Pré-tratamento com remifentanil protege contra a redução da contratilidade intestinal relacionada à lesão de isquemia e reperfusão em ratos.

(1)

REVISTA

BRASILEIRA

DE

ANESTESIOLOGIA

PublicaçãoOficialdaSociedadeBrasileiradeAnestesiologia

www.sba.com.br

ARTIGO

CIENTÍFICO

Pré-tratamento

com

remifentanil

protege

contra

a

reduc

¸ão

da

contratilidade

intestinal

relacionada

à

lesão

de

isquemia

e

reperfusão

em

ratos

Hale

Sayan-Ozacmak

a

_,

_Veysel

_Haktan

_Ozacmak

a,∗

,

Inci

Turan

a

,

Figen

Barut

b

_e

_Volkan

_Hanci

c

a_Departamento_de_Fisiologia,_Faculdade_de_Medicina_da_Universidade_Bulent_Ecevit,_Kozlu,_Zonguldak,_Turquia b_Departamento_de_Patologia,_Faculdade_de_Medicina_da_Universidade_Bulent_Ecevit,_Kozlu,_Zonguldak,_Turquia

c_Departamento_de_{Anestesiologia}_e_Reanimac_¸ão,_Faculdade_de_Medicina_da_Universidade_Dokuz_Eylul,_Inciralti,_Izmir,_Turquia

Recebidoem18dejulhode2013;aceitoem2desetembrode2013 DisponívelnaInternetem1deoutubrode2015

PALAVRAS-CHAVE

Contratilidade intestinal;

Lesãointestinalde

isquemia/reperfusão; Rato;

Remifentanil

Resumo

Justificativaeobjetivos: Alterac¸õesfuncionaiseestruturaissériasdotratogastrointestinalsão

observadasnainsuficiênciadeirrigac¸ãosanguínea,levandoaalterac¸õesdamotilidade

gastroin-testinal.Aativac¸ãodosreceptoresopioidesproporcionaumefeitocardioprotetorcontraalesão

deisquemia/reperfusão (I/R). Oobjetivodo presenteestudofoideterminarseremifentanil

podeounãoreduziralesãodeI/Rdointestinodelgado.

Métodos: Ratosmachosalbinos,dalinhagemWistar,foramsubmetidosàisquemiamesentérica

(30minutos)seguidadereperfusão(3horas).Quatrogruposforamdesignados:shamcontrole;

remifentanil isolado;controleI/R; remifentanil+I/R.Osanimais do gruporemifentanil+I/R

foram submetidosà infusãoderemifentanil(2␮gkg−1_min−1₎_por₆₀_min, _metade_dos _quais

iniciouantesdainduc¸ãodaisquemia.Coletandoostecidosdoíleo,aavaliac¸ãodosdanosfoi

baseadanasrespostascontráteisaocarbacol,nosníveisdeperoxidac¸ãolipídicaeinfiltrac¸ão

deneutrófilosenaobservac¸ãodascaracterísticashistopatológicasnotecidointestinal.

Resultados: Apósareperfusão,umadiminuic¸ãosignificativadarespostacontrátilinduzidapor

carbacol,umnotávelaumentotantodaperoxidac¸ãolipídicaquantodainfiltrac¸ãodeneutrófilos

eumalesãosignificativadamucosaforamobservados.Amédiadarespostacontrátilnogrupo

remifentanil+I/RfoisignificativamentediferentedaqueladogrupoI/R.Aperoxidac¸ãolipídica

eainfiltrac¸ãodeneutrófilostambémforamsignificativamentesuprimidaspelotratamento.As

amostrasdetecidodogrupoI/Rapresentaramgrau4naavaliac¸ãohistopatológica.Nogrupo

remifentanil+I/R,poroutrolado,alesãodamucosafoimoderada,apresentandoestadiamento

degrau1.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:vhaktan@yahoo.com(V.H.Ozacmak).

(2)

Conclusões:Opré-tratamentocomremifentanilpodeatenuaralesãointestinaldeI/Remum

graunotável,possivelmentepelareduçãodaperoxidaçãolipídicaedainfiltraçãoleucocitária.

direitosreservados.

KEYWORDS

Intestinal contractility; Intestinal

ischemia/reperfusion injury;

Rat;

Remifentanil

Pretreatmentwithremifentanilprotectsagainstthereduced-intestinalcontractility relatedtotheischemiaandreperfusioninjuryinrat

Abstract

Backgroundandobjectives: Serious functional and structural alterations of gastrointestinal

tractareobservedinfailureofbloodsupply,leadingtogastrointestinaldismotility.Activation

ofopioidreceptorsprovidescardioprotectiveeffectagainstischemia---reperfusion(I/R)injury.

TheaimofthepresentstudywastodeterminewhetherornotremifentanilcouldreduceI/R

injuryofsmallintestine.

Methods:MaleWistarAlbinoratsweresubjectedtomesentericischemia(30min)followedby

reperfusion(3h).Fourgroupsweredesigned:shamcontrol;remifentanilalone;I/Rcontrol;and

remifentanil+I/R.Animalsinremifentanil+I/Rgroupweresubjectedtoinfusionofremifentanil

(2ugkg−1_min−1₎_for ₆₀_min,_half _of_which _started _before _inducing_ischemia. _Collecting _the

ileumtissues,evaluationofdamagewasbasedoncontractileresponsestocarbachol,levelsof

lipidperoxidationandneutrophilinfiltration,andobservationofhistopathologicalfeaturesin

intestinaltissue.

Results:Following reperfusion, a significant decreasein carbachol-induced contractile

res-ponse, a remarkable increase in both lipid peroxidation and neutrophil infiltration, and a

significantinjuryinmucosawereobserved.Anaveragecontractileresponseofremifentanil+I/R

groupwassignificantlydifferentfromthatoftheI/Rgroup.Lipidperoxidationandneutrophil

infiltrationwerealsosignificantlysuppressedbythetreatment.ThetissuesamplesoftheI/R

groupweregrade4inhistopathologicalevaluation.Inremifentanil+I/Rgroup,ontheother

hand,themucosaldamagewasmoderate,stagingasgrade1.

