X V II C O N G R E S S O D A S O C I E D A D E B R A S IL E IR A D E H IG IE N E R ealizar-se-á em Salvador, B ahia, de 8 a 14 de dezembro de 1968. Será o seguinte o tem ário:
I — Epidemiologia, profilaxia e pesquisa das doenças transm issíveis, degene rativas, ocupacionais, m entais, das carências nutricionais e dos acidentes em geral.
II — O rganização e adm inistração sanitárias, com preendendo bioestatística, p la nejam ento, avaliação, financiam ento, integração, form ação de técnicos e auxiliares, educação e inform ação sanitárias.
III — Higiene In d u strial e saneam ento do meio.
-IV — Ensino da Higiene, M edicina Preventiva e do Trabalho.
H averá sessões de Tem as Livres, nos quais serão classificados os trabalhos que não se enquadrem no tem ário oficial.
Os trabalhos de preferência envolvendo questões, problem as e sugestões de ordem prática aplicáveis ao Brasil, deverão conter resum o e conclusões e no frontispício o tem a ao qual concorrem ; devem ser rem etidos ao Dr. José
R E N D IM E N T O D O S M E I O S S E L E T IV O S P A R A B A C T É R IA S D O G Ê N E R O
FU SO BA CTERIU M *
*
W ilson C . d e A raú jo **, M aria; R a q u e l dos S an to s *** e P au lo F reitas ****
M e io s s e le t iv o s p a r a Fusobacterium fo r a m , c o m p a r a d o s n o a s p e c t o d e s u a e f i c i ê n c i a n o i s o l a m e n t o d o s m i c r o r g a n i s m o s f u s i f o r m e s e q u a n t o à in ib iç ã o d a f l o r a c o n c o m i t a n t e . M a te r ia l n ã o c a lc i fi c a d o d o s u l c o g e n g iv a l f o i h o m o g e n e i z a d o e d i lu í d o e m t a m p ã o d e f o s f a t o (0,067 M — p H 7,2); 0,1 m l f o i s e m e a d o e m a g a r s a n g u e , n o m e i o d e O m a t a & D is r a e ly , m e i o d e O m a t a & D is - r a e ly s e m s ô r o , m e i o d e M c M a r t h y & S n y d e r , a g a r s a n g u e c o m v a n c o m i c i n a , m e i o d e O n i s i, m e i o d e O n is i c o m s ô r o d e c a v a l o e m e i o d e O n is i c o m p H 7,0. E m t o d o s o s c a s o s a in c u b a ç ã o f o i r e a li z a d a e m a n a e r o b i o s e , e m j a r r a t ip o B r e w e r , c o m 95% n i t r o g ê n i o e 5% g á s c a r b ô n ic o , d u r a n t e 4 d i a s .
O m e i o d e M c C a r t h y & S n y d e r m o s t r o u - s e t ã o e f i c i e n t e q u a n t o o a g a r s a n g u e e m r e la ç ã o a o is o t U m e n to d e Fusobacterium , a i n d a i n i b i n d o a f lo r a c o n c o m i t a n t e ,
o
m e i o d e O m a t a & D is r a e ly , c o m c r i s t a l v i o l e t a e e s t r e p t o m i -c in a , f o i d e -c e r t o m o d o i n i b i d o r t a m b é m p a r a Fusoba-cterium . O m e i o d e O n isi, s u g e r id o , s e m s ô r o , p o s s i b i li to u o i s o l a m e n t o d e p e q u e n o n ú m e r o d e f u s o b a c -t é r ia s , p r o v à v e l m e n t e a s a m o s t r a s n ã o e x i g e n t e s d e p r o t e í n a s n a t u r a i s .
M icrorganism os fusiformes, do gênero F u s o b a c t e r i u m , são encontrados n a placa dental, sulco gengival e n as tonsilas como com ponentes d a flora anfibiôntica ou n o r m al do hospedeiro.
E n tretan to , a lite ra tu ra rela ta a presen ça dêstes m icrorganism os em quadros p a tológicos d a bôca e ou tras áreas do orga nism o. V incent (15) isolou fusobacteria de lesões ulcerativas e necróticas da g a r
ganta, da gran g ren a hosp italar (P ourn- tu re d ’Hospital) . Veillon & Zuber, (14) exam inando casos de gangrena pulm onar, bartolinite, otite e apendicite, caracteriza
dos pelo odor pútrido do exsudato, encon tra ra m m icrorganism os fusiform es som en te nos casos de apendicite. S m ith (12) iso lou o m icrorganism o de casos de úlcera tropical e de 94% dos casos de abscesso pulm onar. Rosenow e T unicliff (11) rela
tara m um caso de piem ia do qual isolaram fusobacteria de várias lesões cutâneas apresentadas pelo paciente. Dick (5) re latou m inuciosam ente três casos de m e ningite dos quais isolou, p o s t - m o r t e m , im- crorganism os fusiform es. Vários autores isolaram fusobacteria de quadros de sep- ticem ia, como B rocard & Daum (2), Wil liam s (16), B rocard et cols. (3) e Tynes & Utz (13).
