Rosa Maria Barilli Nogueira
Estudo dos aspectos clínico, laboratorial,
histopatológico e do tratamento na intoxicação
experimental pelo veneno da serpente Crotalus
durissus terrificus em cães
Botucatu - SP
2004
Rosa Maria Barilli Nogueira
Estudo dos aspectos clínico, laboratorial,
histopatológico e do tratamento na intoxicação
experimental pelo veneno da serpente Crotalus
durissus terrificus em cães
Botucatu – SP
2004
Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu, como requisito para obtenção do Título de Doutor em Medicina Veterinária, Área de Clínica Veterinária.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: SELMA MARIA DE JESUS
Nogueira, Rosa Maria Barilli.
Estudo dos aspectos clínico, laboratorial, histopatológico e do tratamento na intoxicação experimental pelo veneno da serpente “Crotalus durissus
terrificus” em cães / Rosa Maria Barilli Nogueira. – 2004.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, 2004.
Orientadora: Michiko Sakate Assunto CAPES: 21007004
1. Cobra venenosa – Veneno – Efeito fisiológico
CDD 615.942
Dedico este trabalho às minhas filhas Ana Luiza e Ana Beatriz,
Ao meu marido Anselmo Nogueira,
Meus pais Jaime Barilli e Adilce Barilli, minha irmã Juliana
Barilli,
E aos meus sogros Erondina Nogueira e Paulino Nogueira,
Pelo amor, compreensão, carinho e apoio constante.
À Prof.
aAss. Dr.
aMichiko Sakate,
Pelo exemplo de dedicação, pelo apoio, confiança, incentivo
e amizade construída.
Em especial ao meu querido e amado Pai
Que Deus o tenha ao seu lado, sempre, por toda a vida
Que seu novo caminho seja cheio de luz
Nossos momentos serão lembrados para sempre e a
saudade,...
será eterna.
Obrigado, Pai!
AGRADECIMENTOS
À Universidade do Oeste Paulista, em especial à pró-reitora Ana Cardoso Maia de Oliveira Lima pela ajuda financeira para realização da presente pesquisa.
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu, pela acolhida e oportunidade concedida para a realização do curso.
À seção de pós-graduação da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da UNESP, Campus de Botucatu, em especial aos funcionários Denise A. Fioravante Garcia e Maria Aparecida Dias de Almeida Manoel.
À seção de pós-graduação da Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE, Presidente Prudente, em especial aos funcionários Andréia G. Louzada Rascovitz e Ana Carla L. Giroti.
Ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) de Botucatu, pela doação do veneno de Crotalus durissus terrificus.
Aos docentes da Pós-graduação em Clínica Veterinária da FMVZ-UNESP-Botucatu, pelos ensinamentos e exemplos profissionais, Prof. Ass. Dr. Flávio Quaresma Moutinho, Prof.a Dr.a Helena, e Profa. Ass. Dra. Sônia R.V.S.
Franco. À Prof.a Ass. Dr.a Michiko Sakate pelo incentivo em todos os momentos
À querida amiga Silvia Franco Andrade, colega de trabalho, meu carinho, amizade e agradecimento ao companheirismo e incentivo de todos os momentos nesta árdua jornada.
A Profa. Dra. Luzia Trinca pelo auxílio na análise estatística dos dados.
Aos funcionários do Laboratório Clínico do Hospital Veterinário da Universidade do Oeste Paulista, pela realização dos exames laboratoriais e em especial a Dra. Cecília Braga Laposy e Ana Maria Siqueira Junqueira pela ajuda e amizade.
Ao Prof. Dr. Antônio Fluminhan Júnior do Laboratório de Genética pelo auxílio na confecção das fotos das lâminas.
Aos funcionários do serviço de Patologia da UNOESTE em especial Prof. Dr. Raimundo Alberto Tostes pelos esclarecimentos e leitura das lâminas de histopatologia.
Aos professores Luís Carlos Vianna e Colombo Guerra Carvalho Júnior pelo apoio e incentivo oferecido para realização desta pós-graduação.
À Farmácia do Hospital Veterinário da UNOESTE, em especial à farmacêutica Rosimeire Ramos Haddad, pela amizade e dispensação dos medicamentos necessários neste trabalho.
Aos funcionários e colegas de trabalho do Biotério Central da UNOESTE Agostinho, Célio, Claudemir, Irene, Francisco, Gilmar, Celso, Reinaldo, Márcia, Maria pelo apoio e compreensão, obrigada.
Às amigas e colegas da Clínica Médica de Pequenos Animais do Hospital Veterinário da UNOESTE, Profa. Msc. Alessandra Melchert, pela atenção e amizade, a Profa. Msc. Adriana Falco de Brito pela ajuda na correção do trabalho e incentivo em todos os momentos da realização deste projeto e ao Prof. Msc. Haroldo Alberti pelo apoio na confecção das fotos.
Aos colegas e funcionários do Hospital Veterinário da UNOESTE, pelos anos de convívio e incentivo ao trabalho todo meu carinho e reconhecimento.
À Médica Veterinária Fabíola Sangiorgio, pelo auxílio e companheirismo.
Aos alunos Marcos Meleiro e Thaís Lima Fanelli pelo auxílio, dedicação e eficiência indispensável à realização deste trabalho, meu carinho e agradecimento e a Ana Rita, muito obrigado, pelo auxílio nas fotos.
Aos funcionários da Divisão de Biblioteca e Documentação da UNESP – Campus de Botucatu pela presteza no atendimento e pela orientação quanto a bibliografia e confecção da ficha catalográfica.
Às bibliotecárias e aos funcionários da rede de bibliotecas da UNOESTE, que sempre me auxiliaram e atenderam com carinho, meu agradecimento e carinho.
SUMÁRIO
RESUMO ABSTRACT
1. INTRODUÇÃO... 2. REVISÃO DE LITERATURA...
2.1 Características da serpente... 2.2 Acidente ofídico... 2.3 As frações do veneno crotálico... 2.4 Os efeitos do veneno crotálico... 2.4.1 Efeitos neurotóxicos... 2.4.2 Efeitos miotóxicos e nefrotóxicos... 2.4.3 Efeitos coagulantes e hemolíticos... 2.4.4 Efeitos hematológicos e imunológicos... 2.4.5 Efeitos hepatotóxicos... 2.5 Achados anatomopatológicos... 2.6 Tratamento do acidente crotálico... 3. MATERIAL E MÉTODOS...
3.1 Local... 3.2 Animais... 3.2.1 Seleção dos animais... 3.2.2 Manejo dos animais... 3.3 Delineamento experimental...
3.3.1 Grupos experimentais... 3.3.2 Momentos... 3.4 Inoculação do veneno e soroterapia... 3.5 Colheita de material... 3.5.1 Sangue total... 3.5.2 Hemogasometria... 3.5.3 Urina... 3.5.4 Medula óssea...
3.6 Exames laboratoriais... 3.6.1 Hemograma... 3.6.2 Exames bioquímicos... 3.6.3 Tempo de coagulação... 3.6.4 Urinálise... 3.6.5 Medula óssea...
3.6.6 Tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcial ativado...
3.6.7 Fibrinogênio... 3.6.8 Eletrocardiograma... 3.6.9 Pressão arterial sistólica... 3.6.10 Histopatologia... 3.6.11 Hemogasometria... 3.7 Análise estatística... 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO...
4.1 Considerações iniciais... 4.2 Observações clínicas... 4.3 Hemograma...
4.3.1 Eritrograma... 4.3.2 Leucograma... 4.4 Plaquetas... 4.5 Tempo de coagulação e fibrinogênio...
4.6 Tempo de protrombina e tempo de tromboplastina parcial ativada...
4.7 Urinálise... 4.8 Bioquímico... 4.9 Hemogasometria... 4.10 Pressão arterial sistólica... 4.11 Eletrocardiograma... 4.12 Mielograma... 4.13 Histopatologia...
