Análise do perfil de expressão gênica pela técnica de microarrays de oligonucleotídeos em subgrupos de pacientes com mieloma múltiplo definidos a partir de antígenos câncer/testículo

(1)

VALÉRIA CRISTINA DA COSTA ANDRADE

ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA PELA TÉCNICA DE

DE OLIGONUCLEOTÍDEOS EM SUBGRUPOS DE

PACIENTES COM

MIELOMA MÚLTIPLO DEFINIDOS A PARTIR DE

ANTÍGENOS CÂNCER/TESTÍCULO

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.

SÃO PAULO

(2)

VALÉRIA CRISTINA DA COSTA ANDRADE

ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA PELA TÉCNICA DE

DE OLIGONUCLEOTÍDEOS EM SUBGRUPOS DE

PACIENTES COM

MIELOMA MÚLTIPLO DEFINIDOS A PARTIR DE

ANTÍGENOS CÂNCER/TESTÍCULO

Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina, para obtenção do título de Doutor em Ciências.

Orientadora:Profa. Dra. Gisele W. B. Colleoni, UNIFESP/EPM.

Co)orientador:Prof. Dr. André Luiz Vettore, UNIFESP, Campus Diadema.

SÃO PAULO

(3)

Andrade, Valéria Cristina da Costa

Análise do perfil de expressão gênica pela técnica de

de oligonucleotídeos em subgrupos de pacientes com mieloma múltiplo definidos a partir de antígenos câncer/testículo/ Valéria Cristina da Costa Andrade. – São Paulo, 2008.

xx, 115f.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós9graduação em Hematologia.

Título em inglês: Gene expression profile by microarray analysis in subgrups of multiple myeloma patients according to cancer/testis antigens expression.

(4)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO

ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA

DEPARTAMENTO DE ONCOLOGIA CLÍNICA E EXPERIMENTAL

Chefe do Departamento:

Prof. Dr. José Orlando Bordin

Coordenador do curso de Pós)graduação:

(5)

ANÁLISE DO PERFIL DE EXPRESSÃO GÊNICA PELA TÉCNICA DE

DE OLIGONUCLEOTÍDEOS EM SUBGRUPOS DE

PACIENTES COM

MIELOMA MÚLTIPLO DEFINIDOS A PARTIR DE

ANTÍGENOS CÂNCER/TESTÍCULO

Presidente da banca:Profa. Dra. Gisele W. B. Colleoni

Banca Examinadora

Profa. Dra. Sara T. Ollala Saad 9 UNICAMP

Prof. Dr. Roberto Passetto Falcão 9 USP/Ribeirão Preto

Prof. Dr. Edgar Gil Rizzatti 9 Laboratório Fleury Profa. Dra. Mihoko Yamamoto 9 UNIFESP

Suplentes

Profa. Dra. Simone Cristina Olenscki Gilli 9 UNICAMP

(6)

DEDICATÓRIA

Ao Ari, pela compreensão e apoio ao longo dessa jornada.

Aos meus pais Cléo e Alay, pelos valores transmitidos, incentivo e respeito às minhas escolhas.

À minha avó Luiza pelo imenso amor e carinho.

Aos meus irmãos Paulo e “Patrícia”, aos meus sobrinhos Mariana e Murilo e aos meus primos Fábio e Gabriel.

(7)

... “o mundo é pleno de coisas belas e contudo pobre, muito pobre de belos instantes e revelações de tais coisas. Mas talvez esteja nisso o mais forte encanto da vida: há sobre ela, entretecido de ouro, um véu de belas possibilidades, cheio de promessa, resistência, pudor, desdém, compaixão e sedução...”

(8)

Agradecimentos

Essa tese é o resultado do trabalho de um belo grupo, com o qual tive o privilégio de conviver. Por isso, os resultados obtidos nessa minha caminhada não são méritos apenas meus, pois sem o suporte e a organização da equipe do mieloma múltiplo e sem as parcerias estabelecidas, essa pesquisa não teria sido concretizada. No entanto, peço licença a todos para inicialmente agradecer aos pacientes que gentilmente concordaram em participar desse trabalho. Caros, vocês foram o meu vigor e inspiração... espero poder contribuir muito mais com a batalha de vocês.

À Profa. Dra. Gisele W. B. Colleoni, agora Gisele, minha orientadora, conselheira e amiga. Você foi um dos grandes presentes dessa caminhada e trabalhar com você tem sido um aprendizado de vida. Você é ética, justa, humana e uma profissional exemplar. Muitas vezes eu pensava: “como ela consegue fazer tudo isso? E ainda é mãe!”. Agradeço pelos incentivos e por me fazer acreditar que eu posso ir muito além do que eu mesma imagino. A nossa parceria já transcendeu à vida acadêmica, pois você tem me modificado para melhor. Eu agradeço a Deus por ter me dado essa oportunidade de mudança e a você por tudo o que tem feito por mim.

Ao Prof. Dr. André L. Vettore pelos ensinamentos, convivência e parceria. Eu te admiro muito, pois você é uma pessoa extremamente obstinada e perspicaz. Obrigada pelas sugestões sempre muito pertinentes e coerentes. Se bem que às vezes é tão exigente e perfeccionista com os experimentos, que ficamos fatigados. Mas o pior é que no final você sempre tem razão e só nos resta acatar as ordens de um corinthiano cheio de marra. Fazer o que...

(9)

À Dra. Otávia Caballero, uma pessoa que vi apenas uma vez, mas que tem uma grande importância nesse trabalho. Eu me considero uma pessoa de muita sorte por ter você como uma colaboradora e aliada. Uma pessoa incrível daquelas que a gente conhece e se inspira. Muito obrigada pelas sugestões, disponibilidade, paciência e oportunidade. Mesmo tendo me visto apenas uma vez, me escreveu uma linda carta de recomendação... eu nunca vou me esquecer disso.

Quando eu tinha mais ou menos 15 anos vi uma entrevista com o Dr. Andrew Simpson no programa Brasil Pensa da TV cultura. Na ocasião ele coordenava um projeto relacionado à esquistossomose. Fiquei muito impressionada e admirada e pensei “nossa que cara bacana”. Hoje me sinto honrada em poder colaborar com esse pesquisador incrível, admirável e que tenho muito respeito. Obrigada por tudo!

Ao Dr. Lloyd Old pelo incentivo de iniciarmos estudos para o estabelecimento de uma vacina contra o mieloma múltiplo. Obrigada pelas preciosas contribuições e pela oportunidade de uma possível colaboração.

Ao Dr. Yao9Tseng Chen pela disponibilidade, paciência e contribuição com a imunohistoquímica do CT45 e valiosas contribuições com a discussão desse artigo, que esta sendo finalizado.

À Amélia Góes de Araújo, pelo suporte técnico com as análises dos microarrays de oligonucleotídeso e pelo acolhimento na minha estadia em Ribeirão Preto.

Ao Rodrigo Panepucci pela normalização dos dados de microarrays de oligonucleotídeos e sugestões de análises desses dados.

(10)

À Mariana Maschietto, do Laboratório de Genômica e Biologia Molecular da Fundação Antônio Prudente. Obrigada pelas dicas para o funcionamento do programa Pathway Express, que utilizei para análise dos dados normalizados provenientes dosmicroarrays de oligonucleotídeos.

À Profa. Dra. Shirley Pignatari, da Disciplina de Otorrinologia Pediátrica da UNIFESP/EPM, pela colaboração com as amostras de amígdalas e adenóides de crianças.

À Profa. Dra. Maria Regina Regis Silva, do departamento de patologia de UNIFESP/EPM, pela contribuição com as análises morfológicas relacionadas ao CT45.

Ao Prof. Dr. José Orlando Bordin, pela oportunidade de participar do Projeto Genoma Clínico do Câncer em Mieloma Múltiplo e pelo incentivo acadêmico.

À Profa. Dra. Mihoko Yamamoto e à Elisa Kimura, sempre muito gentis e prestativas, pela separação magnética dos plasmócitos e pela ajuda no banco de amostras do ambulatório de Mieloma Múltiplo.

À Profa. Dra. Maria de Lourdes L. F. Chauffaille e à equipe do laboratório de Citogenética, pela avaliação citogenética dos casos de Mieloma Múltiplo.

Ao Prof. Dr. José Salvador R. de Oliveira e às equipes de transplante da UNIFESP e do Hospital Santa Marcelina, pelo apoio na coleta de controles normais.

Ao Prof. Dr. Adagmar Andriolo e ao Laboratório Fleury, pela realização dos exames de imunocaracterização, essenciais para diagnóstico e seguimento dos pacientes com Mieloma Múltiplo.

(11)

À Roberta S. Felix por ter me acolhido tão amavelmente no grupo do MM. Você é uma das pessoas com mais vivacidade que eu já conheci. Obrigada pela ajuda, atenção, paciência e amizade.

À Manuella S.S. Almeida, pela imensa admiração e respeito pela profissional que você é e pelo gerenciamento do banco de tumores do mieloma múltiplo.

Ao Fabrício, pelo auxílio técnico, amizade e “brain storm” sobre as perspectivas de futuras colaborações. Você tem um potencial gigante e é uma pessoa muito capaz e eu torço muito por você.

