UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
DIVERSIDADE
PATOGÊNICA
EM
ISOLADOS
DE
Thielaviopsis paradoxa
PROVENIENTES DE DIFERENTES
ÁREAS PRODUTORAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Débora Maria Sansoli Chanquinie
Bióloga
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
DIVERSIDADE
PATOGÊNICA
EM
ISOLADOS
DE
Thielaviopsis paradoxa
PROVENIENTES DE DIFERENTES
ÁREAS PRODUTORAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
Débora Maria Sansoli Chanquinie
Orientador: Prof. Dr. Antonio Goes
2015
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – UNESP, Campus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de
Mestre em Agronomia (Genética e
Sansoli Chanquinie, Débora Maria
S229d Diversidade patogênica em isolados de Thielavipsis paradoxa provenientes de diferentes áreas produtoras de cana-de-açúcar / Débora Maria Sansoli Chanquinie. – – Jaboticabal, 2015
ix, 45 p. : il. ; 29 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2015
Orientador: Antonio Goes
Banca examinadora: Ivan Antonio dos Anjos, Margarete Camargo Bibliografia
1. Manejo. 2. Podridão abacaxi. 3 Saccharum officinarum. I. Título. II. Jaboticabal-Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
CDU 632.4:633.61
DADOS CURRICULARES DO AUTOR
DÉBORA MARIA SANSOLI CHANQUINIE – casada, nascida em 12 de
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho primeiramente а Deus, pоr ser essencial еm minha vida, autor dе mеυ destino, mеυ guia e socorro presente nаs horas de angústia.
Aos meus pais: Sérgio Sansoli, meu saudoso pai, homem de índole incomparável, o qual me deu os melhores ensinamentos de vida cristã. Sua presença é constante em meu coração. Tenho certeza que, onde estiver, estará muito feliz com mais essa conquista na minha vida, como sempre esteve! E à minha amada mãe, por toda ajuda e companheirismo em todos os dias da minha vida, mulher inabalável e de um coração puro e bondoso.
Ao meu marido Pedro Henrique Chanquinie, pessoa cоm quem аmо partilhar а vida, que sempre esteve ao meu lado, sendo o maior incentivador para a realização desse sonho. Todo seu amor e carinho contribuíram para que eu não desanimasse, seus conselhos sempre cautelosos me fizeram acreditar que mesmo quando estamos cansados ainda podemos ir mais longe.
À minha amada filha Helena Sansoli Chanquinie, que mesmo tão pequenina é a razão de toda a minha alegria. Sua chegada veio para confirmar a presença de Deus na minha vida. Toda minha luta é por ela e para ela!
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida e por se fazer sempre presente, realizando incontáveis maravilhas.
À Dra. Silvana Creste, que foi mais que uma co-orientadora, sempre dedicando sua atenção e ajuda quando precisei. Agradeço, também, a oportunidade de ter realizado todo o mestrado no laboratório do Centro de Cana-IAC.
Ao meu orientador Prof. Dr. Antonio de Goes, que sempre esteve disponível em ajudar todas as vezes que precisei. Por me acolher como orientada. Agradeço a paciência, disponibilidade e orientação.
Ao Professor Dr. Dilermando Perecin por toda ajuda e disponibilidade na produção deste trabalho.
Aos professores do Departamento de Fitossanidade Laboratório de Fitopatologia, Professora Dra. Rita de Cassia Panizi e Professora Dra. Margarete Camargo pelos ensinamentos e amizade.
Ao Dr. Álvaro Sanguino por compartilhar de todo seu conhecimento e por toda ajuda na realização deste trabalho.
Às minhas grandes amigas Ana Carolina Tardiani e Camila Nunes. Amigas de longa data, há mais de dez anos partilhando de uma amizade fiel e verdadeira, desejo tê-las sempre por perto em minha vida!
Às irmãs Melloni, Maria Letícia e Maria Natália, dois anjos na minha vida. Toda minha gratidão a elas que me ajudaram antes mesmo de iniciar o mestrado. Que Deus as conserve sempre assim, bondosas e amorosas.
A todos os amigos e colegas do laboratório do Centro de Cana-IAC, Luís Fernando, Thaís, Maicom, Izadora, Larissa, Fernanda, Rafael, Alexandre, Paula, Michael e todos os demais, pelo companheirismo, trocas de experiências, ajudas, momentos de descontração, dicas e conselhos.
SUMARIO
PÁGINA
RESUMO... viii
ABSTRACT ... ix
1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 3
2.1. Etiologia ... 4
2.2. Patogenicidade ... 7
3. MATERIAL E MÉTODOS ... 10
3.1. Obtenção dos isolados de Thielaviopsis paradoxa ... 10
3.2. Preservação dos isolados de Thielaviopsis paradoxa ... 11
3.3. Preparo do inóculo ... 12
3.4. Experimentos ... 13
3.4.1. Avaliação da diversidade patogênica ... 13
3.4.2. Comportamento patogênico entre isolados de Thielaviopsis paradoxa contrastantes quanto à patogenicidade ... 15
3.4.3. Avaliação da sensibilidade de isolados de Thielaviopsis paradoxa a fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis ... 16
4. RESULTADOS ... 18
4.1. Diversidade patogênica de Thielaviopsis paradoxa ... 18
4.2. Comportamento patogênico entre isolados de Thielaviopsis paradoxa contrastantes quanto à patogenicidade ... 20
4.3. Sensibilidade de isolados de Thielaviopsis paradoxa a fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis ... 24
5. DISCUSSÃO ... 35
6. CONCLUSÕES ... 39
DIVERSIDADE PATOGÊNICA EM ISOLADOS DE THIELAVIOPSIS PARADOXA
PROVENIENTES DE DIFERENTES ÁREAS PRODUTORAS DE CANA-DE-AÇÚCAR
RESUMO - Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, é um
fungo apontado como a principal causa da baixa germinação de toletes de cana-de-açúcar. A doença é uma das principais causas pela redução da brotação e consequente falhas no stand. Não existem variedades resistentes, e quanto mais rápida é a emergência das plantas, menor é o dano causado pelo patógeno. Nesse estudo foi avaliada a diversidade patogênica de onze isolados de T. paradoxa
oriundos de toletes de canas-de-açúcar com sintomas, coletados em cinco Estados brasileiros (SP, GO, MG, BA e PR). Na inoculação foram empregados toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000, de nove meses de idade. Constatou-se diferença estatisticamente significativa entre os isolados, com destaque para os isolados 6 e 7, os mais patogênicos, ambos provenientes de Guaíra-SP. O isolado 2, proveniente de Santa Juliana-MG, foi o menos patogênico. Testes complementares com três isolados contrastantes (baixo, intermediário e alto grau de patogenicidade) inoculados em três variedades de cana-de-açúcar (IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039) comprovaram o comportamento diferenciado, sendo reproduzidas características fenotípicas semelhantes àquelas quando da inoculação na variedade IACSP95-5000. As três variedades de cana-de-açúcar empregadas nesse estudo mostraram-se suscetíveis, com indicação e possível comprovação da inexistência de variedades resistentes. Não foi constatado relação entre a origem geográfica dos isolados e níveis de patogenicidade. Testes in vitro com fungicidas dos grupos das estrobilurinas (trifloxistrobina e piraclostrobina) e triazol (tebuconazole), nas concentrações 1, 10 e 100 µgmL-1 de ingrediente ativo, tornaram evidente que apenas o fungicida tebuconazole, isoladamente ou em combinação com trifloxistrobina, mostrou-se eficiente na inibição do tamanho das colônias, quando a 100µgmL-1de i.a.. Estudos complementares acerca da viabilidade de fungicida do grupo dos triazóis, in vitro, em concentrações mais elevadas, com respectiva validação sob condições de campo, fazem-se necessários.