48 48 48 49 49 50
50 51 51 52 54 55 55 56 56 57 71 71 76 82 84
5. CONCLUSÕES... 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... ANEXO...
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
% - porcento (+) – uma cruz (++) – duas cruzes (+++) – três cruzes
± - mais ou menos
50x- aumento de 50 vezes 100x – aumento de 100 vezes 400x – aumento de 400 vezes bmp – batimentos por minuto ppm – pulsações por minuto mpm – movimentos por minuto dL – decilitro
EDTA – etileno-diamino-tetracético FC – freqüência cardíaca
FR – freqüência respiratória SAB – soro antibotrópico SAC – soro anticrotálico
SABC – soro antibotrópico crotálico AV - após veneno
AT – após tratamento g – grama
GI – grupo I GII – grupo II GIII – grupo III kg – quilograma L – litro
mg – miligrama mL – mililitro mm – milímetro 0C – graus Celsius P25 – percentil 25 P75 – percentil 75 x – vezes
h – horas M – macho F – fêmea
RP – reações precoces RT - reações tardias TP – tempo de protrombina
TTPA – tempo de tromboplastina parcial ativada µL – microlitro
µg – micrograma
HE – hematoxicilina eosina IL – interleucina
IFN-g – interferon gama
RESUMO
O presente trabalho teve por objetivo avaliar os aspectos clínico, laboratorial, histopatológico e tratamento na intoxicação experimental com o veneno da serpente Crotalus durissus terrificus em cães. Foram utilizados 21
cães, adultos, sem raça definida, divididos em três grupos com sete animais: grupo I – somente veneno; grupo II – veneno + cinco ampolas de soro antiofídico + fluidoterapia; grupo III – veneno + cinco ampolas de soro antiofídico + fluidoterapia + alcalinização da urina. O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus
liofolizado e reconstituído em solução salina foi inoculado pela via subcutânea, na dose de 1mg/kg de peso vivo, na face lateral da coxa do membro posterior esquerdo dos cães dos grupos I, II e III. Os animais foram submetidos às avaliações clínica, hematológica, hemostática, urinálise, bioquímica sérica, hemogasometria, pressão arterial sistólica, eletrocardiograma e mielograma. Três animais de cada grupo foram eutanasiados e foram colhidas amostras do tecido muscular para avaliação histopatológica. Os resultados mostraram a eficácia da soroterapia na neutralização do veneno e mostrou que o veneno da serpente
Crotalus durissus terrificus provoca alterações clínica, hematológica, hemostática,
de urinálise, hemogasométrica, da pressão arterial sistólica, do mielograma e histopatológica nos cães. Não houve evidências de alterações eletrocardiográficas e bioquímica.
Palavras-chave: Crotalus durissus terrificus, cães, avaliação laboratorial, avaliação
clínica, histopatologia.
NOGUEIRA, R. M. B. Estudos dos aspectos clínico, laboratorial, histopatológico e do tratamento na intoxicação experimental pelo veneno da serpente Crotalus
durissus terrificus em cães. Botucatu, 2004,176p. Tese de Doutorado em
ABSTRACT
This work evaluated the clinical, laboratorial, histological and treatment in the experimental intoxication with the venom of the Crotalus durissus terrificus snake
in dogs. Twenty-one adults (mixed breed) dogs divided in three groups with seven animals were used: group I - only venom; group II - venom + five bladders of anti-ophidic serum + fluid therapy; group III - venom + five bladders of anti-anti-ophidic serum + fluid therapy + alkalization of the urine. The lyophilized venom of the
Crotalus durissus terrificus snake was reconstituted in saline solution and
inoculated subcutaneous, in the dose of 1mg/kg B.W., in the lateral face of the left thigh of the dogs of the groups I, II and III. The animals were submitted to clinical, hematological evaluation, hemostatic, urinalysis, biochemical, blood gas analysis, systolic arterial pressure, electrocardiogram and mielograma. Three animals of each group were eutanasied and samples from the muscular tissue and popliteal lymphonode were collected for hitopatological evaluation. The results showed the effectiveness of the serum therapy in the neutralization of the venom and it showed that the venom of the Crotalus durissus terrificus snake causes clinical,
hematological, hemostatic, of urinary, hemogasometric changes, of the systolic arterial pressure, of the mielograma and histopathological in the dogs. There were no evidences of alterations eletrocardiografic and biochemical alterations.
Keywords: Crotalus durissus terrificus, dogs, laboratorial evaluation, clinical
evaluation, histopathology.
NOGUEIRA, R. M.B. Study of clinical, laboratorial, histopathological and treatment aspects in the experimental intoxication with the venom of the Crotalus durissus
terrificus snake in dogs. Botucatu, 2004,176p. Thesis Doctorate in Veterinary
Acidentes ofídicos acarretam um problema médico relevante em nosso país devido à alta toxicidade dos venenos das serpentes encontradas e à letalidade provocada pelos acidentes (Araújo & Belluomini., 1960-62).
Vital Brazil, médico veterinário sanitarista, residente em Botucatu, no início do século 20, perante ao grande número de acidentes com serpentes peçonhentas, passou a realizar estudos com os venenos ofídicos. Baseando-se nos primeiros dados experimentais obtidos pelo francês Albert Calmitte, descobriu a especificidade do soro contra o veneno de serpentes, isto é, cada tipo de veneno ofídico requer um soro específico preparado com o veneno do mesmo gênero de serpente que causou o acidente (Vital Brazil et al, 1966).
As vacinas e soros são produtos de origem biológica (chamados imunobiológicos) usados na prevenção e tratamento de doenças. O soro contém os anticorpos necessários para combater uma determinada doença ou intoxicação, sendo assim, considerado curativo (Vital Brazil, 1972).
O gênero Crotalus é considerado de maior importância médica, tanto em
humanos quanto em animais, pela gravidade do quadro clínico que provoca em muitos casos, podendo ser fatal principalmente quando o tratamento com soro específico não é instituído precocemente (Araújo & Belluomini, 1960-62). O veneno crotálico é considerado mais tóxico que o veneno das serpentes do gênero
Bothrops (Belluomini, 1984).
Belluomini et al. (1987) analisaram 2.757 prontuários do Hospital Vital Brazil, relativos a atendimentos feitos em humanos durante o ano de 1983. Dos casos atendidos, 44% foram devido ao gênero Bothrops, 3,4% por Crotalus, 0,2%
por Micrurus e 52,3% por serpentes não peçonhentas ou casos em que não houve
confirmação de picada.
Na veterinária, há escassez de dados sobre o número de animais acometido por acidentes ofídicos, espécie animal mais acometida, regiões
geográficas envolvidas e taxa de letalidade nestes acidentes. Alguns Centros possuem dados referentes aos atendimentos feitos em hospitais veterinários na sua região, como é o caso do Hospital Veterinário de Botucatu-SP (Bicudo, 1994).
Araújo & Belluomini (1960-62) verificaram que, para cães, o limiar da dose letal de venenos ofídicos está ao redor de 1mg de veneno por quilo de peso corporal.
O veneno crotálico exerce três ações principais: neurotóxica, miotóxica e coagulante além de uma ação hemolítica “in vitro”. As frações que constituem o
veneno são muito solicitadas para estudos, pois apresentam um grande número de proteínas farmacológica e bioquimicamente ativas (Varanda & Giannini, 1994). No entanto, poucos são os trabalhos que referem as alterações clínicas e laboratoriais em animais picados por serpente crotálica.
O acidente crotálico manifesta-se com alterações locais discretas, mas exibe quadro sistêmico que pode ser muito grave na maioria dos casos (Azevedo-Marques et al., 1987).
Face à escassez de maiores informações a respeito dos quadros clínico, laboratorial e dos outros efeitos do envenenamento crotálico em cães, este trabalho teve por objetivos:
Objetivo geral:
• Estudos dos aspectos clínico, laboratorial, histopatológico e do tratamento na intoxicação experimental pelo veneno da serpente Crotalus durissus
terrificus em cães.
Objetivos específicos:
• avaliar as possíveis alterações clínicas e laboratoriais em cães intoxicados experimentalmente com o veneno da serpente Crotalus durissus terrificus;
• avaliar as possíveis alterações clínicas e laboratoriais em cães submetidos à intoxicação experimental com o veneno da serpente Crotalus durissus
terrificus e submetidos a dois diferentes protocolos terapêuticos:
1. soro antiofídico botrópico-crotálico + fluidoterapia;
• avaliar as possíveis alterações morfológicas em cães intoxicados experimentalmente com o veneno da serpente Crotalus durissus
terrificus e tratados com os diferentes protocolos terapêuticos acima
citados.
• avaliar a eficácia do soro antiofídico (botrópico-crotálico) na neutralização do veneno crotálico e a associação com tratamentos complementares como a fluidoterapia e alcalinização da urina.
Por meio da realização de:
• hemograma com contagem de plaquetas;
• tempos de coagulação, de protrombina, de tromboplastina parcial ativada e fibrinogênio;
• urinálise;
• determinação dos níveis séricos de uréia e creatinina; • mielograma;
• hemogasometria; • pressão arterial; • eletrocardiografia;
2.1 CARACTERÍSTICAS DA SERPENTE
As serpentes fazem parte de um grupo de répteis que, segundo Bellairs & Underwood (1951), surgiram como formas aquáticas e em seguida emergiram para terra. Rage (1987) relata que as serpentes eram formas escavadoras.
