Câncer do colo uterino: rastreamento, marcador biológico e polimorfismo genético

CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

CÂNCER DO COLO UTERINO: RASTREAMENTO, MARCADOR BIOLÓGICO E POLIMORFISMO GENÉTICO

RICARDO NEY OLIVEIRA COBUCCI

CÂNCER DO COLO UTERINO: RASTREAMENTO, MARCADOR BIOLÓGICO E

POLIMORFISMO GENÉTICO

Tese apresentada ao programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como requisito para a obtenção do título de Doutor em Ciências da Saúde.

Orientadora: Prof.ª Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves

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MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE

Coordenador do Programa de pós-Graduação em Ciências da Saúde:

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RICARDO NEY OLIVEIRA COBUCCI

CÂNCER DO COLO UTERINO: RASTREAMENTO, MARCADOR BIOLÓGICO E

POLIMORFISMO GENÉTICO

Aprovada em 30/05/2014

Banca Examinadora

Presidente da Banca: Prof.ª Dra. Ana Katherine da Silveira Gonçalves

Membros da Banca:

Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros Prof.ª Dra. Paula Renata Lima Machado

Prof. Dr.Paulo César Giraldo Prof. Dr. José Eleutério Junior

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DEDICATÓRIA

Ao meu pai, Ney, à minha esposa Joyce e aos meus filhos, Davi e Marina por serem meu porto seguro e a razão da minha vida.

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 A Deus, que sempre esteve ao meu lado me protegendo ao longo da vida.

 À minha orientadora Ana Katherine da Silveira Gonçalves, que me incentivou a ingressar na carreira acadêmica e compartilhou seus conhecimentos desde a dissertação do mestrado até a conclusão dessa tese de doutorado. Agradeço e sou grato por tudo que me ensinou.

 À companheira de docência na Universidade Potiguar, amiga, incentivadora e colaboradora nesse projeto de pesquisa, professora Conceição Cornetta que sempre acreditou no meu potencial e me motivou com palavras de incentivo, sem deixar de dividir comigo sua experiência.

 Aos professores doutores da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Janaína Crispim, Carlos Jatobá, José Veríssimo Fernandes e Luiz Reginaldo Menezes da Rocha, que foram fundamentais para a execução dessa pesquisa, bem como para a minha formação como pesquisador.

 À minha colega ginecologista, Dra. Socorro Nobre, que me ajudou na seleção das pacientes e na coleta de material de pesquisa no ambulatório de patologia cervical da Liga Norteriograndense contra o câncer.

 À minha bolsista de iniciação científica pela Universidade Potiguar, Pollyana de Souza pela dedicação e empenho durante todas as etapas da pesquisa.

 Aos estudantes de medicina voluntários, Ricardo César de Souza e Vanessa Viana, que juntos com Pollyana dedicaram-se durante todo o estudo.

 Aos professores Aldo Medeiros e Paula Machado, pelas valiosas colocações na qualificação deste trabalho.

 Ao meu pai Ney, minha esposa Joyce Hellen e meus filhos Davi e Marina pelo apoio incondicional, pela compreensão nos momentos de ausência e pelo carinho e o amor fundamentais para que nos momentos difíceis não desistisse desse sonho.

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citologia resultaram em diminuição significativa da incidência e mortalidade por câncer do colo do útero, no entanto, um excesso substancial de tratamento de lesões intraepiteliais de baixo grau que dificilmente progrediriam para carcinoma cervical resulta da baixa especificidade do tradicional rastreio citológico. A detecção precoce das lesões através do rastreamento citológico e a avaliação do grau histológico em espécimes cervicais são fundamentais, entretanto não permitem identificar quais pacientes terão maior probabilidade de progressão para lesões de alto grau e carcinoma invasivo. A busca de potenciais marcadores de prognóstico; objetivando o entendimento da progressão das lesões intraepiteliais é de suma importância. Acredita-se que fatores imunoregulatórios, imunogenéticos e proteínas do ciclo celular estejam intimamente envolvidos no processo de carcinogênese. Considerando o exposto, a proposta do projeto foi inicialmente avaliar a eficácia da citologia oncológica no rastreamento do câncer cervical, foi investigado ainda o polimorfismo do gene do fator de transcrição FOXP3 e a expressão da proteína do

ciclo celular P63 (P63) associados respectivamente a diagnóstico e prognóstico das lesões cervicais. Em um primeiro momento foi realizado estudo transversal que envolveu 3194 mulheres. As participantes foram submetidas à citologia e biópsia de colo dirigida por colposcopia e os resultados foram comparados para verificar-se a acurácia do teste de Papanicolaou na detecção de lesões intraepiteliais e câncer cervical. Posteriormente, realizou-se estudo comparativo do tipo observacional estratificado em três grupos: Grupo 1: 16 casos com diagnóstico histopatológico de metaplasia/cervicite, considerados normais, Grupo 2: 11 casos com lesão de baixo grau (LSIL) e Grupo 3: 15 casos com lesão de alto grau (HSIL) ou carcinoma epidermoide de colo. Um total de 42 participantes respondeu a um questionário epidemiológico padronizado sobre as características demográficas, hábitos pregressos, história reprodutiva e de comportamento sexual. Após exame colposcópico, foram coletados fragmentos de espécimes cervicais para a pesquisa da expressão proteica da P63 por imunohistoquímica. Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração do DNA e detecção do polimorfismo do gene FOXP3.

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estudo subsequente onde se comparou a expressão da proteína P63 observou-se maior número de núcleos marcados no grupo com lesões intraepiteliais de alto grau e câncer quando comparado ao grupo com biópsias negativas (p=0,0004). No último estudo pesquisou-se a associação do polimorfismo do gene FOXP3 com lesões intraepiteliais cervicais sendo evidenciada maior prevalência do genótipo heterozigoto, CT, no grupo com lesões de colo na histopatologia (p=0,027). Mulheres com lesões intraepiteliais de baixo ou alto grau e câncer de colo de útero apresentam maior expressão da proteína P63 e maior prevalência de genótipo heterozigoto do gene FOXP3 em comparação com as sem lesões cervicais. A associação da pesquisa da expressão da proteína e do polimorfismo do gene pode tornar os exames utilizados atualmente para a avaliação diagnóstica e prognóstica das lesões de colo uterino mais efetivos em detectar quais as mulheres com maior risco para progressão para câncer.