PATHOGENIC DIVERSITY IN ISOLATES OF THIELAVIOPSIS PARADOXA FROM
DIFFERENT PRODUCING AREAS OF SUGARCANE
ABSTRACT - Thielaviopsis paradoxa, causal agent of pineapple disease is a main
cause of poor germination of sugarcane sets. The disease is one of major cause for the reduction of budding and consequent failures on the stand. There is no resistant varieties, and as faster is the plant emergence, less is the damage caused by the pathogen. In this study it was evaluated the pathogenic diversity of eleven isolates of
T. paradoxa from stalks of sugarcane with symptoms collected from five Brazilian states (SP, GO, MG, BA and PR). For the inoculation it was used sugarcane sets of the variety IACSP95-5000, with nine months of age. Data analysis revealed differences among the isolates, especially isolates 6 and 7, the most pathogenic, both from Guaíra-SP. The isolated 2, from Santa Juliana-MG was the least pathogenic. Additional tests with three contrasting isolates (low, intermediate and high level of pathogenicity) inoculated in three varieties of sugarcane (IACSP95-5000, IAC911099 and IACSP97-4039) confirmed the different behavior, being reproduced phenotypic characteristics similar to those when inoculated in variety IACSP955000 . The three varieties of sugarcane used in this study showed to be susceptibles, with indication and possible evidence of absence of resistant varieties. It was not found relation between the geographical origin of the isolates and pathogenicity levels. In vitro tests with fungicides of the strobilurin group (pyraclostrobin and trifloxystrobin) and triazole (tebuconazole) at concentrations of 1, 10 and 100µgmL-1 active ingredient, became clear that only the fungicide
tebuconazole alone or in combination with trifloxystrobin, showed efficient in inhibiting the size of the colonies, when at 100µgmL-1. Complementary studies about the fungicide viability of the group triazoles, in vitro, at higher concentrations, with their validation under field conditions, are necessary.
A cana-de-açúcar (Saccharum spp.) é uma das culturas mais importantes no cenário socioeconômico brasileiro, sendo fonte de matéria-prima para produção de açúcar e etanol combustível. Além disso, também fornece inúmeros subprodutos, tais como bagaço, vinhaça e torta de filtro.
Atualmente, o Brasil é o maior produtor mundial de açúcar e etanol, com área plantada de nove milhões de hectares, seguido por Índia, Tailândia e Austrália. Com produção de 38 milhões de toneladas de açúcar por ano, dos quais 60% são destinados à exportação, e 23,6 bilhões de litros de etanol/ano, é o único país a utilizar o etanol em larga escala como combustível renovável e alternativo ao petróleo (UNICA, 2014).
Porém, a cultura da cana-de-açúcar no campo está sujeita a diferentes tipos de estresses, bióticos ou abióticos, os quais comprometem sua produtividade, podendo culminar em impactos negativos na economia sucro-alcooleira.
Dentre as principais doenças que acometem a cultura da cana-de-açúcar, a podridão abacaxi, causada pelo fungo Thielaviopsis paradoxa, tem apresentado crescente destaque, visto que o patógeno infecta toletes, com consequente atraso na germinação, causando redução no stand e, consequentemente, reduzindo a produtividade. Essa condição é verificada principalmente em plantios de outono-inverno, que abrangem o período de junho até início de setembro. Dessa forma, infecções nos toletes após o plantio resultam em germinação irregular, com muitas falhas, resultando, em alguns casos, na necessidade do replantio (TOKESHI; RAGO, 2005; RAID, 2010).
muito escassa, e, por vezes muito antigas. Nesse cenário inclui-se a relação
Saccharum-T. paradoxa.
Até o momento, não há relatos acerca da diversidade patogênica de T. paradoxa, e também quanto à existência de variedades de cana-de-açúcar resistentes ao patógeno. O controle do patógeno baseia-se na adoção de práticas culturais, como plantio de mudas de boa qualidade, devendo ser realizado em épocas apropriadas (SEGATO et al., 2006). O controle químico tem também se apresentado como alternativa para o controle do patógeno (CHAPOLA et al., 2014). Entretanto, há ainda escassez de informações sobre a viabilidade técnica do controle do patógeno mediante fungicidas, fato esse que contribui à baixa disponibilidade de fungicidas registrados para o controle do patógeno. Nos diversos patossistemas, para o desenvolvimento de variedades de plantas resistentes aos patógenos, há a necessidade da existência de fontes de resistência, viabilidade técnica e agronômica na sua incorporação, assim como procedimentos experimentais adequados. O conhecimento prévio da variabilidade genética do patógeno insere-se dentre os cuidados experimentais mais importantes, visto que os métodos de melhoramento são também definidos em função do comportamento fenotípico desses agentes fitopatogênicos.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tradicionalmente, em todo o mundo, a cana-de-açúcar é propagada vegetativamente por segmentos do colmo, denominados de toletes. Estes, uma vez plantados, sofrem indução das gemas e formação do sistema radicular (VIEIRA et al., 1981). Quando há condições ambientais favoráveis (umidade, temperatura, solo, etc.), iniciam-se as atividades meristemáticas nos primórdios radiculares, resultando no desenvolvimento de raízes e na formação do broto. Esta fase é muito importante, pois quando há uma boa brotação, geralmente obtêm-se plantas com alto vigor. Ao contrário, fatores bióticos e abióticos podem comprometer seriamente o estande germinativo, e, consequentemente, resultar em grandes falhas no talhão, com grande redução na produtividade.
Para uma brotação satisfatória dos toletes é necessário que a temperatura do solo esteja acima de 21°C, já que sob temperaturas mais baixas pode culminar em brotação muito lenta, ou mesmo em falhas de brotação (CLEMENTS et al.,1940). Da mesma forma, quando há falta ou o excesso de água, a brotação das gemas pode também ser seriamente afetada (CASAGRANDE et al., 1991).
A cana-de-açúcar, após o plantio, ou subsequente às fases iniciais de desenvolvimento das brotações, quando sob estresse biótico por período prolongado, pode ocorrer elevado nível de podridões, destacando-se a podridão abacaxi.
A podridão-abacaxi é uma doença causada pelo fungo do grupo dos ascomicetos, representado por Ceratocystis paradoxa (De Seynes) Moreau, e na fase anamórfica Thielaviopsis paradoxa (De Seynes) Höhn) (EDGERTON,1958; TOKESHI ; RAGO, 2005).
Segundo Wismer (1961), T. paradoxa foi observado pela primeira vez em 1886, pelo pesquisador francês De Seynes, causando queima em frutos de abacaxi, e foi descrito como Sporochisma paradoxum. Entretanto, de acordo com Wismer (1961), em 1892 o patógeno foi reavaliado por Saccardo, sendo reclassificado como
como Thielaviopsis ethaceticus Went. Nessa etapa, por consequência da similaridade do odor produzido e liberado por toletes doentes e aquele produzido por frutos de abacaxi, mesmo sadios, a doença passou a ser denominada “podridão-abacaxi”.
Von Höhnel, em 1904, constatou que T. ethaceticus Went era idêntico ao
Sporochisma paradoxum, o qual havia sido observado em coqueiros, fato que proporcionou um novo registro do patógeno, sendo descrito como T. paradoxa (De Seynes) Höhn. (WISMER,1961).
As muitas designações adotadas para a fase assexual do patógeno também ocorreram para a fase sexual. Segundo Wismer (1961), em 1928 a fase sexuada foi descrita por Dade, como Ceratostomella paradoxa (De Seynes) Dade. Já em 1934, Melin e Nannfeldt renomearam para Ophiostoma paradoxum, e em 1935,
Ceratostomella paradoxa. Finalmente, em 1952, quando da reclassificação do gênero Ceratostomella, o nome foi redescrito, sendo adotado Ceratocystisparadoxa.
No Estado de São Paulo, condições desfavoráveis à brotação das gemas e, portanto, favoráveis à T. paradoxa são representadas por plantios tardios, realizados de março até agosto (ARRUDA, 1946; GALLI et al., 1980), com consequente falhas que podem abranger grandes extensões que, em alguns casos, podem levar ao replantio da área.
2.1. Etiologia
condições climáticas podem ser adversas à sua sobrevivência (WISMER, 1961; KILE, 1999; TOKESHI, 1980).
Em sua fase teleomórfica, Thielaviopsis paradoxa (Ceratocystis paradoxa) produz peritécio, dentro do qual são produzidas as ascas e, por sua vez, os ascósporos (EDGERTON, 1958; TOKESHI; RAGO, 2005).
