Rev. Inst. IVIed. trop. São Pau[o
29(6) :367 -373, novembro-de zembro, l9B7
ESTUDO COMPARATIVO DE TESTES SOROTóGICOS NO DIAGNóSTICO IMUNOLóGIGO DA NEUR(rc¡SNCERCOSE
c¿rmen silvia de Melo PTaLARISSI (1), Adelatde Josê vaz (1), tua lllaria Carv¿lho de SoUza 11),
Par¡lo Muffio NåKÁMUBA o), Eide Dias cÂMARÆio (r), r[arcos v¡n¡cius d¿ srLva (z) & Mirthes UEDA (1)
RESIIMO
Estudamos comparativamente quatro técnicas imunológicas para o diagnóstico da neurocisticercose (NC), utilizando tíquido cefalorraquiano
ir,cn¡
como espécime clÍnico: as reaçöes de fixação de complemento (RtrE), hemaglutinacã,o pãs-siva (RIIA), imunofluorescê'ncia indireta
(RIF) e
teste imunoenzimrítico uf,fSe.Foram ensaiadas 125 amostras de LCR de pacientes com NC comprovada
e
g4 amostras de r,cR do grupo cÒntrole (60 de pacientes com quadros elínicos neu_ rológicos diversos e 84 de pacientes supostamente normais).os
índices d.e sensibilidade
e
especificldade obtidos paraos
testes foram, respectivamente, de48,OVo
e
90,4Vo paraa
RF!C; 88,BVoe
g6,BVo para,a RIÍA;
gïp
e
ggþTopíta
aRrF
e
97,6vo e g8,g7o parao
testeELrsÂ.
a
diferença significativa(p
i
o,os) obse¡vada entre ,os testes permite concluir que o melhor teste parao
diagnóstico de NC
foi
o teste ELISA seguido das reações de If.A e IF.üNrrERMo's: Neurocisticercose; LÍquido cefalorraquiano; rmunodiagnóstico da ùeurocisticercose.
A
neurocisticercose humana destaca_seen-tre
as
afecçõesdo
sistema nervoso centrat causadaspor
parasitas, pela elevadafreqüên-cia
e
prÍncipalmente pela gravid.ade aas te,sões que acarreta, sûnstituindo problema de saúde pública de interesse em nosso meio.
.4, infestação
do
sistema nervosoe
seusenvoltórios pelo Clstic.ercus cellulosac,
_
neu-rocisticercossa
pode determinar alterações no líquido cefalorraquiano indicadoras darea-ção
inflamatória.
LANGE, em 1940rz concei_tuou
a
"síndrome liquóricada
neurocisticer_cose", caracte¡izada fr¡ndamentalmente pela
ocorrência
de
pleocitose, eosinofilorraquia e anticotpos especÍficos detectados através dareação de fixação
de
complemento. OutrosTNTRODnçÃo
(f) SeCáo de Sorologia do Instituto .Adolfo Lutz de SÉo paulo, SI,., Brasil.
(2) Seção de Sorologfa do rnstttuto'.{dolfo Lutz e Hospitêt Þnilió Ribas, são pauto, Sp., Brasil.
EnalQFeço rlars corrsslrcndêlrd8: IÌ¡8. ca,rmen s. de Melo PialÍ¡rissi. rñstituto Adolfo Lutz. Seção de Sorologia. Av.
Dr. Arn¿ldo, 355. CEF 01246. São pa!'lo, Sp., Brasil.
367 autores têm encontrado baixa sensibilidade e
limitada especificidade para esta reação
quan-do aplicada em soro ou líquiquan-do cefalorraquia.
¡6 7,8,{,r4.
Com
o
desenvolvimento de métodos imu-nológicos mais sensíveise
específicos, as téc-nieas sorológicas têm sido utilizadas nodiag-nóstico da neurocisticercose com maior cou-fiabilidade r¿.