À Fernanda Corbi pela amizade e troca de idéias. Obrigada pela força e por tentar me inserir no mercado de trabalho.

Às minhas queridas amigas Cláudia Pereira e Roberta Lessa, pelo carinho, amizade e momentos de descontração. Vocês tornaram essa minha empreitada muito mais suave. Foram a base de apoio das minhas “noitadas laboratoriais”. Vocês me acolheram, enquanto eu é que deveria ter feito isso. Muitíssimo obrigada!

À Carol, por ser uma pessoa muito especial, inteligente e prestativa. Qualquer lugar fica muito melhor com você, pois você é uma pessoa generosa e que tem um coração enorme. É uma espécie de ponto de equilíbrio da nossa nova casa.

Obrigada por sua amizade!

À Vivi, pela amizade, conversas e serenidade. Uma pessoa que eu nunca vi mal humorada e que eu admiro como profissional, pois ela ama o que faz e transmite isso.

À Marianna, pelo convívio, amizade e por me dar dicas sobre o mercado de trabalho.

À Luiza, Aline e Mari Cavalare, as novas “vetoretes”. Obrigada pelo apoio, carinho, amizade e momentos de descontração.

(12)

A todos que passaram pelo Laboratório Genética do Câncer do, ILPC: Luis Sakamoto, Alex, Andréia Seixas, Fabio Picolli, Fernanda Góes, Luciana, Luciane, Danielle, Emerson, Benjamim, Ivete, pela convivência, descontração e auxílios técnicos.

Aos amigos de pós9graduação do ambulatório de Mieloma Múltiplo/Linfoma não9 Hodgkin: Vanderléia C. Silva, Leina Y. Etto, Riguel J. Inaoka.

(13)

(14)

Sumário

Dedicatória………....………... V

Agradecimentos………....………...………... Vii

Listas……….………...……... Xiv

Resumo………...………... Xx

1. INTRODUÇÃO………..………...………... 1

2. OBJETIVOS………...………... 4

3. REVISÃO DA LITERATURA………..………...……...………... 5

4. CASUÍSTICA………..………...………... 13

5. MÉTODOS…………...…..………...………... 16

6. RESULTADOS………....………...………..…... 41

7. DISCUSSÃO………..………...…... 93

8. CONCLUSÕES……....………...……..…... 106

9. REFERÊNCIAS………...…...…… 107

Anexos...………...………...………...……….……...

Abstract...

(15)

Lista de Figuras

Figura 1 Etapas da realização dosortingdas células CD91389positivas... 19

Figura 2 Etapas dos experimentos envolvidos na técnica demicroarraysde

oligonucleotídeos... 28

Figura 3 Citospin do material obtido porsortingda medula óssea total de

paciente com MM... 41

Figura 4 Citometria de fluxo realizada com os anticorpos para CD38 e CD45.. 42

Figura 5 Visualização das bandas 28S e 18S do RNA de sete amostras de

medula óssea total... 43

Figura 6 Visualização das bandas 28S e 18S do RNA de quatro amostras de

plasmócitos obtidos a partir de medula óssea ... 43

Figura 7 Checagem da síntese de cDNA. Amplificação do fragmento de 645

pb do geneβactina(amostras de medula óssea)... 44

Figura 8 Checagem da síntese de cDNA. Amplificação do fragmento de 645

pb do geneβactina(plasmócitos)………....…………... 44

Figura 9 Amplificação do geneSPA17, vista em gel de agarose 2% corado

com brometo de etídeo... 47

Figura 10 Seqüência do RNA mensageiro doSPA17... 48

Figura 11 Eletroferograma parcial da seqüência do RNAm doSPA17... 48

Figura 12 Número e percentual de amostras de pacientes com MM com

expressão positiva para os 13 CTs analisados... 50

Figura 13 Sobrevida global de acordo com a expressão dos genes da família

GAGE... 51

Figura 14 Sobrevida global de acordo com a expressão do número de CTs

positivos... 51

Figura 15 Sobrevida global de acordo com a expressão do geneCT7... 52

Figura 16 Integridade dos RNAs de plasmócitos utilizados nos experimentos

demicroarraysde oligonucleotídeos... 53

Figura 17 Verificação da amplificação do cRNA... 56

Figura 18 Gráfico com os controles positivos do primeiro experimento de

microarraysde oligonucleotídeos... 59

Figura 19 Gráfico com os controles positivos do segundo experimento de

Figura 20 Imagem de uma lâminaCodeLinkescaneada... 61

Figura 21 Imagem de uma lâmina CodeLink com os spots já

identificados... 61

Figura 22 Dendograma da clusterização hierárquica obtido pelo método de

Average Linkagee que utilizou a métrica deSpearman Rank... 62

(16)

Figura 24 Curva de eficiência dos primers que amplificaram o gene

GAPDH... 75

Figura 25 Gráfico da média de estabilidade da expressão dos genes

normalizadores testados para todas as amostras do estudo... 76

Figura 26 Determinação do número adequado de genes para a normalização... 77

Figura 27 Expressão relativa do gene Crk nas amostras de plasmócitos

tumorais com mais de seis CTs expressos versus amostras de plasmócitos tumorais com seis CTs expressos ou menos... 83

Figura 28 Expressão relativa do gene ITGA5 nas amostras de plasmócitos

Figura 29 Expressão relativa do gene RhoA nas amostras de plasmócitos

Figura 30 Expressão relativa do gene RhoD nas amostras de plasmócitos

Figura 31 Expressão relativa do gene Src nas amostras de plasmócitos

Figura 32 Expressão relativa do gene Crk nas amostras de plasmócitos

tumorais ao diagnósticoversusplasmócitos normais provenientes de amigdalectomia... 87

Figura 33 Expressão relativa do gene ITGA5 nas amostras de plasmócitos

Figura 34 Expressão relativa do gene RhoA nas amostras de plasmócitos

Figura 35 Expressão relativa do gene RhoD nas amostras de plasmócitos

Figura 36 Expressão relativa do gene Src nas amostras de plasmócitos

(17)

Lista de Tabelas e Quadros

Quadro 1 Sistema de estadiamento internacional (ISS) (Greipp et al., 2005)... 07

Quadro 2 Achados clínicos e laboratoriais dos 39 pacientes com MM ao

diagnóstico avaliados neste estudo... 15

Quadro 3 Critérios diagnósticos no MM (Kyle et al., 2003). ... 17

Quadro 4 Sistema de estadiamento de Durie&Salmon... 17

Quadro 5 Seqüências, referências e condições da RT9PCR dos primers

utilizados neste estudo... 23

Quadro 6 Seleção dos controles internos mais estáveis que foram utilizados

como referência na quantificação relativa da expressão gênica... 34

Quadro 7 Primes utilizados como normalizadores nos experimentos de RT9

PCR em tempo real... 35

Quadro 8 Ciclagem da RT9PCR em tempo real dos genes normalizadores... 36

Quadro 9 Protocolo usando o kit TaqMan® Universal PCR Master Mix,

TaqMan® Gene Expression Assays e TaqMan® Endogenous

Control(ACTB, bGUSeGAPDH)... 38

Quadro 10 Condições de termociclagem utilizadas para amplificação dos genes alvo e normalizadores... 38

Quadro 11 Resultado das análises das reações de RT9PCR dos 14 CTs em

tecidos normais... 46

Tabela 1 Expressão dos 13 CTs em GMSI, plasmocitoma solitário (PLS),

pacientes com MM e na linhagem celular U266... 49

Tabela 2 Variáveis identificadas como fatores prognósticos independentes

para sobrevida global pelo modelo de regressão de Cox (p< 0,05)... 52

Tabela 3 Características clínico9laboratoriais dos pacientes que foram

submetidos à técnica de microarrays de oligonucleotídeos, experimento 1... 55

Tabela 4 Características clínico9laboratoriais dos pacientes que foram

submetidos à técnica de microarrays de oligonucleotídeos, experimento 2... 56

Tabela 5 Indicadores de qualidade das hibridações de microarrays de

oligonucleotídeos do experimento 1... 58

Tabela 6 Indicadores de qualidade das hibridações de microarrays de

oligonucleotídeos do experimento 2... 58

Tabela 7 Genes hiper9expressos obtidos a partir dos experimentos de

Tabela 8 Genes hipo9expressos obtidos a partir dos experimentos de

Tabela 9 Valores de expressão gênica obtidos por microarrays, para os CTs

avaliados pela RT9PCR... 69

(18)

Quadro 12 Genes envolvidos na via de adesão focal, provenientes da lista dos genes diferencialmente expressos de acordo com a técnica de

microarrays de oligonucleotídeos, escolhidos pelo programa

Pathway Express... 74

Tabela 11 Valores de eficiência de amplificação obtidos para cada um dos

genes incluídos no estudo... 77

Tabela 12 Curva de eficiência dos primers que foram utilizados nesse

estudo………...………..………. 79

Quadro 13 Expressão relativa dos genes Src, Crk, ITGA5, RhoD e RhoA nas

amostras de plasmócitos dos pacientes que foram submetidos aos

amostras de plasmócitos dos pacientes com MM ao diagnóstico, que possuem mais de seis CTs expressos... 81

