CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE
ISOLADOS CLÍNICOS DE
Trichosporon
spp.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE
ISOLADOS CLÍNICOS DE
Trichosporon
spp.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Orientador: Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo
Co-Orientador: Dr. Guilherme Maranhão
Chaves
ii
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MEDICINA
Chefe do Departamento: Profa. Dra. Emília Inoue Sato
Coordenador do Curso de Pós-Graduação: Prof. Dr. Ricardo Sobie Dias
iii
CARACTERIZAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE ISOLADOS CLÍNICOS
DE
Trichosporon
spp.
Presidente da banca:
Dr.: Arnaldo Lopes Colombo
Prof. Titular do Departamento de Medicina
Disciplina de Infectologia – Escola Paulista de Medicina - UNIFESP
___________________________________________________________________
BANCA EXAMINADORA
Drª. Ângela Maria da Silva
Profª. Adjunta da Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias Departamento de Medicina - Universidade Federal de Sergipe - UFS
Drª. Analy Sales de Melo
Pós-doutoranda – Departamento de Medicina Escola Paulista de Medicina - UNIFESP
Prof. Dr. Carlos Pelleschi Taborda Departamento de Microbiologia
Instituto de Ciências Biomédicas - USP
SUPLENTE
Drª. Cristina Viana Niero
iv
Se acreditássemos, porém, que tudo é tão efêmero e impermanente quanto à morte é previsível e inevitável, seríamos mais previdentes em nossas opções, mais dignos em nossos atos, mais honestos em nossas atitudes, mais generosos em nossas palavras, mais humildes em nossos gestos, enfim, mais humanos nos testemunhos de nossas ações.
v
À minha mãe,
Almerinda Sá
Por ser a minha fonte de determinação e exemplo de vida em todos os
sentidos. E por me mostrar que eu posso ir muito mais longe depois de
pensar que não se pode mais.
Aos meus irmãos,
Sobretudo, Adilene Sá e Ana de Lourdes Sá
Que foram o grande alicerce de mais um sonho realizado e que estiveram
presentes nos momentos mais importantes da minha vida.
À minha tia,
Ada
Meu porto seguro, meu oráculo, a minha segunda mãe. Por todos os
conselhos sempre bem aplicados.
À minha irmã de coração,
Cledja Soarem de Amorim
Amiga de todas as horas e grande exemplo de vida.
vi
Edméa Helena de Oliveira
Pelo grande apoio, persistência e paciência nas leituras dos ensaios laboratoriais das assimilações de carboidratos. Quantas leituras fizemos juntos! Quantos risos! E quantos momentos difíceis ficaram mais fáceis, devido a sua presença.
Guilherme Maranhão Chaves
Por acreditar neste trabalho, que parecia impossível e me ajudar a torná-lo real.
vii
A Deus, por mais uma oportunidade de crescimento profissional e espiritual.
Ao Prof. Dr. Arnaldo Lopes Colombo, pela excelente orientação,
disponibilidade, compreensão, atenção, em fim pela grande oportunidade de evolução profissional.
À Rossana Cahino Pereira, que sempre esteve presente nos momentos
mais decisivos da minha vida.
Às minhas amigas Luciana Barros de Santana e Jussimara Monteiro, que
sempre me incentivaram na minha carreira acadêmica.
À Drª. Ângela Maria da Silva, responsável por despertar meu interesse em
Micologia e pela minha chegada ao LEMI.
Ao meu cunhado, Adenilson Oliveira Barroso, pelo apoio oferecido na
minha chegada em São Paulo.
À Leila Paula de Almeida, que mesmo “desconfiada e assustada com minha
presença, abriu a porta do LEMI e ouviu minha longa história”. Hoje, grande
responsável por várias páginas desta dissertação e da minha vida profissional.
Aos meus amigos, Daniel Archimedes da Matta e Viviane Reis, por me
ensinarem muito do que sei sobre Micologia e amizade.
A todos os amigos do LEMI, em especial: AnaCarolina Azevedo, Fernanda
Pahim, Fernando, Gisela, Patrício Godoy, Mara Stort, Rosângela, Thaís
Guimarães, Thelma Alves, Vinicius Ponzio e Zelinda Nakagawa, que
viii
À Eliete de Miranda Frigatto, por acreditar no meu potencial, pelos
conselhos e além de tudo pela grande amizade.
À Drª. Antônia Maria Machado, pelo constante incentivo e pelas inúmeras
oportunidades profissionais.
À minha família do Laboratório Central, em especial: Ademir Medeiros, Ana
Paula Toledo, Cecília Godoy, Cida Gomes, Clarice Yume, Clayde Barqueta, Elza, Fernando Pereira, Flávia Palomo, Jorge Oliveira, Laíde Santos, Lisete
Liviero, Lourdes, Luciene, Luíza Reis, Madalena, Márcia Pozo, Mirella, Neide,
Regina Corrêa, Vivian Mota e a todos que mesmo não citados me apoiaram e
ouviram meus desabafos, sem vocês nada disso teria sido possível.
À Drª. Márcia Melhem e ao grupo do Instituto Adolfo Lutz, pelo apoio na
aquisição de alguns carboidratos utilizados nos experimentos.
Ao Recni Mohamad Ibrahim, Kafah Mohamad Ibrahim eMarta Younes por
me acolher nos momentos mais complicados e pelo apoio nos momentos finais deste trabalho.
Ao Charles, Cássia, Mirian, André, Wancler por todo apoio oferecido
durante a elaboração desta tese.
À Maria de Jesus Lima dos Santos e Maria de Fátima de Souza
Nascimento, por estarem sempre solícitas e pelos momentos de boas risadas.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para a minha formação acadêmica e me ajudaram a vencer mais uma etapa importante da minha vida.
ix
Dedicatória ... v
Agradecimentos especiais... vi
Agradecimentos ... vii
Listas ... xii
Resumo ... xvi
Abstract... xvii
1
Introdução
... 11.1 Biologia do gênero Trichosporon e sua relevância clínica ... 2
1.2 Infecções causadas pelo gênero Trichosporon ... 4
1.3 Caracterização microbiológica dos casos de infecções por Trichosporon no Brasil ... 7
1.4 Dificuldades na identificação de espécies de isolados de Trichosporon ... 7
1.4.1 Métodos fenotípicos ... 8
1.4.2 Uso de ferramentas moleculares na identificação de Trichosporon spp. ... 11
1.5 Desafios terapêuticos e dificuldades na realização de testes de sensibilidade in vitro de amostras de Trichosporon spp. ... 13
2
Objetivos
... 1721. Objetivo geral... 18
2.2 Objetivos específicos... 18
3
Material e Métodos
... 193.1 Seleção das amostras ... 21
x
3.2.2.2 Características bioquímicas da levedura... 24
3.3 Identificação molecular de espécies de Trichosporon... 25
3.3.1 Formação de protoplastos e extração do DNA genômico... 25
3.3.2 Tratamento do DNA com RNAse... 27
3.3.3 Quantificação do DNA... 27
3.3.4 Seleção dos oligonucleotídeos para genotipagem... 28
3.3.5 Reação de PCR... 28
3.3.6 Eletroforese de DNA em gel de agarose... 29
3.3.7 Purificação dos produtos de PCR para a reação de seqüênciamento... 30
3.3.8 Reação de seqüenciamento... 31
3.3.9 Precipitação do DNA e eliminação dos reagentes de PCR... 31 3.3.10 Análise e interpretação da qualidade das seqüências... 32
3.3.11 Análise das seqüências por comparação em bancos genômicos... 32
3.4 Avaliação do perfil de sensibilidade a antifúngicos... 32
3.4.1 Preparo do meio de cultura... 33
3.4.2 Preparação de drogas antifúngicas... 33
3.4.3 Preparo das placas ensaios de microdiluição em caldo... 34
3.4.4 Preparo do inóculo... 34
3.4.5 Realização do ensaio de sensibilidade aos antifúngicos... 35
3.4.6 Leitura e interpretação dos resultados... 36
3.4.7 Caracterização dos resultados das CIMs para os antifúngicos... 36
4
Resultados
... 38xi
4.1.2.1 Identificação molecular do gênero Trichosporon por técnica de
PCR... 41
4.1.2.2 Identificação molecular de espécies de Trichosporon por seqüenciamento da região IGS1 do rDNA... 43
4.1.3 Comparação entre as identificações fenotípica e genotípica... 44
4.2 Perfil de sensibilidade aos antifúngicos... 46
4.2.1 Avaliação dos testes de sensibilidade a Anfotericina B... 46
4.2.1.1 Padronização dos métodos de Etest® e microdiluição em caldo. 46 4.2.1.2 Comparação da sensibilidade a anfotericina B de isolados clínicos de Trichosporon por microdiluição em caldo e Etest®... 47
4.2.1.3 Impacto do tempo de leitura no padrão de sensibilidade de Trichosporon spp. à anfotericina B... 49
4.2.1.4 Impacto do tempo de leitura no padrão de sensibilidade de Trichosporon spp. aos azólicos, caspofungina e 5-fluorocitosina. 50 5
