Aplicação de teste molecular para detecção de adenovírus em pacientes pediátricos distintos.

(1)

www.rpped.com.br

REVISTA

PAULISTA

DE

PEDIATRIA

ARTIGO

ORIGINAL

Aplicac

¸ão

de

teste

molecular

para

detecc

¸ão

de

adenovírus

em

pacientes

pediátricos

distintos

Diane

Puerari,

Clarice

Camargo,

Sandra

Gratura,

Aripuanã

Sakurada

Aranha

Watanabe,

Celso

Granato

e

Nancy

Cristina

Junqueira

Bellei

∗

UniversidadeFederaldeSãoPaulo(Unifesp),SãoPaulo,SP,Brasil

Recebidoem17deabrilde2014;aceitoem22desetembrode2014 DisponívelnaInternetem28demarçode2015

PALAVRAS-CHAVE

Infecc¸ãorespiratória viral;

Adenovírusereac¸ão emcadeiada polimerase

Resumo

Objetivo: Osadenovírusdesempenhamumpapel importantenaetiologiadainfecçãoaguda grave dotrato respiratórioinferior, especialmenteentrecrianças. Oobjetivodoestudo foi avaliaradetecçãodoadenovírushumano(HAdV)pordiferentesmétodos(imunofluorescência direta---DFAereaçãoemcadeiadapolimerasenested---nestedPCR)emamostrascoletadas dediferentespopulaçõesdepacientespediátricos.

Métodos: Omaterialfoicoletadodecriançasportadorasdedoençacardíacacongênita(DCC ---123aspiradosnasaiscoletadosem2005,2007e2008)edecriançasdacomunidade(CC ---165aspiradosnasaiscoletadosem2008).Ascriançaseramconsideradaselegíveisse apresen-tasseminfecçãorespiratóriaaguda(IRA)deprováveletiologiaviral,comatésetediasdeinício dossintomas.TodasasamostrascoletadasnoestudoforamavaliadaspormeiodeDFAenested PCR.

Resultados: De209amostrasincluídas,43(14,8%)forampositivasempelomenosumdostestes feitos:17/165(10,3%)dascriançasdacomunidadee26/125(20,8%)dascriançascardiopatas. AstaxasdedetecçãopornestedPCRforam15/165(9,1%)emcriançasdacomunidadee24/125 (19,2%) em crianças cardiopatas.O método molecular mostrou maiores taxas de detecção quandocomparadocomaDFA(p<0,001). Aanáliseunivariada mostrouque ascrianças por-tadoras decardiopatia congênitaapresentaramchance significativamentemaiordeadquirir HAdV(oddsratio2,3;IC95%:1,18-4,43).

Conclusões: Baseadonosresultadosobtidosnapresenteavaliac¸ão,recomenda-seavigilância derotinaempacientesderisco(DCC)pormétodosmoleculares,quemelhoraofluxodiagnóstico eaeficiênciadadetecc¸ão.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:nbellei@uol.com.br(N.C.J.Bellei).

http://dx.doi.org/10.1016/j.rpped.2014.09.004

(2)

KEYWORDS

Respiratoryviral infection; Adenovirusand polymerasechain reaction

Applicationofmolecularassayforadenovirusdetectionamongdifferentpediatric patients

Abstract

Objective: Adenovirusesplayanimportantroleintheetiologyofsevereacutelowerrespiratory infection,especiallyinyoungchildren.TheaimofthepresentstudywastoevaluatetheHuman Adenovirus(HAdV)detectionbydifferentmethods(DirectFluorescenceAssay---DFAandNested PolymeraseChainReaction---nestedPCR),amongsamplescollectedfromdifferentgroupsof pediatricpatients.

Methods: Collectionofsampleswas madeinchildren withcongenital heartdisease (CHD ---123nasalaspiratescollectedintheyearsof2005,2007and2008)andincommunitychildren (CC---165nasalaspiratescollectedin2008).Childrenwereeligibleifthey presentedacute respiratoryinfection(ARI)ofprobableviraletiology,withinupto7daysofsymptoms’onset. AllstudiedsampleswereevaluatedbyDFAandnestedPCRassay.