As serpentes são encontradas em quase todo globo terrestre sendo mais freqüentes nas regiões tropicais e sub-tropicais por serem pecilotérmicos (Jim & Sakate, 1994)
As serpentes do gênero Crotalus encontradas no Brasil apresentam
características consideradas também em outras serpentes peçonhentas da família Viperidae, como cabeça triangular, olhos pequenos com pupilas em fendas e um par de fossetas loreais situado entre as narinas e a boca. A referida fosseta funciona como detector térmico muito sensível, captando também as vibrações do ar, por intermédio da membrana que reveste o septo entre suas duas câmaras (Noble & Schmidt, 1937). Possuem escamas na cabeça, dentes inoculadores de veneno e são chamadas de Solenóglifas (Jorge & Ribeiro, 1990; Barraviera, 1994). Possuem, na extremidade da cauda, guizo ou chocalho característico em forma de gomos ou anéis que está relacionado ao número de mudas de pele (Belluomini, 1984).
No Brasil, são encontradas seis subespécies de serpentes do gênero
Crotalus: Crotalus durissus terrificus (FIGURA 1), Crotalus durissus collilineatus,
Crotalus durissus cascavella, Crotalus durissus ruruima, Crotalus durissus
marajoensis e Crotalus durissus trigonicus (Sakate, 2002).
A Crotalus durissus terrificus é encontrada desde o Rio Grande do Sul até
Minas Gerais sendo conhecida popularmente por cascavel, cascavel-quatro-ventas, boicininga, maracambóia, maracá e outras denominações populares (Sakate, 2002).
As serpentes do gênero Crotalus encontram-se, de modo geral, em campos
abertos, áreas secas, arenosas e pedregosas, encostas de morro, cerrados e raramente na faixa litorânea ou nas florestas úmidas (Jorge & Ribeiro, 1992; Jim & Sakate, 1994).
2.2 ACIDENTE OFÍDICO
Em 1986, o Ministério da Saúde tornou obrigatória a notificação dos acidentes ofídicos humanos e, assim, foi observado que no Estado de São Paulo, no período compreendido de 1986 a 1988, as serpentes do gênero Crotalus foram
responsáveis por 13,6% dos acidentes (Jorge & Ribeiro, 1990).
No período de janeiro de 1990 a dezembro de 1993, os acidentes ofídicos notificados ao Ministério da Saúde somaram 81.611 casos, e representou uma média de 20.000 casos/ano para o Brasil. A maioria das notificações originou das regiões Sudeste e Sul. Das 81.611 notificações analisadas, 90,5% dos acidentes foram provocados por serpentes do gênero Bothrops, 7,7% do gênero Crotalus,
1,4% do gênero Lachesis e 0,4% do gênero Micrurus (Brasil, 1998). A análise
sobre a letalidade mostrou que o maior índice recaiu sobre acidentes crotálicos.
Na veterinária, apesar de não haver obrigatoriedade da notificação dos acidentes, encontram-se dados referentes à investigação e ao levantamento epidemiológico por parte de algumas instituições brasileiras. Assim, em um estudo retrospectivo dos dados dos prontuários de atendimento no período de 1972 a 1989 junto ao Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP – Campus de Botucatu, computaram-se 149 acidentes ofídicos, sendo 128 causados por Bothrops, 11 por Crotalus e 10 sem
identificação. Dentre os acidentes, 103 ocorreram em caninos, 22 em eqüinos, 17 em bovinos, quatro em caprinos, dois em felinos e um em suíno (Bicudo, 1994).
2.3 AS FRAÇÕES DO VENENO CROTÁLICO
A quantidade de veneno inoculada no ato da picada depende de fatores como o tamanho da serpente, tempo decorrido entre uma picada e outra, idade da serpente, e o local da picada (Araújo & Belluomini, 1960-62). Portanto, não existem dados precisos a respeito da dose de veneno inoculada, uma vez que a quantidade de veneno obtida por extração nem sempre reflete as condições naturais.
Em um estudo realizado por Rosenfeld et al. (1960-62), a quantidade máxima extraída de 75% das serpente do gênero Crotalus durissus terrificus, que
foram recebidas no Instituto Butantan, foi de 50 mg, sendo que existe grande probabilidade desta quantidade ser inoculada no ato da picada em 75% dos acidentes.
As principais frações do veneno crotálico são: crotoxina, crotamina, giroxina e convulxina (Moura Gonçalves & Vieira, 1950; Barrio, 1961; Prado-Franceschi & Vital Brazil, 1981; Roodt et al. 1996). Cerca de 50% da fração do veneno é o complexo molar de proporção 1:1 denominado crotoxina. Esta é formada por uma fração básica, chamada crotoxina B, com atividade fosfolipase A2, e uma fração
ácida chamada crotoxina A ou crotapotina, sem atividade enzimática (Puig et al., 1995; Roodt et al., 1996). Nenhuma das duas substâncias separadas possuem ação tóxica, somente a crotoxina B em doses elevadas pode mostrar algum efeito tóxico.
A fração crotoxina produz efeitos tanto no sistema nervoso central (SNC) como no sistema nervoso periférico (SNP) (Saliba et al., 1983). Causa lesões na junção neuromuscular e fibras musculares, provocando bloqueio periférico da transmissão neuromuscular, podendo levar o paciente a óbito por paralisia respiratória, provavelmente, por atuar em canais iônicos desencadeando falhas na liberação de acetilcolina na pré-sinapse (Vital Brazil, 1972; Okamoto et al., 1983).
As neurotoxinas são classicamente divididas em pré e pós-sinápticas, e estudos revelam que algumas neurotoxinas produzem redução do número de vesículas sinápticas do terminal motor das junções neuromusculares. Estes distúrbios podem estar relacionados ao mecanismo de reciclagem da membrana axolemal, durante os fenômenos de reconstituição das vesículas sinápticas ou à atividade fosfolipásica (Dal Pai & Neto, 1994).
A maior parte dos venenos ofídicos possui atividade fosfolipásica e, sendo a bainha de mielina constituída de lipídios, pode-se admitir que, dependendo da concentração dessa enzima, as lesões de componentes nervosos intramusculares podem ocorrer. Alguns autores, como Dempster et al. (1980) e Gopalakrishnakone et al. (1984), relatam que após quatro a seis horas da inoculação da crotoxina são observadas lesões subsarcolêmicas com edema intramitocondrial e, após 24 a 48h, as mitocôndrias apresentam depósitos densos, com elevada concentração de cálcio. Na inoculação de fosfolipase A2, observou-se necrose com qualquer dose
embora mais graves, são as mesmas provocadas pela fosfolipase A2 (Kini & Evans
1989).
A crotamina, um polipeptídeo básico, é muito menos tóxica que a crotoxina e ativa canais de sódio quase que exclusivamente na membrana celular e nas fibras do músculo esquelético, induzindo um influxo desse cátion (Slotta & Fraenkel-Conrat,1938; Moura-Gonçalves & Vieira, 1950; Chang & Tseng, 1978). Outro dado importante da crotamina recai sobre a sua potente ação analgésica, muitas vezes comparada à morfina, observada primeiramente em ratos (Hudelson & Hudelson, 1995; Mancin et al., 1998).
A convulxina induz a síntese de tromboxano A2, potente agregante
plaquetário, e conseqüentemente causa agregação plaquetária ou aglutinação plaquetária in vitro (Barraviera, 1994; Francischetti et al., 1997). Outros sinais
clínicos atribuídos à convulxina são o aparecimento de convulsões, perturbações circulatórias e respiratórias (Amaral et al., 1991),
A giroxina é uma substância que produz sintomas labirínticos e não é considerada letal (Barrio, 1961).
O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus possui como principais
ações: neurotóxica (Vital Brazil, 1972; Vital Brazil, 1980), miotóxica (Azevedo-Marques, et al., 1985; Magalhães et al., 1986), coagulante (Amaral et al.,1988) e hemolítica “in vitro” (Rosenfeld et al., 1960-62).
2.4 OS EFEITOS DO VENENO CROTÁLICO
Os efeitos decorrentes da intoxicação crotálica podem ser divididos em efeitos locais e sistêmicos. O local da picada deve ser inspecionado e pode variar de simples arranhão até uma marca puntiforme única ou dupla. Na maioria das vezes não é observada reação local, embora um pequeno edema e dor local possam estar presentes. Um relato de caso apresentado por Nishioka et al. (2000) descreve um caso de acidente ofídico por Crotalus durissus que apresentou como
complicação rara. Os efeitos sistêmicos são bem caracterizados e são de grande importância e de gravidade preocupante (Nishioka et al. 2000).