Os m icrorganism os do gênero F u s o b a c t e r i u m , a p a rtir do trabalho de P ia tt (9) têm sido isolados com m ais facilidade em meios nutritivos com sangue ou sôro, e adicionados de corantes como o verde bri lhante, violeta de genciana, verde de m a- laquita, etil violeta, cristal violeta, etc., conform e ressalta a d etalhada revisão realizada por Bõe (1), em 1941.
* T r a b a l h o r e a l i z a d o c o m a u x i l i o cio C o n s e l h o d e P e s q u i s a s d a U . F . R . J .
** l a b o r a t ó r i o d e M i c r o b i o l o g i a O r a l , I n s t t i t u t o d e M i c r o b i o l o g i a d a U . F . R . J . — P r o f e s s o r A d j u n t o e D o c e n t e L i v r e d a U . F . R . J .
248 R ev. S c c . B ras. M ed . T rop. V ol. H — N? 5
Posteriorm ente, outros meios seletivos fo ram recom endados por O m ata & D israe- ly (7) e por M acC arthy & Snyder (6) os quais em pregaram , como substâncias im - pedientes da flora de associação, cristal violeta-estreptom icina e estreptom icina- vancomicina, respectivam ente. Ao c o n trá rio das observações m ais comuns sôbre as condições de isolam ento de F u s ó b a c t e r i u m, Onisi (8) recom endou um meio seletivo só
lido, sem proteínas n atu rais, com pH 8.0, adicionado de azida sódica e cristal vio leta como substâncias im pedientes.
Com a finalidade de com parar o ren d i m ento dos diversos meios seletivos propos tos p ara isolam ento de F u s ó b a c te r i u m . foi realizado o presente trabalho, no qual é analisado o isolam ento de bactérias do gê- nêro F u s ó b a c te r iu m , como tam bém a efi ciência de sua inibição sôbre a flora con com itante .
MATERIAL E MÉTODOS
De pacientes adultos, com e sem doen ça periodontal, foi colhido m aterial não calcificado de sulco gengival, com auxí lio de curetas periodontais esterilizadas.
O m aterial foi pesado sôbre um a secção de papel alum inizado estéril, de ta ra prè- viam ente d eterm in ad a. Em tam pão de fosfato (0.067 M, pH 7,2), o m aterial íoi dispersado em hom ogeneizador de tecido ÍA rthur Thom as, P h ilad elp h ia), com vin te m anipulações do pistilo. Em todos os casos foi guardada a proporção 1 m g do m aterial p a ra 10 m l do diluente (diluição iniciál 10-4); ainda no tam pão do fosfa - to foram realizadas diluições decimais, es palhando-se 0,1 m l de cada, n a superfí cie dos seguintes meios nutritivos:
1. AGAR SANGUE
peptona (Difco) 1%
extrato de carne (Difco) 0,3% extrato de levedura (BBL) 0,3% cloreto de sódio (Fisher) 0,5% agar (Difco) 1,5%
sangue desfibrinado de coelho 5%
2. MEIO DE OMATA & DISRAELY
casitone (Difco) 1,5%
extrato de levedura (BBL) 0,5%
glicose (Coleman & Bell) 0,5% cloreto de sódio (Fisher) 0,5% 1-cistina (P fanstiehl) 0,075%
cristal violeta (Allied C h .) 0,001%
sulfato de estreptom icina (Lilly)
0,0 0 1%
agar (Difco) 1,5% sôro de cavalo 5% pH 7,2
3. MEIO DE OMATA & DISRAELY
sem sôro de cavalo
.4. MEIO DE ONISI
polipeptona (BBL) 1% extrato de carne (Difco) 1% glicose (Coleman & Bell) 1%
1-cistina (Pfanstiehl) 0,05% gluconato de sódio (N.B.Co) 0,05% cloreto de sódio (Fisher) 0,25% azida sódica (Merck) 0,01%
cristal violeta (Allied Ch) 1:80.000 agar (Difco) 1,5%
pH 8,0
5. MEIO DE MACCARTHY & SNYDER
ag ar sim ples
sangue desfibrinado de coelho 5% vancom icina (Lilly) 7,5 ug/m l
sulfato estreptom icina (Lilly) 20 ug/m l
6. AGAR SANGUE
VANCOMICINA (LILLY) 75, MG/ML
7. MEIO DE ONISI com PH 7,0
8. MEIO DE ONISI com sôro de cavalo 5%
As placas foram incubadas à 37°C, du ran te 4 dias, em anaerobiose (95% N itro gênio s 5% gás carbônico), usando-se ja r ras tipo Brewer.