Tabela 13 Sumário da expressão relativa dos genes Src, Crk, ITGA5, RhoDe

RhoA nas amostras de plasmócitos ao diagnóstico dos pacientes com MM que possuem mais de seis CTs expressos... 82

amostras de plasmócitos dos pacientes com MM ao diagnóstico, na comparação dos plasmócitos tumoraisversusplasmócitos normais... 86

Tabela 14 Sumário da expressão relativa dos genesSrc, Crk, ITGA5, RhoDe

RhoA nas amostras de plasmócitos ao diagnóstico, na comparação do plasmócitos tumoraisversusplasmócitos normais... 87

(19)

Lista de Abreviaturas

B2M β29microglobulina

Gene Antígeno melanoma B91

BLAST Basic Local Alignment Search Tool (ferramenta de bioinformática)

BLAT BLAST#Like Alignment Tool(ferramenta de bioinformática)

Gene ciclina D1 Gene ciclina D3

cDNA DNA complementar

CEP Comitê de Ética em Pesquisa Gene c9maf

Gene v9crk sarcoma virus CT10 oncogene homolog (avian) Gene Câncer/testículo 7 ouMAGE#C1

CT Antígeno Câncer/Testículo

del(13) Deleção do cromossomo 13

DEPC Dietil pirocarbonato

DHL Desidrogenase lática

Dkk 1 Dickkopf1

DMSO Dimethyl sulphoxide

DNA Ácido desoxiribonucléico

dNTPs Deoxinucleotídeos

EDTA Ácido etilenodiamino tetra9acético

EFP Eletroforese de proteínas

FISH Fluorescesce in situ hybridization

FITC Isotiocianato de fluoresceína GenesFGFR3/MMSET

Gene Antígeno G

! Gene gliceraldeído939fosfato9desidrogenase

GMSI Gamopatia monoclonal de significado indeterminado

HLA Antígeno leucocitário humano

IgA Imunoglobulina A

IgG Imunoglobulina G

"# Gene Interleucina96

Sistema de Estadiamento Internacional

ITGA5 Gene integrin, alpha 5 (fibronectin receptor, alpha polypeptide)

" Gene Antígeno L91

LTC Linfócito T citotóxico

MACS Magnetic Cell Sorting of Human Cells

Gene maf9B

(20)

$ Gene Antígeno específico de melanoma92

# Gene Antígeno específico de melanoma93/6

% Gene Antígeno específico de melanoma94

& Gene Antígeno específico de melanoma910

$ Gene Antígeno específico de melanoma912

MgCl2 Cloreto de magnésio MM Mieloma múltiplo

mM Milimolar

MO Medula óssea

MP Melfalano/Prednisona

MPT Melfalano/Prednisona/Talidomida

NCBI National Center of Biotechnology Information

' GeneNF#κB

Gene Carcinoma espino celular de esôfago de Nova Iorque

PB Pares de bases

PBS Phosphate#buffered saline

PCR Reação em cadeia da polimerase

pmol Picomol

Gene Antígeno expresso preferencialmente em melanoma

( Gene ras homolog gene family, member A

( Gene ras homolog gene family, member D

RQ)PCR Reação em cadeia da polimerase, quantitativa e em tempo real

RNA Ácido ribonucléico

RNM Ressonância nuclear magnética

RT Radioterapia

RT)PCR Reação em cadeia da polimerase9 transcriptase reversa

SG Sobrevida global

Gene Proteína auto9antigênica 17 do espermatozóide

Gene v9src sarcoma (Schmidt9Ruppin A92) viral oncogene homolog (avian)

) Gene Sarcoma sinovial com pontos de quebra no cromossomo X

TCTH Transplante de células9tronco hematopoéticas

U Unidade

VAD Vincristina/Doxorrubicina/Dexametasona

(21)

Resumo

Introdução: Antígenos câncer/testículo (CT) têm se tornado o grupo de antígenos mais estudados no campo da imunoterapia contra o câncer. Objetivos: Este estudo avaliou a expressão global de 14 CTs em MM para identificar possíveis marcadores prognósticos e alvos terapêuticos.Materiais e métodos: A expressão deMAGEA1, MAGEA2, MAGEA3/6,

MAGEA4, MAGEA10, MAGEA12, CT7, BAGE#1, GAGE (família), NY#ESO#1, LAGE#1,

SPA17, PRAME e SSX1foi estudada pela RT9PCR em: 15 tecidos normais, umpool de 10 amostras de medula óssea (MO), três amostras de plasmócitos obtidos de tonsilas palatinas normais, seis aspirados de MO de doadores, três aspirados de MO de gamopatias monoclonais de significado indeterminado (GMSI), cinco aspirados de MO de plasmocitomas solitários, 39 amostras de MO de MM (95% em estádio avançado) e em uma linhagem celular de MM (U266). A plataforma CodeLink Human UniSet I Bioarrays 10,000 genes foi utilizada para as análises de microarrays de oligonucleotídeos. Os dados normalizados dos microarrays foram submetidos ao programa Pathway#Express, que identificou cinco genes da via de adesão focal (Crk, Src, ITGA5, RhoA e RhoD) para a validação pela RQ9PCR.Resultados: A expressão do geneSPA17foi positiva em todos os tecidos normais e por isso esse gene foi excluído de futuras análises. A expressão doCT7

foi positiva em amostras de MO de um caso de GMSI e um caso de plasmocitoma solitário. A linhagem celular U266 foi positiva para todos os CTs excetoSSX1. A freqüência dos CTs em amostras de MO total de pacientes com MM foi: CT7 = 30/39 (77%); LAGE#1 = 19/39 (49%); MAGEA3/6 = 16/39 (41%); MAGEA2 = 14/39 (36%); GAGE family = 13/39 (33%); NY#ESO#1= 13/39 (33%);BAGE#1= 12/39 (28%);MAGEA1= 10/39 (26%);PRAME= 9/39 (23%); SSX#1 = 10/39 (26%); MAGEA12 = 8/39 (20.5%); MAGEA4 e MAGEA10 = 0%. O modelo de regressão de Cox mostrou que a positividade da família GAGEe o número de CTs > 6 são fatores prognósticos desfavoráveis independentes para a sobrevida global (SG), quando todos os pacientes foram analisados. No entanto, a expressão de CT7 foi o único fator prognóstico desfavorável para a SG quando apenas os pacientes não transplantados foram analisados. Três amostras de CTs predominantemente positivos (> 6) e três amostras com expressão predominantemente negativa (0 ou 1) para os 13 CTs analisados foram submetidas aos microarrays de oligonucleotídeos. Essa ferramenta identificou 147 genes como diferencialmente expressos nos dois grupos. A validação dos genes candidatos da via de adesão focal por RQ9PCR mostrou que o geneITGA5foi hipo9 expresso quando comparamos o grupo > 6 CTsversusgrupo ≤ 6 CTs (p= 0.0030). Quando a comparação foi feita em plasmócitos tumoraisversusplasmócitos normais, o geneITGA5

(22)

(23)

Introdução 1

O Mieloma Múltiplo (MM) é uma neoplasia maligna caracterizada pela proliferação clonal de plasmócitos na medula óssea, pela secreção de imunoglobulinas monoclonais detectadas no sangue e/ou urina e por lesões osteolíticas. Representa 10% das neoplasias hematológicas, sendo geralmente diagnosticado em indivíduos com idade entre 60 e 70 anos. Apesar das alternativas terapêuticas hoje existentes, o MM permanece como doença incurável (Kyle, Rajkumar, 2008).

A terapia combinada (talidomida e dexametasona, melfalano e prednisona ou esquema VAD) são opções para o tratamento dos sintomas do MM, porém a sobrevida em 5 anos para estes pacientes é de apenas 25 a 30%. O tratamento envolvendo altas doses de quimioterapia, seguido de transplante autólogo de células9tronco hematopoéticas pode alcançar elevados níveis de resposta e aumento da sobrevida global, mas dificilmente levará à cura dos pacientes. Já o transplante alogênico de doador HLA9compatível pode representar uma chance de cura para casos selecionados, mas o procedimento envolve alta morbidade e mortalidade (Kyle, Rajkumar, 2008). Portanto, a melhor compreensão da patogênese e a identificação das bases moleculares envolvidas na heterogeneidade desta doença poderão auxiliar no desenvolvimento de novas alternativas terapêuticas.

A identificação de antígenos expressos predominantemente ou exclusivamente por células tumorais tem levado à implementação de ensaios clínicos que objetivam o estímulo ou aumento da resposta imune a estes antígenos, presentes nos pacientes portadores de câncer (Ayyoub et al., 2004). Nesse contexto, os antígenos câncer/testículo (CTs) têm sido amplamente estudados em vários tipos de neoplasias malignas.

Os antígenos específicos de câncer/testículo (CTs) são assim denominados, pois suas proteínas foram identificadas nas células germinativas dos testículos. A espermatogônia é conhecida por não expressar antígenos de histocompatibilidade (HLA) e isso a torna incapaz de apresentar peptídeos ao linfócito T citotóxico (LTC). A expressão dos CTs também foi identificada em células trofoblásticas da placenta. Exceto por essas duas localizações, os CTs encontram9 se geralmente silenciados em tecidos normais (van Baren et al., 1999).