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CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior

DEPC- Dietilpirocarbonato

DNA- Ácido desoxirribonucleico

dNTP- Desoxinucleotídeotrifosfatado

FAPERN- Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Norte

Foxp3- Gene Forkhead box protein 3

HIV- Vírus da imunodeficiência humana

HPV- Papilomavírus humano

HSIL-Lesão Escamosa Intraepitelial de Alto Grau

HUOL- Hospital Universitário Onofre Lopes

LSIL- Lesão Escamosa Intraepitelial de Baixo Grau

NIC1- Neoplasia intraepitelial cervical grau I

NIC2- Neoplasia intraepitelial cervical grau II

NIC3- Neoplasia intraepitelial cervical grau III

P63- protein-coding gene

PCR- Reação em cadeia da Polimerase

PPGCSA- Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde

PSPP 0.8.3- Software de análise estatística

TCLE- Termo de Consentimento Livre e Esclarecido

TMO-Doadores de medula óssea

Tregs - Células T reguladoras

UFRN- Universidade Federal do Rio Grande do Norte

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Dedicatória v

Agradecimentos vi

Resumo vii

Lista de Abreviaturas e Siglas ix

1. Introdução 11

2. Justificativa 15

3. Objetivos 16

4. Métodos 17

5. Artigos Produzidos 22

5.1. Artigo 1 - Pap test accuracy and severity of squamous intraepithelial lesion 22

5.2. Artigo 2 -P63 expression profiles in cervical intraepitelial neoplasia and cancer of the cervix 26

5.3. Artigo 3-The effect of genetic polymorphism of FOXP3 on cervical intraepithelial neoplasia 34

5.4. Artigo 4- O papel da inflamação na carcinogênese induzida pelo HPV 45

5.5 Outras Publicações 57

- Prospective Therapies of Genital Human Papillomavirus Infections 58

6.Comentários, Críticas e Sugestões 75

Referências 78

Apêndices 81

Apêndice 1 – Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 81

Apêndice2 – Questionário Sociodemográfico, Clínico e Comportamental 83

Anexos 85

1. INTRODUÇÃO

Ao longo das últimas duas décadas, diversos estudos epidemiológicos e laboratoriais têm demonstrado que o carcinoma do colo uterino é uma doença complexa com múltiplos determinantes ambientais e genéticos. As infecções genitais, especialmente as associadas ao papilomavírus humano (HPV) de alto risco, e o comprometimento da resposta imune celular são fatores diretamente envolvidos no processo de transformação maligna. O carcinoma do colo uterino apresenta-se como a segunda neoplasia mais prevalente dentre a população feminina mundial e é responsável por cerca de 250.000 mortes a cada ano no mundo.1

No Brasil, esta neoplasia situa-se como a terceira mais comum dentre a população feminina, apenas suplantada pelo câncer de pele (não melanoma) e o câncer de mama, sendo a quarta causa de morte feminina por câncer.2 O desenvolvimento do câncer do colo uterino está diretamente relacionado a infecção persistente pelo HPV.3 Estimativas mundiais indicam que aproximadamente 20% de indivíduos normais estão infectados com HPV e que a cada ano surgem em torno de 500.000 casos novos de câncer de colo uterino, dos quais em torno de 70% ocorrem em países subdesenvolvidos ou em desenvolvimento. Além disso, acredita-se que nestas regiões ocorram de 10 a 20 vezes mais lesões precursoras deste tipo tumoral, o que significa um número elevado de indivíduos acometidos por esta doença.1

Apesar da alta incidência de câncer de colo uterino, esta é uma doença passível de rastreamento e cura. O primeiro passo em direção ao controle do carcinoma cervical foi dado por Hans Hinselmann, médico alemão, que em 1921 desenvolveu um aparelho capaz de detectar lesões de colo uterino incipientes através do uso de potentes lentes de aumento, o colposcópio. Ao invés de esperar que as lesões tornassem-se extensas, visíveis a olho nu, Hinselmann era capaz de detectá-las precocemente e tratá-las com melhor prognóstico para as pacientes.4

Hinselmann. Rapidamente vários países adotaram o rastreamento de lesões cervicais através da citologia de Papanicolaou e aqueles que efetivamente desenvolveram programas de rastreamento organizados conseguiram reduções drásticas na incidência e na mortalidade por tumores cervicais.5

No início da década de 70, outra descoberta importante iria mudar o rumo do controle do câncer cervical: a sua associação com HPV. ZurHausen, Meislen e Fortin publicariam uma série de artigos em que descrevem a relação de HPV, coilócitos e displasia leve em citologia cervical, mas ainda demoraria uma década para que os primeiros subtipos de HPV associados a oncogênese fossem isolados de amostras cervicais.6

Apesar de ter sido desvendada a associação do HPV e câncer de colo uterino, inúmeras outras questões ainda devem ser respondidas no processo de carcinogênese cervical. Nosso conhecimento atual alcança até o processo de interação das proteínas virais E6 e E7 com o genoma humano, a partir daí as informações são extremamente fragmentadas e pontuais. Sabemos que o HPV infecta as células, muda o seu fenótipo, mas o mecanismo que faz algumas células progredirem para câncer ainda é completamente obscuro.

genes celulares que poderão predizer eficientemente a iniciação neoplásica; as modificações nos cromossomos e/ou genoma viral em regiões distintas e reconhecidamente modificadas pelo evento da integração viral; a identificação de polimorfismos de genes associados a um melhor prognóstico.10,11,12

O gene p63 tem sido relacionado a processos biológicos que contribuem para a homeostase epidérmica, incluindo adesão, proliferação, estratificação e diferenciação celular. Defeitos em qualquer desses processos podem contribuir para um fenótipo neoplásico.13 No câncer humano o p63 tem uma rara tendência de inativação através de mutações. Na maioria das vezes no carcinoma epidermoide, o locus gênico de p63 encontra-se amplificado, com um correspondente aumento em sua expressão.14 A expressão da proteína p63 está mais associada a carcinomas epidermoides e de células transicionais do que a adenocarcinomas.15 Wang et al.16encontraram forte correlação entre a infecção por HPV-16 e a expressão da proteína p63 em carcinomas invasores do colo uterino. Porém, a associação entre as infecções virais e a expressão de p63 nas neoplasias ainda necessita ser melhor investigada.

O gene Forkhead box protein 3 (Foxp3) está envolvido com a regulação do sistema imunológico e é um marcador específico de células T reguladoras (Tregs) que desempenham importante papel na supressão da imunidade tumoral.17,18 _O número de Tregs aumenta em resposta a infecção por microrganismos e este aumento inibe a ativação de células CD4+e CD8+, a secreção de citocinas, afetando a resposta imune à infecção e favorecendo a progressão para infecção crônica. Este fenômeno indica que o gene Foxp3 pode predispor à infecção crônica pelo papilomavírus, aumentando o risco de carcinoma cervical.18,19_Foi confirmado que os polimorfismos genéticos do Foxp3 estão relacionados com o desenvolvimento de algumas doenças autoimunes, como a rinite alérgica e com doenças ginecológicas como a endometriose.20,21_{Entretanto, ainda não está claro} se este polimorfismo está relacionado com câncer de colo.

tratadas evitaria a utilização de tratamentos agressivos desnecessários, enquanto as lesões com maior chance de progredirem seriam passiveis de tratamento antes do desenvolvimento de um câncer invasivo.