Results: Ofthe290samplesincludedduringthestudyperiod,43(14.8%)werepositiveonat leastonetest:17/165(10.3%)oftheCCand26/125(20.8%)oftheCHDchildren.Thenested PCRdetectionratesinthecommunitychildrenwere15/165(9.1%),andforchildrenwithCHD, 24/125(19.2%).MolecularmethodshowedhigherdetectionrateswhencomparedtotheDFA test(p<0.001).Univariateanalysisshowedthatchildrenwithcongenitalheartdiseasepresented asignificantlyhigherchanceforacquiringtheHAdV(OddsRatio2.3;95%CI:1.18-4.43). Conclusions: Based on data obtained inthe present evaluation, we suggest thata routine surveillanceshouldbeperformedinhighriskpatientsbymolecularmethods,thusimproving diagnosticflowandefficiency.

Introduc

¸ão

Os adenovírus desempenham um papel importante na etiologiadainfecc¸ãoagudagravedotratorespiratório infe-rior, especialmente em crianc¸as menores.1 _Os _adenovírus

humanos(HAdV)disseminam-serapidamenteemambientes

fechados, o que muitas vezes resulta em doenc¸a

epidê-mica em comunidades populosas. Além disso, a infecc¸ão

por adenovírus é clinicamente difícil de distinguir de

outras infecc¸ões respiratóriasvirais ou bacterianas.2 _Essa

combinac¸ãodefatoresindicaquemétodosmicrobiológicos

clínicos maiseficazes sãonecessários paraa detecc¸ão da

doenc¸arespiratóriaagudacausadaporadenovírus.

Antes do advento da reac¸ão em cadeia de polimerase

(PCR),aimunofluorescênciadireta(DFA)eoisolamentoviral

eramosmétodosmaissensíveisdisponíveisparaadetecc¸ão

dosvírusrespiratórios.3,4_Entretanto,_um_número

significa-tivo de amostras de pacientes com infecc¸ão respiratória

viralclinicamente compatível eraincorretamente

classifi-cado como negativo pela DFA e pela cultura viral, o que

implica falha na identificac¸ão do vírus causador em uma

percentagemsignificativadecasos.5-7 _Os_métodos

molecu-laresdemonstrammaiorsensibilidadequando comparados

comensaiosconvencionaisparadetecc¸ãodeadenovírusem

amostrasrespiratórias.8,9

Napopulac¸ãopediátrica,oHAdVéosegundopatógeno

maisfrequentemente detectado10 _e _o _vírus _é _responsável

por5%a15%dasdoenc¸asrespiratórias.10,11 _Amostras

clíni-casdecrianc¸asgeralmenteapresentamcargasviraismaiores

quandocomparadascomasdospacientesadultos.12_Os

estu-dosbrasileirosdescrevemumafrequênciaquevariade3%

a 7,1%, de acordo com a técnica usada.13-16 _Outro _grupo

deriscoparainfecc¸ãorespiratóriaadquiridaporHAdVsão

ascrianc¸ascomcardiopatiascongênitas, emboranãohaja

publicac¸ãoquecomproveessefato.

Nessecontexto,o objetivodopresenteestudofoi

ava-liaraocorrênciadeHAdVpormeiodediferentesmétodos

(imunofluorescência direta --- DFA e reac¸ão em cadeia da

polimerasenested---nestedPCR)emamostrascoletadasde

crianc¸asdediferentespopulac¸ões.

Método

Este estudo transversal incluiu duas populac¸ões distintas avaliadasde2005a2008.

1) Crianças com doença cardíaca congênita (DCC): durante 2005, 2007 e 2008, 123 pacientes ambulatoriais comdoençacardíacacongênitaatendidosnoServiço Pediá-trico de Doenças Cardíacas Congênitas foram incluídos. Durante 2006, a ala de cardiopatia congênita passou por umareforma estruturale administrativa,oque impossibi-litouacoletadasamostras.Dospacientesincluídos,49,7% eram do sexo masculino, com idade média de 3,9 anos (medianade2,9anos),variaçãodeumanoeseismesesa 11anos.