(24)

Introdução 2

malignos versus plasmablastos policlonais (gerados a partir de células B de sangue periférico), pela técnica de microarrays de oligonucleotídeos, mostrou que entre os oito genes mais expressos, cinco eram CTs: GAGE#6, MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3eSSX#2(Tarte et al., 2002).

Jungbluth e colaboradores (2005) demonstraram que os CTs MAGEC1/CT7 e MAGEA3/6 estão freqüentemente expressos em amostras de medula óssea de MM em estádio avançado e que altos níveis dessas duas proteínas se correlacionaram com índices elevados de proliferação de células plasmáticas. Isso sugere uma possível função dessas proteínas na patogênese do MM, tornando9 as ainda mais atrativas para imunoterapia nessa doença.

A equipe de pesquisadores liderada por Rehee et al., iniciou o estudo intitulado ”Pilot Study of MAGEA3 and NY#ESO#1 immunotherapy in combination with DT9PACE chemotherapy and autologous transplantation in Multiple Myeloma”, baseado na abordagem dos CTs. Este estudo pode ser observado com mais detalhes no site www.multiplemyeloma.org/clinical e demonstra que, na prática, os CTs já estão sendo utilizados como alvos terapêuticos complementares ao transplante autólogo de medula óssea. No entanto, até o momento, o papel destas proteínas na progressão do MM ainda não está muito claro. Além disso, não existem relatos sobre os outros genes envolvidos na ativação dos CTs em câncer.

Por isso, consideramos interessante estudar as possíveis associações de outros genes com a expressão dos CTs, pois acreditamos que a análise do perfil de expressão gênica dos CTs no MM poderá contribuir com novas e importantes informações para a melhor compreensão da doença.

(25)

Introdução 3

(26)

(27)

Objetivos 4

1. Avaliar a expressão de determinadas famílias de CTs em amostras de medula óssea total obtidas de pacientes com MM ao diagnóstico, pela técnica de RT9 PCR, e correlacioná9la com dados clínicos9laboratoriais e prognósticos.

2. Identificar amostras de pacientes que sejam predominantemente positivas e negativas para a maioria das famílias de CTs testadas.

3. Identificar os genes que apresentam expressão diferencial nesses dois grupos de pacientes, pela técnica do microarraysde oligonucleotídeos.

(28)

(29)

Revisão da Literatura

3.1 O mieloma múltiplo

O mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia maligna de linfócitos B caracterizada pela proliferação de plasmócitos clonais na medula óssea. As manifestações clínicas são heterogêneas e incluem produção de proteína monoclonal no soro e/ou na urina, redução da secreção de imunoglobulinas normais, doença osteolítica, anemia, hipercalcemia e disfunção renal. O MM representa 1% de todas as neoplasias e 10% das neoplasias hematológicas (Barlogie et al., 2006). Nos Estados Unidos a incidência é de quatro casos por 100.000 habitantes/ano, sendo duas vezes maior em negros do que em caucasianos. A idade mediana de apresentação é 65 anos e em apenas 2% dos casos a doença acomete indivíduos com idade inferior a 40 anos (Kyle, Rajkumar, 2008).

Os sintomas mais comuns ao diagnóstico são fadiga, dor óssea e infecções recorrentes. De acordo com o consenso do International Myeloma Working Group, o diagnóstico de MM sintomático requer a presença das seguintes características: plasmócitos monoclonais na medula óssea (ou biópsia de tecido com plasmocitoma); proteína monoclonal no soro ou na urina; e evidência de uma ou mais lesão de órgão9alvo (anemia, hipercalcemia, insuficiência renal e doença óssea) (Kyle et al., 2003).

(30)

para persistência do tumor e resistência ao tratamento quimio ou imunoterápico (Kyle, Rajkumar, 2004).

3.2 Fatores prognósticos no MM

A sobrevida dos pacientes com MM é muito variável. Apesar da sobrevida global mediana ser de 3 a 4 anos, este intervalo pode variar de poucos meses a mais de 10 anos devido à heterogeneidade de fatores envolvidos na gênese da doença (Greipp et al., 2005).

Anormalidades cromossômicas podem ser detectadas através de citogenética clássica (técnica aplicada à minoria dos casos pela dificuldade em se obter pelo menos 20 metáfases para análise adequada em cultura de plasmócitos) ou pelo método FISH(fluorescence in situ hybridization).

A falência ao tratamento e a sobrevida reduzida têm sido associadas com a presença de del(13) (detectada por cariótipo convencional em 15% ou por FISH em 50% dos pacientes) e com outras anormalidades citogenéticas hipodiplóides (Shaughnessy et al., 2003). Freqüentemente, a del(13) está associada a outros fatores de prognóstico desfavorável, como t(4;14), del(17p) e t(14;16) (Avet9Loiseau et al., 2007). O cariótipo hiperdiplóide (45% dos casos) e as alterações t(11;14) e t(6;14) (16 a 20% dos casos) parecem conferir risco prognóstico padrão (Fonseca, 2007). Outros fatores independentes associados ao pior prognóstico no MM são: 1) β29microglobulina > 5,5 mg/L; 2) albumina sérica <3,5g/dL; 3) morfologia plasmablástica; 4) plasma cell labeling index > 1%; e 5) isotipo IgA (Barlogie et al., 2004).

(31)

Quadro 1.Sistema de estadiamento internacional (ISS) (Greipp et al., 2005).

Estádio Critério Sobrevida

Mediana

Estádio 1 Β2M sérica < 3,5 mg/L e 62 meses

Albumina sérica ≥ 3,5 g/dL

Estádio 2 Β2M sérica < 3,5 mg/L e 44 meses

(não se enquadra em 1 ou 3) Albumina sérica < 3,5 g/dL Ou Β2M sérica 3,5 a 5,5 mg/L e

Qualquer nível de albumina sérica

Estádio 3 Β2M sérica ≥ 5,5 mg/L 29 meses

3.3 O tratamento do MM

O MM permanece como uma doença incurável com os esquemas de quimioterapia convencionais, apresentando taxas de respostas completas muito baixas (<5%) e sobrevida mediana em torno de três anos (Barlogie et al., 2004). Avanços importantes têm sido relatados no tratamento do MM com o uso do transplante de células tronco hematopoéticas (TCTH), que apresenta taxas de resposta completa em torno de 30 a 40% dos casos e sobrevida mediana de 4 a 5 anos (Durie et al., 2003).

(32)

sendo recomendada a profilaxia com heparina de baixo peso molecular ou aspirina (Morgan et al., 2006).

Para pacientes não elegíveis ao transplante autólogo, devido à idade ou co9 morbidades, a quimioterapia convencional é o tratamento de escolha. Esses pacientes

podem receber tratamento com agentes alquilantes, como

melfalano/prednisona/talidomida (MPT) por 12 ciclos (Palumbo et al., 2006).

A indicação de transplante alogênico de células9tronco hematopoéticas (TCTH9alo) no MM é bastante restrita devido à idade avançada da maioria dos pacientes e às taxas de mortalidade (em torno de 50%) associadas aos regimes de condicionamento mieloablativos (Barlogie et al., 2004). Regimes não9mieloablativos (mini9transplante alogênico) têm sido melhor tolerados e podem ser indicados como terapia de consolidação após transplante autólogo no MM, em pacientes jovens e que apresentem fatores prognósticos desfavoráveis (Barlogie et al., 2004).

Na tentativa de se erradicar a última célula maligna residual, responsável pelas recidivas após TCTH em MM, novos procedimentos imunoterápicos vêm sendo propostos. Entre eles, as vacinas contra os antígenos câncer/testículo começam a ser consideradas como possíveis alternativas nessa doença.

(33)

3.4. Os genes câncer/testículo (CTs)

Os antígenos câncer/testísculo (CTs) foram descobertos originalmente em pacientes com melanoma maligno e atualmente sabemos que são expressos em vários tipos de tumores humanos. Em tecido normal foram inicialmente descritos em linhagem germinativa de testículo. Por isso, os genes que codificam essas proteínas receberam o nome de antígenos câncer/testículo (CTs) (Utsunomiya et al., 2004).

Assim, os CTs constituem uma promissora classe de antígenos tumorais devido à sua limitada expressão em tecidos somáticos: células germinativas do testículo, ovário fetal e trofoblásticas placentárias (Cho et al., 2006; Costa et al., 2007). Alguns CTs estão expressos em outros tecidos normais como pâncreas, fígado e baço, mas o nível encontrado de expressão é bem mais baixo do que aquele visto em células germinativas (Costa et al., 2007).

Nas células testiculares e trofoblásticas placentárias não há expressão de MHC (‘Major Histocompatibility Complex’) de classe I: isso faz com que os CTs não sejam reconhecidos por linfócitos T citotóxicos (LTC) CD8+. No entanto, essa situação peculiar os colocam na posição de excelentes candidatos a vacinas anti9 células tumorais (Jungbluth et al., 2005). Além disso, a expressão anômala dos CTs nos tecidos onde normalmente estes antígenos deveriam estar silenciados faz com que eles sejam reconhecidos pelos LTC (Smet et al., 1996; van Baren at al., 1999).