Discussão
... 526
Conclusões
... 657
Referências Bibliográficas
... 67xii
1. Dificuldades na identificação de espécies de isolados de Trichosporon...
9
2. Cepas de referência utilizadas neste estudo... 21
3. Perfil bioquímico esperado para identificação fenotípica de espécies de
Trichosporon segundo adaptação da literatura... 23
4. Resultados de ensaios bioquímicos encontrados neste estudo com cepas de referência CBS e de isolados clínicos de hemoculturas de
Trichosporon spp. ... 40
5. Identificação fenotípica dos isolados de Trichosporon spp. ... 41
6. Identificação genotípica dos isolados de Trichosporon spp. ... 44
7. Identificação dos isolados de Trichosporon spp. por dois diferentes
métodos: clássico e molecular... 45
8. Variação das CIMs dos antifúngicos por microdiluição e Etest® das cepas de referência... 47
9. Comparação da sensibilidade a anfotericina B de isolados clínicos de
xiii
1. Representação esquemática do locus do rDNA. Os retângulos azuis indicam regiões transcritas funcionais. Adaptada de Sugita, et al.
(2002)... 28
2. Géis de agarose da PCR utilizando os oligonucleotídios TRF e TRR... 42
3. Géis de agarose da PCR utilizando-se os oligonucleotídios 26SF e 5SR... 43
4. Regressão linear das CIMs de na anfotericina B para os 23 isolados de
Trichosporon spp. obtidas por Etest® e microdiluição em caldo... 49
5. Comparação da sensibilidade dos 23 isolados de hemoculturas de
Trichosporon spp. à anfotericina B pelos métodos de microdiluição em
caldo e Etest®... 50
6. Perfil de sensibilidade dos 23 isolados de hemoculturas de
Trichosporon spp. frente aos antifúngicos pelo método de microdiluição
xiv
ATCC American Type Culture Collection
BLAST Basic Local Alignment Search Tool
C Citosina
C Carbono
oC Graus Celsius
CBS Centraalbureau voor Schimmelcultures
CIM Concentração inibitória mínima
CIM0 Concentração inibitória mínima de crescimento visual proeminente
CIM2 Concentração inibitória mínima com completa inibição visual
CIMs Concentrações inibitórias mínima
CIM50 Concentração inibitória mínima de antifúngico capaz de inibir o
crescimento de 50% dos isolados
CIM90 Concentração inibitória mínima de antifúngico capaz de inibir o
crescimento de 90% dos solados
CLSI Clinical Laboratory Standards Institute
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucléico
DO Densidade óptica
EPM Escola Paulista de Medicina
EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético
EUA Estados Unidos da América
EUCAST European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing
et al. E outros
G Guanina
g Gramas
g/L Grama por litro
h Hora
HCl Ácido clorídrico
IGS1 Intergenic spacer 1
ITS1 Internal transcriber spacer 1
ITS2 Internal transcriber spacer 2
LEMI Laboratório Especial de Micologia
LSU Large subunit
NCBI National Center for Biotechnology Information
mg Miligrama
mL Mililitro
mM Milimolar
MOPS Ácido morfolinopropanolsulfônico
N Nitrogênio
xv
NaOH Hidróxido de sódio
NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards
ng Nanogramas
nm Nanômetros
pb Pares de bases
PCR Reação de polimerase em cadeia
pH Potencial hidrogeniônico
pmol Picomol
R Resistente
rDNA DNA ribossomal
RNA Ácido ribonucléico
rpm Rotações por minuto
RPMI Roswell Park Memorial Institute
S Sensível
SDD Sensível dependendo da dose
SDS Dodecil sulfato de sódio
spp. Espécies
SSU Small subunit
TBE Tris bórico EDTA
UFC Unidade formadora de colônia
µL Microlitro
µm Micrômetro
UNIFESP Universidade Federal de São Paulo
UV Ultravioleta
YEPD Yeast Extract Pepton Dextrose
w/v Weight/volume
® Marca registrada
x Vezes
Menor ou igual a Maior ou igual a
% Por cento
xvi
Introdução: Trichosporon tem sido descrito como patógeno oportunista
emergente relacionado às infecções disseminadas em pacientes
imunocomprometidos, sobretudo em indivíduos apresentando neutropenia intensa. É bastante evidente que há poucas informações disponíveis sobre as características das infecções por este patógeno principalmente nos hospitais brasileiros, sendo necessária a realização de estudos que permitam a
caracterização do seu perfil epidemiológico. Objetivos: 1)Identificar por métodos
fenotípicos e genotípicos as espécies de Trichosporon isoladas de hemoculturas
obtidas de pacientes hospitalizados; 2) Adaptar a metodologia do CLSI para a avaliação da sensibilidade a antifúngicos de isolados de Trichosporon spp.; 3)
Avaliar Etest® para predizer a sensibilidade à anfotericina B; 4) Avaliar o perfil de
sensibilidade de diferentes espécies do gênero Trichosporon, em relação a seis
antifúngicos. Material e Métodos: Foram utilizadas 23 cepas de Trichosporon
spp.isoladas de hemoculturas provenientes de dois hospitais terciários da cidade
de São Paulo e coletadas entre os anos de 1995 e 2004. As leveduras foram identificadas em nível de espécie através de características morfológicas e bioquímicas, sendo esta identificação confirmada por estudos moleculares. Para tanto, foi amplificada a região 18S do rDNA para a confirmação da identificação do gênero e realizado o seqüenciamento da região IGS1 para confirmação da identificação de espécie. A avaliação da sensibilidade aos antifúngicos foi realizada por dois diferentes métodos: microdiluição em caldo e difusão em ágar
por Etest®. Resultados: A identificação fenotípica foi comparada com a
genotípica demonstrando algumas incongruências quanto às duas metodologias.
Três isolados foram erroneamente identificados como: T. asteroides
(identificação molecular: T. asahii var. asahii); T. inkin (identificação molecular: T.asahii var. asahii) e T. asahii (identificação molecular: T. asteroides), enquanto
que quatro isolados não foram identificados em nível de espécie pelo método fenotípico. Houve 61 % de concordância entre as duas metodologias, sendo T. asahii a espécie mais freqüentemente identificada na presente série. Anfotericina
B foi o único antifúngico testado pelas duas metodologias. As CIMs da microdiluição em caldo apresentaram-se distribuídas em menor espectro de diluições, enquanto que no Etest® as CIMs apresentaram-se num largo espectro.
