Morphological aspects of rumen ciliate (Entodiniomorphida, Ophryoscolecidae) demonstred by Protargol and Feullgen's reation techniques.

ASPECTOS MORFOLÓGICOS DE CILlADOS DE RÚMEN (ENTODINIOMORPHIDA, OPHRYOSCOLECIDAE) REVELADOS PELAS

TÉCNICAS DO PROTARGOL E DA REAÇÃO DE FEULGEN

I Marta O' Agosto Mi lden Rodrigues de Santa-Rosa 2

ABSTRACT, rVIOKPIIOI.O(ólCAL AWlr lS 01· KI 'MI')I ('I 1.1 AT I" Ｈｅｾｔｏｉｬｉｾｉｏｍｏｋｐ ｉｉｉｉｬ ａＮ＠ ()PIII,)'OS('OI.E('IIlAE) 11I',MO"S'1 KEIl BY PKI)'J AK(;OI. A"1l FU 'U;E"'S ｋｅａｔｉｏｾ＠

I ECIINI<)I II:""i. ｔｨｾ＠ fÇ:-iUItS 01' ｴｨｾ＠ prnt<lrgnl"s k...:hniqul.! and Fl.!ulgl!l1's rça...:tinns nn

( iliaks uf'thl.! gl.!llLlS EII/fIllil1ill111 Skin. I X:"Y. Dip/nclinilll1l S...:huhl.!rg. 1 XXX. Eodinium

Knlilid & ｬＧ､ ｡｣ ｌｾｮｮＢｮＬ＠ 1'132, E/ulipl""i"i",,, Dngid. 1927 and ()s/meodi"i"",

ｄｮｾｩ､Ｎ＠ !Y27 ar...: prl.!sl.!llku. Th\.! ...: iliah!s ｜｜Ｇ｜Ａｲｾ＠ nh lain...:d fnHll sampk:-. of hovinç's nlllllllal "'; ()Ilknt .

KEY \VORDS . EnItH.lininll1\)T'phida. Ophrynsl.' ()kcidal.!. rUIll"':1l ...:ilia l...:. sil v\!r ｩｬｬｬｰｮＺｾｮ｡ｴｩｮｮＮ＠ Fl.!ulgl.!n· ... fl.!adinll

Désdé a prIllléira ohservação por GRUBY & DELAFOND (1843). ･ｓｰｾｃｬ￩ｓ＠

de cillados de rúmen ｖｾＱｬｬ＠ senuo assinaladas é descritas nas divérsas régiões dé ｯ｣ｯｲｲｾｮ｣ｬ｡＠ de seus hospedeiros. ruminantes é pseuuo-rulllinanks dOl1lésticados ou silvéstréS. Quanto às ｴｾ｣ｮｩ ｣｡ｳ＠ de ev idénciaçào ､ｾ＠ suas estruturas são ｵｴｩｬｩｺ｡､｡ｾ＠

l1lontagens provisórias co m ciliados mio corados (V AN H OVEN 1(83) , em glicerina (KOFOID & MACLENNAN 1930: WERTHEIM 1935 : DAs-GUPTA 1935: CLARKE 1964) ou corados, Para ev idenciar o macrol1lÍL' leo t\ co mum () ￩ ｭｲｲ ｾｧｯ＠ do verde dé tl1élila (CLARKE 1964: DEHORITY 1974: Ir-.IAI 1988). verde ､ｾ＠ mélila-ｰｩｲｯｮＱｬＱ｡Ｍ｡ｃｾｬｯＭＨＩｲ｣ｾｩｮ｡Ｍ｣ｬｯｲ￭､ｮ｣ｯ＠ ou reação ao Azul' A. Gürr (CHARDEZ 1983) ou azul de metileno acidiftcado (DEHORITY 1974). ｾ＠ para ev idencia\ào das placas

･ｳｱｵ･ｬｾｬｩ｣｡ｳ＠ solu,ão de Lugol ou outra cOlltenuo iodo (KOFOID & CHRISTENSON

1934; DAS-GUPTA 1935: ZIELYK 1961: CLARKE 1964: DEH()RrTY 1974: VAN HOVEN 1975, 1983 : CHARDEZ 1983),

Quanto às ｰｲ ｾｰ｡ ｲ｡￧￴ ･ｳ＠ péflllanentcs. foram referidas a co loração pela hémaloxilina de ｈ ｾ ｩ､ｾｮｨ｡ｩｬｬＮ＠ Mal lory. Dclafield ou ｵｾ＠ Mayer. é ainda hell1atoxilina é eosina (KOFOID & MACLENNAN 1930, 1932: WERTHEIM 1C)35; DAs-GUPTA 1935; ZIELYK 1961: V AN HOVEN 1975. 1983 ; OGIMOTO& 1M AI 1981: IMAI1988).