A
reação de hemaglutinação passiva, em-pregada,mais
freqtientementeno
soro, temaprbsentado resultados variáveis3)6,L1?'o. .A
reação de imunofluorescência indireta utilizan
do
fragmentos 15ou
cortes histotógicos ro dgPIALARISSI, C. S. de M; VAZ, A. J.; SOUZA, A. M. C. de; NAKAMURA, P. M.; CAMÂRGo, E. D.; SILVA' M. V. &
UÐA, M. - Estudo comparativo ate test€s sorológicos no diagnóstico imunológico da neurocisticercose. ReY.
hst. Med. trop. São Paulo, 29:367-373, 1987.
soro ou líquido cefalorraquiaino com bons re' sultados 7,2J0,13,r6. Recentemente, o teste
imu-noenzimático
ELISA
(En4yme-Linked Immu'nosorbent Assay) vem sendo aplicado ao
diag-nóstico da neurocisticercose por apresentar
al-ta
sensibilidadee
especificidade 5,6,1a,1e.Considerando que
a
resposta imune na neurocisticercose, som produçáo de anticorpos específicos freqüentemente se restringe às es'truturas que circundam o parasita 18'22,
estuda-mos
o
comportamento de diferentes técnicas imunológicas, avaliando sua eficiênciana
de-tecçáo desses anticorpos no líquido cefalorra-quiano.MATERIÁL
E
METOIX)S1.
Antígenos:a,.
Extrato Antigênico Salino Total (ST):o
antígeno STfoi
utilizado nas reações defi-xação
de
complemento (RFC),hemaglutina-ção passiva (RHA)
e
no
ieste ELISA tendosido preparado conforme metodologia
descri-ta por
COSTAS. O extrato antigênico obtidofoi
liofilizado em alíquotas de 1ml e
arma-zenadoa
4'C. A
sua earactertzagãofoi
feita quanto às concentrações proteica pelo método de BRADFORD a e polissacarídica pelo métododa antrona2s.
b.
Antígeno Particrfado:o
antígeno departículas de cisticercos
foi
utilizado fixado alâmieas de microscopia para a reação de
imu-nofluorescência indireta
(RIF),
e
foi
prepa-rado segundo MAGIIADO
e
cols. ls, comalgu-mas modificações. Os cisticercas lavados e congelados foram secos em dessecador à
tem-peratura ambiente.
O
materialfoi
trituradoem gral
e
peneiradoem
tamisde
abertura0,297 mm,
"tyler"
48 (Granutest,Brasil).
Os fragmentos tamisados foram lavados em etanol(Merck, Brasil)
por
três vezes,e
novarnente lavados em acetona bidestilada. As partículasobtidas foram secas em dessec-¿dor
a
vácuopor 24 horas e então ressuspensas em solução
salina tamponada com fosfatos, PBS
pII
7,2 (Fosfatos 0,01M-Na,Cl 0,14M) na proporçáo de 1 rng para 20ml.
Após rápida decantação daspartículas maiores,
o
sobrenadantefoi
distri-búdo
em lâminasde
microscopia, cerca de 40 partÍculas ¡x)r ca¡npo de 400X. As lâminas,368
após secagem
a
37'C,foram
conservad¿s a-zVC, embrulhadas uma
a
uma.2.
Amostras de líquido cefalorraquiano (LCR): fora,m ensaiadas 125 amostras de LCR de pa. cientes com neurocisticercose comprovada. Ogrupo controle estudado
foi
constituído por34 amostras de LCR, de indivíduos
supostamen-te normais e por 60 amostras de IÆR de pa'
cientes com outros quadros clínicos neuroló-gicos, mas isentos de cisticercose (meningites 38; neurossÍfilis 13; tumores 4; hidrocefalia 2; cefaléia
2;
acidente vassular cerebral 1).3.
Testes sorológicos:ø". Reaçáo
de
Fixaçãode
Complemento(RFC):
foi
empregada a microtécnica da RFCutilizando
o
antígeno ST,de
acordo com a metodologia descrita por FER'IIEIRA e cols.z,com modificações nos volumes. Os LCR
ro-ram diluÍdos em placas de microtitulação de
poliestireno (Inlab, Brasil) de fundo em U, na razá,o
2 a partir
de 1:2, volumefinal
de 0,05ml,
em solução salina contendo Íons Cálsioe Magnésio (NaCl 0,15M; CaC.lr 0,15mM; MgCl,
0,5
mM).
A
cada cavidade da placa adicio. nou-se 0,025ml
de antígeno diluído segundoseu
título na
Ínesma solução,e
0,05ml
desoro normal
de
cobaio (complemento)con-tendo
5
unidades hemolíticas50%.