Os isolados de T. asahii apresentaram CIMs mais elevadas e menores índices de
sensibilidade a anfotericina B, por ambos os métodos, quando comparados com
isolados de T.não-asahii. Houve elevada sensibilidade aos azólicos. Em
contrapartida, 5-fluorocitosina e caspofungina não apresentaram atividade in vitro
contra estes isolados. Conclusão: O seqüenciamento da região IGS1 foi
suficiente para a identificação de todos os isolados clínicos incluindo espécies geneticamente relacionadas. Mesmo utilizando número limitado de cepas,
observamos que os triazólicos apresentaram melhor padrão de atividade antifúngica
xvii
Introduction: The genus Trichosporon has been described as an emergent
opportunistic pathogen related to disseminated infections in immunocompromised patients, specifically those individuals with intense neutropenia. It is highly evident that there is not enough information available about the characteristics of the infection caused by this pathogen, mainly in Brazilian hospitals. Therefore, it is important to investigate trichosporonosis epidemiology. Objectives: 1) To identify strains isolated from blood cultures using phenotypic and genotypic methods. 2) To adapt CLSI methodology for the evaluation of Trichosporon spp. sensitivity to
antifungal drugs. 3) To evaluate Etest® for predicting sensitivity to Amphotericin B. To evaluate the sensitivity profile of different Trichosporon species to 6 antifungal
drugs. Material and methods: We analyzed 23 strains of Trichosporon spp.
recovered from blood cultures of two tertiary hospitals in São Paulo and collected between 1995 and 2004. The yeasts were identified to species level based on their morphological and biochemical characteristics and subsequently by molecular biology. For those purposes, we amplified the18S rDNA region to confirm genus identification and sequenced the IGS1 region of rDNA to confirm species phenotypic identification. We used two different methods to investigate sensitivity to antifungal drugs: broth microdilution and agar-diffusion disk test using Etest®. Results: We observed some incongruences between the phenotypic and genotypic methods used for identification. Three isolates were misidentified as T. asteroids (molecular
identification: T. asahii var. asahii). T. inkin (molecular identification: T. asteroids),
while four isolates could not be identified to species level using phenotypic methods. The two different methods agreed on 61% of the cases. T. asahii was the most
commonly isolated species in the present study. Amphotericin B was the only antifungal drug tested with both methodologies. Broth microdilution MICs were less variable within different dilutions, while Etest® MICS showed broader variation. T. asahii isolates had higher MICs values and were less susceptible to Amphotericin B
for both methods than Non-AsahiiTrichosporon. The isolates were highly sensitive to
azoles. Nevertheless, 5-fluorocitosin and caspofungin had no in vitro activity against
the clinical isolates analyzed. Conclusion: The IGS1 region sequencing was enough
1.1- Biologia do gênero Trichosporon e sua relevância clínica
Leveduras do gênero Trichosporon estão amplamente distribuídas na
natureza, sendo encontrados predominantemente em zonas tropicais e temperadas. Usualmente, este fungo basidiomiceto é encontrado em materiais procedentes do meio ambiente principalmente no solo e madeiras em decomposição. Ocasionalmente, pode fazer parte da microbiota permanente do trato gastrointestinal, da microbiota transitória da pele e do trato respiratório de humanos (Walsh, et al., 1990; Walsh, et al., 1992; Lussier, et al., 2000; Walsh, et al., 2004).
O gênero Trichosporon é caracterizado por apresentar artroconídios e
blastoconídeos, além de hifas e pseudo-hifas. No entanto, algumas espécies possuem outras características que as diferenciam morfologicamente, como apressoria e macroconídios, ou conidiação meristemática. Todas as espécies deste gênero são capazes de assimilar grande número de carboidratos e nitrogênio, além de degradar a uréia. A cultura em ágar Sabouraud dextrose permite o crescimento de colônias leveduriformes com matiz de coloração que varia do branco ao bege, apresentando, na maioria das vezes, aspecto característico com sulcos cerebriformes radiados em sua superfície (De Hoog,
et al., 2000).
O gênero Trichosporon foi criado em 1890, para posicionar alguns
fungos causadores de micoses superficiais em humanos, Trichos = pêlos e
sporon = esporos. Este gênero, assim como a espécie Trichosporon beigelli, foi
descrito originalmente a partir da observação clínica de pacientes com nódulos em cabelos e pêlos. Durante anos as micoses superficiais foram consideradas
menos importantes na micologia médica. T. beigelli era conhecido como um
fungo saprófita ambiental, apenas ocasionalmente encontrado como agente de piedra branca, sendo a primeira publicação de infecção sistêmica causada por
Passaram-se mais de três décadas para a importância médica desse fungo ser reconhecida (Hoy, et al., 1986; Walsh, et al., 1986; Anaissie, et al.,
1989; Walsh, et al.,1989; Herbrecht, et al.,1992).
Trata-se de um gênero estritamente anamórfico, com história complexa quanto à sua nomenclatura, o que tem gerado grandes controvérsias. A
primeira descrição de possíveis isolados clínicos de Tichosporon spp. foi feita
em 1867, a partir do cultivo de nódulos de piedra branca, onde foram observadas células arredondadas, tendo sido o agente etiológico
equivocadamente designado como uma alga, Pleirococcus beigelli
(Rabenhorst, 1867). Posteriormente, Behrend (1890) descreveu
detalhadamente o fungo isolado de piedra branca de barba, com o nome de
Trichosporon ovoides. Desde então, outros isolados de Trichosporon spp.
foram relatados. Em 1902, Vuillemin considerou todas as espécies de
Trichosporon como Trichosporon beigelli, que significa levedura artrosporada
(Guého, De Hoog, Smith, 1992).
Em 1910, Beurmann cultivou um fungo isolado de lesão cutânea
denominando-o Oidium cutaneum. Este foi subseqüentemente renomeado de
Tricosporon cutaneum por Ota em 1926. Contudo, Diddens e Lodder (1942)
consideraram T. beigelli e T. cutaneum como sendo da mesma espécie. Esta
situação levou a uma drástica simplificação do gênero para somente dois nomes com relevância clínica, considerados sinônimos e usados
rotineiramente, a saber: Trichosporon beigelli, adotado por clínicos e
Trichosporon cutaneum, preferido por micologistas ambientais (Guého, De
Hoog, Smith, 1992).
A utilização de critérios macromorfológicos, micromorfológicos, ecológicos e fisiológicos não são suficientes para permitir maior caracterização
do gênero Trichosporon, visto que aglutina no mesmo taxon, isolados de
comportamento genético muito heterogêneo. Este gênero abrangia tradicionalmente poucas espécies, até a revisão taxonômica realizada por Guého, et al., (1992), baseada em estudos moleculares de ácidos nucléicos,
critérios utilizados para reclassificar as espécies de Trichosporon, baseados
nos novos conceitos taxonômicos, foram: a análise da ultra-estrutura dos poros septais, conteúdo Guanina-Citosina (mol % G - C), valores de reassociação do ácido desoxirribonucléico (DNA), perfil nutricional e seqüência parcial da região 26S do DNA ribossomal (rDNA). As seqüências do rDNA e os valores de reassociação DNA/DNA, foram usados como os critérios mais importantes para a demarcação de espécie.
O taxon T. beigelli não foi mantido e como resultado foram propostas
seis espécies patogênicas para substituir tal designação. T. beigelli foi
considerado um dos taxa mais heterogêneos. (Gueho, et al., 1992; Sugita, et al., 1994; Sugita, et al., 1995). Consequentemente, a utilização de ferramentas
moleculares foi fundamental para permitir maior consistência na nova taxonomia deste gênero.