O desenvolvimento de vacinas contra antígenos específicos de tumor depende, em parte, da identificação de um amplo espectro de proteínas imunogênicas expressas predominantemente em câncer humano. A técnica de clonagem de epítopos de células T desenvolvida e publicada em 1991, resultou na descoberta dos antígenos CTs humanos MAGEA1, BAGE e GAGE. Em 1995 foi utilizada a técnica SEREX (‘Serological Expression Cloning’) na busca de novos antígenos tumorais reconhecidos pela IgG de pacientes com câncer. Entre os genes identificados por SEREX em tumores humanos estão o SSX2,NY#ESO#1e SYCP#1

que, como os genes MAGE, BAGE e GAGE, também são expressos

predominantemente em testículo normal e em câncer (Scanlan et al., 2004).

(34)

CTs expressos de maneira restrita em testículo e tumor (‘Testis9Restricted’); 2) mRNA dos CTs detectado em dois ou mais tecidos não9gametogênicos (‘Tissue Restricted’); 3) mRNA dos CTs detectados entre 396 tecidos não9gametogênicos (‘Diferentially Expressed’); 4) CTs expressos em > 6 tecidos não9gametogênicos (‘Ubiquitously Expressed’) (Scalan et al., 2004). Atualmente, há em torno de 90 famílias de CTs descritas, nas quais estão distribuídos mais de 240 membros (Stevenson et al., 2007).

Com um crescente número de CTs sendo descobertos, foi necessário implementar uma nomenclatura para a diferenciação desses genes. De forma geral, devido à falta de informação sobre as funções que os produtos desses genes desempenham no meio celular, a nomenclatura foi baseada na ordem cronológica da descoberta dos CTs, por exemploMAGEAé CT1,BAGEéCT2, etc. Há casos de múltiplos membros em uma família de CTs; com isso cada membro de uma família é designado numericamente, por exemplo SSX1 é CT5.1, SSX2 é CT5.2, SSX3 é CT5.3e assim por diante (Scanlan et al., 2004).

Os genes que codificam os CTs podem ser divididos entre os que estão localizados no cromossomo X e os que estão presentes em outros cromossomos (os autossomos) (Cho et al., 2006). Os CTs que estão no cromossomo X, como o gene MAGEC1/CT7, tendem a formar famílias de genes que são normalmente expressos na espermatogônia de forma coordenada.

Acredita9se que o silenciamento da expressão dos CTs em tecidos normais não9gametogênicos seja regulado pelo mecanismo epigenético da metilação. A transcrição destes genes é inibida pela adição de um grupo metil (CH3) em sítios específicos da sua região promotora, o que ocasiona a hipermetilação do promotor gênico e desacetilação de histonas (Smet et al., 1996; Simpson et al., 2005; Cho et al., 2006; Costa, 2007). É possível que a desmetilação do DNA seja um dos mecanismos responsáveis pela expressão dos CTs em células cancerígenas (Ayyoub et al., 2004).

(35)

exemplo oBAGE, se encontram distribuídos aleatoriamente no Genoma (Simpson et al., 2005).

No testículo, os CTs são normalmente expressos nos espermatócitos e atuam na meiose. Assim, a expressão “aberrante” de CTs em células tumorais pode levar à segregação cromossômica anormal e aneuplodia, justificando sua importância na tumorigênese (Simpson et al., 2005). Como os CTs não são expressos ou têm baixa expressão em tecidos somáticos diferenciados, alguns autores sugerem que a expressão dos CTs em tecido tumoral pode ser restrita às células que retêm propriedades de células9tronco (Parmigiani et al., 2006; Costa et al., 2007). Na massa tumoral, uma população restrita com propriedades de célula9 tronco (cancer stem cell) pode ser mantida, favorecendo a manutenção do tumor, proliferação e metástases (Costa et al., 2007).

Vários CTs já foram estudados no MM: famíliaMAGE(antígeno específico de melanoma); BAGE (antígeno melanoma B); LAGE (antígeno L); família GAGE (antígeno G); PRAME (antígeno expresso preferencialmente em melanoma); NY# ESO#1 (antígeno do carcinoma espino celular de esôfago de Nova Iorque), (van Baren et al., 1999); CT/MAGEC1 (câncer/testículo 7) (Cho et al., 2004); SPA17 (proteína auto9antigênica 17 do espermatozóide) (Zhang et al., 2004),SSX(sarcoma sinovial com pontos de quebra no cromossomo X) (Tarte et al., 2002) e CT45 (câncer/testículo 45) (Chen et al., 2005).

A famíla MAGE foi inicialmente identificada em linhagens celulares de melanoma humano e codifica um antígeno que é reconhecido por LTC autólogo, auxiliado pela molécula de HLA9A1. As famílias BAGE, GAGE e LAGE foram identificadas da mesma maneira e, por compartilharem do mesmo padrão de expressão da família MAGE, também são conhecidas como genes tipo MAGE. Como os demais, o gene MAGEC1/CT7 foi descoberto em linhagens celulares de melanoma. Apesar de possuir homologia com os membros da família MAGE ele é estruturalmente muito maior e contém uma seqüência repetitiva distinta na região 5’. A expressão do gene NY#ESO#1 foi inicialmente observada em uma linhagem de carcinoma espino celular de esôfago e seu antígeno é reconhecido por anticorpos autólogos (Chen, 1998; van Baren et al., 1999; Dhodapkar et al., 2003).

(36)

antígeno do melanoma humano reconhecido por células T citotóxicas (Matsushita et al., 2003).

Os genesSSXforam inicialmente descritos em sarcoma sinovial e sua família é composta por 5 membros, dentre os quais o SSX1 é o mais freqüentemente expresso em linhagens celulares de mieloma e leucemias de células plasmáticas (Tarte et al., 2002).

O gene SPA17 foi identificado, em princípio, como um antígeno do esperma do coelho, sendo a maior proteína que se liga à zona pelúcida. Especula9 se que a proteínaSPA17seja uma das responsáveis pela fertilização e que participe da adesão e da migração celular colaboradores (Lacy, Sanderson, 2001). O potencial de antígeno tumoral deste CT foi mostrado em MM por Lim e colaboradores (2001).

Mais resentemente a expressão do CT45 foi descrita por Heidebrecht e co9autores (2006) em 44% (4/9) dos plasmocitomas anaplásicos e em 6% (4/64) dos casos de MM (Condomines et al., 2007).

(37)

(38)

Casuística 13

A Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP/EPM) participou do Projeto Genoma Clínico do Câncer, financiado pela FAPESP (200192003 e 200592007) e pelo Instituto Ludwig de Pesquisa Sobre o Câncer (ILPC). O projeto coordenado pela Profa. Dra. Gisele Colleoni forneceu dados clínicos, amostras de sangue periférico e soro, bem como amostras de aspirado de medula óssea total e plasmócitos para os estudos que foram desenvolvidos em conjunto pela UNIFESP/EPM, ILPC e USP de Ribeirão Preto.

Pacientes

Foram coletadas 61 amostras de medula óssea total ao diagnóstico de pacientes portadores de MM, sem tratamento clínico prévio. No entanto, apenas 39 amostras de pacientes com MM foram utilizadas no estudo detalhado nessa tese. Isso ocorreu porque um dos critérios de inclusão que julgamos importantes para o estudo foi o pareamento da medula óssea total ao diagnóstico com as amostras de plasmócitos separadas pela técnica desortingmagnético.

Assim, os aspirados de medula óssea total de três gamopatias monoclonais de significado indeterminado, cinco plasmocitomas solitários, 39 amostras de MM ao diagnóstico (dois em estádio II e 37 em estádio III de Durie9 Salmon) foram obtidos entre junho de 2002 e abril de 2006, no Hospital São Paulo UNIFESP/EPM.

De acordo com oInternational Staging System (ISS) (Greipp et al., 2005) (baseado nos níveis séricos de albumina e β2microglobulina ao diagnóstico), a classificação dos pacientes foi: três casos ISS 1, 13 casos ISS 2 e 20 casos ISS 3. Os pacientes foram tratados com protocolos quimioterápicos preconizados na época da coleta das amostras, como vincristina, doxorrubicina e dexametasona (VAD) ou melfalano e prednisona (MP), ou de acordo com a idade e indicação de futuro transplante de medula óssea. Oito pacientes foram submetidos a transplante autólogo de células9tronco hematopoéticas (TCTH).

(39)

Casuística 14

Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNIFESP/HSP e todos os pacientes assinaram o consentimento livre e esclarecido previamente à coleta do aspirado de medula óssea.

A casuística da análise da expressão dos 14 CTs nas 39 amostras de pacientes com MM está sumarizada no Quadro 2.

Controles normais e tumorais

Um painel de tecidos normais foi construído para a avaliação da expressão de 14 CTs. As amostras normais testadas foram: testículo, placenta, músculo esquelético, bexiga, pulmão, baço, coração, cérebro, timo, útero, estômago, glândula mamária, pâncreas, próstata e cólon (Clontech, Palo Alto, CA, USA), um pool de 10 amostras de medula óssea normal total (Palo Alto, CA, USA), seis aspirados de medula óssea normal (doadores normais para transplante alogênico) e oito amígdalas normais (material de adeno9amigdalectomia).