Segundo Chi (1949), citado por Wismer (1961), T. paradoxa tem seu crescimento e desenvolvimento limitados quando sob temperatura de cerca ou próxima de 10ºC e 34ºC, e em pH em torno de 3 e 9. De acordo com Yadahalli, Adiver e Kulkarni (2007), os intervalos de temperatura entre 25ºC e 28ºC, e de pH entre 6 e 7, foram as condições de ambientes que se mostraram adequadas ao desenvolvimento do fungo e à produção de esporos, em grande quantidade. Quando a 5 ºC o fungo teve o seu desenvolvimento vegetativo inibido.
Em termos de sintomas, nas extremidades de toletes infectados por T. paradoxa observa-se um encharcamento do tecido que, à medida que a podridão avança, a sua coloração vai se alterando, acompanhado pela formação de tecido avermelhado contendo substâncias de defesa da planta, passando para cinza, parda-escura e, finalmente, negra (Figura 2). Os tecidos parenquimatosos são
Figura 1. Vista parcial de microconídios e macroconídios de Thielaviopsis
paradoxa ao microscópio óptico, objetiva de 100x. A- Vista parcial microconídios em de cadeia. B- Vista parcial de macroconídios (estruturas mais escuras).
B
Macroconídio Microconídio
destruídos, restando somente os feixes fibrovasculares, cobertos pelos esporos escuros do fungo (TOKESHI; 1997).
Raízes e gemas podem iniciar seu desenvolvimento em toletes infectados com o patógeno, os quais, no entanto, têm seu crescimento inibido ou retardado e, na maioria dos casos, morrem antes mesmo de emergirem do solo. Às vezes, dão origem a plantas sem vigor e com pouca chance de sobrevivência (MOHANRAJ et al., 2002; TOKESHI; RAGO, 2005).
O sintoma mais típico da doença podridão-abacaxi é a fermentação dos tecidos dos toletes, dos quais exala um odor característico de essência de abacaxi. Tal odor ocorre devido à produção de acetato de etila, toxina que é responsável pela inibição da brotação das gemas. O fungo produz maiores quantidades de acetato de etila a 20°C do que a 28°C (Kuo et AL. 1969), o que pode explicar a maior importância da doença no período de inverno. Já a fermentação é mais acentuada nas fases iniciais de infecção, quando o tolete tem mais reservas de açúcar (TOKESHI; RAGO, 2005).
Figura 2.A. Vista parcial de toletes de cana-de-açúcar colonizados por Thielaviopsis
paradoxa. B. Vista parcial em lupa, aumento de 10x, das fibras vasculares mostrando-se muito escuras resultantes da elevada esporulação do fungo.
A
2.2. Patogenicidade
A penetração de T. paradoxa ocorre por ferimentos do colmo da planta, onde o fungo penetra por cortes ou rachaduras da superfície, sendo incapaz de penetrar por aberturas naturais. Por isso, em cana-de-açúcar, o estudo deste fungo é particularmente importante visto que, no plantio convencional, as canas são cortadas em toletes por ocasião do plantio, representando, portanto, a porta de entrada para o fungo.
Normalmente, quanto maior a pressão de seleção, maior são as alterações, com consequente modificações genéticas. Também, dependendo das diferentes formas de sobrevivência, disseminação, faixas de hospedeiros e modos de reprodução, podem ocorrer expressiva variabilidade genética dos organismos.
Entre os fungos, a variabilidade pode ocorrer por diferentes formas, incluindo heterocariose (MCGUIRE et al., 2004; MILGROOM et al., 2009), recombinação genética (SOUZA-PACCOLA et al., 2003, SIJMEN et al., 2007), aneuplodia (MORROW; FRASER, 2013) e parassexualidade (MILGROOM et al., 2009). A variabilidade, em termos pontuais, pode ocorrer entre culturas monoconidiais (CASELA; FREDERIKSEN, 1986), assim como entre isolados intra-campos (XU et al., 2008).
O fungo T. paradoxa conta com diversas formas de sobrevivência e disseminação, favorecido naturalmente pela elevada esporulação (ALEXOPOULOS et al.,1996). Em etapas posteriores da colonização do fungo, e por consequência do apodrecimento dos tecidos dos toletes infectados, grande quantidade de esporos são produzidos e dispersos no solo, servindo como fonte de inóculo para o próximo plantio (RAID, 1998). De acordo com Milanes Virelles et al. (1994), citados por Rott et. al (2000), a sobrevivência de T. paradoxa no solo pode ultrapassar 15 meses.
cana-de-açúcar (Diatraea saccharalis (Fabr.) (Lepidoptera: Pyralidae), por exemplo, pode facilitar a introdução e disseminação do patógeno (FAWCETT, 1931).
Segundo Gheller (1995), T. paradoxa afeta apenas as gemas que levam muitos dias para brotar, sendo que, em condições normais de umidade e temperatura, a brotação inicial das gemas de cana-de-açúcar ocorre em apenas 15 dias. Segundo Boyd e Allison (1968), essa brotação inicial da cana-de-açúcar é uma etapa crucial, visto que a gema em crescimento deve se estabelecer antes do patógeno invasor. Normalmente, esporos de T. paradoxa presentes no solo, estimulados por substância liberadas pela cana, germinam e penetram nos toletes por meio de ferimentos. Quando as gemas brotam, no período normal, e iniciam o processo fotossintético, a doença não se manifesta, uma vez que o patógeno não consegue penetrar ou colonizar os tecidos da planta devido às respostas de defesas da planta (TOKESHI, 1980).
Em canaviais da Flórida, T. paradoxa tem causado grande falhas de brotação (RAID, 2010). Rahman e Mandall (2014), assim como Chapola et al., (2014), destacaram, em seus estudos, que a podridão-abacaxi pode reduzir em quase 50% da brotação da cana-de-açúcar, ocasionando redução de 31% a até 42% na produtividade final.
Tratamentos térmicos, quando feitos de forma inadequada, incluem-se dentre alguns fatores que podem contribuir à predisposição da cana-de-açúcar ao fungo T. paradoxa. O ideal é que a germinação ocorra de forma rápida para diminuir o impacto da doença (RAID, 1998).
Uma medida importante e recomendada para o controle da podridão-abacaxi trata-se do uso de variedades com rápida brotação. Outra alternativa prática de controle da doença baseia-se na utilização de gemas do ápice (mais novas), pois estas tendem a brotar mais rapidamente (CASAGRANDE, 1991), e a utilização de quantidades maiores de gemas por metro de sulco, com consequente compensação de falhas. Além disso, é recomendável adotar bom preparo do solo e plantio mais raso, pois tais práticas resultam em brotação mais rápida da cana-de-açúcar, mais uniforme e mais vigorosa (TOKESHI; RAGO, 2005). Também, as novas tecnologias
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Obtenção dos isolados de Thielaviopsis paradoxa
Toletes de cana-de-açúcar com sintomas de podridão-abacaxi foram coletados em canaviais, de diversas variedades, em municípios localizados nos estados de São Paulo, Paraná, Minas Gerais, Goiás e Bahia (Tabela 1), e levados ao Laboratório de Fitopatologia do Centro de Cana do Instituto Agronômico de Campinas, da Agencia Paulista de Tecnologia do Agronegócio (APTA) em Ribeirão Preto/SP, onde foram cortados longitudinalmente e retirados fragmentos de tecidos lesionados, visando o isolamento do patógeno.
Para o isolamento foram retirados fragmentos de aproximadamente 5 mm2 de
Tabela 1. Isolado, variedade de cana-de-açúcar, local e ano de coleta dos isolados de Thielaviopsis paradoxa utilizados no presente estudo.
Isolado Variedade Município/Estado Ano
1 n.r. n.r. /Bahia 2004
2 n.r. Buritizal/SP 2006
3 RB 72454 Barrinha/SP 2004
4 n.r. Pradópolis/SP n.r
5 RB 867515 Água Emendada/GO 2012
6 SP 81-3250 Santa Juliana/MG 2012
7 SP 81-3250 Guaíra/SP 2012
8 SP 81-3250 Guaíra/SP 2012
9 SP 81-3250 Guaíra/SP 2012
10 RB 867515 Conceição das Alagoas/MG 2012
11 RB867515 Colorado/PR 2012
n.r.: Não registrado.