S e te m b r o -O u tu b r o , 1968 R e v . S c c . B r a s . M e a T rop 249
croscópio estereoscópico (aum ento 32x) com luz incidindo sôbre a superfície co lonial. A bacterioscopia sem pre m ostrava bastonetes finos, de extrem idades afiladas, gram negativos, às vêzes apresentando , grânulos roxos nas extrem idades ou ao
longo do citoplasm a (figura 3) .
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com m aterial de doze pacientes an alisa mos a capacidade seletiva do meio de O m a ta & Disraely, M acC arthy & Snyder, Agar-
sangue-vancom ícina em relação ao rendi m ento oferecido pelo agar sangue. Os re sultados estão representados n a Tabela 1. O meio de O m ata & Disraely cuja seletivi dade parece depender d a adição do cristal violeta e da estreptom icina, isolou menos fusobacteria que o agar sangue. A dife rença entre as m édias obtidas é estatisti cam ente significante, n a base do teste de S tudent (P < 0,001) . Evidentem ente, a ação inibitória do meio de O m ata & Dis raely sôbre a flora de associação foi m ul to acentuada, m as não foi total, pois V e ií - lo n e lla , S t r e p t o c o c c u s e “difteroides” a in da cresceram neste meio seletivo.
Embo-«■ llt
F I G F R A 2 : A s p e c t o (la m o r f o l o g i a c o lo n i a l d e F u s ó b a c t e r iu m e m m e i o (le O m a t a & D i s r a e l y . A u m e n t o d e 9 0 X .
\
F I G U R A 1 : A s p e c t o d a m o r f o l o g i a c o l o n i a l d e F u s ó b a c t e r i u m e m m e i o d e O m a t a & D i s r a e l y , a p ó s 4 d i a s d e i n c u b a ç ã o e m a n a e r o b i o s e ( 9 5 % d e N i t r o g ê n i o e 5 % d e g á s c a r -b ô n i c o ) A u m e n t o d e 4 2 X .
• \
F I G U R A 3 : E s f r e g a ç o c o r a d o p u lo m é t o d o d e G r a m a p a r t i r d e u m a c o l ô n i a d e F u so - b a c te r iu m c r e s c i d a e m m e i o d o O m a t a &
D i s r a e ’ y , a p ó s 4 d i a s d e in c u b a ç ã o e m a n a e -r o b io s o ,
250 R e v . S c c . B r a s . M e d . T r op V o l. n — N ? 5
O meio sugerido por M acC arthy & Sny der, agar-sangue adicionado de estrepto- m icina e vancom icina, isolou ta n to F u s o - b a c t e r i u m quanto o ag ar sangue e ainda reduziu b astan te a flora concom itante. A diferença en tre as m édias de isolam ento de F u s o b a c t e r i u m não teve significação estatisticam ente. E ntretan to , o meio de M acCarthy & Snyder isolou m ais fuso bacteria que o meio seletivo sugerido por O m ata & Disraely (P < 0,02).
O agar sangue-vancom icina selecionou tan to fusobacteria quanto o meio de M ac C arthy & Snyder, en tre ta n to êste último foi m ais im pediente p a ra a flora de asso ciação (P < 0,01) provàvelm ente devido à presença da estreptom icina.
Assim, parece que os antibióticos adicio nados aos meios, estreptom icina e vanco
micina, não afetam o isolam ento de F u
s o b a c te r iu m , pois, no agar-sangue vanco m icina e no meio sugerido por M acC arthy & Snyder, o isolam ento de m icrorganism os fusiform es foi com parável ao do ag a r-san gue. Por outro lado, h á indícios de que o reduzido núm ero de fusobacteria isolado no meio de O m ata & Disraely foi d eterm i nado pela adição do cristal violeta p a ra tam bém inibir a flora associativa. De Araújo & Gibbons (4) an teriorm ente de m onstraram que, no meio de O m ata &
Disraely, a seletividade dependia do c ris tal violeta, porque a estreptom icina não se m ostrava eficiente n a inibição da flo ra concom itante.