Posteriormente, Guého, et al., (1994) e Sugita, et al., (1994, 1995)
fizeram uma revisão de espécies clinicamente significativas e propuseram uma nova classificação. Com estes trabalhos, 17 espécies e 5 variedades foram
aceitas para o gênero Trichosporon. Estes autores sugeriram ainda que o taxon
Trichosporon beigelli englobasse seis patógenos para a espécie humana: Trichosporon cutaneum, Trichosporon asahii, Trichosporon asteróides, Trichosporon mucoides, Trichosporon inkin e Trichosporon ovoides. Em estudo
recente Sugita et al., (2002) propuseram 25 espécies para o gênero
Trichosporon, sendo que entre estas espécies 8 teriam relevância na Micologia
Médica, incluindo duas espécies emergentes em infecções invasivas: T.
pullulans e T. loubieri.
1.2- Infecções causadas pelo gênero Trichosporon
Trichosporon tem sido descrito como patógeno oportunista emergente
As espécies de Trichosporon estão associadas a um amplo espectro de
infecções, incluindo, na maioria das vezes, lesões superficiais benignas como
piedra branca, predominantemente causada por T. inkin (em pêlos pubianos) e
por T. ovoides (em cabelos) ou infecções cutâneas superficiais, onde as
espécies mais isoladas são T. cutaneum e T. asteroides. Podem causar ainda
infecções invasivas onde os agentes mais associados são T. asahii, seguido de
T. mucoides. No Japão, diversos autores têm documentado que T. asahii pode
causar quadros de pneumonia alérgica (Thérizol-Ferley et al., 1994;
Kataoka-Nishimura, et al., 1997; Nishiura, et al., 1997; Yoo, et al., 1997, Groll, Walsh,
2001). Duas espécies emergentes também relacionadas a infecções, habitualmente superficiais em humanos têm sido descritas na literatura:
Trichosporon pullulans e Trichosporon loubieri (Lascaux, et al., 1998; Krcmery, et al.,1999; Padhye, et al., 2003).
Trichosporon é o agente mais comum de piedra branca, que se
caracteriza pela presença de nódulos irregulares ao longo dos pêlos acometidos, sendo necessário cultivo para diagnóstico diferencial de
Corynebacterium spp (Lacaz, et al., 2002). Estes nódulos podem apresentar-se
de cor branca ou marrom clara. Piedra branca é uma infecção cosmopolita que pode ser encontrada nos pêlos da barba, bigode, axilas e genitálias (Arêa Leão, 1940; Thérizol – Ferley et al., 1994; Kataoka-Nishimura, et al., 1997;
Groll, Walsh, 2001). Outros tipos de infecções superficiais causadas por
Trichosporon spp. incluem onicomicoses e otomicoses (Reirsol, 1955; Fusaro,
Miller, 1984).
A incidência de micoses invasivas por fungos patogênicos oportunistas tem crescido consideravelmente ao longo das últimas décadas (Trick, et al.,
2002; Ostrosky-Zeichner, et al., 2003; Pfaller, et al., 2004; Walsh, et al., 2004;
Karabay, et al., 2006). Este fato está provavelmente relacionado a alguns
al., 2004; Walsh, et al., 2004). Vale destacar que, geralmente, as infecções
fúngicas invasivas estão associadas com alta mortalidade e prognóstico reservado (Tashiro, et al.,1994).
As infecções invasivas por Trichosporon spp. são geralmente precedidas
da colonização do trato respiratório ou gastrointestinal, sendo comum nestes pacientes a presença de cateter venoso em posição central (Walsh, et al.,
1990; Walsh, et al., 1992; Lussier, et al., 2000; Walsh, et al., 2004). O gênero Trichosporon tem sido relatado como a segunda causa mais comum de
infecções por leveduras após o gênero Candida, em pacientes com doenças
hematológicas malignas, casos onde a mortalidade é da ordem de 80%,
mesmo na vigência terapêutica com anfotericina B (Krcmery et al., 1999;
Flemming, et al., 2002; Walsh, et al., 2004).
As infecções disseminadas por Trichosporon spp. possuem distribuição
mundial, sendo conhecidos relatos de casos em diferentes cenários clínicos.
Kataoka-Nishimura, et al., (1997) relataram 11 casos de fungemia por
Trichosporon cutaneum num Hospital de Tokio entre 1986 e 1996 onde 9
pacientes eram portadores de doença hematológica maligna. Manzella, et al.,
(1982) reportaram um caso de fungemia com disseminação cutânea por
Trichosporon spp. em um indivíduo com leucemia granulocítica, enquanto que
no caso descrito por Itoh et al., (1996), a paciente apresentava como doença
de base leucemia linfocítica. Outros relatos de tricosporonose invasiva foram publicados por Kirmani, et al., (1980), Hebwick, et al., (1992),
Kataoka-Nishimura, et al., (1998); Kim, et al., (2001), Meyer, et al., (2002), Yang, et al.,
(2002), Rodrigues, et al., (2006). Segundo estes autores a maioria dos
pacientes com este tipo de infecção apresentava neutropenia intensa. As manifestações clínicas descritas nos casos de disseminação hematogênica incluem febre, múltiplas lesões cutâneas, presença de infiltrados pulmonares, envolvimento neurológico, corioretinites e até mesmo choque séptico com falência renal. Aparentemente, a espécie mais associada a este tipo de infecção é T. asahii (Walsh, et al., 1986; Hoy, et al., 1986; Walsh, et al., 1989;
1.3- Caracterização microbiológica dos casos de infecções por
Trichosporon no Brasil
No Brasil, em concordância com a literatura, a maioria dos estudos tem
relatado a ocorrência de infecções superficiais por Trichosporon spp., incluindo
casos de onicomicoses e piedra branca. Entretanto, na maioria das vezes, a identificação em categoria de espécie não é realizada (Pontes, et al., 2002a;
Pontes, et al., 2002b). Febré, et al., (1999) caracterizaram 2 amostras de Trichosporon isoladas de urina de pacientes no centro de tratamento intensivo
(CTI) em uso de sonda vesical. As amostras eram de T. inkin e T. ovoides,
ambas resistentes a anfotericina B. Em 2002, Neves, et al. isolaram uma cepa
de cavidade oral. O isolado foi identificado como T. pullulans, porém não foi
realizado teste de sensibilidade a antifúngicos.
Em relação a episódios de doença invasiva, Rodrigues, et al., (2006)
relataram 22 casos clínicos de tricosporonoses por T. asahii isolados de 30
amostras clínicas (sendo: 23 de urina, 3 de sangue, 2 de líquido de ascite, 1 de líquido de diálise e 1 de líquido pleural) num período de 1999 a 2005.
Moretti-Branchini, et al., (2001) postularam 2 casos de infecção invasiva por
Trichosporon em pacientes transplantados de medula óssea no Hospital das
Clínicas da Universidade de Campinas, do Estado de São Paulo (Unicamp). Um dos portadores apresentou cultura de ponta de cateter e swab anal
positivos para T. inkin, sendo o mesmo tratado com fluconazol e apresentando
sucesso terapêutico. O segundo paciente desenvolveu neutropenia intensa devido à quimioterapia, apresentando em seguida hemocultura positiva em que
o isolado foi identificado primeiramente como Candida spp. Posteriormente
verificou-se que se tratava de Trichosporon asahii var. asahii. O paciente foi
tratado com anfotericina B, mas evoluiu para óbito.