Após 1 hora a 3?"Cfoi
adicionado o sistemahemolítÍ-co
(hemácias de carneiraa
1,4Vo sensibiliza. das. com uma unidade exatade
hemolisinaproduzida ern coelho), 0,025
ml
por
cavidade'e
a placafoi
incubada por 30 minutos a 37"Ce
t
hora à temperatura ambiente, apóso
quefoi
feitaa
leitura.b.
Reaçãode
Hemaglutinaçáo Passiva (RH.å,): hem¿icias de caineiro a 5% foram sensibilizadas com
o
extrato antigênico ST, petametodologia descrita
por
IM.A,I*
"o¡s
rr,
fi-cando
o
reagente de usoa
0,67o, A. reaçãofoi
realizada em placas de microtitulação depoliestireno (Inlab, Brasil), de fundo em V.
As amostras de LCR foram diluÍdas em duas
séries de cavidades
da
placa,na
razáio 2,t
partir de 1:1, em volume de 0,025 ml, em PBS
E|EI 7,2 contendo O,l'Vo de soroalbumiha bovina (Difco,
USA).
.4. uma das séries adicionou-se 0,025ml
de hemácias sensibilizadase
à outraPIALAR'ISSI' C. S' dþ M.i VAZ, A' J.; SOUZA, Â. M. C.
'IE; NAKAMI'R,A, P. M.; CAIVIAR,GO, E. D.; SILVA, M. V. & rtEDå" Inst. Med. M' - trop. Estudo São paulo, comparativo de testes sorológicos no d.iagnóstico imunológico da neurõcisticercose. RÊv.
29:86?-8?8, 199?,
foi
agitadae
deixada em repousoà
tempera-tura
ambientepor
2 horas, e entãofoi
reali-?"ada a leitura.c.
Reação de fmunofluorescência Indireta (R.IF):a
RIFfoi
realizada segundoa
técnicade MACHADO
e
cols. 15, send.o emþregado oconjugado anti.gamaglobulina
humana-isotio-cianato de fluoresceína (Instituto Adolfo Lutz,
lote 33).
d.
Teste imunoenzimático, ELISA: placasde poliestireno de fundo em
U
foram sensibi_lizadas eom
o
antígeno ST, d.iluído conformeo
título
em solução tamponada carbonato-bi_carbonato (NarCQ 0,0r2M; NaH@, 0,08M; pH
9,6), no volume de 0,1 ml
por
cævidade. Após 18 horasa
4C, as placas foram lavad.as três vezes em PBSpH
?,4 (NaCl 0,18M; fosfatos0,02M) contendo 0,05%
de
Tween-20 (Sigma,USA)
-
PBS-T.
A
cada cavidade d.a placa adicionou,se 0,1ml
das amostras de LCR,pu-ro e suas di.luições na razáo 2, em PBS-T con_
tendo 0,5Vo ìde gelatina (Difco, USA),
e
a placa foi incubada por 45 minutos a B?"C. Apóstrês
lavagens, adicionou-se 0,1ml
do
conju_ gado, anti,IgG humana-fosfatase alcalina(Sig-ma Chem. Co., USA) diluído a l:1600 em
pBS-TG.
A
placafoi
submetidaa
novo ciclo d.eincubaçáo
e
lavagense
a
cada cavidade adj-cionou-se 0,1ml
da sotução cromógena(p-ni-trofenil-fosfato dissódico em solução de
dieta-nolamina
lM,
pH g,B, na proporção de 1 mglml) e a
placafoi
incubadapor
B0 minutosa
3?C.
A reaçã,o êhzimáticafoi
interrompida pela adição de 0,05ml
de NaOIf ZM ea
rea.tividade avaliada em, espÞctrofotômetro para
leitura automática de placas (Titertek
Muttis-kan,
f'low
Lab., USA),em
comprimento d.eonda de 405 nm.
4.
Aruílise EstatÍstica:a
média geométrrcados títulos
foi
calcrrlada com os títulos codi_ficados pela fórmula lo+J2y/zr 23. para
o
es,tudo
comparativodõf
testes sorológicosfo-ram analisados os lndÍces estatísticoss, e apli-cado o teste Q de Cochran¿o.
RES[]LTÁI}OS
As concentrações protéica e polissacarídica
do extrato antigênico salino total (ST), obtido
de 200 cisticercos em volume
final
de 20 ml,foram respectivamente de 6,1 mg/ml e 5,2 mg/
ml.