Com m aterial de 16 pacientes pro cu ra mos com parar o rendim ento do meio de Onisi em relação ao meio de O m ata & Dis- raely, de emprego m ais comum en tre os pesquisadores. Os resultados são apresen tados n a Tabela 2. O meio sugerido por O m ata & Disraely isolou m ais fusobacte ria que o meio de Onisi (P < 0,001). O meio de Onisi parece b a sta n te im pediente, inclusive p a ra a flora de associação, e, ao que parece, neste aspecto, depende da azi- d a sódica, pois quando rem ovida do meio houve aum ento do núm ero de colônias da outros m icrorganism os, diferença e sta tisti cam ente significativa (P < 0,001) . A a u sência d a azida sódica todavia não alterou o isolam ento de fusobacteria, pois a m é dia do isolam ento não diferiu com expres são significativa (tabela 2 ).
P arece que o baixo rendim ento do meio de Onisi, p a ra isolam ento de F u s o b a c t e r i u m , pode ser explicado pela composição do meio nutritivo, destituído de proteínas n a tu ra is com um ente exigidas no isola m ento dêstes m icrorganism os. Assim, re m ovendo-se do meio de O m ata & Disraely a quantidade de sôro de cavalo proposta,
Tabela 1: Isolam ento de F u s o b a c t e r i u m e da flora de associação nos meios seletivos
de O m ata & Disraely e de M acC harty & Snyder (núm ero de colônias por gram a do
m aterial x 107)
MATERIAL
A .S.
Fusobacterium
O m ata M-S A.S+VA. A .S.
Outros
O m ata M-S A.S+VA.
1 60 a 9 26 720 2 48 115
2 50 18 56 115 550 12 35 134
3 60 9 12 12 750 28 59 221
4 30 6 7 11 550 1 0 7
5 110 5 45 62 660 0,8 18 70
6 70 15 60 36 420 10 35 86
7 20 5 10 12 380 14 15 78
8 60 12 40 30 350 4 101 175
9 10 3 5 9 310 18 5 105
10 20 2 2 3 220 1 0 14
11 40 10 14 6 350 2 51 157
12 110 10 68 62 580 7 28 122
Média 53 9 27 32 486 8 33 107
S—
S e te m b r o -O u tu b r o , 1968 R e v . S c c . B r o s . M e d T r o p . 251
Tabela 2: Isolam ento de F u s o b a c t e r i u m e da flora de associação nos meios de O m ata & Disraely e Onisi (núm ero de colônias por gram a do m aterial x 107)
MATERIAL
O m ata
Fusobacterium
O m ata Onisi » Onisi
s/sôro s/azid a c/azida O m ata
Outros
O m ata Onisi Onisi
s/sôro s/azid a c/azida
1 84 23 35 0 5 1 8 0
2 80 • 73 49 87 82 25 54 17
3 78 56 53 14 35 3 152 0
4 50 64 35 5 30 34 19 2
5 25 14 10 0 3 3 7 1
6 144 45 56 14 39 9 58 14
7 170 56 10 24 80 2 0 0
8 83 55 20 36 162 4 12 13
9 138 35 9 22 50 6 26 0
10 79 37 56 68 246 10 143 2
11 5 26 21 2 18 11 15 1
12 85 15 29 6 34 16 10 3
13 205 22 27 13 61 6 2 2
14 106 8 25 2 153 0 15 0
15 14 0 4 2 0 0 20 0
16 87 88 20 16 119 12 80 0
M édia 89 38 29 19 70 9 39 3
S— 13,6 6,2 4,3 6,2 12,8 2,3 12 1,4
X
Tabela 3: Isolam ento de F u s o b a c t e r i u m e da flora de associação nos meios de O m ata & Disraely, Onisi adicionado de sôro e Onisi com pH 7,0 (núm ero de colônias por g ra
m a do m aterial X 107)
Fusobacterium Outros
MATERIAL
O m ata Onisi Onisi
c/sôro pH7,0Onisi O m ata Onisi c/sôroOnisi pH7,0Onisi
1 60 4 29 12 70 0 8 1
2 80 81 151 69 128 6 27 2
3 23 8 64 12 38 111 220 100
4 61 50 160 19 2 5 132 0
5 131 44 37 26 74 0 252 6
6 46 9 21 5 113 5 56 1
7 27 6 3 5 37 93 264 100
8 40 13 58 7 23 7 24 6
9 87 10 73 19 67 3 96 45
10 . 80 55 101 40 62 2 156 3
11 85 24 38 18 210 6 225 7
12 30 19 64 35 38 11 14 5
13 40 17 33 5 11 23 107 16
14 64 14 148 4 26 11 22 20
M édia 61 25 70 20 64 20 114 22
S — X
252 R e v . S o c . B r a s . M e d T r o p . V o l . II — N ? 5