(40)

Casuística 15

Quadro 2.Achados clínicos e laboratoriais dos 39 pacientes com MM ao diagnóstico avaliados nesse estudo.

GMSI Plasmocitoma

Solitário

Mieloma Múltiplo

Variação da idade (anos) 62972 48971 37980

Sexo

Masculino 3 3 26

Feminino 0 2 13

Isotipo

IGA 9 9 11

IgG 2 1 21

N/D 1 4 7

Isotipo da cadeia leve 9 9

Kappa 1 3 25

Lambda 1 1 13

N/D 1 1 1

Estadiamento Durie) Salmon

I 9 9 0

II 9 9 2

III 9 9 37

ISS

1 9 9 3

2 9 9 13

3 9 9 20

N/D 9 9 3

Ploidia de DNA (n=23)

Hipodiploidia 9 9 6

Hiperdiploidia 9 9 15

Pseudodiploidia 9 9 1

Normal 9 9 1

N/D 9 9 16

Análise Citogenética (n=23)

Del 13 9 9 7

Normal 9 9 16

N/D 9 9 16

Total de pacientes 3 5 39

(41)

(42)

Métodos 16

5.1 Avaliação diagnóstica dos pacientes com suspeita de MM

A avaliação inicial dos pacientes com suspeita de MM incluiu os exames necessários para diagnóstico e estadiamento:

1) Hemograma completo, uréia, creatinina, cálcio total e iônico, DHL, β29 microglobulina (B2M), proteína C reativa.

2) Avaliação radiológica do esqueleto, incluindo raios9X simples de crânio, coluna vertebral, bacia e membros, bilateralmente. Pacientes com suspeita de compressão da medula espinhal foram avaliados com ressonância nuclear magnética (RNM) de coluna vertebral.

3) Eletroforese de proteínas (EFP) sérica.

4) Quantificação das imunoglobulinas séricas por método imunonefelométrico.

5) Imunofixação de proteínas do soro.

6) Imunofixação de proteínas da urina. Para a demonstração da proteína monoclonal (proteína9M) na urina (proteinúria de Bence9Jones), a eletroforese de proteínas e a imunocaracterização foram realizadas em alíquota adequadamente concentrada da urina de 24 horas.

7) Mielograma. O material obtido por aspiração da medula óssea foi corado com May9Grünwald9Giemsa para avaliação morfológica e determinação do percentual de plasmócitos.

(43)

Métodos 17

5.2 Critérios diagnósticos no MM

Os pacientes foram diagnosticados segundo critérios propostos pelo International Myeloma Working Group(2003).

Quadro 3.Critérios diagnósticos no MM (Kyle et al., 2003).

Mieloma múltiplo sintomático

1. Proteína9M no soro e/ou urina

2. Plasmocitose clonal na medula óssea > 10% e/ou plasmocitoma em biópsia de tecido

3. Lesões em órgãos9alvo associadas ao mieloma (um ou mais):

CRAB (acrônimo do Inglês:Calcium, Renal insuficiency, Anemia, Bone lesions):

• ••

• Hipercalcemia (cálcio sérico > 2.65 mmol/L ou > 11.5mg/dL)

• ••

• Insuficiência renal (creatinina sérica > 2mg/dL ou 177imol/L)

• ••

• Anemia (hemoglobina < 10 g/dL ou 2 mg abaixo do limite normal)

• ••

• Lesões ósseas (lesões líticas ou osteopenia)

5.3 Estadiamento clínico

O estadiamento obedeceu ao sistema proposto por Durie & Salmon (1975) (Quadro 3) e aoInternational Staging System(ISS) (Quadro 4).

Quadro 4.Sistema de estadiamento de Durie&Salmon.

Mieloma Múltiplo

Estádio Critério Massa CelularA (x 1012/m2) I Presença das características:

1.Hb > 10g/Dl

2.Cálcio normal < 0,6 (baixa) 3.Ausência de lesão óssea (escala 0)Bou apenas

plasmocitoma

4.IgG < 5g/dL, IGA < 3g/dL, cadeia leve urina < 4g/24hs

II Não se encaixa em I e III 0,6 – 1,2 (intermediária) III Uma ou mais características:

1.Hb < 8,5g/Dl

2.Cálcio acima do normal > 1,2 (alta) 3.Lesões ósseas líticas avançadas (escala 3)B

4.IgG > 7g/dL, IGA > 5g/dL, cadeia leve urina > 12g/24hs Subclassificação: A (Creatinina < 2mg/dL)

B (Creatinina > = 2mg/dL)

A= 1012células = aproximadamente 1 Kg

(44)

Métodos 18

5.4. Avaliação de ploidia e del(13)

Nesse estudo, avaliamos a ploidia a partir da enumeração dos centrômeros (utilizando a sonda Cromoprobe Multiprobe9I System, Cytocell UK) e a presença de deleção do cromossomo 13 (utilizando a sonda LSI 13/RB1 DNA Spectrum Orange – 13q14, Vysis Inc., USA) pela técnica de FISH em 23 pacientes (59%). Os testes foram executados no Laboratório de Citogenética da Disciplina de Hematologia e Hemoterapia da UNIFESP, pela equipe da Profa. Dra. Maria de Lourdes L. F. Chauffaille.

5.5 2 34 dos plasmócitos

Tecido de amígdalas trituradas ou 2 a 4 mL de medula óssea total coletados em EDTA foram submetidos à separação dos plasmócitos utilizando as colunas com os microbeads conjugados ao anticorpo monoclonal anti9CD138 (syndecan91), utilizando a metodologia MACS – Magnetic Cell Sorting of Human Cells(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany).

O CD138 se expressa em plasmócitos normais e neoplásicos. Já em linfócitos B e T circulantes ou monócitos esse antígeno não é expresso. O princípio da técnica é o seguinte: células que apresentam a expressão do antígeno CD138 são separadas ao passar por uma coluna (contendo microbeads revestidos com o anticorpo anti9CD138) localizada no campo magnético do separador MACS. As células CD1389positivas são retidas na coluna e as células negativas são eliminadas. Após a remoção da coluna do campo magnético, as células CD1389 positivas que ficaram retidas podem ser eluídas como a fração positivamente selecionada. Os plasmócitos assim obtidos foram congelados em 1 mL de Trizol para posterior extração de RNA.

(45)

Métodos 19

Figura 1 – Etapas da realização do sorting das células CD91389positivas.

(www.miltenyibiotec.com)

5.6 Confirmação do grau de pureza da qualidade do 2 34

Algumas amostras foram fenotipadas para a confirmação do sorting dos plasmócitos, utilizando9se os anticorpos monoclonais para a identificação de CD38, CD45, anti9κ e anti9λ. Resumidamente, as células foram marcadas com os anticorpos anti9CD45 e CD38, fixadas com 100 L da solução A do kit Intraprep (Coulter Immunotech, Marseille, France) e lavadas com solução PBS. A seguir, as

Seleção das células CD91389 positivas na coluna

Eluição das células positivas

(46)

Métodos 20

células foram permeabilizadas com solução B (5 minutos), incubadas com anticorpos anti9κ e anti9λ/FITC, durante 15 minutos e lavadas. A captação e análise foram realizadas utilizando9se o citômetro de fluxo FACScalibur (BD, San Jose, USA) e programa de software CELL QUEST.

5.7 Extração do RNA e síntese do cDNA

O RNA obtido dos plasmócitos foi extraído de acordo com as orientações do fabricante do Trizol (Invitrogen, Carlsbad, USA). A extração de RNA foi feita misturando9se clorofórmio para separarmos a amostra em duas fases, a primeira com o RNA e a segunda com o DNA e proteínas. A fase do RNA foi submetida ao mesmo procedimento mais duas vezes para aumentar a pureza do RNA. Na fase de precipitação com isopropanol, utilizamos acetato de sódio e glicogênio para obter um melhor rendimento/visualização do pellet. Após a última lavagem com etanol 70%, o RNA foi ressuspendido em 15930 L de água tratada com DEPC (dietil pirocarbonato) e estocado a –70oC até ser utilizado.

Após a quantificação em espectrofotômetro, a integridade do RNA foi avaliada por eletroforese em gel de agarose na concentração de 1%.

O material das fases de DNA e proteínas foi congelado a –70oC para utilização em outros estudos.

O DNA complementar (cDNA) foi sintetizado com o kit SuperScript II transcriptase#reversa (RT)(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Foram utilizados 2 jg de RNA total, 1jL de Oligo(dT) (500jg/mL), 1jL de dNTP Mix (10mM) e água RNAse9 free, para um volume final de 12 jL. A mistura foi incubada a 65ºC no GeneAmp PCR 9700 durante 5 minutos e armazenada em gelo. Em seguida, foram adicionados 4jL de 5x Tampão First Strand, 2jL de 0,1M DTT, 1jL de RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor (40U/jL). A reação seguiu com incubação a 42ºC por 2 minutos e adição de 1jL (200 U) deSuperScript II. Incubamos a mistura a 42ºC por 1 hora e a 70ºC por 15 minutos, para inativação da enzima. Todos os cDNA foram diluídos 10x com adição de água DEPC.