A
atividade antigênica do antÍgeno ST foi avaliadapor
titulação em bloco, frentea
lf-quidos cefalorraquianos padrões positivo. e
ne-gativo, para determinação das concentra{ões
a
serem utilizadas nas reações de fixação de complemento (RFC), de hemaglutina4ãopassi-va
(RHA)e
teste imunoenzimático (ELISA). Na RFCfoi
ohtidaa
concentração antigênicaótima de 40 ¡r.g Þor cavidade da placa. A con
centração
de
30 Fg/mlfoi
escolhida para a sensibilização das hemácias utilizadas na RHA, coriro o reagente de uso é diluÍdo 10 vezes, pa.ra
cadamililitro
de hemácias utiliza,mos B ¡rEde proteÍna antigênica. Na figura 1 são apre
sentados os resultados
do
teste ELISA paraos líquidos cefalorraquianos, padrões positivo
e
negativo, .diluídos nø raz,áo 2,a partir
de1:1,
e o
àntígenoST
nas concentraçÕes de5, 10, 20 e 40 ¡.rg/ml'. Foram consideradas po.
sitivas
as
diluiçõescom
densidades ópticas(DO) iguais ou maiores que 0,100 (.,cut off").
A
concentração del0
pe/ml ou 1 ,¡rg por cr}vidade
foi
escolhida paraa
sensibilização das plaeas.Na tabela.l são apresentados os resultados
dos testes sorológicos para
as
amostras d.eLCR dos dois grupos estudados: pacientes com neurocisticercose
e
grupocontrole.
As
dis-tribuições
da
freqüência dos títulos das 125 amostras de LCR, dos pacientes comneurocis-ticercose são apresentadas
na
figura2.
Natâbela
2
são apresentadas as médiasgeomé-tricas desses títulos (MGT).
A sensibilidade (S) expressa como porcen
tagem de positividade
e
a
especificidade (E)expressa como porcentagem de negatividadg
com os respectivos intervalos de confiança de
9li% de probabilidade, obtidas para oS testes realizados, são apresentadas
na
tabelaB.
Ofndice de Youden
(S+E-l)
foi
calcula<lo pa.ta
eada testê, e é. apresentado na mesma ta-bela.Para avaliação
da
concordância entre os testes, os resultados das 219 amostras de LCR estudadâs, foram classificados como reagentese não-reagentes
e
analisados comparativamente.
Os índices de co-positiv,idade; co,negativi-dade e concordância das reações sãoapresen-tados na tabela 4.
PIAI¡AnISSI, C. S. de M.., VAZ, A, J.; SUZ.A, A, M. C. ale; NAKAMUR.â,, p. M.; CAMÀRCrO, t. D.; STLVA, M. V. & IIE)A,, M. - Estudo comparatlvo de testæ sorológicos no diagùóstico fnu¡ológico da Deurocisticercose. Bey. Itrst. Med. froB. São Paulo, 29:367-37¡t, 198?.
3 c c
o
a D o !
a s a
ê
FiS. I - LeDsldades ópticas obtid¿s para as diluiçþes d.os soros (1.4) e lÍquidos cefalor¡aquianos (l-B) para paalrões positivo (a) e'negativo (b) no teste ET,IS.A, utitizando extrato salino total do qy$fueruus cellulosa€ ¡as co¡¡ceûtraçõqs de
i5 p*lmt (-.-.-), tO pclnt (-), 20 þClmr (--, e 40 p,clmt r...).
TABELA I
Dlstribuição dos lfquidos cefalomaqulanos dos grupos de pacientes com neu¡ocisticercose l¿) e contlole. (b), segu¡ato
teste sorológico
Dllrlção
!l:
-¡#
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o..!n'
: o.' a ô o.l
ì-LK
RFC o
b
ìR
RHA
85
o
b
RIF
2
l4
9t
t7t3t666 -t
o. b
1 I
t620ß2tt4t39to4
93t-t2
o
b
*
excluío¡s as axosrRAs arrrcorpLEuExf REsDISCUSSÃO
Foram estudadas as reações de fixação de
complemento (RFC), hemaglutinação passiva
(RHA) e
o
teste imunoenzimático ET,ISA, uti: lizando extrato antigênico salinototal
(ST), e a reação de imunofluorescência ind,ireta (RIF)utilþando como antÍgeno partículas
de
cisti-'cercos fixadas a lâminas, para pesquisa dean-ticorpos anti-Qsticercus cellulosae em líquido cefalorraquiano.