1.4- Dificuldades na identificação de espécies de isolados de
Trichosporon
Vários métodos para a identificação de espécies de Trichosporon têm
o uso de ferramentas moleculares. Os métodos fenotípicos são utilizados em
laboratórios de rotina, mas sua acurácia parece limitada (Gueho, et al., 1992;
Sugita, et al., 1994; Sugita, et al., 1995; Walsh, et al., 2004). Por outro lado,
métodos moleculares oferecem maior exatidão na identificação, mas ainda são pouco compatíveis com as exigências de custos e praticidade de laboratórios de rotina (Sugita, et al., 2002; Rodriguez-Tudela, et al., 2005).
1.4.1- Métodos fenotípicos
Os métodos fenotípicos disponíveis são baseados em análises micromorfológicas e bioquímicas, e freqüentemente apresentam resultados inconsistentes para identificação de espécies de Trichosporon. Vale ressaltar
que a maioria destes métodos não contempla as novas categorias taxonômicas em seus bancos de dados. Além disso, para laboratórios interessados em realizar identificação pelas provas clássicas, alguns substratos recomendados para provas bioquímicas não são comercialmente disponíveis, a exemplo de
DL-lactato e D-glucosamina (Dooley, Beckius, Jefrey, 1994; Fenn, et al., 1994;
Ramani, et al., 1998).
Tabela 1. Utilização de diferentes substratos na caracterização bioquímica das
espécies de Trichosporon com relevância clínica, segundo a experiência de 3
investigadores.
Cepas T. asahii CBS
(2530) T.cutaneumCBS (2466) T.inkin(5585) CBS T. mucoidesCBS (7625) CBS (7556) T.ovoides T.CBS (2481) asteroides
Provas Autores 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
L-arabnose + + + + + + - - v + + + - v - + + +
Sorbitol v - v v + v v - v + + + v - V v v v
Melibiose - - - - + + - - - + + + - - - + - -
A
ss
im
ila
çã
o
Inositol v - v + + + + v + + + + + - + + + +
Crescimento a 37°C + + + - - - + + + + + + v v + v + v
Crescimento em presença de
0,1 % ciclohexamida n + - n - - n v v n + v n + - n v n
Formação de apressoria - - - + + + - - - + + + - - n
1- De Hoog, et al., 2000; 2- Sugita, et al., 1995; 3 – Kurtzman, et al., 1998; (+) positivo; (-) negativo; (v) variável; n= não informado.
Entre os sistemas comerciais não automatizados, a identificação de
espécies do gênero Trichosporon é apresentada de forma simplificada e
incompleta no banco de dados e chaves classificatórias para identificação final deste microrganismo. Os métodos comerciais mais utilizados em laboratórios de rotina são os seguintes:
API 20C AUX (BioMérieux – Vitek, Inc., Hazelwood, Mo.): metodologia baseada na assimilação de 20 carboidratos, requer provas adicionais como macro e micromorfologia, produção de urease e, em sua base de dados não constam as novas categorias taxonômicas do gênero Trichosporon, utiliza-se,
portanto, a única e antiga denominação: Trichosporon beigelli (Espinel-Ingrof, et al., 1998; Ramani, et al., 1998).
RapID Yeast Plus System (Innovative Diagnostic System, Norcross, Ga., EUA): é um método baseado em reações enzimáticas e substratos cromogênicos para a identificação de leveduras clinicamente importantes. Espinel-Ingrof, et al., (1998a). Kitch, et al., (1996) avaliaram a habilidade desta
técnica em identificar 304 isolados clínicos em 4 horas. Nesta metodologia, 12 isolados clínicos que foram identificados previamente como diferentes espécies de Trichosporon foram identificadas exclusivamente como Trichosporon beigelli
(taxon que consta na base de dados).
Quanto aos sistemas automatizados, mesmo antes da revisão da
taxonomia do gênero Trichosporon, já eram conhecidas limitações de sua
acurácia:
Vitek System® (BioMérieux Vitek, Hazelwood, EUA): este sistema é baseado em testes de assimilação de carbono e nitrogênio, utiliza provas enzimáticas e de sensibilidade à ciclohexamida. A leitura se faz por espectrofotômetro com tempo de incubação entre 24 e 48 horas para a versão 1 e de 15 horas para a versão 2. Necessita provas adicionais de micromorfologia. Seu banco de dados está progrmado para identificar somente 3 espécies, T. asahii, T. inkin e T. mucoides. Além disso, foram reportadas
incongruências nas identificações de T. inkin, erroneamente identificadas como
sendo Trichosporon asahii por este sistema (Fenn, et al., 1994; Huang, et al.,
2001; Ahmad, et al., 2005).
Baxter MicroScan® (Baxter MicroScan, West Sacrament, EUA): permite a identificação de leveduras em 4 horas. Este método avalia o perfil enzimático do organismo. A leitura é fluorométrica e espectrofotométrica e pode requisitar macro e micromorfologias como testes adicionais. A acurácia desta técnica é menor que a obtida no Vitek. Vários pesquisadores experimentaram
dificuldades com a identificação de Trichosporon spp. utilizando esta
Diante de todas as limitações mencionadas para a identificação em nível de espécie por diferentes métodos fenotípicos, além das incongruências entre os resultados gerados por diferentes autores, muitas publicações a respeito de
Trichosporon spp. caracterizam os isolados clínicos apenas como T. asahii e T.
não-asahii. Portanto, torna-se necessária a identificação acurada de todas as
espécies a fim de avançarmos no real entendimento da epidemiologia deste agente, bem como de suas peculiaridades terapêuticas (Walsh, et al., 1990;
Perparim, et al., 1996; Uzun, et al., 2000; Arikan & Hasçelik, 2002).
1.4.2- Uso de ferramentas moleculares na identificação de Trichosporon
spp.
Na tentativa de melhorar a acurácia da identificação deste microrganismo, métodos baseados no estudo do DNA para identificação de espécies têm sido propostos como uma alternativa precisa e segura, já que apresentam maior estabilidade dos caracteres ao longo do tempo, alta reprodutibilidade e objetividade na interpretação dos resultados (Pfaller, et al.,
1995).
Alguns autores sugerem que comparação direta de seqüências de nucleotídeos possa ser um método objetivo para a resolução dos problemas de taxonomia e identificação fenotípica de espécies de Trichosporon. Para este
tipo de abordagem as sequências mais conservadas e espécies-específicas são representadas por genes ribossomais. Estes genes têm regiões muito conservadas, alternadas por regiões variáveis, ideais para comparações intra- específica e interespecífica (Sugita, et al., 1997, 1998).
Nos últimos anos, métodos de biologia molecular têm mudado a
taxonomia do gênero Trichosporon de forma significativa (Gueho, et al., 1992;
Sugita, et al., 1994). Sugita et al., (1998) descreveram uma árvore filogenética
CTA CCA TGG TAT CA – 3’) e TRR (5’ – TAA GAC CCA ATA GAG CCC TA – 3´), que amplificam parte da região SSU do rDNA, foram utilizados para a
confirmação da identificação do gênero Trichosporon, já que estes
oligonucleotídios não hibridizam em regiões conservadas do gene ribossômico de outras leveduras de importância médica (Sugita, et al., 2002).
Posteriormente, na tentativa de classificar cepas em nível de espécie,
Sugita, et al., (1999) seqüenciaram e analisaram as regiões dos genes
espaçadores transcritos internos (internal transcriber spacer - ITS1 e ITS2) de
Trichosporon spp. e propuseram 17 espécies e cinco variedades dentro do
gênero Trichosporon. Com estas informações, os autores concluíram que as
seis espécies clinicamente relevantes poderiam ser identificadas por suas seqüências de ITS.