2.4.1 EFEITOS NEUROTÓXICOS
Os efeitos neurotóxicos mais comumente observados na intoxicação crotálica são os transtornos de locomoção, fasciculações, flacidez da musculatura da face, ptose palpebral, alteração do diâmetro pupilar, oftalmoplegia, disfagia e dificuldade de fonação além de sialorréia, vômitos e diarréia (Araújo & Belluomini, 1960-62; Azevedo-Marques et al., 1987; Barraviera, 1994).
Ratas inoculadas com veneno de Crotalus durissus terrificus manifestaram
alterações neurológicas com ptose palpebral e midríase bilateral, dificuldade respiratória, insensibilidade e paralisia progressiva (Perez et al., 1997a).
Koscinczuk et al. (2000) relatam casos de dois cães picados por cascavel e revelam que sinais neurológicos como ptose palpebral, anisocoria e sialorréia foram evidentes poucos minutos após o acidente. Lago et al. (2000) também relatam, em trabalho de intoxicação experimental em bovinos, um quadro clínico neurotóxico no qual se observaram na segunda hora de evolução: apatia, cabeça baixa, letargia profunda e edemaciação discreta no local da inoculação, na sexta hora o quadro evoluiu para mioclonias e na décima hora incoordenação motora e decúbito esternal.
Em outro trabalho são relatados os acidentes crotálicos em 31 crianças em que 27 apresentaram ptose palpebral, 23 mialgia e 20 delas fraqueza (Bucaretchi et al., 2002).
Oliveira et al. (2003) descreveram quatro envenenamentos por Crotalus
durissus da região norte no Estado do Pará, onde todos os pacientes
apresentaram visão escura e ptose palpebral bilaterais.
2.4.2 EFEITOS MIOTÓXICOS E NEFROTÓXICOS
Alguns autores revelaram o efeito miotóxico do veneno de Crotalus durissus
terrificus produzindo lesões em fibras musculares esqueléticas,
predominantemente sobre fibras do tipo I, com liberação de mioglobina e elevação de enzimas marcadoras de lesão muscular como creatinaquinase (CK), lactato desidrogenase (LDH) e aspartato aminotransferase (AST) (Azevedo-Marques et al., 1982; Magalhães et al., 1986; Hudelson & Hudelson, 1995; Jorge & Ribeiro, 1992).
Magalhães et al. (1986) relatam dois casos de rabdomiólise secundária a envenenamento produzido por Crotalus durissus terrificus, com sinais de mialgia
intensa e generalizada e constatação de níveis séricos elevados de CK, AST e LDH, com confirmação do diagnóstico pela detecção de mioglobina no soro por meio de imunoeletroforese e de biópsia muscular. Além dos achados laboratoriais, a biópsia muscular também pôde contribuir de forma importante na confirmação de rabdomiólise (Rossi et al., 1989).
Há referências sobre estudos experimentais quanto à ação miotóxica local da crotoxina e da crotamina em camundongos com necrose de coagulação, necrose miolítica ou combinação de ambas (Hudelson & Hudelson, 1995).
Siqueira et al. (1990) relatam um caso de lesão miocárdica em uma mulher que apresentou, ao exame histológico, alterações de fibras cardíacas que variaram desde microvacuolizações até formação de massas amorfas no interior de fibras cardíacas.
Em estudo realizado em bovinos, por Soerensen et al. (1995), é relatado um quadro de congestão e discreta hemorragia no local da inoculação do veneno crotálico.
Perez et al. (1997a) relatam que em estudo experimental com inoculação do veneno de Crotalus durissus terrificus houve danos em tecido muscular
Um relato de caso, sobre acidente crotálico em um cão na Argentina mostra edema de tecido conjuntivo no músculo injetado e muitas fibras musculares com necrose. No membro contralateral, pôde ser observada mionecrose entre fibras de músculo normais (Koscinczuk et al., 2000).
Salvini et al. (2001), em estudo experimental com ratos, sugeriram uma ação sistêmica e seletiva da crotoxina em musculatura ou regiões de músculos compostos por fibras do tipo I ou IIA.
Em 2002, Bucaretchi et al. relataram que, em 31 crianças atendidas vítimas do acidente crotálico, foram observadas várias alterações sugerindo rabdomiólise, sendo que 28 delas apresentaram aumento da CK, 25 aumento de LDH e 14 delas mioglobinúria.
A ação miotóxica provoca mialgias que podem aparecer precocemente. A fibra muscular esquelética lesada libera quantidades variáveis de mioglobina, inicialmente interpretada como sendo hemoglobina, acarretando em mioglobinúria, e conferindo-lhe uma cor avermelhada ou de tonalidade mais escura até o marrom (Amorim et al., 1969).
As alterações renais foram verificadas por Amorim & Mello (1952), após autopsiarem doentes picados por cascavel. Em 1969, Amorim et al. induziram, experimentalmente, lesões renais em cães com a inoculação de veneno crotálico.
Em 1978, Rovere et al. relataram que o veneno crotálico reduz de maneira significativa o fluxo sangüíneo cortical renal e, 35 minutos após a injeção do veneno foi observada trombose dos capilares glomerulares, o que sugere a diminuição da irrigação cortical e contribuição para a instalação da insuficiência renal aguda.
A ação indireta do veneno sobre as células renais seria em decorrência da mioglobinúria secundária a rabdomiólise, que levaria à obstrução tubular por cilindros de mioglobina e lesão tóxica direta nos túbulos (Magalhães et al., 1986; Soerensen, 1990).
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, desenvolveram necrose tubular aguda, sendo que dois deles necessitaram de métodos dialíticos. Bucaretchi et al. (2002) também relataram que três crianças, de um total de seis, atendidas após seis horas do acidente crotálico evoluíram para insuficiência renal aguda, sendo que duas delas necessitaram hemodiálise.
Em 1986, Magalhães et al. citaram dois casos de acidente crotálico em que um paciente desenvolveu, como complicação do acidente, quadros clínico e laboratorial de insuficiência renal aguda com instalação de hipotensão arterial, hipocalcemia e hiperfosfatemia grave na fase oligúrica.
Em trabalho experimental em ratas com o veneno crotálico, foram observados, em tecido renal, sinais de congestão cortical a partir de três horas, e nas próximas 24 h a congestão estendeu-se às zonas justaglomerulares com escassa quantidade de cilindros hialinos (Perez et al., 1997a).
Um trabalho, realizado por Monteiro et al. (2001), demonstrou que o veneno
de Crotalus durissus terrificus e a crotoxina, seu principal componente, causam
nefrotoxicidade aguda em rato, e sugerem que as alterações renais possam ser o resultado de uma ação direta ou liberação de mediadores em tecido renal. Martins et al. (2002) também relatam que a crotoxina é o componente principal responsável pela nefrotoxicidade causada pelo veneno de Crotalus durissus.
Outros fatores como desidratação, hipotensão arterial, acidose metabólica e choque podem contribuir para a instalação da lesão renal (Lopez et al., 1972; Soeresen, 1990). As lesões renais quando instaladas podem provocar oligúria e anúria com elevação dos níveis de uréia, creatinina, ácido úrico, fósforo e potássio séricos, levando o paciente à morte por insuficiência renal aguda com necrose tubular (Azevedo & Teixeira, 1938; Rosenfeld, 1971; Amaral et al., 1986).
2.4.3 EFEITOS COAGULANTES E HEMOLÍTICOS
Rosenfeld et al. (1960-62) e Kelen et al. (1960-62) observaram que os venenos das serpentes dos gêneros Bothrops e Crotalus causaram hemólise “in
vitro”, quando colocados em contato com hemácias de diferentes espécies animais. Com relação ao número de plaquetas, geralmente não há redução do seu número “in vivo”, mas ocorre indução de agregação plaquetária “in vitro” (Jorge & Ribeiro, 1988).
As alterações de coagulação sangüínea ocorrem devido ao veneno crotálico possuir uma fração do “tipo trombina” (Nahas et al., 1964; Raw et al., 1986), capaz de converter o fibrinogênio diretamente em fibrina, levando o doente a uma afibrinogenemia (Amaral et al., 1980). O consumo do fibrinogênio pode levar a aumentos no tempo de coagulação e incoagulabilidade sangüínea, além de aumentos no tempo de protrombina e tromboplastina parcial (Amaral et al., 1988; Barraviera, 1990).
Um trabalho de levantamento de 43 casos, atendidos no período de 1988 a 1993, relata que 91,9% dos pacientes humanos apresentaram alteração de coagulação (Ribeiro et al., 1998).
Em bovinos, foi relatado aumento no tempo de coagulação nas primeiras oito horas após a intoxicação crotálica (Soerensen et al., 1995) e, mesmo com as alterações de coagulação, a presença de sangramento em indivíduos acidentados
com Crotalus é baixa (Jorge & Ribeiro, 1992; Nogueira, 2001).