3?0
t6
Dílrlçio (t: )
3 - 2 ? 2 A 9 t7 t3 t2 2t 7 I t2 4 5
93t-12 6a QA 256 5t2 to24 20a€ ¡l(x¡6 ot92 >8t92
¡3 t3 t2 t3 t5 7 3 4 5 2
A
avalta4áo da atividade antigênica doex-trato
ST
nas reações, demonstrou seu bom rendirnento, que ao lado da facilidade de pßsparação
e
bom
desempenho com relação àespecificidade, indicam-no para
o
prqtaro de reagentes em larga escala.Na figura 1 foram ap¡eselrtada"s as distri-buições dos títulos obtidos nos testes para oS 125 LCIì de pacientes com
neurocisticerco-se.
Os maiores tftulosforarr
observados noÍOTAL
I ¡5
t25
94
t25
94
t25
PTÁI,AN'ISSI' C. S.
'Iþ M.i VAZ, A. J.; SOI'ZA, Â. M. 9. 'IE; NAK.å',R'-..ô., P. M.; CAMARGO, T. D¡I SILVA, M. V. & rIEÐA' M' - tstutlo oomparativo ale testes sorológicos no diagnóstico imunológico da neurocistic€rcose. Bev. Inst. Med. trop. São paulo, 29:86?-A?A, tgg?.
FiC. .? - Fleqüéncia (o/o) dos tÍtulos de 12â lÍquiafos ¡orológicos.
TABEL.A II
Média Geométrica dos tftulos dos ¡fquidos cefalo¡r"¿quiar¡G
dos pacientes com neurocisticercose, segunalo teste sorãtógico
TESTE
IÍG T
* EXCLUíOAS AS AI¡OSTRAS ANTIGOI'PLEM€NTARES TÁBELA III
Sensibilidade, especificidade com os respectivos intervalos de confiança, (IC) e fndice de youden, segrjndo teste so_
rológico realizado no lfquido cefalorraquiano RFC
*
lr9
RHA
s
5rl
cofalorraquianos de p8cientes com neurocistioercose ¡os testes
RIF
IFG
sfLst Drof I FsÞFdFmr lû1È¡ ¡ærl
rûrL lÉt
23r6
NHA
RIF
ELISA
55 a8,O
r25 (39.O - sto)
TAÐEI.A IV
fridices do co-positividade, có-negêtividÀde e conoordånc¡a
entre os testes
ELI SA
ilr r¡ r25 (tt,2 - xr)
258,9
teste ELISA,
o
que é sonfirmado pelas MGTsobtidas (tabela 2).
O
comportamento dos te,stes, quanto às sensibilidade e especificidade, tabela B, sugere que sejem empregadas técnicas mais sensíveis pa,ra o diagnóstico da neurocisticercose,quan-do se estuda o líqr¡ido cefalorraquiano. A R¡'C apresentou
a
mais baÍxa sensibÍlidade (49%),ro9 a?t2
125 {ar,z - 93.2}
\iqct
rçsrÈ--t2? 97,6
t25 (94,9 - ræ) ESTIE
'CgEl Ydt llct
fLItA,ñu
a5
g (4r,4 , $,4)
91 96,8
* (95,2 - tæ)
Àl|^
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olü¡rnvlo¡æ
ffir
o.86
o,55
lt¡ rIFC
o¡ a6
* Etct¡,loß ta
^¡o¡ttl¡ Amt@ttcguE
Ínferior
a
obtidapor REI$IfLIIO e
cols.z+.que obsel$ara,m 7t% de positividadg utilizan
do
antÍgeno de cistioercos t¡:¡rtados com a,ce,tona( A
especificidadeda
RFC (90,4%) foiconsiderada boa e, se exclufumos as oito amo$
tras
do
grupo controle com resultadopreju-dicado pela anticomplementariedade,
a
especi-ficidade calculada seria de g8.,gqo,
o
que está de acordo com dados de literatura z,s,zr. A¿ur-ticomplementariedade de 18 amostras das 2lg estudadas (8,2lol não era esperada, e poderia
ser explicada pelas ligeiras xantocromia e tur.