Em estudo recente, Sugita et al., (2002) determinaram a seqüência da
região espaçadora intergênica (intergenic spacer - IGS1) que está localizada
entre os genes 26S e 5S do rDNA em 25 espécies de Trichosporon. A
seqüência da região IGS1 variou em comprimento de 195 pares de base (pb) a
704 pb. A análise comparativa das seqüências de nucleotídios sugeriu que
estas variações eram maiores na região IGS1 que as das regiões de ITS. Além disso, estes autores também puderam identificar cinco diferentes genótipos de
T. asahii em 43 cepas desta espécie. Estes autores observaram ainda que a
maioria dos isolados do Japão pertencia ao genótipo 1 e as cepas originárias das Américas (incluindo duas cepas brasileiras) pertenciam ao genótipo 3 ou 5, ressaltando a importância do método no estudo das relações filogenéticas. A utilização desta região do rDNA para seqüenciamento tem grande potencial como ferramenta diagnóstica e epidemiológica nas tricosporonoses, além de estudos sobre filogenia.
Diaz, et al., (2004) utilizaram o método de citometria de fluxo baseado na
tecnologia do Luminex 100 xMAP na identificação das espécies de
Trichosporon através de sondas espécie-específicas. A tecnologia é baseada
diferentes intensidades de cores. O ensaio se baseia na adição de sondas espécie-específicas adicionadas às microesferas que se ligam aos produtos de PCR do DNA alvo ligado a uma molécula de biotina. Através da adição de uma molécula “reporter” (estreptavidina R-ficoeritrina), todos os amplicons espécie-específicos hibridizados pela sua seqüência complementar presente nas microesferas são reconhecidos através da intensidade da fluorescência da estreptavidina quando ligada às moléculas de biotina. Os autores utilizaram sondas obtidas das seqüências de DNA das regiões D1/D2 e ITS. Entretanto, a região IGS foi utilizada para a construção das sondas para aquelas espécies onde as regiões D1/D2 e ITS não são suficientementes discriminatórias para a identificação, por exemplo, para a diferenciação das espécies T. asahii, T. japonicum e T. asteroides. Apesar desta metodologia representar uma
ferramenta eficiente para identificação de espécies de Trichosporon de
importância médica, a realização desta técnica requer a aquisição de um citômetro de fluxo, o que a torna inviável para a aplicação em laboratórios de rotina.
1.5- Desafios terapêuticos e dificuldades na realização de testes de
sensibilidade in vitro de amostras de Trichosporon spp.
A terapia antifúngica com anfotericina B tem resultados controversos em tricosporonoses. Estudos laboratoriais demonstram que muitos organismos deste gênero são relativamente resistentes a esta droga (Anaissie, et al.,
1992). Alguns isolados podem ser inibidos em concentrações seguramente aceitáveis no soro, mas a atuação fungicida da droga não tem sido observada em pacientes granulocitopênicos (Walsh, et al., 1990).
Falhas terapêuticas utilizando fluconazol, anfotericina B e combinações
de ambas as drogas têm sido relatadas. Da mesma forma, há relatos de
isolados de T. asahii naturalmente resistentes a anfotericina B, fluconazol,
itraconazol e 5-fluorocitosina (Wolf, et al., 2001; Paphitou, et al., 2002;
Makimura, et al., 2004). Além disso, as equinocandinas apresentam pouca
atividade contra Trichosporon spp. não sendo recomendadas terapeuticamente
Relatos de tricosporonose disseminada apresentam prognóstico
reservado, com mortalidade superior a razão de 80 % (Krcmery, et al., 1999).
Numa série de 25 pacientes granulocitopênicos que desenvolveram tricosporonose sistêmica e foram tratados com anfotericina B, somente quatro deles sobreviveram, possivelmente devido à recuperação da neutropenia (Hoy,
et al., 1986). Rodrigues, et al., (2006) analisaram 22 casos de tricosporonoses,
destes somente 9 sobreviveram, vale salientar que 7 destes apresentavam somente lesões superficiais.
Davies, et al., (2006) relataram um caso de fungemia em uma paciente
com 71 anos de idade após cirurgia cardíaca e o agente foi identificado como
T. inkin quatro dias após o óbito mesmo na vigência de fluconazol iniciada 2
dias antes do óbito (400mg/dia).
Trichosporon spp. foi isolado de cultura de líquido sinovial de paciente
após o 6° dia de transplante de medula óssea mesmo com terapia de manutenção com acetato de caspofungina. Entretanto, este paciente obteve êxito na terapia com fluconazol (Goodman, et al., 2002).
Matsue, et al., (2006) postularam 4 casos de tricosporonose invasiva por
T. asahii no Japão, sendo que 3 pacientes apresentavam como doença de
base leucemia mielóide aguda e 1 síndrome mielodisplásica, todos tratados com micafungina (150 mg/dia). No entanto, uma melhora clínica foi observada apenas em um dos casos citados após recuperação da neutropenia e terapia com voriconazol.
Apesar dos relatos de tricosporonose invasiva presente em pacientes
apresentando neutropenia, em estudo realizado por Karabay, et al., (2006) nos
Estados Unidos evidenciou-se um caso de fungemia por T. asahii em paciente
Em contrapartida, Fournier, et al., (2002) e Assada, et al., (2006)
obtiveram sucesso no tratamento de infecção disseminada por T. asahii em
pacientes com leucemia mielóide aguda utilizando voriconazol como
monoterapia. Estes dados confirmam sugestões de Paphitou, et al., (2002) que
sugeriram que os novos triazólicos (voriconazol, ravuconazol e posaconazol) são superiores a anfotericina B e a demais antifúngicos no tratamento de tricosporonoses.
Apesar do freqüente aumento dos casos de tricosporonose e relatos de
infecção refratária à terapêutica convencional, estudos sobre a sensibilidade in
vitro de Trichosporon spp. ainda são bastante restritos. As dificuldades na
caracterização de diferentes espécies do gênero, bem como a falta de padronização para testes de sensibilidade in vitro, contribuem para a limitada
informação disponível a este respeito.
No protocolo de microdiluição em caldo do Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI – antigo, National Committee for Clinical Laboratory Standards -
NCCLS) não está incluído o gênero Trichosporon spp. Contudo, os poucos
estudos sobre a sensibilidade in vitro aos antifúngicos de espécies de
Trichosporon utilizam como referência as normas do CLSI (2002),
padronizadas para Candida spp. e Cryptococcus neoformans (Arikan &
Hasçelik, 2002).
Vários autores sugerem que a metodologia de microdiluição em caldo apresenta dificuldades na detecção de isolados resistentes a anfotericina B visto que tal método gera estreita variação entre as concentrações inibitórias mínima (CIMs) obtidas com diferentes amostras clínicas. Conseqüentemente, valores de corte para este antifúngico ainda não foram estabelecidos até hoje. (Chaturvedi, et al., 2004; Hospenthal, et al., 2004).
microdiluição em caldo do CLSI (Pfaller, et al., 1990; Arikan & Hasçelik, 2002;
Paphitou, et al., 2002).
Estes resultados de estudos in vitro e in vivo sugerem que infecções por Trichosporon spp. podem ser refratárias às principais drogas disponíveis
comercialmente, tornando este cenário clínico um desafio terapêutico a ser vencido. Recentemente, há indícios de que voriconazol seja uma opção terapêutica para infecções por Trichosporon spp. (Fourneir, et al., 2002;
Paphitou, et al., 2002).