O conhecimento de importantes etapas no processo de malignização da cérvice uterina, possibilitará a identificação das pacientes que estão em risco de apresentar progressão de lesões pré-tumorais e assim evitar milhões de tratamentos desnecessários que são realizados anualmente. Poder-se-ia ainda criar drogas específicas que previnam o carcinoma cervical em pacientes infectadas pelo HPV ou melhorar a qualidade do rastreamento do câncer cervical com a adição de alvos moleculares a serem identificados.

2. JUSTIFICATIVA

As lesões cervicais pré-neoplásicas e o carcinoma do colo uterino têm origem numa zona do epitélio designada por zona de transformação, onde ocorre um processo contínuo e progressivo de transformação do epitélio cilíndrico em epitélio escamoso. A infecção deste epitélio pelo HPV constitui um fator determinante no desenvolvimento das lesões cervicais pré-neoplásicas e do carcinoma do colo uterino, mas isolada não é condição suficiente para a evolução maligna.

Uma série de fatores é responsável pela regressão ou persistência da infecção ou pela progressão para lesões precursoras do carcinoma invasivo do colo uterino. Estes fatores para influenciar na carcinogênese cervical dependem do HPV, da célula epitelial infectada, do hospedeiro e da interação entre o vírus e o hospedeiro.

Os estudos moleculares têm demonstrado que o desenvolvimento do carcinoma do colo do útero ocorre após uma série de lesões genéticas cumulativas nas células epiteliais do colo uterino, resultantes dos efeitos diretos das oncoproteínas do HPV de alto risco, decorrentes da expressão dos genes E6 e E7. A investigação tem vindo a demonstrar que as alterações moleculares induzidas pelas oncoproteínas estão relacionadas com vias de sinalização para a proliferação celular, diferenciação e potencial metastático. A utilização deste conhecimento para se obterem biomarcadores e/ou alvos terapêuticos poderá teoricamente predizer o comportamento biológico da doença e a necessidade de intervenção clínica ou vigilância continuada após medidas de prevenção, diagnósticas ou terapêuticas.

Como ainda não foram identificados biomarcadores específicos das lesões displásicas graves e do carcinoma do colo uterino, o diagnóstico tem sido baseado em exames morfológicos e histológicos e o prognóstico em dados clínicos. Vários potenciais biomarcadores das lesões displásicas do colo uterino são alvo de estudos in vivo e in vitro. É incessante e intensa a busca atual por marcadores

3 OBJETIVOS 3.1 Objetivo geral

Estudar a acurácia da citologia oncológica no rastreamento do câncer cervical, analisar a expressão da proteína do ciclo celular P63 e o polimorfismo do gene do fator de transcrição FOXP3 na avaliação diagnóstica e prognóstica em pacientes com diferentes graus de lesões de colo uterino.

3.2 Objetivos específicos

3.2.1- Avaliar a acurácia do teste de Papanicolaou para detecção de lesões induzidas pelo HPV e câncer do colo uterino

3.2.2 - Investigar o desempenho da expressão da proteína do ciclo celular P63 na avaliação prognóstica das lesões do colo uterino

4.MÉTODOS

Em um primeiro momento, realizou-se estudo transversal que incluiu 3194 mulheres com idade entre 14 e 98 anos que realizaram citologia oncológica e biópsia de colo de útero no serviço de Patologia Cervical da Universidade Potiguar (UnP) em Natal-RN entre Janeiro e Dezembro de 2011.

Para o cálculo amostral, utilizou-se por base um nível de confiança de 95%, com poder do teste de 80%, erro de estimativa de 0,05 e considerou-se a frequência de mulheres com biópsias com resultado de lesão de baixo grau, proveniente da amostra do estudo piloto.

Como critérios de inclusão, foram consideradas adolescentes e adultas encaminhadas para consulta no serviço de Patologia Cervical da UnP que estavam em condições para a realização de coleta de citologia, exame colposcópico e biópsia dirigida do colo e que concordassem em participar da pesquisa assinando o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE). Foram excluídas as pacientes que apresentavam secreção vaginal abundante, sinais de cervicite, sangramento e atrofia genitais que impediam a execução dos exames citados.

As mulheres elegíveis, após a assinatura do TCLE, passaram por consulta com ginecologista que realizou o teste de Papanicolaou, seguido de colposcopia e biópsia dirigida de colo uterino, encaminhando o material coletado com uma ficha com nome e idade da paciente e com os achados colposcópicos.

As citologias foram preparadas e classificadas conforme as recomendações do Sistema Bethesda.22 O material de biópsia foi preparado como de rotina com hematoxilina/eosina e os resultados foram estratificados em quatro categorias: Negativa/normal, Neoplasia intraepitelial de baixo grau (NIC1), ou de alto grau (NIC2/NIC3) e Carcinoma.

especificidade, valor preditivo positivo e valor preditivo negativo na detecção de lesões intraepiteliais e câncer de colo de útero.

Análises da expressão da proteína do ciclo celular P63 e do polimorfismo do gene FOXP3

Posteriormente, foi realizado estudo piloto comparativo do tipo observacional com mulheres encaminhadas para os serviços de patologia cervical da Liga Norteriograndense contra o Câncer e da UnP. Entre Janeiro e Dezembro de 2013,um total de 42 participantes com idade entre 19 e 86 anos respondeu a um questionário epidemiológico padronizado sobre as características demográficas, hábitos pregressos, história reprodutiva e de comportamento sexual. Após exame citológico e colposcópico, foram coletados múltiplos fragmentos de espécimes cervicais para a pesquisa da expressão proteica da P63 por imunohistoquímica.Amostras de sangue periférico foram coletadas para extração do polimorfismo do gene FOXP3 e realização de Beta-HCG e

sorologias para hepatite, HIV e sífilis.

Como critérios de inclusão, foram consideradas adultas, não grávidas, com sorologias negativas e sem alterações genitais que impedissem a realização de citologia, colposcopia e biópsia. Foram excluídas menores de idade, gestantes, portadoras de sífilis, hepatite e HIV e com corrimento abundante, ou sangramento e atrofia genitais no momento do exame ginecológico.

Após a assinatura do TCLE as pacientes respondiam ao questionário epidemiológico e tinham o sangue periférico coletado. Em seguida, eram encaminhadas para um dos dois ginecologistas responsáveis pela coleta do Papanicolaou, pelo exame colposcópico e pela retirada de múltiplos fragmentos cervicais.