Conclusions:ThepretreatmentwithremifentanilcanattenuatetheintestinalI/Rinjuryata

remarkabledegreepossiblybyloweringlipidperoxidationandleukocyteinfiltration.

reserved.

Introduc

¸ão

Os receptores opioides (ROs) ativados protegem contra

a lesão de isquemia/reperfusão (I/R) no corac¸ão e nos

neurônios.1-3 _Peptídeos _opioides_e _ROs _estão _presentes _no

intestino.4,5 _{Remifentanil,} _um _analgésico _opioide _de _ac¸ão ultracurtaderivadodafenilpiperidina,éumcardioprotetor contraa lesão de I/R através dos ORs mediadores,1,6

ati-vandoaproteínaquinaseC(PKC)econduzindooscanaisde potássiosensíveisaATPmitocondrial(KATP)7_que_imitam_o pré-condicionamento(PC)isquêmico.1,8

Sepse, hemorragia, transplante intestinal, queimadu-ras graves e trombose mesentérica causam isquemia mesentérica,9,10_resultando_em_grande_impacto_no_intestino. A I/R intestinal tem um papel importante no

desenvol-vimento da disfunc¸ão primária do enxerto.11,12 _O _tecido intestinal é muito sensível à I/R. Na verdade, embora o

tratogastrointestinalrepresentecercade5%dopeso cor-poral, o seu consumo de oxigênio constitui cerca de 20% dototaldeoxigêniousado.13 _A_{interrupc¸ão}_do_suprimento deoxigêniodiminuiaquantidadedeATPintracelular, alte-randoahomeostasecelularatravésdoaumentodasespécies reativasdeoxigênio(ERO).Areperfusãoinduzdanos estru-turais e funcionais da mucosae edema intersticial (lesão de reperfusão),14 _que _é _{principalmente} _devida _à _gerac¸ão deERO a partir de várias fontes,incluindo as cadeiasde

transportedeelétronsdasmitocôndrias,ometabolismoda xantina-oxidase,asprostaglandinas,ascélulasendoteliaise osneutrófilosativados.14-17_A

I/Rprejudicaafunc¸ãode

bar-reiradamucosa,provocandoapermeabilidadevasculareda mucosaeatranslocac¸ãobacteriana,terminandoporcausar ainflamac¸ãosistêmicaeinsuficiênciademúltiplosórgãos.18 AI/Rtambémmodificaarespostacontrátildomúsculoliso

intestinal,19---22 _que _está _associada _à _resposta _{inflamatória} localaumentadapelainfiltrac¸ãodeneutrófilos10_e_ERO.23

Algunsagentesfarmacológicosincluindoanestésicos pro-duzemPC.24-28_Os_ROs,_em_particular,_estão_envolvidos_no_PC docorac¸ãoderatos.7,8_Além _disso,_o_{pós-condicionamento} farmacológico induzido por remifentanil também protege contraalesãocardíacainduzidapelaI/R.3 Poroutrolado,

informac¸ão sobre a ocorrência ou não do possível efeito benéfico na lesão intestinal de I/R é extremamente

limi-tada.Apenasumestudoconduzido porChoetal.29 _relata queremifentanilprotegeointestinocontraalesãodeI/R.Os

autoresdemonstramclaramentequeremifentanilreduzde formasignificativaostressoxidativo,arespostainflamatória ealesãotecidual.Contudo,elesnãoavaliaramdiretamente o efeito sobreas func¸ões fisiológicas dotecido (p. ex., a contratilidade). Portanto,o nossoobjetivo foideterminar seremifentaniltemefeitobenéficosobreacontratilidade intestinalalteradapelaI/R.Avaliamosarespostacontrátil,

(3)

demalondialdeído(MDA),o marcadordeperoxidac¸ão lipí-dica,aatividadedamieloperoxidase(MPO)eomarcadorda infiltrac¸ãodeneutrófilos,

Materiais

e

métodos

Animais

Foram usadosno estudo 32 ratos Wistar, machos adultos, pesando 220±20g (média ± desvio padrão). Os animais foramobtidosdobiotério daUniversidadeBulentEcevite mantidos em condições padrão, com livre acesso a ração comercialeágua.Nodiaanterioraosprocedimentos cirúr-gicos,osanimaisforamsubmetidosajejumduranteanoite, masoacessolivreàágua foipermitido.Osanimaisforam mantidosemgaiolas,emtemperaturaambienteconstante, usandociclodeclaridade/escuridãode12h.Todosos pro-cedimentosaquidescritosforamaprovadospeloComitêde ÉticaemExperimentaçãoAnimaldainstituição.

Procedimentoscirúrgicos

Os ratos foram anestesiados com tiopental sódico (60mgkg−1₎ _por _via _{intraperitoneal,} _seguido _por

lapa-rotomiacomincisãonalinhamédianacavidadeperitoneal. Apósumasuaveexteriorizaçãodointestinodelgadoparaa esquerdaedeposiçãosobregazeúmida,osanimaisforam submetidosa30minutos(min)deisquemiaporligadurada artériamesentéricasuperior(AMS)usandofiodeseda3/0. A isquemia intestinal foi confirmada pela falta de pulso na artériamesentéricaepelacor pálidadojejunoeíleo. Depois disso, os intestinos foram devolvidos ao abdome, que foi fechado com duas pinças pequenas. Após 30min de isquemia, o abdome foi reaberto e o fio suavemente removidoparapermitirareperfusãodofluxosanguíneo,o quefoiconfirmadopelaobservaçãodapulsaçãodaartéria e de seusramos nointestino. A temperatura corporal foi mantidaa37,8◦_C_com_lâmpada_de_aquecimento_durante_o

procedimentodeI/R.