3.2. Preservação dos isolados de Thielaviopsis paradoxa
Os 11 isolados de T. paradoxa foram crescidos em placas de Petri contendo meio de cultivo BDA. Após a esporulação, uma suspensão de conídios de cada um dos isolados foi obtida e diluída de forma seriada em água estéril, da qual retirou-se uma alíquota de 0,1 mL, e plaqueada novamente em meio ágar/água (15 gL-1). A seguir, as culturas foram incubadas a 28 ºC, com fotoperíodo durante 12h, para a germinação dos conídios. Um único conídio germinado, observado em aumento 100x em microscópio óptico, foi retirado e transferido para outras placas de Petri contendo meio BDA, seguido de incubação a 28°C durante cinco dias, obtendo-se, assim, colônia monospórica.
ressecamento (Figura 3). Os tubos contendo cada isolado foram armazenados a 12°C. Esses isolados, em número de 11, foram utilizados nos estudos subsequentes.
Figura 3. Vista parcial de tubos de ensaios contendo culturas de isolados de
Thielaviopsis paradoxa
3.3. Preparo do inóculo
Para os testes de patogenicidade foi utilizada suspensão contendo 106
conídios mL-1. Para tal, culturas monospóricas de T. paradoxa foram transferidas e
multiplicadas em placas de Petri contendo BDA, por sete dias, a 28°C, e fotoperíodo 12 h. Posteriormente, em cada uma dessas placas foram adicionados 5 mL de água estéril contendo gotas de tween a 0,1% (v/v), seguido de raspagem superficial das colônias, mediante o uso de um pincel de cerdas macias, com movimentos circulares
3.4. Experimentos
3.4.1. Avaliação da diversidade patogênica
O experimento foi conduzido no laboratório e casa de vegetação do Centro de Cana-de-açúcar, no período 2/set/2013 e 11/out/2013.
A diversidade patogênica foi determinada mediante inoculação de 11 isolados (Tabela 1) em toletes de cana-de-açúcar, com três gemas, obtidos de plantas da variedade IACSP95-5000, com nove meses de idade, provenientes de viveiros de mudas do Centro de Cana, (IAC-Apta), em Ribeirão Preto/SP. Para inoculação, nas extremidades dos toletes foi infiltrado 1 mL da suspensão conidial, empregando-se seringa hipodérmica. A testemunha constituiu-se da infiltração de 1 mL de água estéril. Após inoculação, os toletes, em número de seis, foram acondicionados em bandejas de alumínio medindo 51,5 x 35,5 x 7,3cm, contendo substrato estéril Tropstrato®, sendo mantidos em casa de vegetação à temperatura de 17°C, por 40 dias.
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, sendo cada unidade amostral constituída de seis toletes, ou uma bandeja. O experimento foi realizado em duplicata.
A
B
C
D
E
Figura 4. Ilustração da escala de notas empregada na avaliação da
severidade de sintomas causados por Thielaviopsis paradoxa
inoculados em toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000. A – corresponde à nota de severidade 1; B - nota de severidade 2; C - nota de severidade 3; D - nota de severidade 4 e; E - nota de severidade 5.
Alem da severidade dos sintomas, também foram avaliadas ss variáveis (i) número de gemas viáveis e (ii) de gemas brotadas.
3.4.2. Comportamento patogênico entre isolados de Thielaviopsis paradoxa
contrastantes quanto à patogenicidade
Esse experimento foi implantado e conduzido de forma semelhante àquele descrito no item 3.4.1., sendo realizado no período de 7/abr/2015 a 27/abr/2015. Para tal, foram empregados três isolados de T. paradoxa, que apresentaram comportamento patogênico distinto em relação ao número de gemas brotadas e viáveis quando da inoculação em cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000. Os isolados avaliados foram o 2, 4 e 7, os quais apresentaram três níveis de patogenicidade, sendo: (i) fracamente patogênico, (ii) medianamente patogênico e, (iii) fortemente patogênico, respectivamente.
Para inoculação adotou-se procedimento semelhante ao descrito no item 3.4.1., sendo empregado as variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039, pertencentes ao Programa Cana-de-açúcar do Instituto Agronômico (Centro de Cana-de-açúcar).
Os toletes inoculados, oriundos de plantas de cana-de-açúcar de nove meses de idade, foram acondicionados em bandejas de alumínio (51,5 x 35,5 x 7,3 cm) contendo substrato da marca Tropstrato e mantidos em casa de vegetação, com temperatura controlada a 17°C.
O delineamento experimental adotado foi o inteiramente casualizado, constituído de cinco repetições. Cada unidade amostral foi constituída por cinco toletes de três gemas. Como testemunha, toletes foram inoculados com água destilada estéril, a fim de avaliar qualquer contaminação cruzada de ocorrência natural, além de comprovar que os toletes inoculados não apresentavam contaminação prévia. O experimento foi realizado em duplicata de forma a assegurar a repetibilidade dos dados.
Os dados obtidos foram analisados pelo programa SAS, utilizando o teste “t” (LSD = least significant difference) a 5% (P≥0,05).
3.4.3. Avaliação da sensibilidade de isolados de Thielaviopsis paradoxa a
fungicidas dos grupos das estrobilurinas e triazóis
A sensibilidade dos isolados 2, 4 e 7 de T. paradoxa foi determinada em meio de cultivo BDA acrescido de fungicidas, sobre o qual foi determinado o crescimento das colônias. Os fungicidas avaliados foram trifloxistrobina (Flint®, 500 µgmL-1 de ingrediente ativo (i.a.), Bayer S.A., São Paulo/SP), piraclostrobina (Comet®, 250 µgmL-1 de i.a., Basf S.A., São Paulo, SP), tebuconazole (Folicur®, 250 µgmL-1 de
i.a., Bayer, São Paulo, SP) e trifloxistrobina + tebuconazole (Nativo®, 100 µgmL-1 de
i.a. + 200 µgmL-1 de i.a., Bayer S.A., São Paulo, SP). Os fungicidas trifloxistrobina e
piraclostrobina pertencem ao grupo químico das estrobilurinas, enquanto o fungicida tebuconazole pertence ao grupo dos triazóis (AGROFIT, 2015).
A metodologia de preparo dos meios de cultivo com fungicidas foi semelhante à adotada por Hincapie et al. (2014), com modificações. Para tal, os fungicidas foram dissolvidos em água, e após diluições seriadas obteve-se as concentrações 0, 1, 10 e 100 μgmL-1, os quais foram adicionados ao meio de cultura BDA a 45 °C. Placas
de Petri contendo meio BDA sem fungicida foram também empregadas e se constituíram na testemunha.
O delineamento experimental usado foi o inteiramente casualizado, com 4 fungicidas, 3 isolados e 4 repetições. Cada unidade amostral foi representada por uma placa de Petri.
A avaliação baseou-se na determinação do tamanho das colônias, em sentidos perpendiculares entre si, após 7 dias de incubação, quando as culturas dos isolados do fungo alcançaram a borda das placas de Petri nos tratamentos testemunha. Quando da avaliação, o diâmetro original dos discos de colônias, de 5 mm de diâmetro, foi subtraído.
4. RESULTADOS
4.1. Diversidade patogênica de Thielaviopsis paradoxa
O critério mediante o emprego de escala de notas mostrou-se uma alternativa interessante e viável para a discriminação dos isolados de T. paradoxa quanto ao seu nível de patogenicidade, quando inoculado em toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000. Após 40 dias da inoculação, todos os toletes inoculados com os onze isolados de T. paradoxa apresentaram diferentes níveis de expressão de sintomas de podridão-abacaxi.
As médias fenotípicas atribuídas a partir da escala de notas encontram-se apresentadas na Tabela 2. Verificou-se que houve diferença significativa entre os isolados, sendo os isolados 5, 2 e 9 os mais patogênicos. O isolado 1 apresentou o menor nível de patogenicidade, com menor expressão de sintomas típicos da doença (Figura 5).