Barraviera (1993) demonstrou, em estudo clínico nos pacientes acidentados
com Crotalus, a ausência de anemia e, em sete deles (43,75%), observou um
quadro de incoagulabilidade sangüínea.
Em estudo realizado por Nogueira (2001), em cães intoxicados experimentalmente com veneno crotálico, foi observada incoagulabilidade sangüínea, em 100% dos animais, seis horas após intoxicação, com uma média de recuperação de seis horas após a soroterapia.
2.4.4 EFEITOS HEMATOLÓGICOS E IMUNOLÓGICOS
As alterações hematológicas encontradas no acidente crotálico estão relacionadas aos eritrócitos e leucócitos (Kelen et al, 1960-62; Slotta & Borchet, 1954; Costa et al., 1989).
Wajchenberg et al. (1954-55), estudando doentes picados por serpentes do gênero Crotalus, observaram o hemograma de um doente que evoluiu para óbito.
Neste paciente, foram encontrados 35.000 leucócitos por mm3 com a seguinte
contagem diferencial: metamielócitos=3.255/mm3, bastonetes=9.100/mm3, segmentados=21.000/mm3, eosinófilos=zero, linfócitos=735/mm3 e monócitos=210/ mm3. Em outros seis doentes, os valores totais de leucócitos
variaram de 12.700 a 35.000/mm3.
Barraviera (1993) cita a semelhança dos achados de seu estudo com àqueles de Wajchenberg et al. (1954-55), e propõe que os venenos ofídicos, especialmente os de Crotalus durissus terrificus, atuem sobre o sistema imune,
podendo ser o responsável por grande parte das alterações observadas nos glóbulos brancos.
Venenos induzem resposta inflamatória aguda, provavelmente na tentativa de remover o agente agressor (veneno inoculado), no entanto, esta reação provoca também danos teciduais. A lesão tecidual pode estar relacionada com a produção de vários mediadores, como a liberação de citocinas dentre outros. Pode ser observada, em pacientes picados, a síndrome da resposta inflamatória sistêmica, caracterizada por reação de fase aguda, e que inclui taquicardia, taquipnéia, hipotermia ou hipertermia, leucocitose, distúrbios de coagulação e aumento de proteína C reativa. A presença destes sinais também pode ser explicada pela liberação de citocinas, já que muitas destas induzem efeitos semelhantes (Barraviera, 1994; Barraviera e Peraçoli, 1994).
Nos quadros de envenenamentos, as principais citocinas envolvidas na reação inflamatória são IL-1, IL-6, IL-8 e TNF-α além do IFN- e IL-10. As citocinas
células locais como fibroblastos, macrófagos e células endoteliais a liberarem a segunda onda de citocinas que amplificam o sinal inflamatório (Barraviera, 1994).
Barraviera et al. (1995) demonstraram o aumento de mucoproteínas, proteína C reativa, diminuição de proteínas séricas e albumina e aumento de IL-1, IL-6 e IL-8, principalmente em acidentes por serpentes do gênero Crotalus.
Em trabalho realizado por Cardoso et al. (2001), é sugerido que a crotoxina, como parte do veneno da Crotalus durissus terrificus, possa induzir mecanismos
endógenos, sendo em parte responsável pelas respostas inflamatória e imune.
Costa et al. (1989), em estudo realizado com ratos wistar, observaram um quadro de leucopenia 30 minutos após a inoculação do veneno crotálico, seguida de leucocitose com neutrofilia.
Azevedo-Marques et al. (1990) encontraram um quadro de leucocitose por neutrofilia com desvio à esquerda, que foi encontrada também no acidente crotálico por outros autores como Barraviera, 1990, Rosenfeld, 1991, Jorge & Ribeiro, 1992 e Barraviera, 1993.
Nogueira (2001), em estudo realizado com cães, encontrou um quadro de leucocitose com neutrofilia 24 horas após a inoculação do veneno crotálico, concordando com os achados de Azevedo-Marques et al. (1990) e Barraviera (1990). No mesmo estudo também foram observadas diminuições do número de eritrócitos, hemoglobina e volume globular, possivelmente pela ação hemolítica do veneno.
2.4.5 EFEITOS HEPATOTÓXICOS
As alterações hepáticas no humano foram propostas pela primeira vez por Barraviera et al. (1989), que demonstraram de maneira bastante convincente a hepatotoxicidade do veneno da Crotalus durissus terrificus. Em seres humanos, as
alterações devem-se a dois mecanismos: lesão de mitocôndrias e efeito de citocinas, principalmente interleucina 6 e 8 nos hepatócitos (Barraviera, 1991).
havendo neste aumento uma correlação positiva com os níveis séricos de alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase na maioria dos doentes.
Perez et al. (1997b) relatam que, após a inoculação do veneno crotálico em ratas, foi encontrado comprometimento do tecido hepático com congestão e dilatação de grandes vasos sangüíneos. Os sinusóides periféricos apresentaram hemossiderina em 24 horas e pequenas vênulas continham trombos.
2.5 ACHADOS ANATOMOPATOLÓGICOS
Alguns autores estudaram o efeito da crotoxina, crotapotina e da fosfolipase A2 sobre a musculatura esquelética de animais. Os autores observaram que as
alterações anatomopatológicas decorrentes da inoculação de crotoxina ocorrem quatro a seis horas após a inoculação, e são lesões subsarcolêmicas, com edema intramitocondrial e densos depósitos com elevada concentração de cálcio. As alterações decorrentes da inoculação de fosfolipase A2 levam ao aumento do peso
muscular e necrose. A inoculação de crotapotina não evidenciou lesões histológicas (Dempster et al., 1980; Gopalakrishnakone et al., 1984).
Alterações anatomopatológicas foram relatadas em 16 bovinos intoxicados experimentalmente por veneno da Crotalus durissus terrificus sendo observadas
lesões hemorrágicas no sistema nervoso central, necrose arteriolar hialina no cérebro e nos pulmões em 43% dos animais, e lesão renal foi caracterizada por presença de glomerulonefrite focal em 31% dos casos. No local da inoculação do veneno, foram observadas resposta inflamatória na camada dermal e grave miosite purulenta. Alterações hepáticas e do miocárdio foram degenerativas, representadas por degeneração hidrópica e esteatose (Belluomini et al., 1983).
Azevedo-Marques et al. (1985) relatam mionecrose no local da picada por
Crotalus com desintegração miofibrilar, desorganização e lise de miofilamentos,
múltiplas da mucosa esofágica, gástrica e duodenal, edema cerebral, rabdomiólise e broncopneumonia.
Siqueira et al. (1990) relatam microvacuolização, até com formação de massas amorfas, no interior de fibras cardíacas, necrose maciça e contração presente na camada média das artérias coronárias atribuídas a vasoespasmos.
Alterações hepáticas, induzidas experimentalmente pela administração de veneno crotálico, tais como hiperemia em coelhos, ratos e cães ocorrem com hiperemia. A ocorrência de trombos em ramos venosos portais em cães foram citadas por Amorim et al. (1951), e degeneração hidrópica, esteatose hepática e necrose miocárdica em bovinos citados por Saliba et al. (1983).
Barraviera et al. (1995) relatam um quadro de degeneração hidrópica e lesões mitocondriais hepáticas em um paciente humano que, após acidente crotálico, veio a óbito.
Um estudo realizado com ratos demonstrou que o veneno de Crotalus
durissus terrificus após ser inoculado, via subcutânea, na região do coxim plantar
causou um infiltrado inflamatório rico em leucócitos polimorfonucleares e neutrófilos ao redor de fibras nervosas sem a presença de hemorragia (Perez et al., 1998).
2.6 TRATAMENTO DO ACIDENTE CROTÁLICO
Segundo Murtaugh & Kaplan (1992), vários fatores podem contribuir para a gravidade do acidente ofídico, dentre estes, encontram-se a variação individual (idade, peso, condições gerais do organismo), a quantidade de veneno inoculada, o número de picadas, o local atingido e o tempo decorrido até o tratamento.
discreta ou evidente, mialgia discreta, urina vermelha ou marrom pouco evidente ou ausente, oligúria ou anúria ausente e tempo de coagulação normal ou com sinais de alteração. Acidentes considerados graves geralmente apresentam fácies miastênicas e visão turva evidentes, mialgia intensa, urina vermelha ou marrom presente, oligúria ou anúria presente ou ausente e tempo de coagulação com sinais de alteração.
A confirmação laboratorial do acidente pode ser feita através de antígenos do veneno crotálico, que podem ser detectados no sangue através da técnica de ELISA (Pereira, 2001).