Gruposexperimentais

Osanimaisforamalocadosemquatrogruposdeoitocada: (a)nogruposhamcontroleforamsubmetidosàlaparotomia semaoclusãodaAMS;(b)nogruposhamremifentanil (remi-fentanil isolado) foram tratados com remifentanil e uma operac¸ãoshamsemoclusãodaAMS;(c)nogrupocontrole

I/R,aoclusãodaAMSfoide30min,seguidapor3horas(h)

dereperfusão;(d)nogruporemifentanilmaisI/R,osratos

submetidosàI/Rforamtratadoscomremifentanil.

O pré-tratamento com remifentanil (Glaxo Group Limited, Lake Forest, IL, EUA) foi feito por infusão (2␮gkg−1_min−1₎_em_veia_da_cauda_por₃₀_min_antes_da

oclu-sãodaAMSepor30minadicionaisdurantetodooperíodo deisquemia.Ocateterismodaveiadacaudafoifeitocom um cateter Polyneo de calibre 24G (Polymed, Poly Medi-cureLtd.,Haryana,Índia)paraadministrac¸ãodainfusão.Os animaisdosgruposshamcontroleeI/Rreceberamsoluc¸ão

fisiológicaestéril,emvolumeigual.Apósoperíodode reper-fusão,osanimaisforamsacrificadosmedianteadministrac¸ão

de doses letais de anestésicos; em seguida, as amostras deíleoforamcoletadaseprocessadasparacadaprotocolo experimental.

Contratilidadedomúsculolongitudinaldoíleo

A atividade contrátil do músculo longitudinal do íleo foi avaliadaemsegmentos isoladosdoíleo após3h de reper-fusão em solução de banho de órgãos isolados. Amostras (tiras)do músculo longitudinal medindo 5mm de compri-mentoforamcoletadasa1cmdajunçãoileocecal.Depois decoletaraprimeiraamostraparaaavaliaçãohistológica, outrastrêsamostrasdomesmotamanhoforamcolhidaspara análisesdecontratilidadeebioquímica.Asamostrasforam longitudinalmentesuspensassob2-gdecargaem 20mLde soluçãodebanhotecidualcontendosoluçãodeKrebs (em mmolL−1_:_NaCl,_118,5;_KCl,_4,8;_KH

2PO4,1,2;MgSO4.7H2O,

1,2;CaCl21,9;NaHCO3,25;glicose,10,1).Asoluc¸ão

rece-beuumamisturade5%deCO2e95%deO2efoimantidaa

37◦_C._Após₆₀_min_de_equilíbrio_com_carga_de₂_g,_carbacol

foiadicionadoao banho tecidualem váriasconcentrac¸ões finais variando entre 10−7 _a ₁₀−2_mol_L−1_. _O

desenvolvi-mentodeforçaativafoiregistradoparacadaconcentração paradeterminararelaçãodose-resposta.Aforçaisométrica foimonitorada pelo transdutor dedeslocamentode força externa(FDA-10A,CommatCo,Ancara,Turquia),usandoo softwareMP30 (MP30BiopacSystems Inc,SantaBarbara, CA,EUA).

Análisehistopatológicadalesãode

isquemia-reperfusãoemintestinodelgado

Os segmentos do íleo foram fixados em formalina a 10% e embebidos em parafina. As seções de parafina intesti-naisforamcoradascomhematoxilinaeeosinaparaanálise morfológica.Aanálisehistopatológicadotecidointestinal reperfundidofoibaseadaem ummétododeestadiamento descritoporHierholzeretal.30 _e_a_avaliação_foi_pontuada de zero a quatro. Grau 0: nenhuma alteração patológica específicaéobservada,estruturanormaldaparede intesti-nal,incluindovilosidades,criptas,lâminaprópriaemuscular externa;grau1:lesãolevedamucosaéobservada--- desnu-damentodoepitéliodasvilosidades,masemoutrosaspectos aestruturaestánormal;grau2:danosmoderadosocorrem ---perdadocomprimentodasvilosidadesedescamação epite-lialcomevidênciasdecongestão,hemorragiaeinflamação damucosa,masnenhumamudançanasubmucosaou muscu-larexterna;grau3:danosextensossãoobservados---perda deumgrandenúmerodevilosidades,incluindodesnudação, descamaçãoe a presençadetecido granulomatosocom o dano localizado na submucosa e muscular; grau 4: danos graves e necrose são observados --- inflamação e necrose em toda a espessura da parede intestinal. O pesquisador quefezasmensuraçõesnãotinhaconhecimentodoprojeto experimental.

Determinac¸ãodaatividadedeMDAtecidual

(4)

com umpilão acionadopor motor, as amostras detecido foramhomogeneizadasemácidotricloroacético(TCA) arre-fecidoemgeloaoadicionar10mLdeTCAa10%porgramade tecido.Apósacentrifugac¸ão,750␮Ldesobrenadanteforam adicionadosaigualvolumedeácidotiobarbitúricoa0,67% eaquecidosa100◦_C_por₁₅_min._A_absorbância_das_amostras

foientãomedidaespectrofotometricamentea535nm.

Determinac¸ãodaatividadedeMPOtecidual

A atividade de MPO no sobrenadante do homogenato foi determinadaa partir daoxidac¸ão dao-dianisidina depen-dente de H2O2.32 As alíquotas do sobrenadante (0,1mL)

foramadicionadasa2,9mLdamisturadereac¸ãocontendo 0,167mgmL−1_de_o_-dianisidina_e₂₀_mM_de_soluc¸ão_de_H

2O2,

que foram preparadas em 50mM de tampão de fosfato (PB).Imediatamenteapósaadiçãodaalíquotaàmistura,a variaçãodeabsorbânciaa460nmfoimedidapor5min.Uma unidadedaatividadedeMPOfoidefinidacomoadegradação de1␮moldeperóxidopormina25◦_C._A_atividade_foi_então

normatizadacomounidadepormgdetecido(Umg−1_).