Tabela 2. Médias dos níveis de severidade de sintomas oriundos da inoculação com
11 isolados de Thielaviopsis paradoxa em toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95- 5000, sob condições de casa de vegetação à temperatura de 17°C, avaliado após 40 dias da inoculação.
Isolado Média das notas
Testemunha 1,28 eY
1 4,18 d
2 4,70 a
3 4,61ab
4 4,43 bc
5 4,73 a
6 4,43 bc
7 4,45 bc
8 4,30 cd
9 4,70 a
10 4,48 bc
11 4,43 bc
YMédias seguidas da mesma letra não diferem significativamente entre si (Teste “t”;
Figura 5. Vista parcial das respostas oriundas dos testes de patogenicidade realizados com 11 isolados de Thielaviopsis paradoxa inoculados em toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000, após 40 dias da inoculação.
Em relação ao número médio de gemas viáveis, gemas brotadas, ou gemas mortas de cana-de-açúcar inoculadas com T. paradoxa, observou-se diferença estatisticamente significativa entre os isolados (teste t; P≥0,05) (Tabela 3). Os isolados 6 e 7, os quais provieram de toletes de canas-de-açúcar coletados em Santa Juliana/MG e Guaíra/SP, respectivamente, apresentaram o maior nível de patogenicidade, com consequente menor número de gemas viáveis e gemas brotadas, e maior número de gemas mortas. O isolado 2, proveniente de Buritizal/SP, contrariamente, apesar de não apresentar diferença significativa com a testemunha, assim como quanto ao isolado 10, na variável gemas viáveis mostrou-se o menos patogênico, com conmostrou-sequente maior quantidade de gemas brotadas, e menor número de gemas mortas.
Isolado 5
Isolado 2
Isolado 9
Isolado 1
Tabela 3. Número médio de gemas viáveis, de gemas brotadas ou de gemas mortas de toletes de cana-de-açúcar da variedade IACSP95-5000 inoculados com 11 isolados de Thielaviopsis paradoxa e mantidos em ambiente de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, avaliados após 40 dias da inoculação.
Isolado Gemas viáveisX Gemas brotadasX Gemas mortasX
Testemunha 10,0ab Y 59,4 a Y 30,5 e Y
1 6,1 bcd 2,2 c 91,1 bc
2 12,2 a 1,6 b 76,1 d
3 5,0 cde 1,1 c 92,7 abc
4 2,2 de 3,8 c 93,8 abc
5 5,5 bcde 3,3 c 91,6 bc
6 1,1 e 0 c 98,8 a
7 1,1 e 0 c 98,8 a
8 4,4 cde 1,6 c 93,8 abc
9 7,7 abc 3,3 c 88,8 c
10 4,4 cde 2,7 c 93,8 abc
11 1,6 de 2,2 c 96,1 ab
XDados reais transformados em porcentagem de gemas viáveis, brotadas e mortas.
Y
Médias seguidas de mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05).
4.2. Comportamento patogênico entre isolados de Thielaviopsis paradoxa
contrastantes quanto à patogenicidade
ensaio, conforme dados citados no item 4.1. Observou-se que, mesmo com a inclusão das variedades IAC911099 e IACSP97-4039, a resposta dos isolados avaliados foi semelhante àquela verificada quando da inoculação unicamente na variedade IACSP95-5000. Dessa forma, verificou-se que o comportamento fenotípico dos isolados foi mantido, com baixos, médios e elevados níveis de severidade, para os isolados 2, 4 e 7, respectivamente. (Tabela 4).
Tabela 4. Níveis de severidade oriundos da inoculação de três isolados
contrastantes (fracamente patogênico, medianamente patogênico e altamente patogênico) de Thielaviopsis paradoxa inoculados em toletes de cana-de-açúcar das variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039, sob condições de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, após 20 dias da inoculação.
Isolados Média de severidade
2 2,049 c
4 2,079 b
7 2,132 a
Testemunha 1,791 d
Dados transformados em log 5. Médias seguidas de mesma letra minúscula não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05).
Tabela 5. Níveis de severidade de sintomas em toletes de três variedades de cana-de-açúcar (IACSP95-5000, IAC911099, IACSP97-4039) resultantes da inoculação de três isolados de Thielaviopsis paradoxa, contrastantes entre si (fracamente patogênico, medianamente patogênico e altamente patogênico) em ambiente de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, após 20 dias da inoculação.
Isolados Variedades Média
IACSP95-5000 IAC911099 IACSP97-4039
2 2,055 d 2,048d 2,045d 2,049
4 2,094 bc 2,076 bcd 2,067 cd 2,079
7 2,194 a 2,112 b 2,090 bc 2,132
Testemunha 1,791 e 1,791 e 1,791 e -
Média 2,114 2,078 2,067 -
Dados reais transformados em log 5. Médias seguidas de mesma letra minúscula não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05).
Tabela 6. Efeito de três isolados contrastantes (fracamente patogênico, medianamente patogênico e altamente patogênico) de Thielaviopsis paradoxa no número médio de gemas brotadas e gemas viáveis de toletes de cana-de-açúcar das variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039, inoculados e mantidos em ambiente de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, por 20 dias.
Isolado Número médio de gemas brotadas Número médio de gemas viáveis
2 1,357 b 1,027 b
4 1,013 c 1 b
7 1,148 c 1 b
Testemunha 2,171 a 1,301 a
Dados reais transformados em √ (contagem + 1) de gemas brotadas e viáveis. Médias seguidas da mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05).
Quando se analisa o comportamento diferencial das variedades inoculadas
com os três isolados de T. paradoxa contrastantes entre si, observou-se que, quanto
ao número médio de gemas brotadas, houve diferença estatisticamente significativa
entre as variedades, onde IACSP95-5000 e IAC911099 mostraram-se as menos
suscetíveis, com maior número médio de gemas brotadas. Em relação ao número
médio de gemas viáveis, não houve diferença estatisticamente significativa entre as
Tabela 7. Número médio de gemas brotadas e gemas viáveis de toletes de cana-de-açúcar das variedades IACSP95-5000, IAC911099 e IACSP97-4039, inoculadas com três isolados de Thielaviopsis paradoxa, contrastantes entre si (altamente patogênico, medianamente patogênico e fracamente patogênico), sob condições de casa de vegetação, à temperatura de 17°C, por 20 dias.
Variedades Número médio de gemas brotadas Número médio de gemas viáveis
IACSP95-5000 1,298 a 1,106 a
IAC911099 1,778 a 1,060 a
IACSP97-4039 1,191 b 1,080 a
Dados reais transformados em √ (contagem + 1).Médias seguidas da mesma letra minúscula, nas colunas, não diferem significativamente entre si (Teste “t”, P≥ 0,05).
4.3. Sensibilidade de isolados de Thielaviopsis paradoxa a fungicidas dos
grupos das estrobilurinas e triazóis
Tabela 8. Dados relativos à análise de variância do efeito de fungicidas do grupo das estrobilurinas e triazóis, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição (em %) do tamanho de colônias de três isolados de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro.
Isolado Causas da variação SQ QM F
2 Efeito de Fungicida (F) Efeito de Dose (D) 38,895 77,041 12,965 38,52 155,58** 462,25**
Ef. Interação FxD 77,791 12,965 155,58**
CV (%) 3,76
4
Efeito de Fungicida (F) 44,545 14,848 588,28**
Efeito de Dose (D) 87,21 43,605 1727,61**
Ef. Interação FxD 89,091 14,848 588,28**
CV (%) 2,08
7
Efeito de Fungicida (F) 62,334 20,778 1150,45**
Efeito de Dose (D) 111,28 55,64 3080,69**
Ef. Interação FxD 111,681 18,613 1030,61**
CV (%) 1,80
**Altamente significativo (P≤0,01).
Os isolados de T. paradoxa mostraram-se sensíveis apenas aos fungicidas tebuconazole e tebuconazole + trifloxistrobina, quando na concentração contendo 100 µgmL-1 de i.a. Nas concentrações contendo 1 e 10 µgmL-1 de i.a., todos os
Figura 7. Vista parcial de colônias de Thielaviopsis paradoxa (isolado 2), agente causal da podridão-abacaxi, em placas de Petri contendo meio de cultivo BDA suplementado com trifloxistrobina (A), piraclostrobina (B), tebuconazole (C) e tebuconazole + trifloxistrobina (D) com 0 (Testemunha), 1, 10 e 100 µgmL-1 de i.a., após 7 dias de incubação em
estufas para B.O.D. a 25°C ± 1°C, sob fotoperíodo de 12h.