Araújo & Belluomini (1960-62) observaram que a dose de 1mg/kg de peso vivo dos venenos botrópico e do veneno crotálico em animais domésticos e de laboratório, pode ser mortal, sendo que eqüinos, ovinos e bovinos foram os mais sensíveis, seguidos de forma decrescente pelos caprinos, caninos, coelhos, suínos, cobaios, camundongos, felinos e hamsters, além do rato que sobreviveu a todos os venenos. Este estudo também demonstrou o grau de toxicidade dos venenos estudados, sendo em ordem decrescente: Crotalus durissus terrificus;
Bothrops jararaca; B. jararacussu e de B. alternatus; B. cotiara e de B. neuwiedi e
B. atrox.
O único tratamento eficaz para neutralizar a ação da peçonha crotálica é por meio da soroterapia heteróloga, como o soro antiofídico antibotrópico-crotálico (SABC) ou soroterapia específica anticrotálico (SAC). Como o objetivo é neutralizar a maior quantidade possível do veneno circulante, independentemente do peso do paciente, o soro deve ser administrado o mais precocemente possível após o acidente, e pequenos e grandes animais devem receber a mesma dose (Brasil, 1987). O soro bivalente é o mais facilmente encontrado e utilizado na clínica de pequenos animais. É recomendado pela Organização Mundial de Saúde (1981) que os soros sejam apresentados na forma liofilizada, conservados em geladeira à temperatura de 4 a 8oC positivos, por no máximo 2 a 3 anos (Brasil, 1990).
de veneno neutralizada (Jorge & Ribeiro, 1989; Jorge & Ribeiro, 1992; Ribeiro et al., 1993; Sakate, 2002). As vias subcutânea e intramuscular podem ser consideradas quando houver o impedimento do uso da via intravenosa (Sakate, 2002).
De acordo com a Fundação Nacional de Saúde (Brasil, 2001), a gravidade do acidente é que se determina a quantidade de soro a ser utilizada (Quadro 1).
Quadro 1 – Relação da quantidade de soro antiofídico a ser administrada de acordo com a gravidade do quadro clínico.
Gravidade do quadro Número de ampolas Tipo de soro
Leve 05 ampolas SABC ou SAC
Moderado 10 ampolas SABC ou SAC
Grave 20 ampolas SABC ou SAC
Araújo & Belluomini (1960-62) consideram que a quantidade de soro a ser aplicada em animais acidentados, deve ser suficiente para neutralizar no mínimo 50mg de veneno crotálico.
No Brasil, os laboratórios que produzem esses imunoderivados são: Instituto Butantan (São Paulo), Fundação Ezequiel Dias (Minas Gerais) e Instituto Vital Brazil (Rio de Janeiro).
Fatores como dose do antiveneno usada, via de administração, velocidade de infusão, qualidade de purificação e sensibilização prévia com algum tipo de soro heterólogo podem favorecer o aparecimento de reações precoces (Brasil, 1998).
Podem-se prevenir as reações precoces com a administração prévia de antagonistas H1 e H2 como a dextroclorfeniramina, prometazina, cimetidina,
ranitidina e corticosteróides, como a hidrocortisona, 10 a 15 minutos antes da administração do soro (Brasil, 1990).
O tratamento das RP consiste na suspensão temporária da infusão do soro antiveneno e tratamento sintomático das reações com adrenalina por via intravenosa (IV), hidrocortisona IV, prometazina IV ou intramuscular (IM) e expansão da volemia. Caso ocorra insuficiência respiratória, entubar o paciente, manter oxigenação adequada e usar drogas broncodilatadoras por via IV (Brasil, 1998).
As reações tardias (RT), conhecidas como “doença do soro”, se manifestam por exantema pruriginoso, febre, artralgia, linfoadenomegalia, urticária, articulações edemaciadas, vermelhas e doloridas, ocorrendo geralmente entre cinco a 24 dias após o contato com o soro heterólogo em humanos, porém, não existem relatos sobre isso em cães (Barraviera & Peraçoli, 1994).
Nos casos em que a expansão de volume não resultar em produção de urina, pode ser utilizada solução de manitol 10 a 20%, na dose de 0,5 a 1mg/kg, podendo repetir a dose se for necessário. Caso persista a oligúria, indica-se o uso de diuréticos de alça tipo furosemida por via IV, na dose de 2 a 8mg/kg. A dopamina, na dose de 2 a 3 µg/kg/min, ou a associação de dopamina, na dose de 1 a 5 µg/kg/min em infusão constante mais 1 µg/kg/h de furosemida em bolus,
pode ser utilizada como última tentativa na reversão da oligúria (Belone, 2002).
Devido ao quadro de anorexia, dificuldade de mastigação, paralisia dos músculos faciais e depressão muito grave, há a necessidade da realização da alimentação forçada ou alimentação enteral com alimento líquido ou pastoso, até que o animal se recupere e volte a se alimentar normalmente, além do oferecimento constante de água em pequenas quantidades para evitar o ressecamento da mucosa oral. A aplicação de colírio ou solução fisiológica na córnea ajuda a evitar o ressecamento e aparecimento de úlceras (Sakate, 2002).
Outros procedimentos como o uso de torniquete, corte no local e sucção, uso de produtos químicos são contra indicados no acidente ofídico, pois podem agravar o quadro clínico do paciente (Amaral et al., 1998).
O prognóstico dos acidentes crotálicos leves e moderados pode ser favorável nos animais atendidos nas primeiras seis horas após a picada (Cardoso, 1990). Soerensen et al. (1993), em estudo com camundongos, concluíram que a soroterapia específica deve ser feita pela via intravenosa o mais precocemente possível, para evitar as ações deletérias do veneno sobre o organismo animal.
As complicações e óbitos relacionados ao acidente ofídico foram citados por Ribeiro et al. (1998), sendo relatados 79,1% dos óbitos por insuficiência renal aguda, 65,1% por insuficiência respiratória aguda (mais comum no acidente crotálico), 41,9% devido ao choque anafilático e 41,9% por sepse, esta última só
observada em acidentes botrópicos
.
A maioria dos óbitos (67,6%) ocorreu dentro de três a cinco dias, e o restante (29,4%) dentro dos primeiros dias.3.1 LOCAL
O experimento foi realizado na Universidade do Oeste Paulista - UNOESTE, Hospital Veterinário da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Presidente Prudente-SP.
3.2 ANIMAIS
Foram utilizados 21 cães, adultos, sem raça definida, provenientes do Canil Central da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE de Presidente Prudente-SP.
3.2.1 SELEÇÃO DOS ANIMAIS
Foram utilizados cães sem raça definida, machos e fêmeas, clinicamente sadios, adultos jovens, com peso variando de 4,0 a 7,0 kg.
Os animais foram submetidos a exame físico completo, de acordo com McCurnin & Poffenbager (1991) e a exames laboratoriais (hemograma, urinálise, uréia e creatinina, eletrocardiograma e pressão arterial), sendo excluídos os animais que não apresentaram boas condições de saúde.
3.2.2 MANEJO DOS ANIMAIS
Os animais foram mantidos isolados em baias individuais, no canil do Hospital Veterinário da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, por período não inferior a três dias antes do experimento. Água e ração comercial seca1 foram
fornecidas à vontade.
3.3 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
3.3.1 GRUPOS EXPERIMENTAIS
Foram constituídos três grupos experimentais (Grupos I, II e III) com sete animais em cada grupo sendo:
• grupo I: animais inoculados com veneno da serpente Crotalus durissus
terrificus via subcutânea;
• grupo II: animais inoculados com veneno da serpente Crotalus durissus
terrificus via subcutânea e tratados com cinco ampolas de soro
antibotrópico-crotálico via intravenosa e fluidoterapia;
• grupo III: animais inoculados com veneno da serpente Crotalus durissus
terrificus via subcutânea e tratados com cinco ampolas de soro
O controle foi constituído pelos próprios animais (momento controle-M0), por meio de realização dos exames laboratoriais antes da inoculação do veneno ou do tratamento.
3.3.2 MOMENTOS
A avaliação clínica e exames laboratoriais foram realizados em diferentes momentos (Quadro 2).