Análisededados

Osvalores para as experiências que avaliam a contratili-dade foram normatizadas por grama (g) de tecido. Cada dadomensuradorepresentaamédia±EP.Paraaavaliac¸ão estatística,oprogramaestatísticoSPSS11.0(SPSSInc., Chi-cago, IL, EUA) foi usado. Testes não paramétricos foram feitos,visto que cada grupoeracomposto poroito amos-trasidênticas.Assim,por meiodaanálisede variânciade Kruskal-Wallis(Anova), todososgruposforamcomparados emtermosdeexistênciadeheterogeneidade.Quandouma heterogeneidade estatisticamente significativa foi detec-tada em todos os grupos, os grupos individuais foram comparadosentresicomotestedeTukey.Valores-p inferi-oresa0,05foramconsideradossignificativos.

Resultados

Contratilidadedomúsculolongitudinaldoíleo

Emtodososgrupos,o carbacolcausouumefeitocontrátil dose-dependentesobreossegmentosdoíleoterminal, pro-porcionandocurvassigmoidescomsuasrespostasmáximas (valoresdo Emax) (fig. 1).O valor do Emax de carbacol foi

significativamentemenor nogrupo controleI/Rdoque no

grupo sham (12,83±0,76 vs. 22,19±2,10g/g de tecido, respectivamente). Em outras palavras, a contrac¸ão em respostaao carbacol foireduzida de formasignificativae dependente da dose pela induc¸ão de I/R, como indicado

pelacurvadescendente.Adiferençaestatísticaentreesses doisgruposfoisignificativacomtodasasdosesdecarbacol (p<0,01).Areduçãodacontratilidademelhoroudeforma significativa com o tratamento com remifentanil. Esse efeitofoiestatisticamentesignificativoparacada dosede carbacol,emcomparaçãocomogrupoI/R.Noentanto,as

respostasdecontrac¸ãodosgrupos sham,remifentanil iso-ladoe remifentanil+I/Rapresentaramcurvassemelhantes

com todas as doses de carbacol, sendo estatisticamente indiferentes entre si (p>0,05) (fig. 1). Comparando os valores do Emax, o do grupo I/R (12,83±0,76g/g de

30,00

25,00

20,00

15,00

10,00

5,00

0,00

10–7 ₁₀–5 ₁₀–5 ₁₀–4 ₁₀–3 ₁₀–2

Carbacol], mM

Contração, g/g de tecido

Controle sham Sham+Rem

Controle I/R I/R+Rem

Figura 1 Curvas de concentrac¸ão-resposta ao carbacol em

músculolongitudinaldoíleoisoladodosgruposcontrolesham, sham+Rem, controle I/R e I/R+Rem. Cada dado mensu-radorepresentaamédia±EPdeoitoexperimentos. *p<0,05 indica diferenc¸a estatisticamentesignificativa do grupo con-trole I/R (controle I/R vs. todos os outros três grupos para cadaconcentrac¸ãodecarbacol).(Rem:remifentanil;I/R: isque-mia/reperfusão).

tecido) foi apenas cerca de 58% daquele do grupo sham (22,19±2,10g/g de tecido). O valor médio do Emax do

gruposhamnãofoiestatisticamentediferentedaquelesdos grupos remifentanilisolado (21,55±2,85g/gde tecido)e remifentanil+I/R(24,60±2,86g/gdetecido).

Resultadoshistopatológicos

Analisando seis secc¸ões por grupo, as alterac¸ões mais dramáticas foram observadas no grupo de I/R (fig. 2C;

tabela 1). Inflamação, desnudação da mucosa e edema foramclaramentedetectadosemalgumaspartesdamucosa e submucosa,alémdeáreas necróticasem todaa parede do intestino. Descamação em parte da superfície do epitélio também eraevidente. O grupoI/R foi, portanto,

avaliado como grau 4. No grupo sham, como mostra a

figura 2A, aestruturanormal daparede dointestino com vilosidades,criptas,lâmina própriaecamada muscularfoi claramenteobservadaeogrupofoiclassificadocomograu zero. O grupo remifentanil isolado apresentou aparências muitosemelhantesàsobservadasnogruposham;ouseja, alterac¸ões patológicas específicas não foram observadas; portanto,foiclassificadocomograuzero(fig.2B).Ogrupo

Tabela 1 Classificac¸ão histológica semiquantitativa das

sec¸õesdoíleoderatos(6sec¸ões/grupo)

Média±EP

Controlesham 0

Sham+Remifentanil 0

ControleI/R 3,83±0,16

I/R+Remifentanil 1,17±0,16a

Análise devariânciasimples (Anova),significância estatística

entreosdoisgrupos.

(5)

Figura2 Micrografiasópticasdo tecidointestinalde rato:(A) grupocontrolesham operados; arquiteturanormalda parede intestinalsemqualqueralteraçãopatológica(grau0);(B)gruposham+Rem;aparênciahistomorfológicanormaldotecidointestinal (grau0);(C)grupocontroleI/R;alterações morfológicasmaisextensas detectadas,como olúmenintestinalulcerado,camada muscular significativamente diminuída,perda deepitélio e glândulas eapresentando exsudato superficiale material mucoide (grau4);(D)grupoI/R+Rem;opré-tratamentomelhorouasalteraçõeshistopatológicasobservadasapósaI/R;tecidointestinal inflamadocomafinamentomoderadodamucosa,perdadesigualdo epitélio,ereação celularinflamatóriadotipomistaqueé dominadaporleucócitosnuclearespolimorfos(grau1).(coranteH&E×200,barras deescala=50␮m).(Rem:remifentanil;I/R: isquemia/reperfusão).

remifentanil+I/R apresentou dano moderado da mucosa,

apenas com desnudamento focal mínimo do epitélio das vilosidadesefoiclassificadocomograu1(fig.2D).

NíveisdeMDA

O teor de MDA nos animais do grupo sham apresen-tou média de 73,29±7,46nmolg−1 _de _tecido, _enquanto

a média nos animais submetidos somente à I/R foi de

156,82±15,74nmolg−1_de_tecido₍_fig.₃_),_um_aumento

sig-nificativo no teor de MDA (p<0,001). O pré-tratamento com remifentanil (grupo remifentanil+I/R) reduziu

signi-ficativamente o teor de MDA intestinal induzido pela I/R

para os níveis do grupo sham. Com um valor médio de 107,80±8,93nmolg−1 _de _tecido, _esse _grupo _foi

estatis-ticamente indistinguível do grupo sham (p=0,143), mas estatisticamentediferentedogrupoI/R(p=0,02).Poroutro

lado,amédiadoteordeMDAnogruporemifentanilisolado (84,03±14,90nmolg−1_de_tecido)_não_foi_{estatisticamente}

diferentedaqueladogruposham(p=0,946).