(3)

Para ambos os grupos, as crianças eram elegíveis se apresentassem infecção respiratória aguda (IRA) de pro-váveletiologiaviral,de preferênciacom intervalode até sete dias do início dos sintomas até a coleta das amos-tras. No grupo de crianças da comunidade, os pacientes foramincluídosquandoospaisouresponsáveisprocuraram atendimentomédicoemconsequênciadeumainfecção res-piratóriaaguda.NogrupoDCC,ainclusãodepacientesfoi definidaporummédicoduranteumaconsultaderotina pre-viamenteagendada.A população DCC foi considerada em riscoparacomplicaçõesdeinfecçãorespiratóriaviral; por-tanto,foramcoletadasamostrasde crianças com maisde setediasdoiníciodos sintomas(variação deum-60dias). Os sintomas respiratórios avaliados foram: coriza, tosse, dordegargantaoucongestãonasal;ossintomassistêmicos foram:febre,dordecabeça,mal-estar,calafriosoufadiga. Foiobtidotermo de consentimentolivre e esclarecidode todososadultos responsáveis porcada paciente antes da inclusão.

Todas asamostrasnasais forammantidasa 4◦_C_e ime-diatamentetransportadasparaolaboratório.Umaalíquota (1mL) foi separada para análise molecular e armazenada a ---70◦_C. _O _volume _da _amostra _restante _foi _avaliado _no mesmodia por DFA,de acordocom estudoanterior.17 _Em

seguida, umaalíquota de cada amostraarmazenada teve

o DNA extraído com o kit de extrac¸ão QIamp DNA Blood

extractionkit(Qiagen,EUA),deacordocomasinstruc¸õesdo

fabricante,seguidopornestedPCRparaadetecc¸ãodetodos

osserótiposdoadenovírus,comoanteriormentedescrito.18

Todasasamostrasestudadasforamavaliadaspelatécnica

deDFA.OstestesforamfeitoscomokitSimulfluor

Respira-toryScreenandPanel(ChemiconInt.,EUA),deacordocom

asinstruc¸õesdofabricante.

Osprimersusadosparaadetecc¸ãotiveramcomoalvoa

regiãodogeneHexondoHAdV.Opardeprimersexteriores,

hex1deg(5’-GCC SCA RTG GKC WTACAT GCA CAT C-3’) e

hex2deg(5’-CAGCACSCCICGRATGTCAAA-3’)resultaram

emumprodutode301bp.Osegundopardeprimers(nested

primers),nehex3deg(5’-GCCCGYGCMACIGAIACSTAC

TTC-3’)enehex4deg(5’-CCYACRGCCAGIGTRWAICGMRCYTTG

TA-3’),produziuumampliconde171bp.

Para a primeira reac¸ão de amplificac¸ão, 5␮L de DNA

extraídoforamcolocadosemumtubocomumamisturade

reac¸ãocom2,5␮Lde10×buffer(200mMTris-HCl,pH8,4,

500mMdeKCl),3,5␮MdeMgCl2,0,5␮MdeprimersHex1deg

eHex2deg, 1␮L demistura dedNTPs com20mM decada

nucleotídeo,2,5UdePlatinum®_TaqDNA_polimerase

(Invitro-gen,Brasil)eáguaMilliQautoclavada,emumvolumefinal

de25␮L.

Para a segundareac¸ão de amplificac¸ão,2␮L do

ampli-condaprimeira reac¸ão foramcolocadosem umtubocom

umamisturadereac¸ãoconstituídapor2,5␮Lde10×

buf-fer(200mMTris-HCl,pH8,4,500mMKCl),3,5␮MdeMgCl2,

0,5␮M de primers Nehex3deg e Nehex4deg, 1␮L de

mis-tura de dNTPs,com 20mMde cada nucleotídeo, 2,5U de

Platinum® _TaqDNA _polimerase _(Invitrogen, _Brasil) _e _água

MilliQ autoclavada,em um volumefinal de25␮L.

Contro-lespositivos(AdenovírusSorotipo3)econtroleredundante

negativo (água MilliQ autoclavada) e foram incluídos em

cadasérie.Foramconsideradosresultadospositivosquando

oampliconfoivisualizadoapóseletroforeseemgelde

aga-rose a 2%. A sensibilidade da reac¸ão foi padronizada e

apresentouumlimitededetecc¸ãode10-4_TCID

50/mL.