Grupo 3: 15 casos com lesão de alto grau (HSIL) ou carcinoma epidermoide de colo.

Os fragmentos de biópsia foram encaminhados ao laboratório de Patologia da UFRN onde foram corados da forma convencional com hematoxilina/eosina para o diagnóstico das lesões cervicais (LSIL, HSIL e Carcinoma). Além disso, parte desse material foi separada e fixada em lâminas sialinizadas para análise da expressão de P63 por imunohistoquímica.

O estudo imunohistoquímico foi realizado com a técnica da estreptavidina-biotina-peroxidase, conforme descrito por Zhouet al. 23 Cortes histológicos de 4μm foram obtidos em micrótomo de rotina histológica (Leica), colocados sobre lâminas histológicas previamente tratadas com 3-aminopropiltrietoxisilano

(Sigma). Após desparafinização em estufa a 80˚ por 24 horas, seguidas de recuperação antigênica em calor úmido em panela Dako Pan (DAKO), foram incubados por 30 minutos em anticorpo monoclonal direcionado contra o P63 (DAKO; na diluição de 1:40). Como cromógeno, foi empregada a 3-amino-9-etilcarbazol (AEC, K3461, DAKO). Foram considerados positivos os padrões de coloração nuclear para o P63.

O sangue periférico foi enviado para o laboratório de Farmácia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN) para a dosagem dos níveis de Beta-HCG, a realização de sorologia de HIV, vírus B e C da hepatite, Treponema e para análise do polimorfismo do gene Foxp3.

brancos (0,075M NaCl; 0.024M Na-EDTA pH 8,0), 125µL de SDS a 10% e 1,1mL de perclorato de sódio a 5,0M. O tubo foi agitado vigorosamente por 10 segundos e adicionou-se 2mL de solução salina saturada (NaCl 6.0M), para extração de proteínas. Em seguida, o tubo foi vigorosamente homogeneizado, por 15 segundos e centrifugado a 6000 x g, por 5 minutos a 4°C. O sobrenadante (contendo o DNA) foi transferido para outro tubo de 50mL, sendo adicionado igual volume (7mL) de isopropanolol absoluto (Merk, Alemanha) para precipitar o DNA. O precipitado de DNA foi removido com pipeta de Pasteur e transferido para um tubo eppendorf. O excesso de isopropanol foi retirado com pipeta e o precipitado, lavado com 1,5mL de etanol a 70% após 10 minutos de centrifugação, a 6000 x g, a 4ºC. Em seguida, desprezou-se o etanol e o DNA foi seco à temperatura ambiente, com tubo invertido, em papel toalha. Finalmente, hidratou-se o DNA em 100 a 300µL de água DEPC (dietilpirocarbonato – inibidor de RNAase). O material foi estocado a -20ºC até o momento da análise.

O DNA extraído das amostras foi quantificado em espectrofotômetro NanoDrop 1000 (ThermoScientific) no comprimento de onda de 260nm. As amostras de DNA que estavam na faixa de 50-100 ng/μl foram utilizadas neste estudo para

avaliar o polimorfismo gênico.

A sequência alvo do gene Foxp3 foi amplificada a partir do DNA extraído de células do sangue periférico, por intermédio da hibridização de DNA pela reação em cadeia da polimerase, de acordo com o procedimento descrito por Inoue e colaboradores25. Para a reação de amplificação utilizou-se um volume

final de 25μl, sendo constituído por 50 mMKCl; 10mM Tris-HCL (pH 8,3); 3,5

mM de MgCl2; 200μM de cada desoxinucleotídeotrifosfatado (dNTP); 1U de

Taq DNA polimerase (1U/μL; Invitrogen), 0,5μL de cada primer Foxp3-2383R

(5’- GTCTGTGGAGGCTCCGAACA-3’) e Foxp3-2383F (5’

-GCCTGGCACTCTCAGAGCTT-3’); Invitrogen, São Paulo, Brasil e 5μL da

solução contendo o DNA extraído anteriormente, na concentração de

100ng/μL. Após preparadas, foi utilizado o termociclador

ºC por 1 minuto; 60ºC por 1 minuto; 72ºC por 1 minuto e etapa final a 72 ºC por 10 minutos. O produto da PCR foi digerido ao adicionar a enzima de restrição BsrI (Fermentas) durante 6 horas à 65ºC. Para visualização dos produtos amplificados, as amostras foram aplicadas em gel de agarose a 2% e coradas por gel red (Uniscience, São Paulo, Brasil).

A análise estatística foi realizada com base nos objetivos de cada um dos artigos desenvolvidos no estudo e está descrita em cada um deles, que serão apresentados na seção seguinte (5. Artigos Produzidos).

5.ARTIGOS PRODUZIDOS

5.1. ARTIGO 1

5.2. ARTIGO 2

O artigo P63 expression profiles in cervical intraepithelial neoplasia and cancer of the cervix será enviado como Short Communication para o periódico Cancer Epidemiology, Biomarkers & Prevention que possui fator de impacto 4.559 e Qualis A1.

P63 expression profiles in cervical intraepithelial neoplasia and cancer of the cervix

Ricardo Ney Oliveira Cobucci1, Carlos André Nunes Jatobá2, Luiz Reginaldo Menezes da Rocha2_{, Maria da Conceição de Mesquita Cornetta}3_{, Ana} Katherine da Silveira Gonçalves1_.

1- Postgraduate Program in Health Sciences, Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, Brazil

2- Pathology Department, Universidade Federal do Rio Grande do Norte –

UFRN, Brazil

3- Gynecology and Obstetric Department, Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, Brazil

Abstract

Expression of p63 has been detected in basal and myoepithelial cells in normal human epidermis, hair follicles sebaceous glands, sweat glands and cutaneous carcinomas.Recent studies showed that increased expression of p63 was highly correlated with the stage of cervical cancer, suggesting the possible association with the tumor progression forsquamous cervical carcinoma.In this study, we investigated the expression of p63 in cervical intraepitelial neoplasia and cervical cancer.Twenty-five tissue samples were obtained from women undergoing biopsy:Normal/no neoplastic abnormalities (n=8), low-grade intraepithelial lesions (n=7), high-grade intraepithelial lesions /squamous carcinoma of the cervix (n=10).We observed preferential p63 expression in patients with HSIL or SCC compared with no neoplastic abnormalities and LSIL. Protein p63 expression was significantly correlated with the grade of cervical intraepithelial neoplasia.