ｐｲ･ｰ｡ｲ｡￧￴･ｾ＠ com ｶ･ｲ､ｾ＠ de l11elila des idratadas cm álcool e xilol e ｬＱｬｯｮｴ｡､｡ｾ＠ em Euparol foram féitas por CLARKE (1964). e com ca rmin horáci c!l por ZIELYK (1961 )

1) ｄ｣ｰ｡ｲｴ｡ｬｬｬｾｬ｜ｬｬＧ＠ ､ｾ＠ ｚｰ｜ＩｉＨＩｾｩｩｬ Ｎ＠ ｕｮｩｶｾｲｾｩ､ｭｫ＠ ｆｾｬｫｲ｡ｬ＠ dt: .Iui /. _､ｾ＠ Fnra. 3AOJn-JJO .fuil _､ｾ＠ FI)ra. rvtillélS G\.!ral!'. Brasil.

2) Instituhl dI.! ｾＱｩ ｾ ｲｮｨｩｮｬｮｧｩ｡Ｎ＠ Univl.!rsiJad..: Fúkral dI) Riu li...: Ｎｉ｡ｬｬｬＮＡｩｲｾｬＮ＠ '2 I 4 44 -'i70 Rin dI.! JaIll.!irn , Ri n

d...: Jan...:irtl. Bra:-.il.

216 O'AGOSTO & SANTA-ROSA

OGIMOTO & LMAI (1981) citaram como possíveis técnicas para preparações

pemanentes de ciliados de rúmen, além da hematoxilina férrica de Hcidenhaim, a impregnação pela prata, segundo Bodian, mencionando ainda a técnica de

CHATTON-LwOFF (1930) simplificada, de acordo com FRANKEL & HECKMANN

( 1968).

ZIELYK (1961), além das técnicas já citadas, fez preparações utilizando nigrosina, 10% de azul opala, e técnicas de impregnação pela prata de KLEIN (1958) e CHATTON-LwOFF (1930) para evidenciar estriações longitudinais de

organismos do gênero EmodiniulIl Stein, 1859. O autor assinalou não haver obtido

nenhum resultado positivo na coloração ou impregnação da infraciliatura. O presente trahalho ohjetivou investigar o resultado da utilização de duas técnicas de preparações permanentes, o protargol e a reação de Feulgen, no estudo de ciliados de rúmen de bovinos por se tratar de técnicas clássicas em ciliatologia, de ampla aplicação e que raramente são utilizadas para preservação de Entodiniomorfos.

MA TERIAL E MÉTODOS

Estudos morfológicos de ciliados de rúmen de bovinos toram realizados em microscopia fotônica empregando-se a reação de Feulgen (FEULGEN 1926) e técnica de Bodian (protargol) segundo a variante de TUFFRAU (1964, 1967). O princípio desta última consiste na utilização de sais de prata, proteinato de prata, como agente impregnante e posterior revelação em hidroquinona. Já na reação de Feulgen, após uma hidrólise ácida, os componentes nucleares coram-se de ver-melho intenso por reação com a fuccina do preparado de Schiff.

A triagem dos ciliados foi feita em saleira, com o auxílio de micropipetas, a partir de amostras de conteúdo ruminai fixadas e conservadas em formalina a 18,5% (v/v), sob microscópio estereoscópico com aumento entre 20 e 40x. As amostras foram filtradas em gaze para eliminação dos fragmentos vegetais maiores e lavadas sucessivamente com água destilada para eliminação dos resíduos de conteúdo ruminai e para concentração dos ciliados.

Para a técnica do protargol, a cada gota de água contendo ciliados era adicionada quantidade cinco vezes maior de Bouin Hollande como pós-fixador, o que faciliatava a visualização e triagem dos ciliados. O material foi lavado em água destilada até a eliminacão dos resíduos do Bouin e de vestígios de conteúdo ruminaI.