A associac¸ão entre diferentes variáveis categóricas

(variável resposta: presenc¸a ou ausência de HAdV;

variá-velindependente:crianc¸asdacomunidadee crianc¸as com

doenc¸acardíacacongênita)foiavaliadapelotestedo

qui--quadrado e a razão de probabilidade univariada (SPSS,

versão 11.5). Valor de p<0,05 foi considerado

estatisti-camente significativo. Para comparar os métodos usados,

o teste Kappa foi feito (R software versão 2.11.1) e a

interpretac¸ão dos coeficientes foi feita com o uso da

classificac¸ãodeAltman.19

OpresenteestudofoiaprovadopeloComitêdeÉticaem

PesquisadoHospitalSãoPauloedaUniversidadeFederalde

SãoPaulo(1654/09).

Resultados

As amostras de290 pacientessintomáticos foram analisa-das [48,6% (141/290)do sexofeminino e 51,4% (149/290) dosexomasculino],56,9%(165/290)decrianc¸asda comu-nidadee43,1%(125/290)decrianc¸ascomDCC.Otempode iníciodossintomasatéomomentodacoletavarioudeuma 60dias.

Entreas290amostrasdepacientessintomáticosincluídas duranteoperíododoestudo,41(14,1%)forampositivasem pelomenosumteste:17/165(10,3%)crianc¸as da comuni-dade,26/125(20,8%)crianc¸ascomDCC.Atabela1mostra

a detecc¸ãodiferencial entreosensaiosdeacordo comas

diferentespopulac¸õesestudadas.Nogeral,4/290(0,7%)das

amostrasforamDFApositivase39/290(13,40%)das

amos-trasforamnested PCRpositivas.OmétododanestedPCR

apresentouumamaiortaxadedetecc¸ão,estatisticamente

significativa, entretodasaspopulac¸õesestudadas quando

comparada com o DFA (p<0,001). Comparando-se os

gru-posdecrianc¸aspormétodosmoleculares,asdogrupoDCC

apresentarammaiortaxadedetecc¸ão(p=0,02).

Aanálisedotempodecorridodesdeoiníciodossintomas

atéodiadacoletamostrouumadiferenc¸aestatísticaentre

osmétodosDFAenestedPCR(tabela2).Entreascrianc¸as

Tabela1 Detecc¸ãodeHAdVporDFAenestedPCRentreasdiferentespopulac¸õesestudadas

N◦ _DFA _Nested_PCR _p _Positividade_global

Positivo Negativo Positivo Negativo

Comunidade 165 2(1,2%) 163(98,8%) 15(9,1%) 150(90,9%) <0,001 17(10,3%) DCC 125 2(1,6%) 123(98,4%) 24(19,2%) 101(80,8%) <0,001 26(20,8%)

Total 290 4(1,4%) 286(98,6%) 39(13,4%) 251(86,5%) 43(14,8%)

(4)

Tabela2 Tempodoiníciodossintomasdeacordocomotesteusado

≤5dias >5dias

Positivo %

Negativo %

Positivo %

Negativo %

DFA 3(1,4%) 211(98,6%) 1(1,3%) 75(98,7%)

NestedPCR 24(11,2%) 190(88,8%) 15(19,7%) 61(80,3%)

p <0,001 <0,001

Total 214 76

DFA,imunofluorescênciadireta;PCR,reac¸ãoemcadeiadepolimerase.

da comunidade, a média±desvio padrão, a mediana e o intervalodesdeoiníciodossintomasforamrespectivamente 3,2±2,72; 3; 1-20 dias;e entreascrianc¸as do grupoDCC 6,5±7,1;5;1-60dias.OmétodonestedPCR,emcomparac¸ão com a DFA, detectou maior número de casos,tanto para amostrascoletadascom≤5diasdesdeoiníciodossintomas como para amostras com >5 dias desde o início dos sintomas.

Atabela3mostraaconcordânciaentreostestes

avalia-dos. Aconcordânciageral foi baixa,principalmente entre

as crianc¸as da comunidade. A concordância relativa aos

resultadosnegativosfoielevadaparaambasaspopulac¸ões

estudadas.