AVALIAÇÃO CLÍNICA, HEMOGRAMA, URINÁLISE e
ELETROCARDIOGRAMA: realizados em seis momentos, sendo que na avaliação clínica foram observados: temperatura, freqüência cardíaca, freqüência respiratória, pulso, diâmetro pupilar, ataxia, grau de sedação, sialorréia, presença ou não de vômito, diarréia, paralisia do globo ocular e ptose mandibular:
• M0: momento controle;
• M1: 6 h após a inoculação do veneno;
• M2: 24 h após a inoculação do veneno e 18 h após o tratamento; • M3: 48 h após a inoculação do veneno e 42 h após o tratamento; • M4: 72 h após a inoculação do veneno e 66 h após o tratamento; • M5: 144 h após a inoculação do veneno e 138 h após o tratamento;
TEMPO DE COAGULAÇÃO: realizado em três momentos, que foram determinados por estudo em grupo piloto e estudo anterior em dissertação de mestrado (Nogueira, 2001):
• M0: momento controle;
• M1: 1 h após inoculação do veneno;
COAGULOGRAMA (Tempo de protrombina e Tempo de tromboplastina parcial ativada): realizados em cinco momentos:
• M0: momento controle;
• M1: 2h após a inoculação do veneno; • M2: 6h após a inoculação do veneno;
• M3: 24h após a inoculação do veneno e 18h após o tratamento; • M4: 48h após a inoculação do veneno e 42h após o tratamento.
MIELOGRAMA: realizado em três momentos, determinados de acordo com o tempo onde há somente ação do veneno, e no outro tempo onde já há a ação da soroterapia.
• M0: momento controle;
• M1: 6h após a inoculação do veneno;
• M2: 72h após a inoculação do veneno e 66h após o tratamento.
BIOQUÍMICO (uréia e creatinina) e HEMOGASOMETRIA: realizados em quatro momentos:
• M0: momento controle;
• M1: 6h após a inoculação do veneno;
• M2: 48h após a inoculação do veneno e 42h após o tratamento; • M3: 144h após a inoculação do veneno e 138h após o tratamento.
PRESSÃO ARTERIAL SISTÓLICA: realizada em quatro momentos: • M0: momento controle;
• M1: 2h após a inoculação do veneno; • M2: 6h após a inoculação do veneno;
HISTOPATOLOGIA: realizada em três animais de cada grupo num total de nove animais, uma semana após a intoxicação.
Quadro 2 – Momentos de avaliação dos exames realizados nos cães inoculados
com veneno crotálico
Momentos
M0 M1 M2 M3 M4 M5
Exames realizados
AV AT AV AT AV AT AV AT AV AT
• Avaliação clínica • Hemograma • Urinálise
• Eletrocardiograma
6h - 24h 18h 48h 42h 72h 66h 144h 138h
• Tempo de
coagulação
1h - 24h 18h - - - -
• Coagulograma 2h - 6h - 24h 18h 48h 42h - -
• Mielograma 6h - 72h 66h - - - -
• Bioquímico • Hemogasometria
6h - 48h 42h 144h 138h - - - -
• Pressão arterial sistólica
M O M E N T O
C O N T R O L
E 2h - 6h - 9h 3h - - - -
3.4 INOCULAÇÃO DO VENENO E SOROTERAPIA
O veneno da serpente Crotalus durissus terrificus foi fornecido pelo CEVAP
(Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos) da Universidade Estadual Paulista (UNESP) – Campus Botucatu-SP (Figura 2).
O veneno foi obtido por compressão das glândulas, e posteriormente liofilizado e refrigerado, sendo dissolvido em solução salina estéril1 no momento da
administração, permanecendo na concentração de 4mg/mL.
A inoculação do veneno foi feita no terço médio da face lateral da coxa do cão, com agulha hipodérmica (25x8)2 e seringa descartável de 1mL3 , na dose de 1mg/kg de peso vivo, pela via subcutânea, após a tricotomia e antissepsia local.
1
Solução Fisiológica de Cloreto de Sódio 0,9% Halex e Istar Ltda
2 Agulha 25x8 Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda, Brasil
3 Seringa de 1mL BD – Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda, Brasil Figura 2 – Veneno de Crotalus durissus terrificus
A soroterapia foi realizada com soro antiofídico (botrópico-crotálico1),
comercializado em ampolas de 10mL (Figura 3). O soro foi administrado pela via intravenosa (Figura 4) seis horas após a administração do veneno crotálico, na dose de cinco ampolas. A fluidoterapia foi realizada com solução de cloreto de sódio 0,9% via intravenosa nos animais do grupo II e nos animais do grupo III fluidoterapia com solução de cloreto de sódio 0,9% e bicarbonato de sódio diluído no soro na dose de 4mEq/Kg para promover a alcalinização da urina.
3.5 COLHEITA DE MATERIAL
3.5.1 SANGUE TOTAL
As amostras de sangue foram colhidas por meio de venopunção da jugular, e as amostras foram acondicionadas de acordo com o exame laboratorial a ser realizado (Figuras 5 e 6).
1 Soro antibotrópico-crotálico - Vencofarma Figura 3 – Soro antiofídico (botrópico-crotálico) Vencofarma.
Figura 4 – Administração do soro antiofídico via intravenosa seis
Para a colheita do material para hemograma, contagem de plaquetas e proteína plasmática total foi utilizado vacutainer para hemograma de 5mL1
Para Tempo de protrombina (TP), Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada (TTPA) e Fibrinogênio foi utilizado vacutainer de 4,5mL com anticoagulante citrato de sódio tamponado a 3,2%2.
Para bioquímico de uréia e creatinina, foram utilizadas agulha 30x083 e seringa
de 10mL4 sem anticoagulante e o material colhido foi acondicionado em tubos de ensaio.
Para tempo de coagulação, foram utilizadas agulha hipodérmica 30x83 e seringa de 5mL5 sem anticoagulante e o sangue colhido foi acondicionado em tubos de ensaio pré-aquecidos a 37oC.
1
Vacutainer para hemograma -BD
2
Vacutainer citratado - BD
3
Agulha 30x8 Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda. Brasil
4 Seringa de 10mL BD – Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda. Brasil 5 Seringa de 5mL BD – Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda. Brasil
Figura 6 – Venopunção da jugular com vacutainer. Figura 5 – Venopunção da
3.5.2 HEMOGASOMETRIA
Foi realizada coleta de sangue por punção da artéria femural, com seringa plástica de 1mL1 previamente umidecida com heparina sódica2, acondicionando-se a amostra em recipiente térmico a 4oC (até 30 minutos após a colheita).
3.5.3 URINA
Para urinálise, a colheita de urina foi realizada por meio de cistocentese (Figura 7), após tricotomia e anti-sepsia do local, com agulha hipodérmica 25x83 e seringa de 10mL4 .
1
Seringa 1mL BD - Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda. Brasil
2 Heparin 5.000 UI - Cristália
3 Agulha 25x8 Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda. Brasil 4
Seringa 10mL BD - Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda. Brasil
3.5.4 MEDULA ÓSSEA
A colheita de medula óssea foi realizada com agulha especial para biópsia aspirativa de medula óssea, mediante punção na crista ilíaca dos cães.
Os animais foram contidos em decúbito lateral e os membros posteriores foram voltados cranialmente para que a coluna ficasse flexionada, facilitando o acesso à crista ilíaca. Após anti-sepsia local, a agulha foi colocada sobre a crista ilíaca e foram realizados movimentos circulares e pressão até que a mesma atingisse a cavidade medular. O mandril da agulha foi retirado e conectada uma seringa de 20mL1 que continha EDTA (sal dissódico do ácido etilenodiaminotetracético) a 3% em salina.
Foi aspirado um volume de 0,5 mL de medula óssea por colheita e, em seguida, a agulha foi retirada juntamente com a seringa e procedeu-se a homogeneização da amostra (Figura 8 e 9 ).
1Seringa 20mL BD - Becton Dickinson Ind. Cirúrgicas Ltda. Brasil Figura 8 – Região da crista
ilíaca, local da aspiração da medula óssea.
Figura 9 – Animal com os membros flexionados cranialmente para realização da biópsia aspirativa da
Foram realizados esfregaços do material colhido segundo Alencar et al. 2002 (Figuras 10, 11, 12 e 13).
Figura 10. Conteúdo aspirado da medula óssea.
Figura 11. Preparação para realização do esfregaço.
Figura 12. Esfregaço sanguíneo do conteúdo aspirado da medula
óssea.
3.6 EXAMES LABORATORIAIS
3.6.1 HEMOGRAMA
O eritrograma consistiu da contagem total de eritrócitos, em contador eletrônico de células1 e determinação do volume globular pelo método do microhematócrito2 .
O cálculo dos índices hematimétricos foi realizado segundo Jain (1993). A proteína plasmática total foi determinada por refratometria3.
A contagem total de leucócitos foi realizada em contador automático de células, e a contagem diferencial de leucócitos foi realizada em 100 células em esfregaços corados com panótico4 .
3.6.2 EXAMES BIOQUÍMICOS
As amostras de soro para realização dos exames bioquímicos, uréia5 e creatinina6, foram obtidas por centrifugação do sangue. As amostras foram processadas no mesmo dia para a mensuração de uréia e creatinina pelo método colorimétrico.