A seguir, separavam-se os ciliados, agrupando-os segundo suas dimensões (e.g.,

pequenos entodiniomorfos, grandes entodiniomorfos) em diversas saleiras, para c1ariticacão em á1:,'11a de Javel, com concentração e tempo variáveis de acordo com grupo de ciliados.

O tempo de impregnação no proteína to de prata, a I %, variou de 24 horas,

para pequenos entodiniomorfos, a duas e três horas, para os grandes entodi-niomorfos. As impregnações toram realizadas a temperatura ambiente.

Para a reação de Feulgen, os ciliados lavados, triados e concentrados por micropipetagem foram aderidos às lâminas com albumina glicerinada, preparada

segundo FOISSNER (1991), antes de se proceder à hidrólise em ácido clorídrico a

Aspectos morfol ógicos de ciliados de rúmen ... 217

I N (14 a 60° C) e suhmersão no reativo de Shitl por três horas.

As demais etapas, não mencionadas. seguiram o preconizado pela técnica correspondente até a montagem em hálsamo do Canadá.

As micrografias foram feitas em microscópio ZEIss-Gennany com aumento de lOOOx .

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Apesar de rotineiramente utilizadas em ciliatologia, não é comum o emprego do protargol ou da reação de Feulgen para evidenciação de estruturas de ciliados de nímen ou para sua preservação em coleções de referência.

O registro dos resultados ohtidos com o protargol e a mação de Feulgen

em ciliados ruminais dos gêneros EnlOdiniuIII Stein, 1859. DiplodiniulII Schuherg,

1888, Eodiniul/I Kotóid & MacLennan. 1932, EudiplodiniulII Dogiel, 1927 e

OsrraclidilliulII Dogiel, 1927 pode ser ohservado nas figuras l-S.

Com o protargol, os caracteres morfológicos principais para a identi ticação específica destes ciliados tóram evidenCiados como, por exemplo. a estrutura externa e suas particularidades como estrias e fendas na película (Fig . I A, 8). zonas de slllcília Ｈｆｩｧｾ＠ 1-5). maCfO e micronúcleonúcleo (Fig. 1-5). vacúolo pulsátil (Figs 28 , 3A). Outros caracteres como II opérculo - quando presente '- , cito-taringe , citoprocto e hlgossomo tamhém podem ser ohservados (Figs 1-5).

Registraram-se ainda, a impregnação do macronúcleo (Figs I D, 38) e do

micro-núcleo (Fig. I D) em divisão e de novas zonas ciliares na tórmação do opisto (Fig.

38 , 4D, 5A).

Destacam-sé as melhores impregnaçôes nos organismos de menores

dimen-sôes e em geral sem placas esquelélicas , excetuando-se os do gênero Eudip/odiniulII

que apresentam pequena placa esquelética e hons resultados de impregnação. Todavia. para os ciliados cuja identificacão générica é feita pêlo núméro é forma das placas ésqueléticas. em geral grandes éntodiniomorfós, a imprégnacão argên-tlca é inadequada por não evidenciar completamente estas estruturas. apenas vislumhrando-se sua presença em algunas preparações (Fig. 58). As melhores evidenciaçiies das placas esqueléticas são ohtidas com o emprego de soluçôes a hase de iodo (CHARDEZ 1983; VAN HOVEN 1975, 1983). apesar de serem preparaçôes provlsónas.

Para os entodiniomortós de maiores dil11ensôes co mo os dos gêneros

OSlracodiniul/I, Polyp/lIsrroll Dogiel, 1927 e outros, o emprego do protargol é

restrito pela excessiva impregnação destes organismos, ohservada mesmo com a redução do tempo de imersão no proleinato de prata. Em algumas preparações, entretanto. nota-se a nítida impregnação do macronúcleo e das zonas de sincília.

protraídas ou não (Fig. 5A. C). como as ohservadas em OsrracodilliwlI sp. Com

os organismos de outros gêneros deste grupo não foram obtidos hons resultados.

Dentre as poucas referências à esta técnica para entod iniomorfos . OGIMOTO

& 1M AI (1981) citam uma variante do protargol como um dos métodos para montagem permanentes de ciliados. Os autores não apresentaram. contudo.