0 1 10 100 0 1 10 100
A
0 1 10 100 0 1 10 100
B
Figura 8. Vista parcial de colônias de Thielaviopsis paradoxa (isolado 4), agente causal da podridão-abacaxi, em placas de Petri contendo meio de cultivo BDA suplementado com trifloxistrobina (A), piraclostrobina (B), tebuconazole (C) e tebuconazole + trifloxistrobina (D) com 0 (Testemunha), 1, 10 e 100 µgmL-1 de i.a., após 7 dias de incubação em estufas para B.O.D. a 25°C ± 1°C, sob fotoperíodo de 12h.
A
0 1 10 100
0 1 10 100
0 1 10 100
0 1 10 100
B
Figura 9. Vista parcial de colônias de Thielaviopsis paradoxa (isolado 7), agente causal da podridão-abacaxi, em placas de Petri contendo meio de cultivo BDA suplementado com trifloxistrobina (A), piraclostrobina (B), tebuconazole (C) e tebuconazole + trifloxistrobina (D) com 0 (Testemunha), 1, 10 e 100 µgmL-1 de i.a., após 7 dias de incubação em
estufas para B.O.D. a 25°C ± 1°C, sob fotoperíodo de 12h.
Para o caso específico do isolado 2, a inibição do crescimento das colônias foi de 59,0% quando em meio BDA suplementado com 100 µgmL-1 de i.a. de
tebuconazole, e de 67,0% quando em meio contendo 100 µgmL-1 de i.a. de
tebuconazole e tebuconazole + trifloxistrobina (Tabela 9). Resultados semelhantes 0 1 10 100 0 1 10 100
0 1 10 100 0 1 10 100
A B
foram obtidos para os isolados 4 e 7, os quais mostraram-se sensíveis apenas aos fungicidas tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole quando em meio de cultivo contendo 100 µgmL-1 de i.a.. A porcentagem de inibição do crescimento das colônias
foi respectivamente, de 60,0 e 74,0%, e 77,0% e 78,0%, para os isolados 4 e 7, aos fungicidas tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole a 100 µgmL-1 de i.a.
De acordo com os dados obtidos, verificou-se que houve significância apenas quando das avaliações dos fungicidas tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole, independe dos modelos de regressão avaliados. Para esses fungicidas, a regressão que melhor se ajustou aos dados foi a linear (Tabelas 10, 11 e 12), cujos dados mostram-se ilustrados na Figura 10.
Tabela 9. Efeito de fungicidas do grupo das estrobilurinas e triazóis, em diferentes
concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição (em %) do tamanho de colônias de três isolados de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro.
Fungicidas Concentração
de i.a. 2 Isolados 4 7
Trifloxistrobina
100 0,0 aX,Y 0,0 aX,Y 0,0
aX,Y
10 0,0 a 0,0 a 0,0 a 1 0,0 a 0,0 a 0,0 a
Piraclostrobina
100 0,0 a 0,0 a 0,0 a 10 0,0 a 0,0 a 0,0 a 1 0,0 a 0,0 a 0,0 a
Tebuconazole
100 59,0 b 60,0 b 77,0 b 10 0,0 a 0,0 a 0,0 a 1 0,0 a 0,0 a 0,0 a Trifloxistrobina
+ Tebuconazole 100 10 67,0 c 0,0 a 74,0 c 0,0 a 78,0 b 0,0 a 1 0,0 a 0,0 a 0,0 a
D.M.S. 0,54 0,30 0,25
C.V. (%) 3,76 2,08 1,80
XDados reais do tamanho das colônias transformados em porcentagem de inibição
do crescimento micelial.
YMédias seguidas pela mesma letra nas colunas não diferem estatisticamente entre
Tabela 10. Análise do desdobramento de dados e de regressão quanto ao efeito dos fungicidas trifloxistrobina, piraclostrobina, tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição do tamanho de colônias do isolado 2 de
Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro.
Fungicidas Causas da
variação QM F
Trifloxistrobina
Regressão Linear 0,000
0,00NS Regressão
Quadrática 0,000
Piraclostrobina
Regressão Linear 0,000
0,00NS Regressão
Quadrática 0,000
Tebuconazole
Regressão Linear 66,216 794,59**
Regressão
Quadrática 0,45 5,42*
Trifloxistrobina + Tebuconazole
Regressão Linear 87,57 1050,85**
Regressão
Quadrática 0,595 7,15*
Tabela 11. Análise do desdobramento de dados e de regressão quanto ao efeito dos fungicidas trifloxistrobina, piraclostrobina, tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição do tamanho de colônias do isolado 4 de
Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro.
Fungicidas Causas da
variação QM F
Trifloxistrobina
Regressão Linear 0,000
0,00NS Regressão
Quadrática 0,000
Piraclostrobina
Regressão Linear 0,000
0,00NS Regressão
Quadrática 0,000
Tebuconazole
Regressão Linear 105,542 4181,49** Regressão
Quadrática 0,717 28,45**
Trifloxistrobina + Tebuconazole
Regressão Linear 87,57 2756,23** Regressão
Quadrática 0,595 18,75**
Tabela 12. Análise do desdobramento de dados e de regressão quanto ao efeito dos fungicidas trifloxistrobina, piraclostrobina, tebuconazole e trifloxistrobina + tebuconazole, em diferentes concentrações, isoladamente ou em combinação, na inibição do tamanho de colônias do isolado 7 de
Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, sob condições in vitro.
Fungicidas Causas da variação QM F
Trifloxistrobina
Regressão Linear 0,000
0,00NS Regressão
Quadrática 0,000
Piraclostrobina
Regressão Linear 0,000
0,00NS Regressão
Quadrática 0,000
Tebuconazole
Regressão Linear 105,9 5863,55**
Regressão
Quadrática 0,019 1,07*
Trifloxistrobina + Tebuconazole
Regressão Linear 116,25 6436,60**
Regressão
Quadrática 0,79 43,79**
**Significativo (P≤0,001); *Significativo (P≤0,05); NS: Não significativo
A
B
C = - 0,0006 f2 + 0,0062 f + 8,4944
R² = 1
C = - 0,0006 n2 + 0,0071 n + 8,4935
R² = 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 20 40 60 80 100
Colô
nia
(cm
)
Concentração (µgmL-1 )
Isolado 2
1
2
3
4
C = -0,0007 f2 + 0,0078 f + 8,4929
R² = 1
C = - 0,0006 n2 + 0,0063 n + 8,4942
R² = 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 20 40 60 80 100
Colô
nia
(cm
)
Concentração (µgmL-1 )
Isolado 4
1
2
3
Figura 10. Modelo de ajuste dos dados relativos ao crescimento de colônias dos isolados 2 (A), 4 (B) e 7 (C) de Thielaviopsis paradoxa, agente causal da podridão-abacaxi, em meio de cultura contendo diferentes concentrações (em µgmL-1 ou o equivalente em µgmL-1 de ingrediente ativo) dos
fungicidas 1 (trifloxistrobina), 2 (piraclostrobina), 3 (tebuconazole) e 4 (tebuconazole+trifloxistrobina), sob condições in vitro.
C
C = - 0,0007 f2 + 0,0081 f + 8,4927
R² = 1
C = - 0,0007 n2 + 0,0082 n + 8,4926
R² = 1
1 2 3 4 5 6 7 8 9
0 20 40 60 80 100
Colô
nia
(cm
)
Concentração (µgmL-1 )
Isolado 7
1
2
3
5. DISCUSSÃO
Os resultados desse estudo confirmaram comportamento diferenciado de T. paradoxa, obtidos de cinco Estados brasileiros, independente das variedades de cana-de-açúcar da qual o fungo foi isolado. A uniformidade proporcionada pelo ambiente o qual o experimento foi conduzido demonstra que as respostas não foram determinadas por influências locais, ou do comportamento inerente das próprias plantas.