371 o,9 r
o.$
o,98
o,38
o,99
cotml¡ßn
o,58
o,99
or9a
o,94
qs5
o,99
o,73
o,98
PIALAR'ISSI, C. S. de NLi VAZ, A. J.; SOUZA, A. M. C. det NAK.âMURA, P. M.; CÁI\4ARGO, E. D.; SILVA, M. V. &
IlÐå., M. - Estudo comparativo de testes sorológicos no diagnóstico irhunológico da' ner¡rocisticercose. f,èY. Inst. Med, trop. São Paulo, 29:36?-373, 1987.
vação dessas amostras, presentes mesmo a,pós
centrifuga4ão.
A
RHA apresentou sensibilidadee
especi-ficidade (88,8qo
e
g6,8Vo) muito melhores queos
obtidospor
BIAGI
e
cols.3,de
10% de positividade no estudo da RIIA aplicada a LCRde
pacþntes com neurocisticercOse. Nossosresultádos também foram superiores aos de
MARTINEZ-CAIRO
e
cols. 17,eüe
obtrveramsensibilidade
de
68% estudad¡do LCR previa,mente concentrado cinco vezes.
Â
RIF
também resultou em þons índicesde
sensibilidadee
especificidade, respectiva.mente de 87,2%
e
g8,9Vo, comparáveis aos já dlescritos palaa reação realizada no I,cR LPI'o,13. Contudo,no
nosso estudoa
RIF
comportou-se muito melhol que
a
RFC, ao contrário doque
LMAMENTOIs
e BASSI e cols.z haviamdescrito, par?ú as duas reações.
O
teste imunoenzimático ELISAapresen-tou alta
sensibilidade @75%>e
especificif,a-de
(gï,g,%), comoera
esperado parao
tes-te 5/6.14,19.O
estudodo
comportamentodos
testessorológicos
foi
realizadopela
aplicaçã,o' do teste estatístico Q de Cochran. Obtivemos queos
testes comportaram-se diferentemente en'tre
si'(p <
0.05) e, p€la anál,ise 2x2 (testede
McNemar) dos testes concluimos que omelhor teste para diagnóstico da
neurocisticer-cose
foi o
teste ELISA, seguido das neaçõesde
IF
e HA que comportar¿un-se igualmente. Considerando quea
RFE aíndaé o
testemais difundido quando se investiga a.
neuro-cisticercose e,, ainda, que somente reargentes
imunológicos
pata
a
tealizaçáadas
RFC eRIF são correntemente encontrados no
oomér-cio, sugerimos que também
a
RIf,Ae
princi-palmenteo
teste ELISA, sejam empregadoscomo auxÍlio
no
diagnósticoe
em
possfveis levantamentos epidemiológicos,pala
que pos-samos avaliara
real prevalência da neurocÍs, ticercose em nosso meio.STIMMARY
Corn¡larative study
of
serologica.l tcsts in¡mmunological dia,gnosis
for
neurocgrsticercosls372
Four immunological techniques were
eva-luated
for
the detectionof
anttbod,iesto
Gys. ticercus cellulosae in cerebrospinal fluid (CSF): complement fixation test (CF), passivehaem-magglutination
test
(PHA), indirect immur¡o-fluorescencetest
(IF)
and the en4ymelinkedimmunosorbent assay
(ELISA).
One-hundred twent¡r-five CSF from patients wúth confirmed neurocysticercosis a,nd 94 CSF froma
control group (60 from patients suffering fromneuro-logical disorders other
than
neunocysticercolsis
and 34from
presumably healthy indivi-duals) were assayed. The sensitivity andspe-cifioity
of
the
tests were determined, whichwere, AB.OVo and, 90.4%
for
CF"; B88Vo and 96.8Vofar
PiHA; 87.27o and 98.90/ofor IF,
and 97.60/o ancl 98$Vofor
ELISA, respectively. Tfie're
{¡/€re significative differences among thetests and these allowed
to
concludethat
the best immunodiagnostic testfor
neurocysticer.cosis was ELISA, followed
by PIIA
andIF
tests.
AGRÁDECIME}TIIOS
Agradecemos .aos
Dr.
Aluíziode
Barros Barreto Machado e Dr. Gilberto EduardoBas-si
pelas amostras de líquido oefalorraquiano.BEI¡EBÊNSITS BIBT,IOGN./ÍFICAS
r. BASSI, G. É; CAMAR,GO, M. E.; gIrIEl{ì@URT' J. M. T. & GUÁRNIE&E, D. B. - Rea&ão de inuno.
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