The recently discovered p53-related genes, p63 and p73, have shed light on an

additional level of complexity to the study of p53 function. P63 is necessary to maintain a stem cell epithelial population and is consistently expressed in basal cells of multilayered epithelia. 1,2

Analyses have found p63 to be expressed in basal and myoepithelial cells in normal human epidermis, hair follicles sebaceous glands, sweat glands and cutaneous carcinomas.3 An abnormal over-expression of ∆Np63 was found in many epithelial carcinomas, such as head and neck, skin, lung and cervix .4 This over-expression is possibly caused by amplification of the genomic region which houses p63.5

Originally, the homology between p53 and p63 led scientists to believe that p63 also played an important role as tumour suppressor. However, since p63 is rarely mutated in human tumours, this indicates that it is not a tumour suppressor; the over-expression of p63 seen in many different tumour types suggests that it may function as an oncogene. The potential for p63 to act as an oncogene or as a tumour suppressor and its interaction with other p53 family members continues to be the focus of research.6

In this study, the expression of p63 in cervical intraepitelial neoplasia and cervical cancer was investigated.

Twenty-five tissue samples were obtained from women undergoing biopsy in the cervical pathology service of the ‘Liga Norteriograndense contra o câncer' , Natal, Brazil from January to December 2013. The product of the biopsy was routinely prepared (hematoxylin/eosin) and submitted to a histopathological examination. Histopathology results were classified into three categories of increasing disease severity: Normal/no neoplastic abnormalities (n=8), low-grade intraepithelial lesions (n=7), high-low-grade intraepithelial lesions /squamous carcinoma of the cervix (n=10).

digitally acquired with a Leica ICC 50 camera and processed with Image-Pro Plus 4.0 software (Media Cybernetics, Silver Spring, MD, USA). This software calculates the area and density in pixels of the P63 protein expression. It used the mean value of these measures and T test to assess whether there are differences in the expression using PSPP 0.8.3 software.

In normal cervical tissue, there was no expression of p63 protein(Figure 1A), while samples diagnosed with low-grade intraepithelial lesions (LSIL) expressed it in some nuclei(Figure 1B). In samples with high-grade intraepithelial lesions (HSIL) and squamous cervical carcinoma (SCC), however, it was expressed massively (Figures 1C and 1D).

In our study, we observed preferential p63 expression in patients with HSIL or SCC compared with no neoplastic abnormalities and LSIL. (Tables 1 and 2) In addition, protein expression was higher in women with LSIL than with normal biopsies. (Table 3)

Increased p63 staining has been reported in head, neck, lung, esophageal, and oral cancer, and p63 might also function as a marker of metaplastic breast carcinoma.4,7

References

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Figure 1. Expression of p63 in uterine cervix (40X): Normal; Low-grade intraepithelial lesions (LSIL); High-grade intraepithelial lesions (HSIL); squamous cervical carcinoma (SCC)

HSIL

Normal LSIL

Table 1-Comparison of the area and density mean values of P63 protein expression in women with normal cervix and with HSIL / cervical cancer

Cervical biopsy P63 Normal

n=8

HSIL/SCC n=10

P value*

Area mean value (pixels)

11728,88 227704,31 0.0004

Density mean value (pixels)

1060034,2 26094715,3 0.0086

Table 2- Comparison of the area and density mean values of P63 protein expression in women with LSIL and with HSIL / cervical cancer

Cervical biopsy P63 LSIL

n=7

HSIL/SCC n=10

P value*

Area mean value (pixels)

74477,57 227704,31 0.0125

Density mean value (pixels)

5227512,96 26094715,3 0.0353

Table 3- Comparison of the area and density mean values of P63 protein expression in women with normal cervix and with LSIL

Cervical biopsy P63 Normal

n=8

LSIL n=7

P value*

Area mean value (pixels)

11728,88 74477,57 0.0063

Density mean value (pixels)

1060034,2 5227512,96 0.0075

5.3. ARTIGO 3

O artigo The association of genetic polymorphism of FOXP3 on cervical intraepithelial neoplasia será enviado para o periódico Cancer Epidemiology que possui fator de impacto 2.232 e Qualis B1.

The association of genetic polymorphism of FOXP3 on cervical intraepithelial neoplasia

Ricardo Ney Oliveira Cobucci1, Janaína Cristiana de Oliveira Crispim2, Kleyton Thiago Costa de Carvalho2, José Veríssimo Fernandes3, Maria da Conceição de Mesquita Cornetta4, Ana Katherine da Silveira Gonçalves1.

1- Postgraduate Program in Health Sciences, Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, Brazil

2- Pharmacy Department, Universidade Federal do Rio Grande do Norte –

UFRN, Brazil

3- Biosciences Department, Universidade Federal do Rio Grande do Norte

– UFRN, Brazil

4- Gynecology and Obstetric Department, Universidade Federal do Rio Grande do Norte – UFRN, Brazil

Abstract

FoxP3 gene encodes a transcription factor with crucial roles in the development and function of regulatory T cells. The present study was conducted to investigate whether the C-2383T (rs3761549) polymorphism in the promoter region of the FoxP3 gene is associated with cervical intraepithelial neoplasia (CIN). The study groups consist of 26 patients with CIN and 58 healthy individuals. They were genotyped for the FoxP3 polymorphism at position -2383 C, using polymerase chain reaction restriction fragment length polymorphism method. The numbers of CIN patients with C/C, C/T genotypes were 21 (27.3%) and 5 (71.4%) respectively, while among healthy controls were 56 (72,7%) and 2 (28,6%). Genotype frequencies were significantly different between controls and CIN patients (p=0,027). Our results supported an association between C-2383T FoxP3 polymorphism and cervical intraepithelial neoplasia.

Introduction

One of the most important findings in the scientific literature of the last 30 years is the causal relationship found between human papillomavirus (HPV) infection of the cervix and cervical cancer.1_{A lasting HPV infection is required to develop} cervical intraepithelial neoplasia (CIN) 2 and 3 as well as cervical cancer. Of the most influencial factors in developing a persistent cervical HPV infection, the

host’s cell-mediated immune response and the T helper type 1 cytokine axis are most likely pivotal. Studies have shown decreased reactivity to HPV antigens in the peripheral blood of women with high-grade CIN when compared to women with HPV infections without lesions.2

High-risk HPV downregulates the expression of proinflammatory cytokines tumour necrosis factorα and upregulates anti-inflammatory cytokines that prevent migration of immune cells to the HPV infected area. Preinvasive lesions that progress to cancer accumulate genetic alterations that result in immune evasion: this process is a consequence of the immune system constantly straining the developing tumour, otherwise known as cancer immunoediting. The evolution of cancer depends not only on efficient negative regulation of cell-cycle control, which moderates the accumulation of genetic injury, but also on complex systems of immune evasion, thus delaying detection for long periods of time.3

The number of Tregs, which express FOXP3, have been found to be altered in various pathological conditions. High levels of Tregs have been found in peripheral blood, lymph nodes, tumour specimens, and ascites of patients with specific types of cancer. This suggests that these cells contribute significantly to cancer growth by suppressing autoimmune response. This conclusion is reiterated in a study by Baecher-Allan et al.6_{wich suggest that Treg cells are} able to dampen anti-tumour immunity in a variety of human cancers, and have been reported to be increased in both stroma and intraepithelial tissues in cervical cancer.A study by Van der Burg7_{also corroborated this by isolating} HPV-specific Treg cells from both tumour-draining lymph nodes and tumour tissue in cervical cancer patients: results showed suppressed alloreactive CD4+ responder cells in vitro.