o rendim ento do meio foi sensivelm ente reduzido, havendo um a diferença estatis ticam ente significativa en tre as m édias obtidas (P < 0,01) (tabela 2 ). Em adição, como m ostra a Tabela 3, o meio de Onisi com sôro de cavalo à 5% possibilitou a u m entar o isolam ento de fusobacteria
(P < 0,01), análise realizada com m aterial de 14 pacientes e tendo ain d a o meio de O m ata & Disraely como referência. O meio de Onisi com sôro de cavalo com por tou-se como o meio de O m ata & Disraely no aspecto do isolam ento de F u s o b a c te - r iv tm . E ntretan to , o pH 8
,
sugerido p a ra o meio de Onisi, com a finalidade de a u m entar a capacidade im pediente do meio, parece não ter justificativa p rática, como dem onstram os resultados da tab ela 3 cuja diferença en tre as m édias não temsignificação estatística. Com o pH 7 ou pH 8 o meio de Onisi isola a m esm a quan tidade de fusobacteria e inibe a m esm a quantidade dos germes de associação.
Os resultados do presente trab alh o de certo modo confirm am as inform ações de Prévot (10) sôbre a ocorrência de am os tra s de F u s ó b a c te r iu m , sorolóíilas e outras menos exigentes, como, provàvelm ente, as isoladas no meio seletivo de Onisi.
Como o estudo da ecologia da bôca vem preferindo métodos quantitativos, como o em pregado no presente trabalho, p a ra de finir a m icrobiota anfibiôntica dos nichos ecológicos bucais, acham os que conhecer o rendim ento dos meios seletivos em prega dos num a investigação será de grande im portância p a ra o estudo crítico dos resul tados obtidos.
S V M M A R Y
G i n g i v a l ã e b r is w a s c o ll e c t e d w i t h s t e r i l e p e r i o ã o n t a l s c a le r s f r o m p a t i e n t s w i t h h e a l t h y g i n g iv a a n ã f r o m p e r i o d o n t a l l y i n v o l v e d p a t i e n t s t o c o m p a r e t h e e f j e c t i v e n e s s o f s e l e c t i v e m e d i a f o r i s o l a t i o n o f Fusóbacterium .
T h e m a t e r i a l w a s w e i g h e d o u t o n a l u m i n u m f o i l ( p r e v i o u s l y w e i g h e d ) , h o m o g e n i z e d , d i l u t e d i n t o p h o s p h a t e b u f f e r (0,067 M - p H 1 , 2 ) , a n d "0,1 m l w a s p l a t e ã o u t o n b lo o d a g a r , b lo o d u g a r - v a n c o m y c i n (7,5 u g / m l ) , O m a t a & D is r a e ly a g a r , O m a t a & D i s r a e l y a g a r w i t h o u t h o r s e s e r u m , M c C a r t h y & D i s r a e ly a g a r , O n i s i a g a r w i t h h o r s e s e r u m , a n ã O n i s i a g a r w i t h p H 7,2. I n a li c a s e s t h e p l a t e s w e r e i n c u b a t e ã a t 37°C, i n a n a e r o b ic B r e w e r j a r s w i t h 95% n i t r o g e n a n ã 5% c a r b o n ã i o x i d e f o r fc m r d a y s .
M c C a r t h y & S n y ã e r a g a r w a s s o e f f e c t i v e a s t h e p l a i n b lo o d a g a r i n
r e la t i o n t o t h e i s o l a t i o n o f Fusóbacterium ; o n t h e o t h e r h a n d , i t i n h i b i t e â t h e c o n c o m i t a n t f lo r a . O m a t a & D is r a e l y a g a r (w i t h c r y s t a l v i o l e t a n ã s t r e p
-t o m y c i n ) w a s i n h i b i -t o r y f o r f u s o b a c -t e r i a , -to o . A f e w n u m b e r o f f u s o b a c -t e r i a w a s i s o l a t e ã i n t h e O n i s i m e ã i u m ( w i t h o u t s e r u m) . P r o b a b ly t h o s e s t r a i n s ã i ã n o i r e q u ir e n a t u r a l p r o t e i n s .
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