistemas selecionados foi analisado utilizando um analisador de textura TA-XT plus (Stable Micro Systems, Inglaterra), a partir do qual é possível extrair propriedades mecânicas, tais como a dureza, compressibilidade, adesividade e coesão.
Para a realização do teste, os sistemas selecionados (15 g) foram colocados em tubos de centrífuga cônicos de 50 mL (Falcon, BD®, Franklin Lakes, EUA) e centrifugados a 4000 rotações por minuto, durante 3 minutos, para eliminar as bolhas de ar e tornar a sua superfície lisa. Em seguida, esses tubos foram colocados embaixo da sonda analítica (10 mm de diâmetro) do analisador de textura, que foi programada para comprimir a amostra a velocidade de 0,5 mm/s até a profundidade pré-definida (10 milímetros) e retornar para a superfície da amostra na mesma velocidade. Após 5 segundos de repouso, uma segunda compressão iniciou-se, nas mesmas condições. Todas as análises foram realizadas em setes replicatas, à temperatura de 37 ºC.
4.2.7.6 Bioadesão in vitro em superfície de dente bovino
Para a avaliação in vitro da força bioadesiva em superfície de dente bovino, as etapas 4.2.7.6.1 e 4.2.1.6.2 foram realizadas inicialmente.
4.2.7.6.1 Preparação de saliva humana
saliva foi coletada em tubos de centrífuga cônicos de 50 mL resfriados por gelo e, posteriormente, uma quantidade igual de saliva de cada doador foi misturada, homogeneizada e submetida à centrifugação 10.000 g por 5 minutos a 4 °C (MOURA, 2006), sendo, em seguida, filtrada por meio de sistema de filtração com membrana de 0,22 μm (PEROS & GIBBONS, 1981). A saliva não utilizada imediatamente foi armazenada a –70 ºC. É importante salientar que esta etapa do projeto teve parecer (nº 47/2011) favorável pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, sob o protocolo 15/2011.
4.2.7.6.2 Obtenção do disco de dente bovino
O disco de esmalte bovino foi obtido a partir de incisivos de novilhos com 20 a 30 meses de idade. Dentes com trincas no esmalte, cálculo no terço médio coronário, desgaste do terço incisal, alterações morfológicas da coroa e hipoplasias de esmalte foram descartados. Depois de limpos, foram obtidos discos de 1 cm de diâmetro do terço médio da face vestibular dos dentes, com auxílio de um motor de alta rotação (modelo MRS 400 Torque- Dabi Atlante, Ribeirão Preto, SP, Brasil) acoplado a um disco de ponta diamantada cilíndrica (KG Sorensen, Barueri, SP, Brasil). Para a regularização da superfície, os blocos foram desgastados com lixas d’água de granulação 200 (T469-SF).
4.2.7.6.3 Avaliação in vitro da força bioadesiva
A força necessária para remover os sistemas selecionados da superfície do dente bovino foi avaliada in vitro, utilizando o analisador de textura TA-XT plus (Stable Micro Systems, Surrey Inglaterra), no modo Adhesion Test.
Materiais e Métodos
destacar o dente da amostra foi calculada pela curva força versus tempo. O teste foi realizado em sete replicatas.
4.2.8 Incorporação do peptídeo p1025
Para a caracterização físico química das formulações, foi incorporada a concentração de 110 µg/mL do peptídeo p1025 na fase aquosa dos sistemas F1-C, F2-C e F3-C. Esses sistemas incorporados com o peptídeo p1025 serão referenciados no texto por F1-CP, F2-CP e F3-CP, respectivamente. Essa concentração foi baseada em dados na literatura (Kelly et al., 1999; Li et al., 2009) que identificaram essa concentração como a concentração ativa do p1025. No entanto, para os testes microbiológicos, foi incorporada uma concentração dez vezes maior que a CIM, que foi determinada na etapa 4.2.10.2.
4.2.8.1Caracterização físico-química das formulações contendo peptídeo p1025
Após a incorporação do peptídeo p1025 nas formulações selecionadas, os sistemas foram caracterizados por MLP, SAXS, análises térmicas, análise de perfil de textura e pela avaliação in vitro da força bioadesiva em superfície de dente bovino, descritos pelos itens 4.2.7.1, 4.2.7.2, 4.2.7.4, 4.2.7.5 e 4.2.7.6, respectivamente.
4.2.9 Avaliação da cinética de liberação in vitro do peptídeo p1025
4.2.9.1Parâmetros analíticos
Inicialmente, obteve-se uma curva analítica do peptídeo p1025 em água utilizando oito soluções de peptídeo em triplicata nas seguintes concentrações: 0,5 μg/mL, 1 μg/mL, 2,5 μg/mL, 5,0 μg/mL, 7,5 μg/mL, 10 μg/mL, 15 μg/mL e 20 μg/mL. Os valores da área do pico correspondente ao peptídeo obtidos pela Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), utilizando detector UV-Vis operando com comprimento de onda de 220 nm foram aplicados na equação da curva padrão.