Torna-se evidente que há poucas informações disponíveis sobre as características das infecções por este patógeno principalmente nos hospitais brasileiros, sendo necessária a realização de estudos que permitam a
caracterização do perfil epidemiológico da infecção por Trichosporon no Brasil,
2.1- Objetivo geral
Este trabalho tem por finalidade identificar fenotipicamente e genotipicamente 23 amostras clínicas isoladas de hemoculturas de
Trichosporon spp. de pacientes hospitalizados, além de avaliar a sua
sensibilidade a seis antifúngicos.
2.2- Objetivos específicos
2.2.1- Identificar fenotipicamente as espécies de Trichosporon isoladas de
hemoculturas obtidas de pacientes hospitalizados;
2.2.2- Confirmar genotipicamente a identificação destas amostras utilizando os
oligonucleotídeos TRF e TRR específicos ao gênero e sequenciamento da
região IGS1 para a identificação da espécie;
2.2.3- Adaptar a metodologia do CLSI para avaliação da sensibilidade a
antifúngicos de isolados de Trichosporon spp.;
2.2.4- Avaliar a acurácia da técnica de Etest® para predizer a sensibilidade à
anfotericina B entre isolados clínicos de Trichosporon spp. ;
2.2.5- Comparar o perfil de sensibilidade de diferentes espécies do gênero
3.1- Seleção das amostras
Foram utilizadas 23 cepas de Trichosporon spp. isoladas de
hemoculturas e coletadas entre os anos de 1995 e 2004. As amostras clínicas envolvidas no estudo foram oriundas dos seguintes centros médicos brasileiros: Hospital São Paulo e Hospital do Servidor Público Estadual, ambos na cidade de São Paulo-SP, Brasil. Estes isolados foram encaminhados para o
Laboratório Especial de Micologia (LEMI/UNIFESP-EPM), sendo
posteriormente armazenados no banco de microrganismos congelados a -70°C em meio caldo de Yeast Extract Pepton Dextrose (YEPD - Peptona Oxoid 20 g/L; dextrose 20 g/L; Extrato de leveduras Oxoid 10 g/L) acrescido de 20 % de glicerol.
Além dos isolados clínicos, foram utilizadas em cada ensaio de testes de
sensibilidade aos antifúngicos uma cepa de Candida parapsilosis (ATCC
22019) outra de C. krusei (ATCC 6258) como organismos-controle para análise
destes ensaios, visto que seus resultados das concentrações inibitórias
mínimas (CIM) são previamente conhecidos. As cepas de Trichosporon asahii
(CBS 2479 e CBS 2530), Trichosporon mucoides (CBS 7625), Trichosporon
inkin (CBS 5585), Trichosporon asteroides (CBS 2481) e Trichosporon ovoides
(CBS 7556) foram utilizadas como parâmetros de comparação para os estudos fenotípicos e moleculares de identificação de espécies, bem como para avaliar a reprodutibilidade dos testes de sensibilidade aos antifúngicos para isolados de Trichosporon spp. Além disso, as cepas de Candida albicans (ATCC 90028)
e C. parapsilosis (ATCC 22019) foram utilizadas para confirmar a
Tabela 2. Cepas de referência utilizadas neste estudo.
3.2- Identificações fenotípicas e genotípicas dos isolados clínicos
As leveduras foram identificadas em nível de espécie através de características micromorfológicas e bioquímicas (identificação fenotípica), sendo esta identificação confirmada por estudos moleculares (identificação genotípica).
3.2.1- Avaliação da pureza e viabilidade das amostras
As amostras armazenadas a -70° C foram semeadas em meio
cromogênico seletivo CHROMagar Candida® (Microbiology Paris), para
certificação da pureza do cultivo e viabilidade das colônias. Após 48 h de incubação a 35° C, foram selecionadas as colônias d e mesma cor, sendo em seguidas subcultivadas, com 2 repiques sucessivos após 48 h de incubação a 35° C cada, em ágar Sabouraud dextrose (enzimatic d igest casein 20 g/L, dextrose 40 g/L, ágar bacteriológico15 g/L e cloranfenicol 0,05 g/L- Difco,
Becton, Dickinson and Company, EUA)para posterior identificação.
3.2.2- Perfil fenotípico
A identificação inicial do gênero foi baseada em aspectos micro e macromorfológicos da colônia. A identificação fenotípica em nível de espécie foi baseada em resultados de testes bioquímicos de assimilação e fermentação
N° da coleção de cultura de origem Espécie CBS 2530 T. asahii var. asahii CBS 2479 T. asahii var. asahii
CBS 7625 T. mucoides
CBS 5585 T. inkin
CBS 7556 T.ovoides
CBS 2481 T. asteroides
ATCC 90028 C. albicans
ATCC 6258 C. krusei
ATCC 22019 C. parapsilosis
de carboidratos e assimilação de compostos nitrogenados. Para a interpretação do perfil bioquímicos das culturas, na busca de identificação de espécie, utilizamos os resultados resumidos na Tabela 3 que foi constituída com dados
obtidos pelo trabalho de Rodriguez-Tudela, et al., 2005 e na base de dados do
CBS (http://www.cbs.knaw.nl/databases).
3.2.2.1- Avaliação de características morfológicas
Sob o ponto de vista macroscópico, observaram-se colônias com aspecto cerebriforme. Na análise microscópica destas culturas foram pesquisadas a presença de: artroconídios, blastoconídios, formação de apressoria, células gigantes apicais e células em forma de barril. Para tanto, foi realizado microcultivo: com auxílio de alça de platina, a colônia de levedura
suspeita de Trichosporon spp. foi semeada em três estrias paralelas em placa
de Petri contendo o meio ágar fubá adicionado de Tween 80 (fubá 40 g, Tween
M
at
er
ia
l e
M
ét
o
d
o
s
23
Espécies
Testes T.asahii T.asteroides T.cutaneum T.inkin T.ovoides T.mucoides T. dermatis T. jirovecci
Prova da urease + + + + + + + +
Assimilação de L-Arabnose + v + - - + + +
Assimilação de Galactitol - - - - - + v +
Assimilação de Inositol - + + + - + + +
Assimilação de Melibiose - - + - - + + +
Assimilação de Raffinose - - + - v + + +
Assimilação de Rhamnose + v + - + + + +
Assimilação de Ribose v - + - - + + v
Assimilação de Xylitol v v + - v + + v
Crescimento a 37°C + v - + v + + -
Formação de Apressoria - - - + + - - -
(+) teste positivo; (-) teste negativo; (v) teste variável; N/I não informado.
3.2.2.2- Características bioquímicas da levedura
a) Assimilação de carboidratos e de Nitrogênio (auxanograma) Para o teste de assimilação de carboidratos, foi utilizado meio C (sulfato de amônio 5 g; fosfato de potássio monobásico 1 g; sulfato de magnésio 0,5 g; ágar bacteriológico 20 g - Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA e água destilada – q.s.p. 1000 mL) destituído de qualquer fonte de Carbono, ao qual foi adicionada suspensão da levedura a ser testada, com turbidez previamente ajustada à escala n° 0,5 de McFarland. Após a solid ificação do meio, alíquotas de diferentes açúcares foram distribuídas de forma eqüidistante sobre o ágar. Para controle positivo do teste utilizou-se dextrose. As placas de Petri foram incubadas a 30° C por 72 horas, por um período de a té 2 semanas. De forma complementar, foram realizadas as provas de assimilação de Nitrogênio e aminoácidos, utilizando-se a mesma metodologia previamente descrita para o teste de assimilação de carboidratos, utilizando-se o meio N (dextrose 20 g; fosfato de potássio monobásico 0,5 g; ágar bacteriológico 16,5 g; água destilada q.s.p. 100 mL) e adicionado de alíquotas de compostos nitrogenados, onde foram realizadas leituras seqüenciais a cada 24 horas por um período de até 1 semana. Para controle positivo do teste utilizou-se peptona (Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA). A positividade para ambos os testes foi avaliada pelo surgimento de halo de turbidez na área correspondente a cada substrato adicionado (Lacaz, et al., 2002; Sidrim, Rocha, 2004).