218 O'AGOSTO & SANTA-ROSA

I

ｾ＠

ｾＧＢ＠

-ec

I

I

C

O

Fig. I. ｍｩｬＮＡｲｬｬｧｲ｡ｴｩ｡ｾ＠ dl! E"lodi"ium !"pp. I.!Ill Prnlargol (A. U. L) \! ｲ｜Ａ｡ｬｩ￣ｾｬ＠ lh: Fl!ulgl.!ll ( 1) . Z{lna adora i

､ｾ＠ sine"ia (zas) , Zona adorai ､ｾ＠ sine"ia do opislo ｾｭ＠ formação (zaso), maeroOlícko (ma) ｾｭ＠ divisão

na Ｑ ｾ ｬｲ ｡＠ D, cilofaringc (d ) , fag",,,'oma (I). ciloprocto (c p). ｾｳｬｲｩ｡ｳ＠ (e). ｲｾｮ､｡＠ ｳｬｬｰｾｲｩｯｲ＠ (fs). ｾｳｰｩｮｨｯ＠

caudal (ec). Barra = IOfun.

Aspectos morfológicos de ciliados de rúmen . . . 219

ma

A

B

ma

a

c

o

Fig . 2. Microg ratias de EII/odillilllll IOllgi/lllc/eallllll. e111 Protargo l (A. B) c reação ､ｾ＠ Feulgen CC. D).

Zona adorai de sincília (ms). 111ac romídeo (ma). micro mícJeo (mi). fagosso111a (I). citoproc to (C p).

vactíolo pulsátil (vp) : (C) preda,ão de 11111 congG nere Ｈｳｾ ｴ｡ Ｉ＠ : (D) rest,,,, de material nuclear de um

co ngGnere parcialmente digerido (saas). Barra = 10fun.

220 D'AGOSTO & SANTA-ROSA

B

cp

c

o

Fig. 3 . Microg ratia s ､ｾ＠ Eo<iinilllll sp . ｾｭ＠ Protargol (A. B) e ､ｾ＠ Elldipl odi ni lllll mslmltllll e m prlltargol

(C) e reação ､ｾ＠ FelJlgcn (D). Zona adoraI de sincília (zas). zona esquerda ､ｾ＠ sincília (Zel). zona adoraI

de sincília do opisto em formação (zaso), zona eSljuerda ､ｾ＠ sincília do opist o ｾｭ＠ formação (zeso).

mac ronúcleo (ma), micronúc k o (mi), citofaringc (cl) , citop rocto (cp). vacúolo pulsátil (vp) , ｯ ｲｾｲ ｣ ｵｬ ＨＩ＠

(o) . B.1rra = IOflm .

Aspectos morfol ógicos de c iliados de rúmen .. . 221

A

B

I

ec-c

I

o

ec-Fig. 4 . ｾＱｩ ＮＮＮＺｲｮｧｲＨｬ ｬｩ ｡ＡＧＭ í..k Dip/Ollillillm ,1('11/0111111 ｾｉｬｬ＠ prnlargtl) (A. t..:. D) lo! ｲ｜ＮＡ｡ｾ ｩ ｬｬｬ＠ dI.! F\!ull:!\.! n ( 1\) . Znn(l

adorai ､ ｾ＠ sim.: í1ia (z.as). 'I.ona I!squt.!n.hl dI! sim:llia Ｈ ｺｾｳ ＩＮ＠ I.ona acJond dI! ｳ ｩｮ ｾ￭ ｬｩ Ｎ｡＠ Jp opi sto l!111 ｲ ｮｮ ｮ ｡ｾ￣ｯ＠

(zaso). ma...:rnmí dl! t.) (Ina). mi..; ronúl..:h!o (nli ). I!spi nhns I.:auuais (K) . ｮｲｾｮＧＺｬｉｬｯ＠ (o) . Barra = I ｏｾ ｬｭ Ｎ＠

222 O'AGOSTO & SANTA-ROSA

A

I

B

I

""""zas

mi

ma

c

I

o

I

Fig. 5. Micr,'gral"las lI.! ()slracndillilllll

sr.