A tabela 4 mostra o resultado da análise da razão de

probabilidade univariada de ocorrência doHAdV entreas

diferentespopulac¸õesestudadas.Avariávelrespostafoi a

presenc¸aouausênciadeHAdVeavariávelindependentefoi

ogrupoestudado:ascrianc¸asdacomunidadeeascrianc¸as

comDCC.Ascrianc¸ascomDCCapresentaram

aproximada-mente duas vezes maischance de infecc¸ão adquirida por

HAdVquandocomparadascomascrianc¸asdacomunidade.

Discussão

Entre as crianças da comunidade, a taxa de detecção de adenovírus foi semelhante à descrita na literatura nacio-nal,variaçãode6%a7,1%.13-16_Um_estudo_brasileiro_recente

avaliou 1.121 amostras coletadas de crianc¸as

hospitaliza-daseencontrouocorrênciadeadenovírusem15,8%,oque

corroboraosresultadosdopresenteestudo.10_Estudos

inter-nacionaisrelatama ocorrênciadoHAdV variandode 2%a

3,8%empopulac¸õespediátricas,oqueéligeiramentemenor

quando comparadocom os nossos resultados.20-22 _Estudos

com crianc¸as com cardiopatia congênita demonstram a

circulac¸ãodosvírusrespiratórios,comtaxasrelativamente

altasdeocorrência,emostramqueessesagentesdevemser

consideradosnapráticaclínicaediagnóstica.22 _O_presente

estudoéoprimeiroadescreverainfecc¸ãorespiratóriapor

HAdVemcrianc¸asbrasileirascomDCC.Ataxadedetecc¸ão

de HAdV nos cardiopatas foi maior (20,8%) quando

com-parada com a de crianc¸as da comunidade (10,3%). Vale

ressaltarque,entreascrianc¸ascomcardiopatiacongênita,

acoletadeamostrasfoifeitaduranteaconsultaderotina.

Seopaciente apresentavainfecc¸ãorespiratória durantea

consultaagendada,aamostraeracolhida.Portanto,ataxa

encontradapodeestarsubestimada,porqueprováveiscasos

podemtersidoperdidosporcontadafaltadedemandados

pacientes.Umahipóteseparaamaiordetecc¸ãopodeestar

relacionada coma presenc¸a de comorbidadesentreessas

crianc¸as.23

Ao avaliarosdois testes usadosneste estudo,algumas

questõesimportantesparaclínicoseadministradores

hospi-talaressãolevantadas:Qualéomelhorteste?Atéqualdia

éo períodoideal paracoletara amostra? Hánecessidade

Tabela3 Avaliac¸ãodeconcordânciaentreostestesusados

Amostras coletadas

DFApositiva NestedPCR positiva

Concordânciaa _{Concordância}_de

positividade

Concordânciade negatividadeb

Crianc¸as

Comunidade 165 2(1,2%) 15(9,1%) 64,9% 0% 98,7%

DCC 125 2(1,6%) 24(19,2%) 79,2% 0% 98,0%

Total 290 4(1,4%) 39(13,5%)

DCC,criançascomdoençacardíacacongênita;DFA,imunofluorescênciadireta;PCR,reaçãoemcadeiadepolimerase.

a _{Concordância}_calculada_por_um_método_para_comparar_dois_testes_quando_o_método_padrão_de_ouro_não_era_conhecido.

b _Os_valores_mais_elevados_de_{concordância}_de_negatividade_mostram_que_os_métodos_apresentaram_desempenho_similar_aos_casos

negativosdetectados.

Tabela4 Análiseunivariadadarazãodechances(oddsratio---OR)daocorrênciadeHAdVentreaspopulac¸õesestudadas

Populac¸ões Positividadegeral ␹2(p) OR(95%CI)

Comunidade 17(10,3%) 0,01 1

DCC 26(20,8%) 2,3(1,18-4,43)