(47)

Métodos 21

de primers descrito no (Quadro 5). As seguintes condições de amplificação foram utilizadas: 2,5jL de 10x PCR Buffer, 2jL de dNTP Mix (10mM), 2jL de MgCl2

(25mM), 0,8jL de cada primer, 0,25jL de Takara Taq DNA Polymerase, 1jL de cDNA diluído em um volume final de reação de 25jL. O programa da PCR consistiu em dois minutos iniciais de desnaturação à temperatura de 94ºC, seguidos de trinta e cinco ciclos (45 segundos a 94oC, 45 segundos a 60oC e 1 minuto a 72oC) e 7 minutos finais de extensão a 72ºC (GeneAmp PCR 9700). O produto da reação foi visualizado por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida a 8%, com posterior coloração por prata.

5.8 RT)PCR para avaliar a expressão dos 14 CTs em gamopatias

monoclonais

Para a realização do estudo, foram escolhidos 14 CTs previamente avaliados em MM. São eles:MAGEA1,MAGEA2,MAGEA3/6,MAGEA4,MAGEA10, MAGEA12, BAGE#1, MAGEC1/CT7, família GAGE, LAGE#1, NY#ESO#1, PRAME, SPA17eSSX1.

A ferramenta do Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) doNational Center of Biotechnology Information (NCBI) permitiu verificar se as seqüências de primersselecionados se alinhavam aos genes de interesse. A ferramenta doBLAST# Like Alignment Tool (BLAT) da Genome Bioinformatics Group of UC Santa Cruz (UCSC Genome Bioinformatics Site) identificou se as seqüências dos primers se alinhavam em éxons diferentes, com íntrons grandes entre os éxons. Desta maneira, seria possível verificar eventuais contaminações com DNA genômico, ao realizarmos as reações de PCR a partir de amostras de cDNA.

(48)

Métodos 22

(49)

Métodos 23

Quadro 5. Seqüências, referências e condições da RT9PCR dos primers utilizados neste estudo.

F=primerdireto (forward)

R=primerreverso (reverse)

GENE SEQÜÊNCIA DE PRIMER FRAGMENTO

(PB)

REFERÊNCIA CICLOS DA RT)PCR

Desnaturação: 94°C, 2 minutos GAGE(F)

GAGE(R)

5’9TATGCGGCCCGAGCAGTT93’ 5’9CCTGCCCATCAGGACCATC93’

209 Este estudo

30 ciclos MAGEA4(F)

MAGEA4(R)

5’9GCGAGCTGCTCTGTCTGAC93 5’9AAGGACTCTGCGTCAGGC93’

523 Este estudo

94°C, 45 segundos 60°C, 45 segundos 72°C, 1 minuto Extensão: 72°C, 7 minutos PRAME(F)

PRAME(R)

5’9CTGTACTCATTTCCAGAGCCAGA93’ 5’9TATTGAGAGGGTTTCCAAGGGGTT93’

561 van Baren et al., 1999

Desnatuação: 94°C, 2 minutos

35 ciclos 94°C, 45 segundos

50°C, 45 segundos 72°C, 1 minuto SSX#1(F)

SSX#1(R)

5’9CTAAAGCATCAGAGAAGAGAAGC93’ 5’9AGATCTCTTATTAATCTTCTCAGAAA93’

422 Gure et al, 1997

Extensão: 72°C, 7 minutos

Desnatuação: 94°C, 2 minutos MAGEA2(F)

MAGEA2(R)

5’9TCAGGGAGTTGATGACCTTGT93’ 5’9AGTGCCTCGGGTCCTACTT93’

159/257 Este estudo

35 ciclos MAGEA10(F)

MAGEA10(R)

5’9GGAACCCCTCTTTTCTACAGA93’ 5’9TCCTCTGGGGTGCTTGGTATTA93’

410/500 Rimoldi et al., 1999

94°C, 45 segundos 56°C, 45 segundos 72°C, 1 minuto Extensão: 72°C, 7 minutos BAGE#1(F)

BAGE#1(R)

5’9TGGCTCGTCTCACTCTGG93’ 5’9TCCTGTTGAGCTGCCGTCT93’

275 Este estudo

MAGEA3/6(F) MAGEA3/6(R)

5’9GAAGCCGGCCCAGGCTCG93’ 5’9GGAGTCCTCATAGGATTGGCT93’

423 Jungbluth et al.,

2002 Desnatuação: 94°C, 2 minutos 94°C, 45 segundos MAGEA12(F)

MAGEA12(R)

5’9ATTCTCGCCCTGAGCAACGG93’ 5’9GATGCCTCCAACACACTCAGCT93’

835 Este estudo

60°C, 45 segundos 35 ciclos 72°C, 1 minuto

NY#ESO#1(F) NY#ESO#1(R)

5’9CCCCACCGCTTCCCGTG93’ 5’9CTGGCCACTCGTGCTGGGA 93’

275 van Baren et al.,

1999 Extensão: 72°C, 7 minutos SPA17(F)

SPA17(R)

5’9GGCAGTTCTTACCAAGAAGAT93’ 5’9GGAGGTAAAACCAGTGTCCTC93’

494 Lim et al., 2001

63°C, 45 segundos 72°C, 1 minuto Extensão: 72°C, 7 minutos MAGEC1/CT7(F)

MAGEC1/CT7(R)

5’9GACGAGGATCGTCTCAGGTCAGC93’ 5’9ACATCCTCACCCTCAGGAGGG93’

632 Jungbluth et al., 2002

Desnatuação: 94°C, 2 minutos MAGEA1(F)

MAGEA1(R)

5’9GGCCGAAGGAACCTGACCCAG93’ 5’9AGGGCCTCTTGTTGGGCCTCAA93’

246 Este estudo

63°C, 45 segundos 72°C, 1 minuto LAGE#1(F)

LAGE#1(R)

5’9CTGCGCAGGATGGAAGGTGCCCC93’ 5’9GCGCCTCTGCCCTGAGGGAGC93’

332/561 Wang Y et al.,

2004 _{Extensão: 72}_°_{C, 7 minutos}

65°C, 45 segundos 72°C, 1 minuto β#actina(F)

β#actina(R)

5’9AAATCTGGCACCACACCTTC93’ 5’9AGCACTGTGTTGGCGTACAG93’

646 Kikuchi ET al, 2005

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Métodos 24

5.9 Seqüenciamento do gene

A reação de sequenciamento doSPA17 foi realizada com a utilização do BigDye Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, CA), conforme instruções do fabricante. O equipamento utilizado foiABI Prism 377 DNA Sequencer(Perkin Elmer, Norwalk, CT, USA).

5.10 de oligonucleotídeos

Os experimentos de microarray de oligonucleotídeos foram realizados no laboratório de Hematologia da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo/USP, sob a supervisão da biomédica Amélia Góes de Araújo. Foram utilizadosmicroarrayscomerciais Amersham CodeLink UniSet Human I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ), contendo cerca de 10.000 genes. As análises de bioinformática dessa fase do estudo foram feitas pelo biólogo Rodrigo Alexandre Panepucci, da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo/USP.

O kit CodeLinkTM Expression Bioarray System inclui produtos e ferramentas para experimentos de análise de expressão gênica por arrays de oligonucleotídeos que permitem avaliar o nível de RNA mensageiro de múltiplos genes simultaneamente. O sistema inclui: grupos de lâminas de microarrays desenhadas e validadas com hibridação integrada que cobrem uma ampla escala de genes, reagentes para hibridação e preparação das amostras e software para análise das lâminas.

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Métodos 25

5.10.1 Preparação do RNA para a aplicação da técnica de de

oligonucleotídeos

Um dos requisitos cruciais para a escolha das amostras de RNAs de plasmócitos submetidos à técnica de microarrays foi a quantidade de RNA disponível. Após purificação do RNA com o RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), sua qualidade foi verificada por eletroforese em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo. A concentração do RNA foi quantificada no espectrofotômetro modelo NanoDrop® ND91000 UV (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE, USA).

5.10.2 Amplificação do cRNA

5.10.2.1 Síntese do cDNA fita simples

A síntese do cDNA de fita simples foi iniciada fazendo a junção de 1 micrograma de RNA de interesse com 100 picogramas da solução Spike, proveniente do kit da CodeLink UniSet Human I (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ). A solução Spike é utilizada para a monitorização da eficiência dos ensaios de microarrays de oligonucleotídeos e contém os RNAs mensageiros bacterianos:araB,entF,fixB,gnd,hisB eleuB.

Com as soluções de RNAs humanos e bacterianos, nas condições descritas, prosseguiu9se com a transcrição reversa e adicionou9se: um microlitro do primer T7 oligo (dT)24 e completou9se os 12 jL de volume final com água livre de

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Métodos 26

5.10.2.2 Síntese do cDNA dupla fita

O cDNA de fita simples serviu como molde para a síntese do cDNA dupla fita. Aos 20 jL obtidos na transcrição reversa adicionou9se: 63 jL de água livre de nucleases, 10 jL do tampão 10 X da enzima DNA polimerase, 4 jL de DNTP 5mM, 1 microlitro de inibidor de RNase e 2 jL da DNA polimerase. Após homogeneização, esse volume final de 100 jL foi submetido à incubação de 2 horas à 16°C.