b) Fermentação de açúcares (zimograma)
anteriormente). Os tubos foram incubados a 30° C po r até três semanas. Foram realizadas leituras seqüenciais a cada 24 horas na 1° semana, e 2 leituras por semana posteriormente. A positividade do teste foi avaliada pela presença de bolhas de gás na parte superior dos tubos de Durham indicando ter ocorrido fermentação de carboidratos (Lacaz, et al., 2002; Sidrim, Rocha,
2004).
c) Prova de hidrólise da uréia
O teste da urease foi realizado utilizando-se o meio de Christensen – Probac do Brasil (peptona 1 g; cloreto de sódio 5 g; fosfato de potássio monobásico 2 g; glicose 5 g ágar bacteriológico 20 g - Difco, Becton, Dickinson and Company, EUA; água destilada - q.s.p. 100 mL). As amostras foram semeadas no referente meio com o objetivo de se observar produção de urease. A ocorrência de hidrólise da uréia foi observada através da mudança da coloração do ágar, do amarelo para róseo intenso, indicado pelo vermelho de fenol (indicador de pH) devido à alcalinização do meio de cultura. Os tubos
foram incubados a 30° C e observados por até 48 hor as (Lacaz, et al., 2002;
Sidrim, Rocha, 2004).
3.3- Identificação molecular de espécies de Trichosporon
Os 23 isolados de hemocultura, previamente identificadas por métodos
fenotípicos, foram submetidas a métodos moleculares para confirmação da identificação de espécie.
3.3.1- Formação de protoplastos e extração do DNA genômico
Uma unidade formadora de colônia (UFC) de cada levedura foi semeada
em placa de ágar Sabouraud dextrose e incubada a 30° C durante 48 horas.
Para a extração de DNA genômico, foi utilizado o protocolo de Wach, et.
al., (1994) com algumas modificações. Para obtenção do pré-inóculo, uma UFC
constante durante 12 horas a 200 rpm, 35° C. Poster iormente, foram transferidos 200 µL do pré-inóculo de cada amostra para tubos Falcon de 15 mL contendo 2 mL de YEPD, em triplicata com a finalidade de obter-se maior quantidade de
massa celular. Os tubos foram incubados por mais 12 h a 35° C, 200 rpm. Em
seguida, células dos três tubos referentes a cada amostra foram transferidas para um único tubo, sendo o mesmo posteriormente centrifugado e desprezado o sobrenadante. Alíquota de 1,3 mL do sedimento da cultura foi transferida para um tubo de microcentrifugação, com capacidade para 1,5 mL (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), sendo o mesmo centrifugado a 6.000 rpm durante 3 minutos. O meio de cultura remanescente foi removido e as células lavadas em 1 mL de água milli-Q esterilizada por duas vezes sob as mesmas condições de centrifugação previamente citadas.
As células foram homogeneizadas em 200 mL de tampão protoplasto (10
µL de -mercaptoetanol Pharmacia Biotech; 100 µL de Tris-HCl pH 7,5 100 mM;
20 µL de EDTA 10 mM e 0,2 mg de zymoliase 20.000 ICN Biomedical Inc. adicionada na hora do uso e 870 µL de H2O miliQ esterilizada) e incubadas por 3 horas a 37° C. Alíquota de 200 µL de tampão de li se (20 µL de NaOH 10 N; 100 µL de SDS 10 %; 40 µL de proteinase K - 20 U/mL, INVITROGEN; 880 µL de H2O miliQ esterilizada) foi adicionada à suspensão celular, sendo o tubo incubado a 65° C por 1 hora e em seguida resfriado rapidamen te no gelo. Para precipitar as proteínas e restos celulares, foram adicionados 200 µL de acetato de potássio 5M pH 5,4 ao tubo de microcentrifugação sendo este incubado no gelo por 15 minutos. A suspensão foi centrifugada a 13.400 rpm por 10 minutos e o sobrenadante transferido para outro tubo de microcentrifugação. Quando necessário, a centrifugação foi repetida sob as mesmas condições previamente descritas.
por inversão do tubo e incubado à temperatura ambiente por 10 minutos e
novamente centrifugado por 10 minutos a 13.400 rpm, temperatura ambiente.
A lavagem com etanol foi repetida, o pellet seco por 10 minutos à temperatura ambiente e o DNA dissolvido em 50 µL de água milli-Q esterilizada.
3.3.2- Tratamento do DNA com RNAse
Para remoção de RNA, os tubos contendo 50µL de DNA foram adicionados de 48 µL de água milli-Q esterilizada, 1 µL de tris-HCl 1 M pH 7,5 e 1 µL de RNAse a 10 mg/mL (MPbio, Qbiogene, EUA) e colocados em banho-maria a 37° C por 1 hora. O DNA foi precipitado com a adi ção de 10 µL de acetato de
sódio 3 M e 22 0µL de etanol absoluto gelado. A suspensão foi homogeneizada
por inversão do tubo, e incubada por 10 minutos no gelo e centrifugada por 15 minutos em 14.000 rpm a 4° C. O etanol foi retirado e o precipitado seco por 10 a 15 minutos à temperatura ambiente. A dissolução completa do DNA foi realizada em 50 µL de água milli-Q esterilizada.
3.3.3- Quantificação do DNA
Alíquotas de 5 µL de DNA foram diluídas em tubos contendo 1 mL de água destilada. Em seguida, a absorbância foi aferida em espectofotômetro
(GeneQuantpro, Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, Inglaterra) em
DO260nm de comprimento de onda. Segundo Sambrook et al. (1989) a
3.3.4- Seleção dos oligonucleotídeos para genotipagem
Dois pares de oligonucleotídios foram selecionados para serem utilizados em ensaio de PCR para identificação final em nível de espécie dos isolados de Trichosporon. A seleção desses oligonucleotídios foi baseada em
revisões bibliográficas publicadas nos últimos anos, tendo sido os mesmos previamente utilizados para mesma finalidade. Os oligonucleotídios TRF (5’ – AGA GGC CTA CCA TGG TAT CA – 3’) e TRR (5’ – TAA GAC CCA ATA GAG CCC TA – 3´), que amplificam parte da região SSU do rDNA, foram utilizados para a confirmação da identificação do gênero Trichosporon, já que estes
oligonucleotídios não hibridizam em regiões conservadas do gene ribossômico
de outras leveduras de importância médica (Sugita, et al., 1998). Os
oligonucleotídios 26F (5´- ATC CTT TGC AGA CGA CTT GA- 3´) e 5SR (5´- AGC TTG ACT TCG CAG ATC GG - 3’), que amplificam a região IGS1 (intergenic spacer region 1) do rDNA, foram utilizados para confirmar a identificação da espécie (Figura 1). No gênero Trichosporon, a seqüência da
região IGS1 varia em comprimento de 195 pares de base (pb) a 704 pb. A
análise comparativa destas seqüências em Trichosporon spp. sugere maior
variação que nas das regiões de ITS1 e ITS2 - inter spacer region 1 e 2, respectivamente (Figura 1; Rodriguez-Tudela, et al., 2005).
3.3.5- Reação de PCR
Para as reações de PCR foram adicionados em tubos de microcentrifugação de 0,2 mL de capacidade os seguintes componentes: 25 uL
18S 5.8S
IGS1 ITS1
IGS2 ITS2
28S 5S 18S
TRF TRR 26SF 5SR
Figura 1. Representação esquemática do locus do rDNA. Os retângulos