(5)

derepetiroteste?Qualéonúmeroidealdeamostraspara ofluxoderotinadolaboratório?Qual éoimpactode tes-tesnegativosepositivosempacientesdealtorisco?Alguns dessesaspectospuderamseravaliadosnopresenteestudo. A análise daassociação entre o iníciodos sintomas no paciente e osresultados dos testes laboratoriais mostrou que o método molecular foi mais sensível do que o DFA e essa diferença foi mais evidente após o quinto dia do iníciodos sintomas (p<0,001).A menor detecção porDFA estava relacionada com a baixa carga viral nas amostras respiratórias.24 _As _taxas _de_detecc_¸ão _mais _elevadas _entre

ospacientescommaisdecincodiasdoiníciodossintomas

eramesperadasporcontadamaiorsensibilidade doteste

nestedPCR.25,26_Para_o_sucesso_do_teste_DFA_são_necessários

algunsfatores-chave,comoaboacoletadeamostrase

pes-soalde laboratórioexperiente,10 _enquanto _o _nested _PCR,

baseadonaamplificac¸ãodeácidosnucleicos,podedetectar

umnúmeromuitobaixodepartículasvirais.26,10

Aanáliseunivariadamostrouquecrianc¸ascom

cardiopa-tiacongênitatêmmaiorriscodeadquiriroHAdV(OR:2,29)

quandocomparadascomascrianc¸as dacomunidade.

Uto-kaparch(2011)27 _descreveu_que_pacientes_pediátricos_com

infecc¸ãorespiratóriadotratoinferiorapresentavamcarga

viralmaiselevadaquandocomparadoscompacientescom

infecc¸ãodotrato respiratório superior.Echavarria etal.28

descreveramque crianc¸astêm2a3,5vezesmaischances

deserinfectadasporHAdVdoqueosadultos.Essesdados

corroboramosresultadosdopresenteestudo.

Umadaslimitac¸õesdoestudofoiaausênciadepesquisa

deoutros vírus respiratórios. Entre as amostras negativas

para HAdV, outros vírus poderiam estar presentes. Como

resultado da alta sensibilidade dos métodos moleculares,

asinfecc¸ões viraispoderiamser detectadassemanasapós

o término dos sintomas,29,30 _mas, _no_presente _estudo, _as

amostrasincluídasforamcoletadasdecrianc¸ascominfecc¸ão

respiratóriaaguda,oquediminuiachancededetecc¸ãode

umainfecc¸ãoanterior.Outralimitac¸ãodoestudofoiafalta

decoleta de amostras durante 2006; no entanto, a ideia

principaldoestudo foi pesquisaraocorrência dovírus na

comunidade(crianc¸asdacomunidade)eemumapopulac¸ão

comumrisco elevadodecomplicac¸õesapós umainfecc¸ão

respiratóriaviral(crianc¸ascomDCC).Algunsestudos

descre-vemumaocorrênciadeadenovírusdurantediferentesanose

aolongodoano,31,32_com_padrões_de_ocorrência

semelhan-tes;portanto,a coletadeamostrasduranteanos diversos

aparentementenãocomprometeuoobjetivodoestudo.

Trêsparâmetrospodemindicaravalidadedaescolhado

testediagnóstico:ocustoporamostra,otempoderesposta

(temponecessárioparafornecer oresultado)ea

confiabi-lidadedoteste.Emumestudopublicadoem2009,Mahony

etal.33_compararam_o_custo_do_DFA_com_o_da_técnica

mole-cularparaodiagnósticodeinfecc¸ãopelovírusrespiratório

edescreveramqueotestemoleculartinhaumcusto

ligei-ramente maior, mas, ao mesmo tempo, apresentava um

custo-benefícioexcelentepor contadareduc¸ão dotempo

dehospitalizac¸ão.Diferentesestudosdescreveramotempo

derespostadoDFAedoPCR.Ambosostestesapresentaram

acapacidadedefornecerresultadosemumdia.34,35

Ghara-baghietal.34 _compararam _a_{sensibilidade}_e_{especificidade}

doDFAedoensaio molecularcomercial.Esseestudo

mos-trouumabaixasensibilidadedotesteDFAemcomparac¸ão

com oteste molecularparatodos osvírus pesquisados.O

adenovírusapresentouamenorsensibilidade(38,1%).34

Sugerimosqueavigilânciaderotinasejafeitaem

paci-entesdealtoriscopormétodosmoleculares,oquemelhora

ofluxodediagnósticoeaeficiência.Nossosresultados

tam-bém demonstraram que, em amostras com maisde cinco

diasdoiníciodossintomas,ométodonestedPCRpodeser

amelhoropc¸ão.

Financiamento

ConselhoNacionaldeDesenvolvimentoCientíficoe Tecnoló-gico(CNPq),BrasilpormeiodebolsadeestudoparaDP.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

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