5.10.2.3 Purificação do cDNA dupla fita

A purificação foi realizada com o Kit Codelink ExpressPurify cDNA/cRNA Purification. Duzentos e cinqüenta microlitros do tampão cDNA Binding foram adicionados ao tubo que continha o cDNA dupla fita. Após essa etapa, esses 350 jL foram colocados em uma coluna contendo filtro. Um tubo coletor foi encaixado nessa coluna com filtro e esse aparato foi colocado para centrifugar 1 minuto a 10.000 x g. A solução contendo amostra de cDNA/ tampão cDNA Binding que passou através da coluna foi descartada e a ela foram adicionados 500 jL de solução de lavagem. O tubo coletor foi novamente encaixado na coluna contendo o filtro e o cDNA, e esse aparato foi submetido à 10.000 x g por 1 minuto. Para eluir o cDNA, adicionou9se 12 jL de água pré9aquecida (50955°C) livre de nucleases ao centro do filtro, com incubação de 2 minutos em temperatura ambiente seguido de centrifugação à 10.000 x g por 1,5 minutos. O passo da eluição foi repetido e o volume final obtido foi de 20 jL.

5.10.2.4 Síntese de cRNA marcado com biotina por transcrição 3 5 2 (IVT)

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Métodos 27

5.10.2.5 Purificação do cRNA marcado com biotina

A purificação foi realizada com o Kit Codelink ExpressPurify cDNA/cRNA Purificatione foi iniciada com o ajuste da reação IVT para 100 jL, com água livre de nucleases. Após essa etapa, adicionou9se 350 jLl de cRNA Binding em cada amostra e 250 jL de etanol 100%. Os 700 jL de cada amostra foram colocados em uma coluna contendo um filtro. Um tubo coletor foi encaixado nessa coluna com filtro e esse aparato foi colocado para centrifugar 1 minuto a 10.000 x g. A solução contendo amostra de cRNA/ tampãocRNA Bindingque passou através da coluna foi descartada e a ela foram adicionados 650 jL de solução de lavagem. O tubo coletor foi novamente encaixado na coluna contendo o filtro e o cRNA e esse aparato foi submetido à 10.000 x g por 1 minuto. Para eluir o cRNA adicionou9se 100 jL de água pré9aquecida (50960°C) livre de nucleases ao centro do filtro, com incubação de 2 minutos em temperatura ambiente seguido de centrifugação à 10.000 x g por 1,5 minutos. Após essa etapa de eluição, o cRNA marcado foi quantificado por espectrofotômetro e sua integridade foi verificada mediante a aplicação de 1 jL de amostra em um gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo.

5.10.3 Hibridações dos

Em um volume final de 25 jL, 10 microgramas de cRNA foram fragmentados por aquecimento a 94°C, durante 20 minutos, na solução tampão 5X apropriada para a fragmentação. Aos 10 jg de cRNA fragmentado, adicionou9se 78 jL do componente A e 130 jL do componente B, ambos tampões para hibridização provenientes dokit CodeLInk.Após essa etapa, essa reação foi incubada à 90°C por 5 minutos.

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Métodos 28

A Figura 2 ilustra todos os passos necessários para a eficácia da técnica demicroarraysde oligonucleotídeos.

Figura 2. Etapas dos experimentos envolvidos na técnica de microarrays de

oligonucleotídeos (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ).

É importante ressaltar que os procedimentos para a síntese do cRNA e hibridações foram seguidos conforme as instruções do fabricante e nenhuma alteração foi realizada.

5.10.4 Obtenção e análise das imagens

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Métodos 29

Para a determinação da intensidade do sinal de fluorescência dos diferentes spots da lâmina, as imagens obtidas foram analisadas com o programa CodeLink Expression Analysis Software (Amersham Biosciences). Esse software CodeLink, também permite que a qualidade das diferentes hibridações seja avaliada, antes que se prossiga à análise definitiva dos dados. Esta avaliação ocorre por meio dos controles internos presentes em cada lâmina. Enquanto o RNA bacteriano adicionado antes da síntese do cDNA deve ser detectado em spots específicos da lâmina (controles positivos), outros spots não devem ser identificados (controles negativos).

5.10.5 Análise dos dados por clusterização hierárquica

Após excluir genes mascarados pelo arquivo MSR, um total de 9925 genes foi utilizado para agrupar as amostras de acordo com a similaridade nos perfis de expressão gênica. Para a construção da matriz utilizada como entrada para o software de clusterização, tabelas contendo o conjunto de genes selecionados e os valores normalizados de fluorescência obtidos de cadaarray/amostra foram geradas com auxilio do software Microsoft Access. A tabela foi exportada como um arquivo de texto com os genes dispostos em linhas e os valores de fluorescência dispostos à frente, em sucessivas colunas, separados por TABs. O software Cluster 3.0 desenvolvido por (Eisen et al., 1998) e aprimorado por de Hoon e colaboradores (de

Hoon et al., 2004) (disponível em www.bonsai.ims.u9

tokyo.ac.jp/~mdehoon/software/cluster) foi então utilizado para o agrupamento dos arrays de acordo com a similaridade transcricional das amostras. Os dendogramas referentes aos clusters formados foram gerados e visualizados utilizando o software Java TreeView, desenvolvido pelos mesmos autores. Nenhuma normalização ou transformação adicional foi realizada para a análise de clusterização.

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Métodos 30

5.11 Utilização da ferramenta 2(6 78 9 para análise de vias celulares

A técnica demicroarrays é um claro exemplo de revolução biotecnológica, que permite a seleção de dezenas ou até mesmo centenas de genes simultaneamente, podendo gerar uma vasta quantidade de dados. O desafio desta tecnologia reside na tradução destes dados gerados em fenômenos biológicos inteligíveis. Para facilitar a exploração dos resultados destas análises, algumas ferramentas foram desenvolvidas e dentre elas encontramos a Onto9tools, com acesso livre no endereço eletrônico: www.vortex.cs.wayne.edu/.

A ferramenta Onto#tools consiste em um grupo de nove bases de dados integradas capazes de traduzir automaticamente uma lista de genes diferencialmente expressos em uma dada condição, em vários processos biológicos e vias (Draghici et al., 2003; Draghici et al., 2007 e Khatri et al., 2006). Essas nove ferramentas são denominadas: Onto#Express, Onto#Compare, Onto#Design, Onto# Translate, Onto#miner, Promoter#Express, nsSNPcounter, OE2GO e Pathway#

Express.

Onto#Express é uma ferramenta desenhada para a exploração de dados de anotação funcional disponível, que auxilia no encontro de processos biológicos relevantes em poucos minutos.

Onto#Compare é capaz de encontrar um determinado ensaio de array disponível comercialmente ou a combinação destes, para a construção de uma lâmina capaz de responder a uma dada hipótese biológica. Se na ferramenta Onto# Compare não for possível encontrar uma lâmina de microarray comercialmente disponível adequada, a ferramentaOnto#Designpode auxiliar na construção de uma lâmina composta por um grupo de genes de um determinado processo biológico ou via celular de interesse.

A Onto#Translate permite identificar a redundância existente em uma lâmina demicroarray, pois um mesmo gene pode estar anotado em diferentes bases de dados. Por conta disso, nos experimentos com microarrays, um mesmo gene pode estar representado por mais de uma sonda identificadora, apesar de se referir à mesma seqüência do GenBank, por exemplo.

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Métodos 31

Com a ferramenta Promoter#Express é possível encontrar sítios de ligação de fatores de transcrição em uma condição específica (TFBSs).

A ferramentab nsSNPCounter, também contida no Onto#tools, permite analisar substituições de códons sinônimos e não sinônimos em um gene.

A Onto#Express#to#go (OE2GO)é uma ferramenta que permite encontrar o perfil funcional de um organismo incomum, que não possui anotação em domínio público. Desta maneira, o usuário poderá construir a anotação e ontologia de um novo espécime, por exemplo.

Finalmente, a Pathway#Express é uma ferramenta que agrupa genes envolvidos em uma mesma via. Quando se submete uma lista de genes diferencialmente expressos ao programa (por exemplo, dados de microarrays já normalizados), a base de dados da Onto#Tools constrói uma lista com todos os genes associados àquela via. As vias de sinalização dessa ferramenta têm como base as vias de sinalização contidas no site do Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG).

A análise de impacto utilizada pela ferramentaPathway#Expressincorpora componentes probabilísticos clássicos juntamente com: a magnitude da mudança da expressão de cada gene, a posição do gene diferencialmente expresso em uma dada via, a topologia da via que descreve como esses genes interagem e o tipo de interação de sinalização entre os genes dessa via. Um dos algoritmos utilizados na Onto#tools é o Gene Rank, uma variante do índice PageRank, utilizado pelo site de busca Google. NaPathway#Expressesse modelo serve para encontrar as conexões gênicasdownstream(Draghici et al., 2007).

Utilizamos a ferramenta Pathway#Express para nos orientar sobre a seleção das vias celulares mais importantes dentre os genes encontrados diferencialmente expressos nas amostras de plasmócitos dos pacientes com MM obtidos pela técnica de microarrays de oligonucleotídeos, para posterior validação pela PCR em tempo real.