Para a interação Saccharum-T. paradoxa, esse é o primeiro relato da existência de variabilidade patogênica desse patógeno. A variabilidade, incluindo a patogênica, é uma condição que garante, dentre outros atributos, a maior possibilidade de sobrevivência dos organismos nos seus diferentes ecossistemas. A necessidade da sua permanência em ambientes altamente instáveis, faz com que a variabilidade seja uma alternativa fundamental para a sua sobrevivência, e desenvolvimento coevolutivo. Em razão disso, a interação planta-patógeno é acentuadamente marcada por um processo altamente dinâmico, com respostas que possam atender o curso natural e coevolutivo de ambos os organismos.
Patógenos que sobrevivem saprofiticamente, geralmente são menos afetados pelas influências do meio, e, dessa forma, tendem a apresentar populações genéticas mais estáveis. Thielaviopsis paradoxa apresenta a propriedade de sobreviver saprofiticamente no solo, na forma de macroconídios e microconídios, e também na forma micelial. A sua longevidade, mediante tais formas, ainda não foi determinada.
Segundo Milanes Virelles e Herrera Isla (1994), citados por Rott et al., (2000),
T. paradoxa pode sobreviver no solo por pelo menos 15 meses. Assim sendo, a permanência de estruturas do patógeno de uma safra para a outra pode contribuir para essa variabilidade patogênica, visto que pode ocorrer recombinação entre o patógeno, nas diversas regiões de cultivo.
há, no momento, variedades de cana-de-açúcar resistentes a T. paradoxa e, pela natureza biológica do patógeno, aparentemente esses aspectos continuarão sendo um grande desafio nos programas de melhoramento dessa cultura. A falta de conexão quanto aos níveis de patogenicidade dos isolados avaliados e as respectivas regiões de origem são também indicativos quanto à dificuldade no alinhamento e desenvolvimento de programas de melhoramento visando resistência de canas-de-açúcar a T. paradoxa.
Dessa forma, a variabilidade patogênica existente entre os isolados de T. paradoxa pode ser explicada, entre outros fatores, pela baixa especificidade desse fungo em relação aos seus hospedeiros. Trata-se de patógeno polífago, capaz de infectar uma grande gama de espécies de plantas como banana, coco, abacaxi, manga, eucalipto. Thielaviopsis paradoxa é encontrado em praticamente todas as regiões de cultivo da cana-de-açúcar, o que, obviamente, aumenta a dificuldade de obtenção de genétipos de cana-de-açúcar resistentes.
Os resultados obtidos tanto no experimento com a variedade IACSP95-5000, quanto nas variedades IAC911099 e IACSP97-4039 revelaram o mesmo comportamento fenotípico dos isolados, com baixos, médios e elevados níveis de severidade. Tais dados, além de corroborar a existência da variabilidade patogênica dos isolados, comprova, também, a vulnerabilidade das variedades de cana-de-açúcar avaliadas.
Ainda que tenha havido interação isolados x variedades na relação isolado 7 e a variedade IACSP95-5000, o que poderia caracterizar a existência de uma interação diferencial, e consequente resistência vertical, verifica-se que o comportamento dos isolados, em termos patogênicos, assim como as variedades, em termos de níveis de severidade, as respostas mostram-se mais coerentes ao efeito de genes menores (JOHNSON, 1979; VANDERPLANK, 1984). Além disso, de certa forma houve um ranking quanto aos níveis de patogenicidade entre os isolados avaliados, assim como quanto ao comportamento das variedades, com indicação da predominância do efeito da resistência quantitativa.
fitopatogênicos. Posteriormente, dependendo do desempenho dos mesmos, são realizados estudos complementares com vistas à determinação da sua viabilidade técnica, econômica e toxicológica.
No presente estudo verificou-se que os fungicidas pertencentes ao grupo das estrobilurinas, trifloxistrobina e piraclostrobina, até à concentração contendo 100 µgmL-1 de ingrediente ativo mostraram-se ineficientes quanto à inibição in vitro de T.
paradoxa. Por outro lado, tebuconazole isoladamente ou em mistura com trifloxistrobina, a 100 µgmL-1 foi eficiente no controle do patógeno, refletindo em inibição do crescimento das colônias do fungo.
O fungicida piraclostrobina conta com registro para o controle de T. paradoxa
na cultura da cana-de-açúcar, na dosagem de 400 a 500 mL por hectare, com emprego de 80 a 100 litros de calda por hectare, aplicado nos sulcos de plantio (AGROFIT, 2015).
No presente estudo, dada à ausência de eficiência observada com piraclostrobina, ainda que o seja na concentração contendo 100 µgmL-1,
justificam-se estudos complementares, com concentrações mais elevadas. Infere-justificam-se que, no contexto do presente estudo, indícios de que a eficiência desse fungicida deve ser reavaliada sob condições de campo, após a complementação de testes in vitro, com concentrações mais elevadas do ingrediente ativo. Obviamente, as considerações apresentadas a piraclostrobina se estendem também para trifloxistrobina, embora esse não seja registrado junto ao Ministério da Agricultura para o propósito em questão.
Em nossos estudos, tebuconazole, isoladamente ou em mistura, foi o único fungicida eficiente, embora em nenhuma concentração tenha alcançado 100% de inibição do crescimento de colônias de T. paradoxa. A inibição do crescimento das colônias mediante tebuconazole, isoladamente ou em mistura a 100 µgmL-1 variou de 59% a 78%. Há, obviamente, necessidade de estudos complementares para a determinação das concentrações necessárias para determinação dos valores de EC50, conforme normalmente adotado para estudos dessa natureza (BARTLETT et
al., 2002; MYRESIOTIS et al., 2008; HINCAPIE et al, 2014;).
paradoxa in vitro, aparentemente essa resposta resultou do efeito do fungicida triazol, já que as estrobilurinas, quando empregadas isoladamente, mostraram-se ineficientes quanto à inibição in vitro do patógeno.
6. CONCLUSÕES
- Há variabilidade patogênica entre isolados de T. paradoxa provenientes de diferentes áreas produtoras de cana-de-açúcar do Brasil;
- A variabilidade patogênica entre isolados de T. paradoxa, obtidos de diversas variedades de cana-de açúcar, não é restrita a uma região específica;
- A variabilidade patogênica de T. paradoxa aparenta ter um comportamento estável, já que respostas semelhantes foram obtidas em dois ensaios, e com diferentes variedades de cana-de-açúcar;
- As três variedades de cana-de-açúcar empregadas nesse estudo mostraram-se suscetíveis, com indicação e possível comprovação da inexistência de variedades resistentes;
- O fungicida tebuconazole, pertencente ao grupo dos triazóis, apresenta potencial para o controle de T. paradoxa.
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AGROFIT. Sistema de agrotóxicos fitossanitários. Disponível em: <http://agrofit.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons>. Acesso em: 05 abr. 2015.
ALEXOPOULOS, C. J.; MIMS, C. W.; BLACKWELL, M. Introductory mycology. 4. ed. New York: John Wiley, 1996. 868 p.
ARRUDA, S. C. As doenças da cana-de-açúcar no Estado de São Paulo. O
Biológico, São Paulo, v. 12, n. 1, p. 21-27, 1946.
BARTLETT, D. W.; CLOUGH, J. M.; GODWIN, J. R.; HALL, A. A.; HAMER, M.; PARR-DOBRZANSKI, B. Review the strobilurin fungicides. Pest Management
Science, West Sussex, v. 58, n. 3, p. 649-662, 2002. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1002/ps.813>.
BOYD, H. W.; ALLISON, C. C. Studies of host-parasite relationship in the pineapple disease of sugarcane. Phytopathology, St. Paul, v. 58, n. 6, p.839-842, 1968.
CASAGRANDE, A. A. Tópicos de morfologia e fisiologia da cana-de-açúcar. Jaboticabal: FUNEP, 1991. 157 p.