AtividadesdeMPO

As médiasdas atividades dasenzimasdeMPO dostecidos dos animais submetidos à operac¸ão sham, remifentanil isolado, I/R e remifentanil+I/R foram (em Umg−1 de

tecido)0,63±0,17,0,54±0,08,1,60±0,28e 0,83±0,14, respectivamente(fig.4).

Sham

200 180 160 140 120 100 80 60 40

[MDA], nmol/g de tecido

20 0

Sham+Rem I/R I/R+Rem

Figura3 Médiadoteordemalondialdeído(MDA)em

amos-trasdo íleo dos grupos controlesham,controle sham+Rem, controleI/ReI/R+Rem.Osdadossãoexpressosemmédia±EP (n=8).Emcomparac¸ãocomogrupocontroleI/R,umadiferenc¸a estatisticamentesignificativaéindicadacomo*(p<0,05).(Rem: remifentanil;I/R:isquemia/reperfusão).

AI/Rcausouumaumentodeaproximadamente2,5vezes

daatividadedeMPOnotecidoemrelac¸ãoaonívelbasalde atividade(p=0,004).Opré-tratamentocomoremifentanil aboliucompletamenteo aumentodaatividadeenzimática resultante do insulto de I/R; a atividade de MPO nas

amostrasdosanimaispré-tratadoscomremifentanilfoi sig-nificativamentediferentedaqueladogrupoI/R(p=0,049).

(6)

2,00 1,80 1,60 1,40 1,20 1,00

0,80 0,60 0,40 0,20 0,00

Sham

[MPO] atividade, U/mg de tecido

Sham+Rem I/R I/R+Rem

Figura4 Média deatividadedamieloperoxidase(MPO)das

amostrascoletadasdoíleodosgruposcontrolesham,controle sham+Rem,controleI/ReI/R+Rem.Osdadossãoapresentados emmédia±EPparaoitoanimaisdecadagrupo.Emcomparac¸ão comogrupocontroleI/R,umadiferenc¸aestatisticamente sig-nificativaéindicadacomo*(p<0,05).

Discussão

Opresenteestudodemonstraqueremifentanilpodeterum potencialdeprotec¸ãofortecontraalesãointestinaldeI/R.

EvidênciasindicamqueremifentanilatenuaaI/Rinduzida:

(1)alteraçõespatológicasintestinais;(2)diminuiçãoda res-postacontrátil;(3)aumentodainfiltraçãodeneutrófilose (4)elevaçãodaperoxidaçãolipídica.

Há muitos estudos publicados que apresentam efeitos benéficosdo PCfarmacológico com remifentanil na lesão dereperfusãoemváriostecidos.Noentanto,estudos avali-andooPCfarmacológicodointestinocomremifentanilsão muitolimitadosecarecemdeaspectosfuncionais,taiscomo motilidadee secrec¸ão. Naverdade, apenasum estudose dedicouaessa questão.Choetal.29 _mostraram _que remi-fentanilatenuaalesãointestinaldeI/Remratosaoreduzira

peroxidaçãolipídicaeainflamaçãosistêmica.Nossosdados confirmamosresultadosdesseestudoemrelaçãoàinibição do estresse oxidativo e da inflamação e demonstraram o envolvimentodiretodosleucócitosnostecidos.Noentanto, oestudonãoinvestigoudiretamenteoefeitode remifenta-nilnasfunçõesfisiológicasdotecido,taiscomomotilidade e/ou secreção. Portanto,o presente estudo dá um passo adiante ao mostrarque o pré-tratamento com remifenta-nilmelhoraacontratilidadereduzidacausadapelaI/R,uma

nova descobertapotencialmente relacionada com a ativi-dadeanti-inflamatóriaeantioxidantederemifentanil.

A I/R intestinal pode causar falência de múltiplos

órgãos,morbidadegraveeatémorte.1,16_A_isquemia,_tanto aguda quanto crônica, causa um grande impacto funci-onal e estrutural no intestino, levando à dismotilidade, absorçãoanormalealteraçãodafunçãodebarreiracontra a translocação bacteriana.10,14,33 _A

I/R intestinal aguda

causa alterações estruturais de duração tão longa que desenvolvehipertrofia,disfunção celular,morteneuronal, necrosenointeriordoplexomientérico19,22,33_e _{infiltração} de células inflamatórias (i. é, neutrófilos).30,34 _Muitos estudospublicados descrevemefeitos deletériosdaI/Rna

motilidade intestinal, tais como trânsito gastrointestinal atrasado,35-37 _complexo _motor _migratório _alterado38 _e resposta motora prejudicada a qualquer estímulo.20,39,40

A respostainflamatóriadentro dascélulasmusculares e a diminuic¸ão da contratilidade do músculo liso circular são acionadas pela I/R.30,34 A integridade da rede neuronal

entérica é necessária para a motilidade gastrointestinal normal. Portanto, a I/R pode perturbar a func¸ão motora

do intestino, alterando as propriedades dos neurônios entéricosouatransmissãoneuroefetora.22_Essas_{alterac¸ões} são provavelmente o resultado da resposta inflamatória induzidapelalesãodeI/R.Odanointestinalqueobservamos

podeestarassociado àinflamação, queé especificamente marcada pelo aumento da quantidade de neutrófilos no tecido.Ainibiçãodaativaçãoedaaderênciaendotelialdos neutrófilosreduzodanoinduzidopelaI/Rnamucosa.41Em

resposta à inflamac¸ão do músculo, os neutrófilos são ativados,possivelmentecontribuindoparaodanomuscular. Portanto,émaisprovávelqueaperturbac¸ãodamotilidade ocorridaapósaI/Rtenharesultadodagravelesãomuscular

edareaçãoinflamatóriaassociadaqueobservamos.O trata-mentocomremifentanilreduziunãoapenasaperoxidação lipídicanotecido,mastambémainfiltraçãodeleucócitos, odanotecidualeodistúrbionarespostacontrátil.