adora i de sincília Ｈｺ｡ｾＩＮ＠ zona csq u"rda ､ｾ＠ sincília (zes) protraída "Ill A I! rl!traída el11 C. zona adorai

de sincíl ia do opisto em formação (zaso). zona esqu"rda de sincília do opisto cm formação (zeso) .

macronúcko (ma). micromícl.!o (mi). l'1'ücu lo (o). vestígio dI! placa ｣ｳｱｵ､ｾｴｩ｣｡＠ (pe). Barra = ｬ ｏｵｾｵ ｮ Ｎ＠

Aspectos morfológicos de ciliados de rúmen .. 223

fesultauos uo SeU e mpre1,!o. Em estuuo Ue organismos ua família Ophryosco\cciuae, especialmente Ue EIlWdilliulII dll!l{/rdi 8uisson. 1923 de cervídeo. ZIEL YK ( 196 1 ) utilizou técnicas de impre1,! nat.;ào pela prata de KLEIN (1 958) e de CHATTON-LW()FF (1930) assinalando nà(, ter ohservauo a impreg nat.;ão da infraciliatura. O autor conduiu que material fixado com túrmalina é inadequado a ･ｾｴ｡＠ impregnat.;ào. A impregnat.;ào da infrac iliatura de entodiniomorfos co m ca rhonato de prata C(lm piridina foi ohtida por NOIROT-TIMOTHÉE (1960) e por FERNANDEZ-GALlANo (1958). Sem () empn:!go Ue piridina. em método que c hamou Ue impregnat.;ào rápiua. Este autor realizou estudo sohre PII/)plil.\"fro/l IIl/.tlril'l'.liclllarulII (Dogid &

Fedorowa , 1925). ressaltanuo ter ohtido hons resultados. Nos resultados ohtiuos no presente trahalho. em concordância co m o ohservado por ZIEL YK ( 19(1). não houve a impregnat.;ào da IIlfraciliatura.

Nas preparat.;()éS e m que Sé utilizou a ｲ･｡ｾ ﾷ ￠ｯ＠ de Feulgen (Flgs I D; 2C. D; 3D; 48; 58 , D) nota-Sé qUé o ohjdivo da téc nica. qUé é a evidénciat.;ào uas estruturas nucléarés. túi atin1,!iuo sendo possível a ohsavat.;ão do macro é UO microlllíc\co. Até mésmo nos granues entoullúomorfos os resultados túram has-tanté relévantes como os démostrado em OSl/"IIClldillilll1l sp. (Fig. 58. D).

Cred ita-se à consérvat.;ão prolongada do material em forma li na a di ticuldade dé Sé ohter a comp leta hior<Ílise 00 c itoplasma . ohservando-se. ém muitos organismos , uma colorat.;ão di screta do mesmo, o que nào é comum nesta técnica. Com o emp rego ua reat.;ão de Feu lgen uéstacou-se ainda o háhito de prédat.;ão ue outros ciliauos , aqui reglstrauo para Ellfodinillllllli/lginuc!l'{/IIIIII Dogiel , 1925 com

outro organismo UO mesmo gênero no interior Ué um fagossomo (Fig. 2C) é résto Ué materialnuc \car Ue c iliauojá uigerido (Fig. 2D). Grat.;as à especificiuaué Uésta réat.;ão, pôué-se iuenti ficar como nucleares a" éstruturas ohservauas nestes hlgosSOl1los.

CONCLUSÕES

COnclUiu-se que, apesar do longo tempo uecorriuo entré a ohtent.;ão das amostras e o émprego uas ｴ￩ ｣ｮｩ｣｡Ｎｾ＠ Ue impregnat.;ào é ue colorat.;ào, é possível a s ua utilizat.;ào. Ressalta-se ainda, a importância oe se preparar làminas pérmanentes que sirvam de material de referência para o estuuo uestes ci liauos, sohretuuo quanuo novas espéc ies sào uescritas, a uespeito ua ｰｯＮｾｳｩｨｩｬｩｵ｡ｵ･＠ Ue se ohservar algumas ue suas estruturas em preparat.;()éS mio l:orauas ou lemporárias.

As duas técnicas e mpregadas eviuenc iaram particu larmente hélll as seguin-teS estruturas : mícleos (mano e minonúdeo) , zonas Ue s lllc llia . citofaringe, ciloprocto e fagossoll1a .

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