CASELA, C. R.; FREDERIKSEN, R. A. Pathogenic varibility in monoconidial isolates of the sorghum anthracnose fungus Colletotrichum graminicola from a single lesion and from monoconidial cultures. Fitopatologia Brasileira, Brasília, v. 19, n. 2, p. 149-153, 1994.
rebolos no sulco de plantio. Ciência Rural, Santa Maria, v. 44, n. 2, 2014. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1590/S0103-84782014000200001>.
CLEMENTS, H. F. Factors affecting the germination of sugarcane. Hawaiian
Planter´s Record, Honolulu, v. 44, p. 117-146, 1940.
EDGERTON, C. W. Pineapple disease. In: ______. Sugar-cane and its diseases.
Baton Rouge:Lousiana State University Press, 1958. p. 103-106.
FAWCETT, G. L. La putrefacción negra de la cana de azucar. Revista Industrial y
Agrícola, Tucumán, v. 21, p. 55-59, 1931.
GALLI, F.; CARVALHO, P. C. T.; TOKESHI, H.; BALMER, E.; KIMATI, H.; CARDOSO, C. O. N.; SALGADO, C. L.; KRÜGNER, T. L.; CARDOSO, E. J. B. N.; BERGAMIN FILHO, A. Doenças das plantas cultivadas. São Paulo: Ceres, 1980. v. 2.
GHELLER, A. C. A. Técnica cultural para o controle da podridão-abacaxi em
cana-de-açúcar e modelo para estimativas de perda. 1995. 115 p. Tese
(Doutorado em Fitotecnia) – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 1995.
GISI, U.; CHIN, K. M.; KNAPOVA, G.; KUNG, R. F.; MOHR, U.; PARISI, H. S; SIEROTZKI, U. S. Recent developments in elucidating modes of resistance to phenylamide, DMI and strobilurin fungicides. Crop Protection, Amsterdam, v. 19, n. 8-10, p. 863-872, 2000. Disponível em: <http://dx.doi.org/ 10.1016/S0261-2194(00)00114-9>.
HINCAPIE, M.; WANG, N. Y.; PERES, N. A.; DEWDNEY, M. M. Baseline sensitivity of Guignardia citricarpa isolates from Florida to azoxystrobin and pyraclostrobin.
Plant Disease, St. Paul, v. 98, n. 6, p. 780-789, 2014. Disponível em:
JOHNSON, R. The concept of durable resistance. Phytopathology, St. Paul, v. 69, p. 198-199, 1979.
KILE, G. A. Plant diseases caused by species of Ceratocystis sensu stricto and
Chalara. In: WINGFIELD, M. J.; SEIFERT, K. A.; WEBBER, J. F. Ceratocystis and Ophiostoma: taxonomy, ecology, and pathogenicity. St. Paul: APS Press, 1999. p. 173-183.
KUO, T. T.; CHIEN, M. M.; LI, H. W. Ethil acetate produced by Ceratocystis paradoxa
and C. adiposum and its role in inhibition of germination of sugarcane buds.
Canadian Journal of Botany, Ottawa, v. 47, n. 9, p. 1459, 1969.
LANDELL, M. G. A.; CAMPANA, M. P.; FIGUEIREDO, P. Sistema de multiplicação de cana-de-açúcar com uso de mudas pré-brotadas (MPB), oriundas de gemas
individualizadas. Campinas: Instituto Agronômico. 2012. 16 p. (Documentos IAC,
109). Disponível em:
http://www.udop.com.br/ebiblio/pagina/arquivos/2013_sistema_multiplicacao_cana_c
om_mudas_pre_brotadas.pdf> Acesso em: 25 abr. 2015.
MCGUIRE, C.; MARRA, R. E.; MILGROOM, M. G. Mating-type heterokaryosis and selfing in Cryphonectria parasitica. Fungal Genetics and Biology, San Diego, v. 41, n. 5, p. 521–533, 2004.
MILANES, G.; VIRELLES, P.; HERRERA ISLA, L. Effect of temperature on the growth and pathogenic activity of Thielaviopsis paradoxa (de Seynes) Moreau.
Centro Agricola, Santa Clara, v. 13, n. 2, p. 24-28, 1986.
MOHANRAJ, D.; PADMANABAN, P.; VISWANATHAN, R. Biological control of sugarcane diseases. In: GNANAMANICKAN, S.S. (Ed.). Biological control of crop
diseases. Chennai: CRC Press, 2002. p. 161-178.
MORROW, C. A.; FRASER, J. A. Ploidy variation as an adaptive mechanism in human pathogenic fungi. Seminars in Cell & Developmental Biology, London, v.
24, n. 4, p. 339–346, 2013. Disponível em:
<http://dx.doi.org/10.1016/j.semcdb.2013.01.008>.
MYRESIOTIS, C. K.; BARDAS, G. A.; KARAOGLANIDIS, G. S. Baseline sensitivity of Botrytis cinerea to pyraclostrobin and boscalid and control of anilinopyrimidine- and benzimidazole resistant strains by these fungicides. Plant Disease, St. Paul, v. 92, n. 10, p. 1427-1431, 2008. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1094/PDIS-92-10-1427>.
OLAYA, G.; KÖLLER, W. Baseline sensitivities of Venturia inaequalis populations to the strobilurin fungicide kresoxim-methyl. Plant Disease, St. Paul, v. 83, n. 3, p. 274-278, 1999. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1094/PDIS.1999.83.3.274>.
RAHMAN, M.; MONDAL, R. I. Agricultural research priority: vison-2030 and beyond; crops: cereal other than rice, sugarcane and jute. Disponível em:
<http://www.barc.gov.bd/documentes/final-%20 Dr.%Matiur.pdf>. Acesso em: 30 abr.
2014.
RAID, R. N. Pineapple disease of sugarcane. Gainesville: University of Florida Cooperative Extension Service, Institute of Food and Agricultural Sciences, 1998.
ROTT, P.; BAILEY, R. A.; COMSTOCK, J. C.; CROFT, B. J.; SAUMTALLY, A. S. (Ed.). A guide to sugarcane diseases. Montpellier: ISSCT, 2000. 339 p.
SEGATO, S. V.; PINTO, A. S.; JENDIROBA, E.; NÓBREGA, J. C. M. Atualização
SIJMEN, E. S.; ALFONS, J. M.; DEBETS, M. S.; ROLF, F. H. Mitotic recombination accelerates adaptation in the fungus Aspergillus nidulans. Plos Genet, v. 3, n. 4, p. 68, 2007. Disponível em: <http://dx.doi.org/10.1371/journal.pgen.0030068>.
SOUZA-PACCOLA, E. A.; FAVARO, L. C. L.; CASELA, C. R.; PACCOLA-MEIRELLES, L. D. Genetic recombination in Colletotrichum sublineolum. Journal
Phytopathology, Berlin, v. 151, p. 329–334, 2003.
TOKESHI, H. Doenças da cana-de-açúcar. In: GALLI, F. (Coord.). Manual de
Fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 4. ed. São Paulo: Agronômica
Ceres, 1980. v. 2, p. 141-206.
TOKESHI, H. Doenças da cana-de-açúcar. In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L. E. A. (Ed.). Manual de
fitopatologia. 3 ed. São Paulo:Ceres, 1997. v. 2.
TOKESHI, H.; RAGO, A. Doenças da cana-de-açúcar (híbridos de Saccharum spp.). In: KIMATI, H.; AMORIM, L.; REZENDE, J. A. M.; BERGAMIN FILHO, A.; CAMARGO, L. E. A. Manual de fitopatologia: doenças das plantas cultivadas. 4. ed. São Paulo: Agronômica Ceres, 2005. v. 2, p. 185-196.
UNICA. União da Indústria de Cana-de-Açúcar. Disponível em:
<
http://www.unica.com.br/content/show.asp?cntCode=8875C0EE-34FA-4649-A2E6-80160F1A4782>. Acesso em: 20 set. 2014.
VANDERPLANK, J. E. Resistance horizontal and vertical. In: ______. Disease
resistance of plants. 2. ed. London: Academic Press, 1984. p. 57-80.