Scientists have recently studied the peformance of Tregs beyond immune suppression in tumors and have found Tregs to facilitate angiogenic reprogramming of the tumor microenvironment, thus revealing a multifaceted role wherein cancer is also bolstered through tumor immune escape mechanisms and angiogenesis.8,9Polymorphisms of the FOXP3 gene, including single nucleotide polymorphisms (SNP) and micro-satellite polymorphisms have been reported in patients with autoimmune diseases and cancer.10While most of the polymorphisms seem to be clinically irrelevant, a few alleles show weak clinical correlation with autoimmune diseases.11,12Neverthless, it remains unclear whether FOXP3 gene polymorphism is correlated with HPV-related CIN and cancer.

In the present study, the correlation between specific SNP in the FOXP3 gene and HPV induced cervical lesions is investigated.

Materials and Methods Subjects

A case-control study was set up wherein 84 subjects were recruited from the

gynecological examinations. The group of 26 test subjects consisted of the following: 11 cases of low-grade cervical lesions, 7 of high-grade cervical lesions and 8 of squamous cell carcinoma. Patients were diagnosed based on a cervix-guided biopsy. All subjects gave informed consent for the study, which was approved by the local ethics committee.

Determination of Foxp3 polymorphism 2383C / T (rs3761549)

DNA extracted from peripheral blood cells was used to amplify the target sequence from the Foxp3 gene. DNA hybridization resulting from a polymerase chain reaction (PCR) was used for this process, as described by N. Inoue et al.11

A final volume of 25μl was used for the amplification reaction, consisting of 50 mMKCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 3.5 mM MgCl2, 200μM of each deoxynucleotide triphosphate (dNTP); 1U Taq DNA polymerase (1U/μL,

Invitrogen), 0.5 mL of each Foxp3-2383R primer

(5'-GTCTGTGGAGGCTCCGAACA-3 ') and Foxp3-2383F

(5'-GCCTGGCACTCTCAGAGCTT-3'); (Invitrogen, São Paulo, Brazil) and 5μL of the solution containing the DNA (100ng/μL).

Once prepared, PCR was performed on the solutions using a thermocycler (MyCycler Thermal Cycler, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) with the following program: initial pre-heating at 94°C for 5 min, followed by 40 cycles at 94°C for 1 minute, 60ºC for 1 minute, 72°C for 1 minute and finally 72°C for 10 minutes. The product was digested by adding BSRI restriction enzyme (Fermentas) for 6 hours at 65 ° C. The PCR amplification products were stained red and visualized by agarose gel electrophoresis (2%) (Uniscience, São Paulo, Brazil).

Statistical analysis

Fisher’s exact test was used to test for the deviation of genotype distribution and for the comparison of differences in genotype combinations among groups. The risk associated with individual alleles or genotypes was calculated as the odds ratio with 95% confidence intervals using PSPP 0.8.3 software. P value of less than 0.05 was considered statistically significant.

To evaluate the association between one SNP of FOXP3 (rs3761549) and CIN, we conducted a case control study.All 26 patients and 58 controls were female and there were no significant differences in the age, mean age respectively 44,1 and 32,3.

As regards SNP rs3761549, CIN patients showed significantly different CT genotype distributions than that found in control subjects, 71,4% x 28,6% (p = 0,027). (Table 1)

In women whose cervix biopsy revealed CIN, the CT genotype at rs3761549 was more frequent than for the CC genotype, and was significantly different for women with CIN than in those with negative biopsies (OR 6,66; 95% CI 1,20-37,03; p = 0.0301). (Table 2)

Discussion

A positive correlation between genetic predisposition and the development of cervical cancer has long been accepted by the scientific community. Genetic polymorphisms associated with tumor suppressor genes seem to assist tumour persistence and may encourage progression to cancer brought about by HPV.13 FOXP3 is an accurate marker of primary Tregs in patients with immune-related disease and cance.14 Recent studies show that FOXP3 is not only expressed in Tregs but also in cancerous tumors cells; its expression level and function possibly suggest a new system of immune evasion in cancers. It is possible that polymorphisms of the FOXP3 gene cause an immune imbalance in cancer patients which change FOXP3 quantitatively or functionally.15,16,17

In a study by Molling et al.18_{, systemic Treg enrichment was found to be} associated with HPV persistence. Another more recent study also supported this finding when results showed a significant increase in Treg cells among peripheral blood mononuclear cells and CD4+ T cells in women with CIN or cervical cancer.19

Although Foxp3 polymorphism has been examined in various types of diseases, it has not been described in CIN.

Our data showed that there were significant differences in FOXP3 genotype frequencies between patients with CIN and healthy controls. Furthermore, we hypothesized that the FOXP3 SNP rs3761549 may be associated with susceptibility to HPV induced lesions.

Our results suggest that the FOXP3 CT genotype shows a preferential association with cervical disease.

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Table 1-Genotype frequencies of SNP rs3761549 in patients with CIN and control subjects.

Cervical disease

Genotype Negative % CIN1 % p* value

CC 56 72.7 21 27.3 0,027

CT 2 28.6 5 71.4

Total 58 69.0 26 31.0 84

Table 2. Correlation between SNP rs3761549 genotypes with cervical disease.

Cervical disease

Variable Negative

n=58

% CIN1

n=26

% OR [95% IC] p *_value

Genotype

CC

CT 56

2

72,7

28,6 21

5

27,3

71,4

6,66 [1.20-37.03] 0.0301

1-CIN=cervical intraepithelial neoplasia

5.4. ARTIGO 4

- O artigo O papel da inflamação na carcinogênese induzida pelo HPV foi aceito para publicação no periódico FEMINA que possui Qualis B5.

Artigo 13-14 Femina

Femina Revista <femina.febrasgo@gmail.com> 25 de fevereiro de 2014 _14:10

Para: Ricardo Cobucci <drcobucci@gmail.com>

Prezado Dr. Ricardo,

O seu artigo intitulado "O papel da inflamação na carcinogênese induzida pelo HPV" ´será publicado em uma das edições de 2013 da revista Femina.