1CELM – CC-530
2 Micro EULAB – Modelo 024
3 AST – Japan
4 LABOR-CLIN
5 Uréia – Analisa
3.6.3 TEMPO DE COAGULAÇÃO
O sangue colhido da veia jugular foi colocado em alíquota de 1mL em três tubos de ensaio de vidro (10x75mm) pré-aquecidos a 37oC e numerados de 1 a 3, para a realização do tempo de coagulação pelo método de Lee & White (1913) (Figuras 14 e 15).
3.6.4 URINÁLISE
Foram observados os aspectos físicos, químicos e de sedimento1 .
1
COMBUR10TEST – Roche Diagnostics
Figura 14 – Realização do tempo de coagulação pelo método de
Lee & White.
3.6.5 MEDULA ÓSSEA
O material colhido da medula óssea foi encaminhado ao serviço de Patologia Clínica do Hospital Veterinário da UNOESTE. O exame citológico da medula óssea foi realizado em esfregaços corados pelo método de Leishman (Jain, 1993). A contagem diferencial foi feita em 500 células, por meio de classificação proposta por Jain (1986) e modificada por Assis (1993). A relação mielóide-eritróide (M:E) foi determinada dividindo-se o total de células da série granulocítica pelo total de células nucleadas da série eritrocítica.
3.6.6 TEMPO DE PROTROMBINA (TP) e TEMPO
TROMBOPLASTINA PARCIAL ATIVADA (TTPA)
Após a colheita do sangue em vacutainer com citrato, esse foi centrifugado a 3000rpm por 10 minutos para separação do plasma e realizados os testes em seguida. O TP1 foi determinado adicionando-se 200 µL de uma solução
previamente aquecida (37oC) de tromboplastina a 100 µL de plasma. A determinação do TTPA2 foi realizada pela adição de 100 µL de cefalina e de 100 µL de cloreto de cálcio 0,02M a 100 µL de plasma.
Os tubos com a amostra e reagente foram invertidos continuamente para a observação do tempo decorrido até a formação do coágulo de fibrina. Todas as provas foram realizadas em banho-maria, à temperatura de 37oC. Foram
consideradas incoaguláveis todas as amostras que excederam o tempo de cinco minutos sem a visualização da formação do coágulo de fibrina.
1 TP - BIOLAB 2 TTPA - BIOLAB
3.6.7 FIBRINOGÊNIO
Foi utilizado Fibrinogéne-kit/Fibrinomat1 para dosagem cronométrica do fibrinogênio no plasma. Foram colhidas amostras de sangue com vacutainer citratado e após centrifugação da amostra, foram feitas diluições do plasma, os quais foram mantidos em banho-maria a 37oC durante dois minutos, e foram acrescidos à amostra 100µL do reagente 1 (trombina) e 900µL do reagente 2 (diluente). O cronômetro foi acionado no momento da colheita e foi observado o tempo de coagulação. Quando um plasma diluído é colocado em presença de um excesso de trombina, o logarítimo do tempo de coagulação está em relação linear com o logarítimo da concentração de fibrinogênio do plasma estudado.
3.6.8 ELETROCARDIOGRAMA
Foi utilizado aparelho eletrocardiógrafo2 para realização do exame (Figuras 16 e 17 ). Os animais foram contidos manualmente e posicionados em decúbito lateral direito com membros anteriores e posteriores paralelos entre si. Os eletrodos foram colocados acima da articulação úmero-rádio-cubital nos membros anteriores e acima da articulação fêmur-tíbio-patelar nos membros posteriores.
1
Fibrinogéne-Kit/Fibrinomat - bioMérieux
Para melhor contato entre a pele e os eletrodos, estes foram umidecidos com álcool. Foram registradas derivações bipolares (I, II e III) e unipolares aumentadas (avR, avL e avF) (Edwards, 1996), na velocidade do papel de 50mm/s e derivação II em 25mm/s. A calibração da milivoltagem foi de 1cm=1mV.
3.6.9 PRESSÃO ARTERIAL
Para aferição da pressão arterial sistólica (PAS) foi utilizado método não invasivo, com equipamento detector de pressão Doppler ultra-sônico 10, com transdutor do tipo caneta (Figuras 18 e 19). Foi realizada tricotomia da superfície palmar do membro anterior esquerdo e colocada a caneta junto à pele.
Para melhorar o contato entre a pele e o transdutor foi utilizado gel aquoso. A posição do transdutor foi ajustada até obtenção da clareza do som. A circunferência do membro foi medida e um mangüito humano infantil foi colocado ao redor do membro esquerdo acima da articulação úmero rádio-ulnar. Um manômetro aneróide de pressão foi acoplado ao manguito. A PAS foi medida da seguinte maneira: a pressão no manguito foi aumentada até o som audível do fluxo no Doppler1 cessar, então a pressão no manguito foi gradualmente diminuída e o primeiro som audível, que se trata do pulso sistólico, registrado no manômetro aneróide (Stepien & Gregg, 1999).
Figura 16 – Aparelho de eletrocardiograma CARDIOTEST
EK51.
Figura 17 – Realização do eletrocardiograma em um cão
1
(ESPHYNGOMANOMETER NO-PIT-STOP –UNICS)
Figura 18 – Aferição da pressão arterial sistólica com
aparelho Doppler.
Figura 19 – Aparelho de pressão Doppler ultra-sônico
3.6.10 HISTOPATOLOGIA
Foram submetidos à eutanásia três animais de cada grupo após uma semana da administração do veneno crotálico. Os animais foram sacrificados utilizando a acepromazina1 como medicação pré anestésica e anestesiados com pentobarbital sódico a 3%2, em seguida foi administrada solução de cloreto de potássio a 19,1%3. Os animais foram encaminhados ao serviço de Anatomia Patológica do
Hospital Veterinário da UNOESTE e submetidos à necropsia completa segundo à técnica adotada no referido serviço.
Durante o exame necroscópico, foram colhidas amostras de pulmão, coração, baço, rim, fígado, estômago, intestinos delgado e grosso, linfonodos poplíteos, e cérebro para utilização em futuros estudos. A musculatura esquelética principalmente o bíceps femoral esquerdo e direito e o semitendinoso esquerdo e direito foi colhidos para estudo neste experimento.
As amostras colhidas da musculatura foram fixadas em solução de formalina tamponada a 10% por 48 horas. Foram, em seguida, clivadas e submetidas a processamento histológico de rotina para inclusão em parafina e cortes em micrótomo rotativo a 5µ. Os cortes foram corados pela hematoxilina-eosina (HE) e pelo tricrômico de Massom modificado e examinados à microscopia óptica4.
1
Acepran 0,2% - Univet
2
Hypnol 3% - Fontoveter
3
Solução de cloreto de potássio a 19,1%, ampolas de 10mL - Aster
3.6.11 HEMOGASOMETRIA
Após colheita do material, as amostras foram encaminhadas ao Hospital Universitário da UNOESTE para realização do exame. O pH sangüíneo, pressão parcial de CO2 (PCO2), pressão parcial de O2 (PO2) e HCO3 (mmol/L) foram
determinados por meio do aparelho hemogasométrico1 (Figura 20).
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Inicialmente, foi realizada uma análise de medidas repetidas ou de perfil (Morrison, 1990) da diferença dos momentos, em relação ao momento controle dos grupos I, II e III e diferença entre grupos para as variáveis paramétricas.
Para as variáveis cujas avaliações foram dadas por escores, os grupos foram comparados em cada momento, utilizando-se o teste não paramétrico de Kruskal-Wallis e a comparação do efeito dos momentos em cada grupo pelo teste não paramétrico de Friedman (Siegel, 1975).
Todos os testes foram realizados adotando-se o nível de 5% de significância.
1 Aparelho de hemogasometria AVL.
4.1 CONSIDERAÇÕES INICIAIS
A escolha da serpente Crotalus durissus terrificus foi baseada na sua
grande importância quanto à ocorrência e à gravidade dos acidentes causados por esta espécie (Azevedo-Marques, et al., 1985; Barraviera, 1994; Bicudo, 1994; Hudelson & Hudelson, 1995; Roodt, et al., 1996).
A dose utilizada foi de 1mg/kg, já citada na literatura por Araújo & Belluomini (1960-62), Araújo et al. (1963) e Nogueira (2001), tendo sido também testada em experimento piloto e observado que a referida dose reproduz as alterações clínicas e laboratoriais, prestando-se aos objetivos deste trabalho.
O tratamento instituído, com soro antiofídico (botrópico-crotálico) associado à fluidoterapia e à alcalinização da urina, teve como objetivo investigar a eficácia das duas terapias e pela necessidade de acompanhamento dos animais nos momentos programados.