Oretorno dosangue oxigenado para o intestino isquê-micoagravaaindamaisodanotecidualprincipalmentepor causadoaumentodageraçãodeespéciesreativasde oxi-gênio(ERO),causandoestresseoxidativo.17,42 _As_principais fontesdeEROduranteareperfusãosãoaxantinaoxidasee neutrófilosativadosliberandomediadorespró-inflamatórios esubstânciascitotóxicas,comoaMPO.17 _A_lesão_intestinal dereperfusãoé consideradacomo umadoença inflamató-riacaracterizadapelorecrutamentodeleucócitos.9_As_ERO liberadas na reperfusão estimulam ainda mais a resposta inflamatória,aumentandoo recrutamentoe aativaçãode neutrófilos. A atividade da MPO tecidual, proporcional à quantidadedeneutrófilos acumulados,espelhaa lesãoda mucosaeataxadeinfiltraçãodeneutrófilosemtecido pós--isquêmico.17,43 _Assim,_após_a

I/R,o aumentodaatividade

daMPO notecido indicoua melhora daresposta inflama-tórianopresenteestudo. Apontuaçãohistológicaelevada das lesões teciduais e a diminuição da resposta contrátil coincidiramcomaelevaçãosignificativatantodaatividade daMPOquantodaperoxidaçãolipídicadotecidonogrupo

I/R. Uma das consequências deletérias do dano oxidativo

é a peroxidac¸ão lipídica, queeventualmente provoca dis-túrbios estruturais e funcionais das membranas. O grupo remifentanil+I/Rapresentoureduc¸ãosignificativatantoda

atividadedaMPOquantodoteordeMDA,oqueindicauma limitaçãosignificativadainflamação.Alémdisso,aresposta contrátilaocarbacolnomesmogrupopareceusermantida muitopróximaàdogrupocontrolesham.Essasdescobertas foramcorroboradaspelaobservaçãohistopatológicadeque remifentanilresgatoucomsucessoaintegridadedotecido apartirdalesãodeI/R.

OPCinduzidoporopioidesprotegecontraa lesão car-díacadeI/R.Emespecial,oPCinduzidoporremifentanil,

(7)

culturasdecélulas.Apósaativaçãodereceptorestoll-like 2, os agonistas de opioides têm um efeito inibitório na produção de citocinas pró-inflamatórias em monócitos humanos. A inibição é mediada exclusivamente pela microativaçãodosROs.2_No_presente_estudo,_reconhecemos queaintegridadedamucosaintestinalearespostacontrátil dotecidopermaneceramquasenormaisnogrupo remifen-tanil+I/R. Nossos dados demonstraram que remifentanil

diminuiutantoaperoxidac¸ãolipídicaquantooacúmulode neutrófilosnotecidoisquêmico, oque podeserexplicado pelomecanismo subjacente dos resultadosacima mencio-nados.Noentanto,teriasidomelhoreconfirmativoavaliar osefeitosdeumantagonista/agonistadamicroativac¸ãodos ROsnopresentemodelo,alémdeexaminarumpadrãode dose-respostaderemifentanil.

As célulasdotratogastrointestinalformamumsítiono qualosROsexistememníveiselevados.ApresençadeROs aolongodotratoédemonstradanonervoemúsculoliso.4 Muitosestudosrelatamque aproteçãoporremifentanilé mediadapelosROs.44-46_Por_outro_lado,_alguns_sugerem_que omecanismodemediaçãoindependedosROs.2_No_entanto, Zhangetal.5_mostram_que_os_peptídeos_opioides_endógenos podemdesempenharumpapelimportantenoPCisquêmico do intestino delgado. No modelo de inflamação do intes-tinoderatoinduzidapelo óleodecróton,aexpressão da microativaçãodosROsérelatadacomosendoreguladapara cimanoplexo mientérico dojejuno.Do mesmo modo, os pacientes com doenças inflamatórias intestinais (DII) têm uma expressão aumentada de mRNA dos ROs microativa-dos em seus intestinos delgados e cólons inflamados em relaçãoaotecidointestinalsaudável.47_No_presente_estudo, nãosabemosseoefeitoprotetorderemifentanilfoi medi-adopormecanismosdependentesounãodeROs.Contudo, é tentador especular se o efeito benéfico é devido aos processos mediados pelos ROs, já que o tecido tem uma quantidadeabundantedeROsejáqueasagressões inflama-tóriasinduzemumaregulaçãoparacimados ROs.Seesse for ocaso, então opré-tratamento comremifentanil pos-sivelmenteimita oefeito doPCisquêmico. Istoé, agindo atravésdosROs,remifentanilpodeeventualmenteativara PKC através do metabolismo dofosfatidilinositol induzido pelaativaçãodafosfolipaseCouDligada àmembrana.A PKC em seguida fosforila e estabiliza o estado aberto de ambososcanaisdeKATP,do sarcolema edamitocôndria, queeventualmenteprovocaacitoproteção,comoobservado na proteção cardíaca induzida por remifentanil.7 _O pré--tratamentocomremifentaniltambémpodeterumefeito inibidormediadoporROssobreageraçãodecitocinas pró--inflamatóriaspelos monócitos em resposta àestimulação dereceptorestoll-like2.2_Nesses_casos,_a_{administração}_de umantagonistadeROs(i.é,naloxona)seriaprejudicialpara osefeitospreventivosobservadosnopresenteestudo.Por outrolado,seosmecanismosnãoforemmediadospor recep-tores,aproteçãointestinalinduzidaporremifentanilpode sermultifatorial.Nessecaso,comorelatadosobreoPCpor remifentanildeI/Rhepática,aóxido-nítricosintetase

indu-tível(iNOS)podemediarosefeitos preventivosem tecido intestinal.Porexemplo,tantoaperoxidaçãolipídicaquanto ainflamaçãopodemseratenuadasporumageraçãoelevada deóxidonítrico(NO)endógeno,oquelimitariaaquantidade deEROeatenuariaarespostainflamatória.Estábem docu-mentadoqueoNOendógenopodeesgotarasEROealesão

tecidualmediadaporneutrófilos,dessaformareduzindo sig-nificativamente a resposta inflamatória. Sabe-se também quealesão celularinduzidaporI/Restá relacionadacom

umadiminuiçãosignificativadeNO.Portanto,o remifenta-nilpodeestarassociadoàinduçãodaexpressãodeiNOSe àconsequentegeraçãodeNOendógenonotecidointestinal desafiandoa lesão dereperfusão.Se assimfor, os efeitos protetoresseriambloqueadosporuminibidordeNOS,mas nãopornaloxona.2

Emconclusão,demonstramosqueotratamentoderatos comremifentanilantesdaI/Rforneceuprotec¸ãocontraa

lesãodamucosainduzidaporI/Reodistúrbiocontrátil.Um

possívelmecanismoresponsávelporessasatividades saluta-resderemifentanil,provavelmente,podesermultifatorial. Noentanto,comoo presenteestudo forneceuevidências, a atenuação dainfiltração de neutrófilos e a redução do stressoxidativoparecemserdeprimordialimportânciapara obterosefeitosbenéficos.Estudosadicionaisquepriorizem osmecanismosdos efeitos protetores deremifentanilsão certamente necessários. Em conclusão, mostramos que a administraçãoderemifentanilduranteaisquemiapodeser eficazmenteprotetora contra a maioria dos aspectos his-tológicos, citológicos, bioquímicos e fisiológicos da lesão intestinal, fornecendo um potencial terapêutico para a aplicaçãoclínicaemisquemiaintestinaledistúrbios relacio-nadoscomaisquemia.Alémdisso,opresenteestudosugere que a aplicação de remifentanil como agente analgésico podeserpreferidaparaaquelesquesofremdehipoperfusão intestinaleserãosubmetidosàanestesia.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

Gostaríamos deagradecer àquelesque trabalhamna uni-dadedeassistênciaaosanimaisporsuainestimávelajuda.

Referências

1.PeartJN,GrossER,GrossGJ.Opioid-inducedpreconditioning: recent advances and future perspectives.Vascul Pharmacol. 2005;42:211---8.

2.Yang LQ, Tao KM, Liu YT, et al. Remifentanil preconditio-ning reduces hepatic ischemia-reperfusion injury in rats via inducible nitric oxide synthase expression. Anesthesiology. 2011;114:1036---47.

3.ChunKJ,ParkYH,KimJS,etal.Comparisonof5different remi-fentanil strategies against myocardial ischemia-reperfusion injury.JCardiothoracVascAnesth.2011;25:926---30.

4.Cosola C, Albrizio M, Guaricci AC, et al. Opioid ago-nist/antagonisteffectofnaloxoneinmodulatingrabbitjejunum contractilityinvitro.JPhysiolPharmacol.2006;57:439---49. 5.Zhang Y, Wu YX, Hao YB, et al. Role of endogenous opioid

peptidesinprotectionofischemicpreconditioninginratsmall intestine.LifeSci.2001;68:1013---9.

6.Yu CK, Li YH, WongGT, et al. Remifentanil preconditioning confers delayed cardioprotection in the rat. Br J Anaesth. 2007;99:632---8.

(8)

kinaseCactivationinopenchestofrats.ActaPharmacolSin. 2005;26:546---50.

8.Kim HS, Kim SY, Kwak YL, et al. Hyperglycemia attenua-tes myocardial preconditioning of remifentanil. J Surg Res. 2011;174:231---7.

9.Vollmar B, Menger MD. Intestinal ischemia/reperfusion: microcirculatorypathologyandfunctionalconsequences. Lan-genbecksArchSurg.2011;396:13---29.

10.Mallick IH, Yang W, Winslet MC, et al. Ischemia-reperfusion injuryoftheintestineandprotectivestrategiesagainstinjury. DigDisSci.2004;49:1359---77.

11.SutoY,OshimaK,ArakawaK,etal.Theeffectofnicorandilon smallintestinalischemia-reperfusioninjuryinacaninemodel. DigDisSci.2011;56:2276---82.

12.Cámara-LemarroyCR,Guzmán-delaGarzaFJ,Alarcón-Galván G,etal.TheeffectsofNMDAreceptorantagonistsover intes-tinal ischemia-reperfusion injury in rats. Eur J Pharmacol. 2009;621:78---85.

13.OrsenigoMN,PortaC,SironiC,etal.Effectsofcreatineina ratintestinalmodelofischemia-reperfusioninjury.EurJNutr. 2011;51:375---84.

14.FlessasII,PapaloisAE,ToutouzasK,etal.Effectsoflazaroids onintestinalischemiaandreperfusioninjuryinexperimental models.JSurgRes.2011;166:265---74.

15.ArumugamTV,ArnoldN,ProctorLM,etal.Comparative protec-tionagainstratintestinalreperfusioninjurybyanewinhibitor of sPLA2COX-1and COX-2selective inhibitors, and anLTC4 receptorantagonist.BrJPharmacol.2003;140:71---80. 16.HsiehYH,McCartneyK, MooreTA,etal. Intestinal

ischemia--reperfusioninjuryleadstoinflammatorychangesinthebrain. Shock.2011;36:424---30.

17.Margaritis EV, Yanni AE, Agrogiannis G, et al. Effects of oral administration of (l)-arginine (l)-NAME and allopurinol on intestinal ischemia/reperfusion injury in rats. Life Sci. 2011;88:1070---6.

18.AbdeenSM,MathewTC,DashtiHM,etal.Protectiveeffectsof greenteaonintestinalischemia-reperfusioninjury.Nutrition. 2011;27:598---603.

19.Rivera LR, Thacker M, Pontell L, et al. Deleterious effects ofintestinalischemia-reperfusioninjuryinthemouseenteric nervoussystemareassociatedwithproteinnitrosylation.Cell TissueRes.2011;344:111---23.

20.BallabeniV,BarocelliE,BertoniS,etal.Alterationsofintestinal motor responsiveness in a model of mild mesenteric ische-mia/reperfusioninrats.LifeSci.2002;71:2025---35.

21.Ługowska-Umer H, UmerA, Sein-AnandJ, et al. Endothelin receptorblockersprotectagainstischemia-reperfusion impair-ment of gastrointestinal motility in rats. Pharmacol Res. 2008;57:413---8.

22.ShimojimaN,NakakiT,MorikawaY,etal.Interstitialcellsof cajalindysmotilityinintestinalischemiaandreperfusioninjury inrats.JSurgRes.2006;135:255---61.

23.Ozacmak VH,SayanH,ArslanSO, etal. Protectiveeffectof melatonin on contractile activity and oxidative injury indu-ced by ischemia and reperfusion of rat ileum. Life Sci. 2005;76:1575---88.

24.YangQ,DongH,DengJ,etal.Sevofluranepreconditioning indu-cesneuroprotectionthroughreactiveoxygenspecies-mediated up-regulation of antioxidant enzymes in rats. Anesth Analg. 2011;112:931---7.

25.Obal D, Dettwiler S, Favoccia C, et al. The influence of mitochondrialKATP-channelsinthecardioprotectionof precon-ditioningandpostconditioningbysevofluraneintheratinvivo. AnesthAnalg.2005;101:1252---60.

26.AssadAR,DelouJM,FonsecaLM,etal.TheroleofKATP chan-nels onpropofolpreconditioninginacellular modelofrenal ischemia-reperfusion.AnesthAnalg.2009;109:1486---92.

27.Xiao YY, Chang YT, Ran K, et al. Delayed preconditio-ning by sevoflurane elicits changes in the mitochondrial proteome in ischemia-reperfused rat hearts. Anesth Analg. 2011;113:224---32.

28.Huang Z, Zhong X, Irwin MG, et al. Synergy of isoflurane preconditioningandpropofolpostconditioningreduces myocar-dialreperfusioninjuryinpatients.ClinSci(Lond).2011;121: 57---69.

29.ChoSSC, RudloffI, BergerPJ, et al. Remifentanil ameliora-tesintestinal ischemia-reperfusioninjury.BMC Gastroenterol. 2013;13:69---77.

30.HierholzerC,KalffJC,AudolfssonG,etal.Molecularand functi-onalcontractilesequelaeofratintestinalischemia-reperfusion injury.Transplantation.1999;68:1244---54.

31.CasiniAF,FerraliM,PompellaA,etal.Lipidperoxidationand cellular damage inextrahepatic tissuesof bromobenzene in toxicatedmice.AmJPathol.1986;123:520---31.

32.BradleyPP,PriebatDA,ChristensenRD,etal.Measurementof cutaneousinflammation:estimationofneutrophilcontentwith anenzymemarker.JInvestDermatol.1982;78:206---9. 33.GiaroniC,ZanettiE,GiulianiD,etal.Proteinkinasecmodulates

NMDAreceptorsinthemyentericplexusoftheguineapigileum duringinvitro ischemiaand reperfusion.Neurogastroenterol Motil.2011;23:e91---103.

34.DerT,BercikP,DonnellyG,etal.Interstitialcellsofcajaland inflammation-induced motor dysfunction in themouse small intestine.Gastroenterology.2000;119:1590---9.

35.AlicanI,YegenC,OlcayA,etal.Ischemia---reperfusion-induced delay in intestinal transit Role of endothelins. Digestion. 1998;59:343---8.

36.UdassinR,EimerlD,SchiffmanJ,etal.Postischemicintestinal motilityinratisinverselycorrelatedtolengthofischemia:an invivoanimalmodel.DigDisSci.1995;40:1035---8.

37.HassounHT,WeisbrodtNW,MercerDW,etal.Induciblenitric oxidesynthasemediatesgutischemia-reperfusion-inducedileus onlyaftersevereinsults.JSurgRes.2001;97:150---4.

38.HebraA,HongJ,McGowanKL,etal.Bacterialtranslocationin mesentericischemia---reperfusioninjury:isdysfunctional moti-litythelink?JPediatrSurg.1994;29:285---7.

39.Sayan H, Ozacmak VH, Altaner S, et al. Protective effects of l-arginine on rat terminal ileum subjected to ischemia--reperfusion.JPediatrGastroenterolNutr.2008;46:29---35. 40.BielefeldtK,ConklinJL.Intestinalmotilityduringhypoxiaand

reoxygenationinvitro.DigDisSci.1997;42:878---84.

41.SchoenbergMH,PochB,YounesM,etal.Involvementof neu-trophilsinpostischaemicdamagetothesmallintestine.Gut. 1991;32:905---12.

42.SayanH,OzacmakVH,SenF,etal.Pharmacological preconditi-oningwitherythropoietinreducesischemia-reperfusioninjury inthesmallintestineofrats.LifeSci.2009;84:364---71. 43.TianXF,YaoJH,ZhangXS,etal.Protectiveeffectofcarnosol

onlunginjuryinducedbyintestinalischemia-reperfusion.Surg Today.2010;40:858---65.

44.WongGT,LiR,JiangLL,etal.Remifentanilpost-conditioning attenuates cardiac ischemia-reperfusion injury viakappa or delta opioid receptor activation. Acta Anaesthesiol Scand. 2010;54:510---8.

45.ZattaAJ,KinH,YoshishigeD,etal.Evidencethat cardiopro-tectionbypostconditioninginvolvespreservationofmyocardial opioidcontentandselectiveopioidreceptoractivation.AmJ PhysiolHeartCircPhysiol.2008;294:H1444---51.

46.JangY,XiJ,WangH,etal.Postconditioningprevents reperfu-sioninjurybyactivatingdelta-opioidreceptors.Anesthesiology. 2008;108:243---50.