Cordialmente,

Prof. Aroldo F. Camargos Editor Científico

Revista Femina

O papel da inflamação na carcinogênese induzida pelo HPV The role of inflammation in HPV carcinogenesis

Ricardo Ney Oliveira Cobucci1_{, Ana Katherine da Silveira Gonçalves}2_, Thales Allyrio Araújo de Medeiros Fernandes3_{, Pollyana Carvalho de} Souza4, Ricardo César Daniel Amorim de Sousa4, Josélio Maria Galvão de Araújo5, José Veríssimo Fernandes5

1- Professor do curso de Medicina da Universidade Potiguar, UnP, Natal-RN. Mestre em Ciências da Saúde pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN.

2- Professora doutora do Departamento de Ginecologia e Obstetrícia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN.

3- Professor assistente da Universidade Estadual do Rio Grande do Norte, UERN. Mestre em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Rio Grande do Norte, UFRN.

4- Acadêmicos do curso de Medicina da Universidade Potiguar, UnP, Natal-RN.

Resumo

A inflamação é uma estratégia de defesa inata que evoluiu nos organismos superiores, contra agentes invasores externos e moléculas nocivas. Estudos recentes mostram que a inflamação opera como um sistema muito mais complexo do que se imaginava antes, em termos moleculares, envolvendo diversos processos na sua iniciação, regulação e resolução. Na útima década tornou-se evidente que a inflamação crônica está fortemente associada com câncer, desempenhando um papel importante na tumorigênese. Uma das causas de inflamação crônica são as infecções persistentes por agentes patogênicos virais, com destaque para o papiloma vírus humano (HPV). A ligação entre a inflamação crônica decorrente da infecção persistente por agentes infecciosos e o câncer está atualmente sendo apontada como um dos mecanismos chave para o controle do surgimento de novos casos de carcinomas. Por esse motivo, consultamos os bancos de dados eletrônicos Pubmed/Medline, Lilacs, Embase e Scielo, sem restrição linguística, à procura de artigos que abordassem avanços recentes sobre os mecanismos envolvidos na inflamação, sua participação no processo de carcinogênese, com ênfase na correlação entre inflamação e o desenvolvimento do câncer associado ao HPV, os quais foram incluídos na presente revisão.

Abstract

Inflammation is an innate defense strategy that evolved in higher organisms against external invaders and harmful molecules. Recent studies show that inflammation operates as a much more complex system than imagined before, in molecular terms, involving many processes in its initiation, regulation and resolution. In the very last decade, it has become evident that chronic inflammation is strongly associated with cancer and plays an important role in tumorigenesis. One of the causes of chronic inflammation are persistent infections by viral pathogens, particularly human papillomavirus (HPV). The link between chronic inflammation resulting from persistent infection by infectious agents and cancer is currently being suggested as a key mechanism for controlling the appearance of new cases of carcinoma. Therefore, consult electronic databases such as PubMed / Medline, Lilacs, Embase and SciELO, without language restriction, looking for papers discussing recent advances on the mechanisms involved in inflammation , their participation in the process of carcinogenesis , with emphasis on the correlation between inflammation and the development of cancer associated with HPV , which were included in this review .

Introdução

Virchow, em 1863, sugeriu que o câncer se origina a partir de sítios de inflamação crônica, aliado a fatores que aumentam a proliferação celular1(D). A manutenção desta proliferação em um ambiente rico em células inflamatórias, fatores de crescimento e agentes promotores de alterações no DNA celular certamente promove ou potencializa as chances do surgimento de um câncer. Durante a inflamação normal, as células se multiplicam enquanto o tecido é regenerado e cessam a proliferação quando o agente inflamatório é removido e o tecido reparado. No entanto, se as células em multiplicação contêm mutações em seu DNA, elas continuam a proliferar em ambientes propícios, facilitado por fatores de crescimento que dão suporte ao seu desenvolvimento2_(D).

A inflamação crônica de longa duração é uma das causas potencias para o desenvolvimento de câncer, juntamente com as infecções persistentes causadas por determinados agentes patogênicos, entre eles o papiloma vírus humano (HPV)3_{(D). Entre os mediadores induzidos pela} inflamação incluem-se espécies reativas de oxigênio enitrogênio, citocinas, quimiocinas, fatores de crecimento celular, enzimas tais como ciclo-oxigenase (COX), metaloproteinase, além de prostaglandinasemicro-RNAs específicos4(D).

com diversas proteínas celulares ativando mecanismos que contribuem para o processo de carcinogênese, entre estes a inflamação5(D).

Diante da importância de se conhecer os mecanismos pelos quais o HPV induz o surgimento do CCU para melhorar a prevenção e o tratamento dessa neoplasia, neste artigo os autores tem o objetivo de revisar o papel da inflamação na carcinogênese induzida pelo HPV.

Metodologia

Realizou-se pesquisa de artigos científicos nos bancos de dados PubMed, LILACS/SciELO e EMBASE usando os seguintes descritores do MESH: Neoplasms, Inflammation e Uterine Cervical Neoplasms, sendo a última busca em 15 de Dezembro de 2013.Como filtros, utilizaram-se estudos do tipo revisão e estudos observacionais ou experimentais realizados em animais e em humanos nos últimos 15 anos sobre inflamação, HPV e câncer cervical, sem restrições de idiomas.Com esses descritores, obtivemos um total de 491 títulos, dos quais foram selecionados 146 resumos que foram lidos minuciosamente por todos os autores e, quando confirmava-se que a revisão ou estudo tratavam do tema pesquisado, buscava-se o artigo completo. Dessa forma, 63 artigos completos foram selecionados e lidos de forma independente por dois pesquisadores que, baseados na classificação da Associação Médica Brasileira para grau de recomendação e força de evidência, selecionaram os artigos mais relevantes sobre o tema da presente revisão.

Inflamação crônica, HPV e câncer cervical

Há algum tempo, estudos relatam uma associaçãoentre inflamação da cérvice uterina e ocorrência de NIC ou CCU7,8(B). Foi demonstrado que em mulheres infectadas com hr-HPV, a presença de NIC estava associada com níveis crescentes de inflamação, onde o maior nível da inflamação aumentou até duas vezes o risco desse tipo de lesão. Isto reforça a ideia de que a inflamação pode ser um cofator importante no desenvolvimento de lesões da cérvice uterina infectada pelo HPV9,10(B).

A análise histológica de biópsias da cérvice uterina de mulheres infectadas com hr-HPV mostrou maior grau de inflamação com infiltração de linfócitos e neutrófilos no epitélio, quando comparadas àquelas não infectadas. Associação entre persistência, tipo específico do HPV e progressão de lesão intraepitelial de baixo grau (LSIL) para lesão intraepitelial de alto grau (HSIL) foi menor nas mulheres com inflamação moderada no estroma ou dentro do epitélio. Nas mulheres infectadas com HPV de baixo risco, a inflamação tendeu a envolver apenas a camada superficial do epitélio, ao invés de a camada basal ou toda a espessura do epitélio. Isto sugere que a inflamação da cérvice uterina varia com o tipo de HPV10_(B).

A quantidade de macrófagos presentes no epitélio da cérvice uterina de mulheres normais, com LSIL, HSIL e CCU, foi avaliada por Hammes et al.9(B)que constataram um aumento linear da quantidade dessas células com a progressão das lesões, sendo observada uma migração crescente de macrófagos para epitélio com o agravamento da lesão, havendo uma relação direta entre as quantidades de macrófagos presentes no epitélio e a progressão de lesão premaligna para maligna. A intensidade da reação inflamatória também se mostrou intimamente associada com o grau da lesão. A migração de macrófagos do estroma para o epitélio foi influenciada não apenas pela inflamação, mas também pela presença de células displásicas. Estes dados revelam quemacrófagos CD68+estão associados à carcinogênese cervical, promovendo a progressão delesões intraepiteliais para estágios invasivos9(B).

níveis significativamente elevados de citocinas (IL-6, IL-8, TNF-α, a MIP-1α,

GM-CSF, IL-1α e IL-1 ) no plasma de mulheres com a infecção persistente

pelo HPV, quando comparados àquelas não infectadas. Elestambém observaram que a elevação dos níveis sistêmicos destas citocinas foi acompanhada de uma redução da resposta linfoproliferativa. Isso representa um fato novo e um tanto inesperado, uma vez que existe pouca evidência de uma reação inflamatória sistêmica induzida pelo HPV. No entanto, neste estudo foi observado que a presença de citocinas proinflamatórias no sangue periférico foi associada com persistência viral e fraca resposta linfoproliferativa11(B).

Em um estudo de coorte multiétnico recente, conduzido por Scott et al.12_{(B), foi feito o acompanhamento de mulheres por um longo prazo para} avaliar a expressão na mucosa da cérvice uterina de citocinas candidatas a desempenhar ação antiviral tais como: IFN-α2, IFN-ϒ e IL-12 ,bem como das citocinas proinflamatórios (IL-1α, IL1 , IL-6, IL-8 e TNFα) induzidas

após o estabelecimento da infecção por HPV. Foram comparados os perfis de citocinas nas mulhres que tiveram eliminação rápida do HPV e nas que tiveram infecção estabelecida de longo prazo. A maioria das mulheres apresentou um aumento da expressão de algumas citocinas e a redução de outras, após a infecção. Foi constatada uma associação entre níveis elevados de IL-10, IL-12, MIP-1α e TNFα na mucosa, e reduzida

probabilidade de eliminação de qualquer tipo de HPV. Para hr-HPV a tendência de não ocorrer eliminação do vírus, foi significativamente maior na presença de níveis elevados de IL-12 e TNFα. Padrões semelhantes

A relação entre inflamação, angiogênese e lesão induzida pelo HPV foi avaliada por Mazibrada et al.13(B) em amostras obtidas de mulheres com citologia normal, com NIC, ou com CCU. Com base na densidade de células pan-endoteliais presentes no local, identificadas pelo marcador CD31, foi observado um aumento progressivo de microvasos proporcional ao aumento da gravidade da lesão. A infiltração de macrófagos foi associada com neovascularização tanto em NIC quanto no CCU, existindo uma forte correlação positiva entre o número de macrófagos infiltrados no tumor e sua vascularização. Foi observado um aumento de macrófagos nos microvasos, em paralelo à progressão neoplásica, sendo ainda mais elevadas no CCU13(B).

Heller et al14(B) demonstraram que os macrófagos são um importante componente do estroma de tecidos neoplásicos, incluindo carcinomas de células escamosas da cérvice uterina.Os macrófagos, no microambiente tumoral, possuem a capacidade de afetar o tecido neoplásico em diferentes aspectos . Sugere-se que o macrófago poderia favorecer ou inibir o crescimento tumoral, de acordo com seu estado de ativação. Os macrófagos podem atuar como células fagocitárias inespecíficas ou induzir a morte de células neoplásicas, através da produção de mediadores, IFN- , IL-2 e IL-12, que estimulam o sistema imune, ou por mecanismos como citotoxicidade e apoptose, inibindo ou reduzindo o crescimento tumoral. Em contrapartida, podem também promover o crescimento do tumor através da produção de fatores de crescimento do endotélio vascular (VEGF) e citocinas responsáveis pela angiogênese tumoral14(B).

expressão de COX-2 e de síntese terminal de prostaglandina, resultando na síntese de PGE2. Além disso, a PGE2 foi produzida tanto por COX-1 quanto por COX-2, indicando que eles podem contribuir de igual modo, ou atuarem em sinergia, para promover CCU15(C).

Em um estudo a expressão da COX-2 foi identificada como aumentada em carcinoma cervical quando comparado a NIC, mas a expressão em NIC foi igual à expressão em casos benignos inflamatórios16(C).Outro estudo incluiu separadamente casos normais, com lesões de baixo grau e de alto grau, encontrando associação de COX-2 e gravidade das lesões17(B).Outros autores também evidenciaram positividade para COX-2 em 12 de 13 casos de CCU testados, enquanto controles normais eram negativos18(B).

Usando um modelo de camundongo transgênico expressando genes do HPV16,de Visseretal19_{(B), analisaram a interaçãoentre} imunidadeinata e imunidade adaptativana progressão de tumor induzido por esse vírus. Esses autores criaram uma linhagem de camundongo expressando genes do HPV16 e com deficiência para a produção de linfócitos T e B, fazendo o cruzamento da linhagem de camundogo transgênico para HPV 16 com uma linhagem de camundongos deficiente para a produção dos dois tipos de célula da resposta imune adaptativa, os linfócitos TeB. A eliminação genéticada resposta imune adaptativabloqueou orecrutamento de células da resposta imune inata, a remodelaçãodo tecido e a angiogênese. O processo de carciongênesefoi, portanto, estacionado nesses animais.Quandocélulas B obtidas dos animais transgênicos para HPV16foram transferidas para animais deficientes de células T e B, expressando genes do HPV16, a resposta inflamatória e a progressão do câncerforam restaurados, mostrando que células B foram asresponsáveis por esse fenômeno19(B).

populações de células presentes no ambiente tumoral para a evolução da doença, em particular, macrófagos associados a tumores e as células mielóides imaturas, é assunto ainda controverso a ser comprovado em futuras pesquisas20(B).

Conclusão

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5.5. OUTRAS PUBLICAÇÕES - CAPÍTULO DE LIVRO: