UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
DOUTORANDA: Marta Rabello Piva
ORIENTADORA: Profa. Dra. Lélia Batista de Souza
Natal/RN
2009
Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Patologia Oral.
EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DO CD8, FOXP3,
7*)ȕ71)ĮH1)
-
NN
B EM DISPLASIAS EPITELIAIS E
DEDICATÓRIAS
Dedico este trabalho em especial a meu pai, ³1HVWRU 3LYD´, meu ídolo, meu guia, que apesar de não poder compartilhar com essa vitória, foi o seu desejo e o seu reconhecimento que me incentivaram a chegar até aqui.
A Chiquinho, meu companheiro e incentivador. Sua compreensão, dedicação, carinho e confiança, me fizeram buscar forças para alcançar esta conquista. Sou sua fã nº1.
À minha mãe Bernadeth, que sempre foi meu anjo da guarda, e me confortou com todo seu carinho e preocupação dedicados aos meus filhos durante a minha ausência.
Aos nossos filhos, Francisco Roberto, Diogo, Breno, Luís Henrique, Moema Tereza, João Victor e Paulo Henrique, por serem as pessoas maravilhosas que são. Pela compreensão e apoio que tanto me gratificou e encorajou. Para estes dedico a esperança em um mundo melhor.
Às minhas amigas inseparáveis, Tânia, Lívia, Aída e Rosa, que suportaram o meu abandono nas quartas e sextas. Os caranguejos agradecem.
AGRADECIMENTOS
Aos professores Lélia Batista de Souza e Leão Pereira Pinto, por viabilizarem a realização de um sonho.
Ao CNPq e à CAPES, na pessoa do Prf
º José Fernandes Lima,
pelo apoio financeiro indispensável para a execução deste curso.Aos meus irmãos e sobrinhos, Nestor, Isabela, Augusto César, Isabelle e Nestorzinho pelo apoio e dedicação sem os quais não teria conseguido realizar esta tarefa. Gugu, meu amor por você é incondicional.
À minha orientadora, professora Lélia Batista de Souza por sempre estar ao meu lado nos erros e nos acertos. Acho que decifrei o enigma!
Aos professores Antônio Costa, Hébel, Lélia Maria, Márcia Miguel e Roseana, por tudo que nos ensinaram, pela compreensão e pela solidariedade durante todo o curso.
À Dr.Ângelo, Líbia, Cris e Cassiano pela orientação, possibilitando um conhecimento mais profundo sobre a aplicabilidade dos testes utilizados na análise estatística deste trabalho.
Aos funcionários Gracinha, Idelzuite, Canindé, Sandra, Hévio e Lourdinha sempre amigos dedicados e atenciosos, dispostos a colaborar com nossos trabalhos.
solidariedade não só no nosso aprendizado como também nas comemorações e despedidas, sempre um motivo para festejarmos e estarmos juntos.
A Cassiano, Cris, Éricka, Líbia, Márcia e Pedro Paulo, pela mãozinha nas horas dos apertos. Não existem palavras que expressem, o quanto vocês foram e serão importantes na minha vida.
Ao amigo indispensável nas farras. O que seriam dos congressos sem você, Gustavo?
A todos aqueles que por ventura tenham escapado injustamente do meu pensamento neste momento, meu perdão, mas para fazer justiça sem medo de errar, eu teria que agradecer à Sociedade Médica Sergipana em nome de todos aqueles que me socorreram nos momentos de dificuldade, em especial a Dr. Eduardo Góis e Dr. Caetano Macieira.
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS
APC ± Célula apresentadora de antígeno CE ± Carcinoma epidermóide
Célula NK ± 'RLQJOrV³1DWXUDONLOOHUFHOO´FpOXODPDWDGRUDQDWXUDO CEO ± Carcinoma epidermóide oral
DEO ± Displasia Epitelial Oral
Fas ± Membro da família do TNF expresso na superfície celular (CD95)
Foxp3 ± Proteína de transcrição reponsávem pela função e diferenciação da célula Treg
GITR ± 'RLQJOrV³*OXFRFRUWLFRLG-,QGXFHG71)5HFHSWRU´ IFN-J ± Interferon-J
LB ± Linfócito B
LPS ± Lipopolissacarídio (Endotoxina) LT ± Linfócito T
LTC ± Linfócito T citotóxico
MHC ± Complexo principal de histocompatibilidade NFk-B ± Fator de transcrição nuclear kappa B
TCR ± 'RLQJOrV³7FHOOUHFHSWRU´UHFHSWRUGHFpOXODV7
TGF-E ± 'R LQJOrV ³7UDQVIRUPLQJ JURZWK IDFWRU´ )DWRU GH FUHVFLPHQWR transformante
LISTA DE
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Ilustrações pg
Quadro 01- Critérios para diagnóstico de displasias. 46 Quadro 02- Critérios para avaliação do dismorfismo das massas epiteliais. 47 Quadro 03- Parâmetros avaliados para definir o estágio dos CEO. 47
Quadro 04-Estadiamento do CEO. 48
Quadro 05- Gradação de Bryne.(1998). 48 Quadro 06- Especificações dos anticorpos primários. 50 Quadro 07- Análise semi-quantitativa dos anticorpos. 51 Quadro 08- Gradação histológica de malignidade dos carcinomas epidermóides de acordo com a metodologia desenvolvida para o presente estudo. Natal/RN 2009.
55
Quadro 09- Gradação histológica de malignidade dos Carcinomas Epidermóides de acordo com o método de Bryne (1998) para o front invasivo. Natal/RN 2009.
57
Tabela 01- Gradação histológica das displasias baseada na OMS (2005) de acordo com a intensidade do infiltrado inflamatório. Natal/RN 2009.
54
Tabela 02- Correlação entre Gradação histológica de malignidade dos CEO e a intensidade do infiltrado inflamatório, nas lesões estudadas. Natal/RN 2009.
56
Tabela 03- Expressão imuno-KLVWRTXtPLFDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 71)ĮH1)-NB nas DEO e CEO. Natal/RN 2009.
58
Tabela 04- Expressão imuno-KLVWRTXtPLFDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 71)ĮH1)-NB) de acordo com o grau das DEO. Natal/RN 2009.
59
Tabela 05- Expressão imuno-KLVWRTXtPLFDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 71)ĮH1)-NB) de acordo com o estágio dos CEO. Natal/RN 2009.
60
Tabela 06- Expressão imuno-KLVWRTXtPLFDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 71)Į H 1)-NB) de acordo com a intensidade do Infiltrado Inflamatório nas DEO. Natal/RN 2009.
61
Tabela 07- Expressão imuno-histoquímicDGRVDQWLFRUSRV&')2;37*)ȕ 71)Į H 1)-NB) de acordo com a intensidade do Infiltrado Inflamatório nos CEO. Natal/RN 2009.
62
Tabela 08- Distribuição dos casos de CEO de baixo e alto graus segundo os parâmetros utilizados na gradação histológica de malignidade. Natal/RN 2009.
Tabela 09- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos, estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas SDUD&')2;37*)ȕ71)ĮHNF-NB em relação ao tipo de lesão. Natal/RN 2009.
64
Tabela 10- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos, estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas SDUD&')2;37*)ȕ71)ĮHNF-NB em relação à gradação histológica das DEO. Natal/RN 2009.
64
Tabela 11- Tamanho da amostra, medianas, quartis, médias, soma dos postos, estatística U e sua significância entre a quantidade de células imunopositivas SDUD&')2;37*)ȕ71)ĮHNF-NB em relação à gradação histológica de malignidade dos CEO. Natal/RN 2009.
65
Tabela 12- Coeficiente de correlação de Spearman (r) e sua significância estatística entre a intensidade do infiltrado inflamatório e a quantidade de células LPXQRSRVLWLYDV SDUD &' )2;3 7*)ȕ 71)Į HNF-NB, segundo o tipo de lesão. Natal/RN 2009.
66
Ggáfico 01- Comparação das GHM. 56
RESUMO
A Displasia Epitelial Oral (DEO) é a lesão que precede ou co-existe com o Carcinoma Epidermóide Oral (CEO), apresentando alterações moleculares e/ou histológicas semelhantes. As divergências sobre o potencial de malignização das DEO e o papel da inflamação nestes processos têm dificultado o diagnóstico precoce e a avaliação da agressividade dos CEO. Sendo assim, tornou-se objetivo deste estudo avaliar o papel da inflamação na carcinogênese oral e agressividade tumoral. Para isso foi realizado estudo morfológico em 20 casos de DEO e 40 casos de CEO para detectar o potencial de malignização das DEO e o Grau Histológico de Malignidade (GHM) dos CEO, analisando as massas superficiais para avaliação do dismorfismo e o front invasivo para avaliação do crescimento tumoral; e imuno-histoquímico, utilizando os anticorpos anti-CD8, anti-FOXP3, anti-7*)ȕ DQWL-TNF-Į H DQWL-NF-NB, para comparar a expressão dos mesmos com o tipo de lesão, grau histológico e intensidade do infiltrado inflamatório. Os resultados foram estatisticamente significantes para os parâmetros, maturidade celular (p=0,0001), presença de massas (p=0,038) e dismorfismo (p=0,037), quando associados aos GHM. Ao comparar a expressão dos marcadores com o tipo de lesão, encontrou-se uma expressão significativamente maior do CD8 (p=0,001) e do NF-NB (p=0,002) nas DEO, assim como uma menor expressão GR7*)ȕHSLWHOLDO nas DEO severas (p=0,011), não tendo expressão significativa entre os graus dos CEO. Ao relacionar a expressão dos marcadores estudados com a intensidade do infiltrado inflamatório, observou-se uma relaomRSRVLWLYDFRPR71)Į inflamatório (p=0,003), o 71)ĮHRNF-NB epiteliais (p=0,051 e p=0,004), nas DEO; com o CD8 (p=0,021) e o 71)Į (p=0,015) no conjuntivo dos CEO; e uma relação negativa FRP R 71)Į (p=0,034) epitelial dos CEO. Não foi encontrada relação significativa da FOXP3 com nenhuma das variáveis estudadas. Esses achados levaram a concluir que, o estudo do front invasivo é tão importante quanto o estudo das massas superficiais para avaliação da agressividade tumoral; a intensidade do infiltrado inflamatório não pode ser utilizado como parâmetro para avaliação prognóstica do CEO no exame de rotina; mas os eventos moleculares detectados neste estudo podem ser necessários para embasar a determinação do potencial de malignidade nas DEO e da agressividade nos CEO.
ABSTRACT
The Oral Epithelial Dysplasia (OED) is the lesion that precedes or co-exists with the Oral Squamous Cell Carcinoma (OSCC), presenting molecular and/or histological similar alterations. The divergences about the malignization potential of OEDs and the role of inflammation in this process make hard the early diagnosis and evaluation of OSCCs aggressiveness. Thus, it became the goal of this study to evaluate the role of inflammation in oral carcinogenesis and tumoral aggressiveness. For this purpose a morphological study was performed in 20 OED cases and 40 OSCC cases to detect the malignization potential of OEDs and the histologic malignancy grading (HMG) of OSCCs, analyzing superficial masses for dismorphism evaluation and the invasive front for evaluation of tumoral growing; and immunohistochemical, using CD8, anti-FOXP3, anti-TGFȕ, anti-TNFĮ and anti-NF-NB antibodies, comparing their with the types lesion, histological degree and intensity of the inflammatory infiltrate. The results were statistically significant for the parameters: cell maturity (p=0,0001), masses presence (p=0,038) and dismorphism (p=0,037), when associated to HMG. To compare the expression of the markers with the types lesion, a significantly higher expression of CD8 (p=0,001) and NF-NB (p=0,002) in the OED, and also a smaller expression of the epithelial TGFȕ in the severe OEDs (p=0,011), without significant expression between OSCC degrees. By relating the expression of the studied markers with the inflammatory infiltrate intensity, a positive relation was observed with: inflammatory TNFĮ(p=0,003), epithelial TNFĮ and NF-NB (p=0,051 and p=0,004), in OEDs; and with CD8 (p=0,021) and TNFĮ (p=0,015) in conjunctive OSCCs; and a negative relation with epithelial TNFĮ (p=0,034) in OSCCs. No significant relation was found between FOXP3 with any of the studied variables. These findings lead to the conclusion that, the study of the invasive front is as important as the study of superficial masses for the evaluation of tumoral aggressiveness; the intensity of the inflammatory infiltrate has no use as a parameter for prognostic evaluation of OSCC in routine exams, but, the molecular events detected in this study may be necessary to give basis for determining the malignant potential in OEDs and aggressiveness in OSCCs.
SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS LISTA DE ILUSTRAÇÕES
RESUMO ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO 19
2 REVISÃO DE LITERATURA 21
2.1 Carcinoma Epidermóide (considerações gerais) 22
2.2 Parâmetros para Gradação Histológica de Malignidade 27
2.3 Papel da Inflamação na Carcinogênese 29
2.4 Evasão da Resposta Imunológica no CEO 35
3DSHOGR7*)ȕH71)Į1)-ദ%QR'HVHQYROYLPHQWRGR&(2 37
3 PROPOSIÇÃO 44
4 MATERIAL E MÉTODOS 46
4-1 Caracterização do Estudo 47
4.2 População e Amostra 47
4.3 Implicações Éticas 47
4.4 Estudo Morfológico 48
4.5 Estudo Imuno-Histoquímico 51
4.6 Análise dos Resultados 53
5 RESULTADOS 55
5.1 Resultados Morfológicos 56
5.2 Resultados Imuno-Histoquímicos 60
5.3 Resultados Estatísticos 65
6 DISCUSSÃO 78
7 CONCLUSÃO 94
1- INTRODUÇÃO
Os Carcinomas são as neoplasias malignas de maior incidência no ser humano sendo que, o Carcinoma Epidermóide (CE) corresponde a cerca de 95% das neoplasias malignas orais (ALBERTS, 2004; CHOI et al., 2006). A Displasia Epitelial, é o evento histológico que antecede ou co-existente em muitos CE, o que assegura seu potencial pré-maligno, estando ambos associados à fatores de risco como a radiação ultra-violeta (uv), o fumo, o álcool, e infecção por alguns tipos virais, entre eles o HPV, e quando associados à predisposição genética de cada indivíduo, podem aumentar o potencial cancerígeno ou, quem sabe, dar início a um processo que está freqüentemente associado à reação inflamatória.
Estudos têm demonstrado que a ação intermitente ou descontrolada de citocinas que participam do processo inflamatório são capazes não só de transformar como de induzir à progressão, invasão e metástase das células neoplásicas(AGGARWAL, 2006) e de alguns tipos celulares que participam do controle da inflamação e defesa anti-tumoral (ABBAS e LICHTMAN, 2005).
Embora para alguns pesquisadores o infiltrado inflamatório funcione como defesa do hospedeiro no Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) (BRYNE et al.,1989), outros acreditam que ele possa atuar na transformação e progressão tumoral (BALKWILL e MANTOVANI, 2001). Porém, novos estudos são necessários para que se possa esclarecer seu verdadeiro papel no câncer.
2- REVISÃO DE LITERATURA
2.1 CONSIDERAÇÕES GERAIS:
Displasia epitelial e carcinoma epidermóide oral
O Carcinoma Epidermóide Oral (CEO) é caracterizado por alterações morfológicas e funcionais das células, associadas à diferenciação e crescimento, que definem o processo de progressão tumoral. Várias lesões, histologicamente distintas, precedem o aparecimento do CEO, as quais apresentam eventos similares àqueles observados na progressão, justificando seu potencial de malignidade (MITHANI, 2007).
A Organização Mundial de Saúde (OMS), em 1978, classificou como lesão pré-cancerosa aquela que apresente alterações morfológicas nas quais o desenvolvimento do CEO seja mais provável que o tecido normal (Leucoplasia, Eritroplasia e Lesão do Palato por Fumo Invertido) e, como condição pré-cancerosa, uma situação associada a um aumento significativo do risco de câncer (Fibrose Submucosa, Ceratose Actínica, Líquen Plano e Lupus Eritematoso Discóide). Esse mesmo grupo definiu a ³OHXFRSODVLD´ FRPR XPD SODFD EUDQFD Tue não pode ser classificada clinicamente ou patologicamente como qualquer outra doença, permanecendo por quase 25 anos, quando em 2005, a OMS redefiniu-a como uma placa branca de risco questionável, depois de excluído o diagnóstico de doenças conhecidas ou desordens sem risco aumentado de transformação maligna. Portanto, não devendo ser usado como descritor clínico de uma lesão branca (WARNAKULASURIYA, JOHNSON e VAN DER WAAL, 2007). Para Mithani (2007), a leucoplasia é uma lesão pré-maligna que pode apresentar similaridade molecular e/ou histológica com o CEO, quando apresenta displasia epitelial.
As dificuldades quanto ao diagnóstico e gradação das displasias epiteliais são grandes entre os patologistas. Por isso, a OMS em 2005, resolveu propor um método binário, diminuindo de três para duas, as possibilidades diagnósticas e conseqüentemente as chances de desacordo entre os profissionais. Foi sugerido estudo longitudinal para testar a significância do baixo e alto risco de displasia. O termo desordens potencialmente malignas foi sugerido, sendo a biópsia, prática necessária para confirmar a presença de displasia, embora outros autores como Kuffer e Lombardi (2002), tenham sugerido o termo, neoplasia intra-epitelial escamosa (SIN), ou mesmo como neoplasia intra-epitelial oral (OIN). Na boca, o epitélio das lesões precursoras é geralmente atrófico, sem evidência de invasão, e a quantidade de queratina é irrelevante, porém, para o diagnóstico de displasia, deve-se considerar em primeiro lugar, as alterações arquiteturais e em seguida, as citológicas (WARNAKULASURIYA et al., 2008).
A Displasia Epitelial Oral (DEO) é o evento que assegura, histologicamente, o potencial pré-maligno, já que apenas 15% das lesões sem displasia evoluem para CEO (SILVERMAN, GORSKY e LOZADA, 1984). Sendo assim, através da biologia molecular, várias proteínas relacionadas à progressão tumoral têm se mostrado significativamente alteradas em estudos comparativos entre lesões pré-malignas com Displasias Epiteliais Orais e o CEO, mas não entre os graus histológicos de malignidade (ABBAS et al., 2007).
Apesar da grande maioria das leucoplasias estarem associadas ao fumo, apenas 2,1% das lesões, em pacientes fumantes, tornaram-se malignas em comparação com 11,1% dos pacientes não-fumantes. As porções lateral e ventral da língua são as mais afetadas, geralmente de forma homogênea, envolvendo mulheres idosas e não-fumantes (NAPIER e SPEIGHT, 2008).
Além disso, a interação entre as células tumorais e o estroma peritumoral pode ser um passo importante na progressão, visto que o compartimento estromal de um tumor abriga uma grande variedade de células entre elas: fibroblastos, células endoteliais e inflamatórias que passam a trabalhar a favor da progressão, ao produzirem fatores que estimulam angiogênese, crescimento e metástase (BISWAS et al., 1995; HANAHAN e WEINBERG, 2000 ).
Esse papel coube, em grande parte, ao indutor extracelular de metaloproteinases da matriz, EMMPRIN, designado CD147 no Sexto Seminário Internacional e Conferência sobre antígenos de diferenciação de leucócitos humanos (KOCH et al., 1999). Para Yan, Zucker e Toole (2005) experimentos comprovam que o EMMPRIN induz várias propriedades associadas à malignidade incluindo, invasividade, angiogênese e ancoragem independente de crescimento. Processo esse que pode ter início na remodelação da Membrana Basal ou Matriz extracelular ao redor das lesões pré-malignas.
O Câncer Oral é o 8º câncer mais comum do mundo e o 4º do Brasil (INCA,
2008). Entre 90-95% de todas as neoplasias malignas da boca são carcinomas
epidermóides, sendo também denominados, carcinomas espinocelulares ou carcinomas de células escamosas. Isso talvez se deva ao fato da maior parte da proliferação celular de um organismo humano ocorrer nos epitélios, e/ou então porque os tecidos epiteliais são expostos com maior freqüência às mais variadas formas de agressões físicas e químicas, o que susceptibilizar o desenvolvimento do câncer, caracterizado por proliferação desordenada das células escamosas do epitélio, expressando variáveis graus de similaridade com suas células de origem (MOORE et al., 2000; DANTAS et al., 2003; ALBERTS et al., 2004; CHOI et al., 2006).prognósticos, podendo ser responsável por uma queda de 50% da chance de sobrevivência.
Já está bem estabelecido que, o câncer oral tem etiologia multifatorial, na qual estão envolvidos tanto fatores extrínsecos quanto intrínsecos, sendo provavelmente necessária a ação de mais de um desses carcinógenos para produção da malignidade. Esta requer desestabilização de vários sistemas de controle que coordenam o comportamento celular (PANDE et al., 2002; RAMALHO et al., 2002; NAGPAL, DAS, 2003; SCHLIEPHAKE, 2003).
De acordo com Boshoff e Weiss (2001) ocorre, na maioria dos casos, um acúmulo seqüencial de mutações somáticas por muitos anos, antes da expansão clonal de células transformadas e, as lesões que se tornam clinicamente evidentes são aparentemente resistentes aos mecanismos de defesa da imunidade celular (KERREBIN et al., 1999).
O tabagismo e o etilismo crônicos são os principais fatores de risco para o câncer de boca (MOORE et al., 2000; REGEZI, SCIUBBA, 2000; CANTO, DEVESA, 2002; BETTENDORF, PIFFKÒ, BANKFALVI, 2004; TROMP et al., 2005; GHOSHAL et al., 2006), pois, apenas 15 a 20% dos pacientes portadores de lesões malignas orais não têm história pregressa destes hábitos (VENTURI, CABRAL, LOURENÇO, 2004).
Conforme citam Venturi, Pamplona e Cardoso (2004), o risco de desenvolvimento de CEO na população geral aumenta em cerca de sete vezes com o tabagismo, e em até quinze vezes quando este hábito está associado ao consumo crônico de álcool. Todavia, Schmidt et al (2004) verificaram que 1/3 dos pacientes de sua amostra acometida por CEO, nunca fumaram.
Liang et al. (2008), estudando o carcinoma de língua, encontrou a presença de HPV em apenas um caso dos 51 avaliados, contrastando com estudo anterior onde havia encontrado a presença viral em 51,5% dos casos, concluindo portanto, ser a localização, o fator divergente, responsável pelo resultado encontrado, visto que no primeiro estudo, a amostra era da base da língua e no mais recente, da região anterior da língua.
Outros fatores como a exposição crônica à radiação solar (NEVILLE et al., 2004) e deficiência nutricional 2¶5(*$1HWDO; INCA, 2008), podem favorecer o desenvolvimento do CEO, em pessoas de pele clara e dietas inadequadas que funcionam como fonte de radicais livres, respectivamente.
A localização anatômica dos CEO depende fundamentalmente dos fatores de risco. Em fumantes de cachimbo é mais comum o carcinoma de palato, em mascadores de fumo, o da mucosa jugal, e em alcóolatras e fumantes de cigarro, os da língua, assoalho da boca e gengiva inferior (KOWALSKI, 1991). Ghoshal et al. (2006), encontraram uma maior incidência de CE na mucosa jugal de indianos com hábito de mascar fumo e Magrini et al. (2000); Kerdpon, Sriplung (2001) e Costa et al. (2002) relataram uma maior incidência em língua e lábio inferior, embora o CEO de lábio inferior esteja relacionado àqueles pacientes de pele clara que se expõem freqüentemente à radiação solar, ou utilizam o lábio como apoio para o cigarro, charuto ou cachimbo, cabendo a este a fração de 25 a 30% dos casos de câncer bucal (REGEZI, SCIUBBA, 2000; NEVILLE et al., 2004).
Os homens, principalmente aqueles que se encontram entre a quinta e a oitava década de vida, têm uma probabilidade duas vezes maior de desenvolver CEO, embora essa diferença tenha diminuído nos últimos anos, aumentando entre as mulheres (REGEZI, SCIUBBA, 2000) e pessoas mais jovens, com menos de 40 anos (O`REAGAN et al., 2006).
Schantz e Yu (2002) relataram que o CEO tem uma incidência de 0.4 a 3.9% em pacientes jovens, havendo nestes casos uma maior agressividade da neoplasia e um pior prognóstico; Sasaki et al. (2005) afirmaram que o prognóstico em pacientes mais jovens não difere daqueles que acometem pacientes mais velhos.
Estados de imunodeficiência, especialmente os relacionados à deficiência de imunidade do tipo celular, como a AIDS, aumentam a suscetibilidade às infecções em geral, sendo alta a prevalência de lesões provocadas por HPV nestes grupos, tanto por reativação de uma infecção latente como por aquisição de uma nova infecção (VILLA, 2¶5(*AN et al., 2006).
Doenças inflamatórias crônicas, como as doenças auto-imunes, de etiologia desconhecida, caracterizadas por infiltrado linfocitário sub-epitelial e destruição da membrana basal e/ou ceratinócitos, onde os linfócitos T citolíticos (LTC), possivelmente induzidos por Th1, levam os ceratinócitos à apoptose (SUGERMAN et al., 2002), vêm sendo consideradas fatores de risco para transformação maligna ou mesmo, lesões pré-malignas (PINDBORG et al., 1997; MIGNONA et al., 2004; ACAY et al., 2006).
2.2 PARÂMETROS PARA GRADAÇÃO HISTOLÓGICA DE MALIGNIDADE
Vários parâmetros como: ceratinização de células individuais, formação de pérolas córneas, presença de pontes intercelulares, número e aspecto das figuras de mitose, grau de pleomorfismo celular e nuclear, e presença de células gigantes multinucleadas (WAHI, 1971); estrutura neoplásica, ceratinização, pleomorfismo nuclear, número de mitoses, modo e estágio de invasão, invasão vascular e infiltrado inflamatório linfoplasmocitário (JACKOBSSON et al., 1973); grau de ceratinização, pleomorfismo nuclear, número de mitoses, padrão de invasão, infiltrado inflamatório e invasão vascular (CRISSMAN et al., 1984) e grau de ceratinização, pleomorfismo celular, número de mitoses, padrão de invasão, estágio de invasão e infiltrado inflamatório linfoplasmocitário (ANNEROTH, BATSAKIS e LUNA, 1987) foram utilizados e, em 1999, Martins Neto em uma revisão sobre SGHM do CEO considerou o grau de ceratinização, a atividade mitótica e as atipias celulares e nucleares, os parâmetros de maior relevância, por serem comuns à maioria dos sistemas propostos.
No sistema proposto por Bryne (1989) a autora sugeriu que as células presentes na área do front de invasão tumoral exibem diferentes características moleculares quando comparadas com as áreas superficiais do tumor, e que interações entre o tumor e RKRVSHGHLURQHVVDUHJLmRVmR³FUXFLDLVSDUDGLVVHPLQDomRGDQHRSODVLD´VHQGRHVWD uma importante região para determinação do prognóstico.
Kurokawa et al. (2005) avaliaram 124 pacientes com CE de língua onde 66,7% tiveram sobrevida acima de 5 anos e concluíram que os casos com escore < 8 e aqueles com escore > ou igual a 11, avaliados pela Gradação do Front Invasivo, tinham melhor e pior prognóstico, respectivamente.
Segundo Costa, Araújo-Júnior e Ramos (2005), a gradação histológica das partes mais profundas do tumor influencia diretamente na sobrevida do paciente, pelo fato das células neoplásicas nesse local mostrarem-se indiferenciadas. Estes autores acharam um infiltrado inflamatório predominantemente discreto, nos casos de CEO agressivos, quando correlacionados com o desenvolvimento de metástase nos linfonodos cervicais (TNM II/IV).
Silveira (2007) verificou que as células inflamatórias CD8 e CD25 positivas tinham maior participação nas lesões menos agressivas (lábio inferior), assim como o anti-]foi mais marcante nos casos sem metástase, independente da localização anatômica. A autora afirmou ainda que o infiltrado inflamatório exerceu certa influência na agressividade dos CE de língua e lábio inferior estudados e de certa forma pode estar contribuindo para as controvérsias no tocante a utilização deste como critério morfológico indicador de agressividade, visto que, a grande maioria (80%) da amostra, apresentou infiltrado inflamatório variando de moderado a intenso.
2.3 PAPEL DA INFLAMAÇÃO NA CARCINOGÊNESE
deficiência de inibidores pode resultar em um crescimento descontrolado, ou seja, o câncer (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).
Uma variedade de agentes lesivos, ao mesmo tempo em que provoca danos celulares dispara uma série de eventos que servem para conter a lesão. As respostas vasculares e celulares são desencadeadas por estímulos inflamatórios, e a inflamação só termina quando o estímulo lesivo é removido e os mediadores dissipados ou inibidos (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).
Na grande maioria das vezes, a remoção do estímulo inflamatório fica sob responsabilidade do sistema imunológico, que tem como função defender contra microorganismos infecciosos, embora, atue também contra substâncias estranhas não infecciosas. A imunidade natural ou inata fornece a primeira linha de defesa contra os microorganismos, mas não reconhece diferenças discretas entre substâncias estranhas. Uma outra forma de imunidade mais específica e com memória é desenvolvida em resposta a infecções, conhecida como imunidade adaptativa ou adquirida (ABBAS e LICHTMAN, 2005).
Muitas pesquisas vêm sendo desenvolvidas com o objetivo de ativar o sistema imunológico de forma específica (JANEWAY et al., 2007), já que ele não é efetivo frente a muitos tipos de tumores (KACANI et al., 2003; ABBAS e LICHTMAN, 2005). Para isso, é necessário a identificação dos antígenos associados às células tumorais, pois, tumores sediados na cavidade oral são freqüentemente circundados por infiltrado inflamatório com células imunes (HOFFMANN, BIER e WHITESIDE, 2004).
Os mecanismos efetores da resposta imunológica têm início com a ligação de um agente sinalizador a um receptor específico, na superfície celular que envia sinais ao núcleo através de vias de transdução de sinais, onde fatores reguladores conhecidos como fatores de transcrição promovem alterações específicas na regulação da expressão gênica (COTRAN, KUMAR, COLLINS, 2000).
sinais do TCR induzem à fosforilação pelas INB cinases (IKK), que é seguida pela inserção de múltiplas cópias de uma pequena proteína chamada ubiquitina, liberando assim o NF-NB que entra no núcleo, onde contribui para a ativação transcricional de vários genes de citocinas e receptores de citocinas. O NF-NB está envolvido na ativação da célula T, contribuindo para a transcrição da interleucina 2 (IL-2) e na resposta de muitos tipos celulares às citocinas pró-inflamatórias tais como o fator de necrose tumoral (TNF), interleucina 1 (IL-1) e lipoproteínas bacterianas (LPS) (HAYDEN e GHOSH, 2004; ABBAS e LICHTMAN, 2005).
A manutenção do NF-NB ativado durante a inflamação, predispõe à transformação maligna, podendo ser utilizado para inibir a transformação tumoral, mas para isso, é preciso interferir no seu papel fisiológico, tanto na imunidade e/ou inflamação, como na homeostase (PACIFICO e LEONARDI, 2006).
Os tumores humanos podem ativar linfócitos CD4 ou CD8, dependendo da via do processamento para desencadear a resposta imunológica, e o controle do tumor depende tanto da magnitude da resposta imunológica inicial, como da capacidade de sustentar essa resposta por um período prolongado (SABEL et al., 2005).
O principal mecanismo de defesa anti-tumoral é a morte das células neoplásicas pelos linfócitos T CD8, também conhecidos como linfócitos T citotóxicos (LTC), as quais podem reconhecer e matar células potencialmente malignas que expressem peptídeos derivados de proteínas celulares mutantes ou proteínas virais oncogênicas associadas ao MHC classe I (ABBAS e LICHTMAN, 2005).
Segundo Janeway et al. (2007), a resposta imune do tipo celular, se dá através do receptor de célula T (TCR) associado a moléculas transmembranas designadas CD3 e ] (zeta), as quais traduzem a ligação extracelular com o antígeno em sinais ativadores para o interior da célula, e a completa ativação requer um segundo sinal co-estimulatório fornecido pela ligação do CD28, presente nos linfócitos, ao B7-1 ou B7-2 nas APC.
Quando os linfócitos se tornam células ativadas, passam a expressar receptores para IL-2, podendo ser identificados pelo método da imuno-histoquímica, utilizando-se o anticorpo anti-CD25 (WEISS, 1993). Porém, Sato et al (2005) lembram que o CD25 também se encontra expresso na superfície das células T regulatórias, as quais exibem propriedades imunossupressoras. Segundo Hoffmann, Bier e Whiteside (2004) a IL-2 é capaz de inibir o crescimento de CE de cabeça e pescoço.
A célula Treg, é um subtipo de linfócito T que tem o papel de induzir e manter a tolerância imunológica, bem como a finalização da resposta imune. A deficiência ou diminuição dessa célula pode conduzir a uma doença auto-imune (HORI, NAMURA e SAKAGUSHI, 2003; MAGGI et al., 2005).
Bluestone e Abbas (2003) propuseram dois grupos de células Treg profissionais: a célula Treg Natural, que se desenvolve no timo, tem elevada expressão constitutiva de CD25 (CD4+CD25+) e destrói outras células T por contato, independente de citocinas, tendo papel importante na tolerância contra antígenos próprios; A Treg Adaptável (Th3) torna-se madura nos tecidos periféricos, sob estimulação antigênica e/ou co-estimulação, exercendo função supressiva através de secreção de IL-10 e TGF-E.
Boer et al. (2007) relataram que Foxp3 pode ser um fator de transcrição que induz GITR, talvez por isso encontraram um grupo de células Foxp3 (+) e GITR (-), não considerando este último, um bom marcador.
Wan e Flavell (2007) demonstraram que a diminuição da expressão de Foxp3 causa doença auto-imune dose dependente através da transformação das células Treg em células efetoras, as quais instruiriam uma diferenciação Th2 nas células T convencionais.
Vários estudos têm ressaltado o envolvimento da célula Treg no desenvolvimento e progressão do câncer (PETERSEN et al., 2006; FU et al., 2007; KOBAYASHI et al., 2007), e como a expressão de CD4+CD25+ não quer dizer que essas células sejam Treg, pelo fato de outras células T, recentemente ativadas, poderem expressar CD25, a proteína Foxp3 pode ajudar a entender o papel de Treg na carcinogênese (BOER et al., 2007).
A propriedade imuno-supressiva das células T CD4 foram associadas à baixa sobrevivência de pacientes com câncer de ovário (CURIEL, 2004), embora Sato et al. (2005) não acreditassem que apenas o infiltrado de células T CD4 fosse responsável pela baixa sobrevivência e sim, que a influência da modulação de CD4 sobre os benefícios de CD8 dependesse do número de células Treg na população CD4.
Para Balkwill e Mantovani (2001), ficou mais fácil sugerir a participação das citocinas e células inflamatórias no desenvolvimento e progressão tumoral do que uma resposta anti-tumoral do hospedeiro (NAKANO et al., 2001), como proposto em vários outros estudos onde serviu de parâmetro para gradação histológica de malignidade (JACKOBSSON et al., 1973; ANNEROTH, BATSAKIS e LUNA, 1986; BRYNE et al., 1989).
Aumento na concentração de linfócitos CD4 e CD8 foram relacionados tanto com a transformação como com a progressão do câncer oral e este, exercia influência tanto na reação imune local quanto na sistêmica (GANNOT et al., 2002 e GANNOT, BOCHNER e KEISARI, 2004).
A quantidade de linfócitos T CD8 esteve relacionada com o grau de diferenciação no câncer de pulmão, sendo maior quando as células encontravam-se indiferenciadas (MORI et al., 2000), e segundo Sheu et al. (1999), os CD4 estiveram diminuídos em relação ao CD8 em tumores cervicais de crescimento rápido e produção de metástase.
Na revisão de Chang et al. (2005), os autores citaram um estudo onde a relação CD4/CD8 era menor nas displasias moderadas e severas do que nas displasias leves, sendo a maioria dos CD8 considerados supressores, sugerindo um desequilíbrio imunológico local, e um outro que considerou essa relação menor que 1 preditiva de metástase em linfonodo. Sendo assim, esses autores sugeriram a possibilidade dessa deficiência de linfócitos CD8 no CEO, ser devido a fatores inibitórios liberados pelas células tumorais.
Daniel et al. (2003) encontraram concentrações elevadas de linfócitos CD4 na transformação de lesões pré-cancerosas para o câncer de pele, sugerindo a possibilidade destas estarem relacionadas com a progressão tumoral.
2.4 EVASÃO DA RESPOSTA IMUNOLÓGICA NO CEO
O escape à ação do sistema imunológico resulta em progressão rápida do câncer, sendo necessário o uso da imunoterapia para potencializar a resposta anti-tumoral do hospedeiro e evitar a disseminação (SHEU et al., 1999).
Os cânceres surgem a partir da proliferação e disseminação descontrolada de clones de células transformadas, os quais deveriam ser reconhecidos pelo sistema imune, antes de se transformar em tumor. Embora já tenha sido comprovado que o sistema imune reage contra muitos tumores, ou pelo menos atrasa a progressão, não se sabe ainda, o aproveitamento dessas reações imunológicas para destruir tumores de forma específica. Além disso, tem-se que contar com a capacidade das células tumorais de evadir ou superar os mecanismos de defesa do hospedeiro (COUSSENS e WERB, 2001; ABBAS e LICHTMAN, 2005). A remodelação da matriz extracelular (MEC) e membrana basal (MB) confinada ao microambiente pericelular das lesões Pré-Malignas, podem ser o primeiro passo para a invasão (YAN, ZUCKER e TOOLE, 2005).
O fenômeno da angiogênese, caracterizado pelo desenvolvimento de novos vasos sangüíneos a partir da divisão ou migração da vasculatura existente, é observado em uma série de eventos fisiológicos e patológicos sediados na cavidade oral, incluindo a inflamação, reparo tecidual e metástase tumoral (RAVI et al., 1998; SEDIVY et al., 2003).
0HPEURV GD IDPtOLD 7*)ȕ FRPR D %03-2 é capaz de estimular células mesenquimais indeferenciadas a liberar o P1GF (Fator de Crescimento Placentário), que é importante no recrutamento de células hematopoiéticas e endoteliais indiferenciadas em condições patológicas, como isquemia, inflamação, cicatrização e câncer (RAIDA et al., 2005).
co-estimuladores ou MHC de classe II para induzirem a diferenciação dos LTC; pela imunossupressão provocada por citocinas tumorais (TGF-E), que inibe a proliferação e funções efetoras de linfócitos e macrófagos, ou através do ligante de Fas (FasL) que reconhece o receptor de morte celular nos leucócitos que tentam atacar o tumor, levando à apoptose; pela capacidade de alguns antígenos tumorais induzirem a tolerância imunológica pois, os antígenos tumorais são antígenos próprios encontrados pelo sistema imune em desenvolvimento ou em forma tolerogênica por linfócitos maduros, permitindo livremente o seu crescimento.
La Gruta et al. (2004) acrescentaram que alteração ou ausência na expressão de proteínas formadoras do complexo TCR estão relacionadas ao escape da neoplasia às defesas do hospedeiro, como sugerem Gruiji et al. (1999) no caso dos componentes das proteínas CD3 e ] (zeta) responsáveis por deficiências no sistema imune de pacientes portadores de vários tipos de câncer.
Segundo Kiessling et al. (1996) e Reichert et al. (2002), isso pode estar relacionado à liberação de citocinas imunossupressoras pelas células neoplásicas que induziriam a degradação de constituintes do TCR, já que o referido domínio pode ser clivado pela atividade proteolítica das caspases induzida por Fas (GASTMAN et al., 1999). Reichert et al. (2002) encontraram ainda, que o aumento na proporção das células apoptóticas estava relacionada com a redução na expressão do domínio ]. Como sugeriram La Gruta et al. (2004), a redução ou ausência da expressão de proteínas formadoras do complexo TCR, como a proteína ] está diretamente relacionada à irresponsividade dos LT frente a estimulação antigênica.
O Fas é um receptor da família do TNF, membro dos receptores com domínio de morte que pode estar envolvido na apoptose de linfócitos em tumores humanos (ALDERSON et al., 1995).
repouso, que podem apresentar antígeno próprio, mas expressam pouco B7, ligam-se ao CTLA-4 e induzem tolerância nas células T auto-reativas (ABBAS e LICHTMAN, 2005).
A MMP-9 também está envolvida no mecanismo de escape (evasão) à vigilância imunológica ao clivar o receptor de IL-2, suprimindo a proliferação de células T (COUSSENS e WERB, 2001) ou, quando ativa TGF-E, um importante inibidor da resposta por célula T contra tumor (YU e STAMENKOVIC, 2000; GORELIK e FLAVELL, 2001).
Os mecanismos utilizados para escape às reações de defesa nas neoplasias humanas são variados, o que pode ser complicado pela supressão da imunidade local e sistêmica exercida por elas. Isso pode explicar a discrepância entre falhas e sucessos nas imunoterapias (WHITESIDE, 2005) .
2.5 PAPEL DO TGFEE TNFD1F-N% NO DESENVOLVIMENTO DO CEO
O TGF-Eé uma proteína cuja principal função no sistema imune é inibir a proliferação e ativação de linfócitos e outros leucócitos, comumente designados EEeEcodificados por genes diferentes, entre os quais, o E1 é o mais freqüentemente superregulado nas células tumorais,podendo ser expresso por linfócitos reguladores e/ou células neoplásicas para inibir a resposta de LTC, promovendo a progressão e invasão tumoral (DERYNCK e FENG, 1997; GASTMAN et al., 1999; GORELIK e FLAVELL, 2001; ABBAS e LICHTMAN, 2005).
No tecido epitelial normal, TGF-E regula o crescimento e a diferenciação celular, porém, freqüentemente, funciona como supressor tumoral no início da carcinogênese, depois, passa a funcionar como um promotor na progressão e metástase (MASSAGUÉ, BLAIN e LO, 2000; MOUSTAKAS et al., 2002).
escapem aos efeitos inibitórios de TGF-EDERYNCK, AKHURST e BALMAIN, 2001).
Gorelik e Flavell (2001) desenvolveram ratos transgênicos sem receptor de TGF-E tipo II (dnTGF-RII) nas células T CD4 e CD8 e testaram seu efeito anti-tumoral em modelos de timoma e melanoma, os quais estão associados com a produção de TGF-E, resultando em ratos resistentes ao crescimento tumoral, por uma potente resposta tumor-específica por parte dos LTC. Porém, isso funciona quando o bloqueio de TGF-E ocorre antes das células tumorais inibirem as células T, sugerindo a inibição da diferenciação de LTC e/ou expansão clonal, ou ainda destruição dos LTC pelo grande número de células tumorais. Contudo, ficou claro que o bloqueio de TGF-E favorece a resposta imune anti-tumoral.
Glinka, Chang e Prud`homme (2006) observaram o papel inibitório de TGF-E, ao utilizar uma proteína B7-1 mutante (B7-1wa) que se liga seletivamente ao CTLA-4, associando-a à pré-proinsulina (PPins) e ao ácido glutâmico (GAD65) como vacina, ambos utilizados contra diabetes auto-imune, com resultados favoráveis restritos, induzindo assim o aumento de células T regulatórias (Treg) que expressavamCTLAFoxpe7GF-E, tendo um efeito protetor contra a doença. A deleção de TGF-E abolia o efeito supressor exercido pela célula Treg.
Glick et al. (1994) demonstraram que a diminuição autócrina de TGF-E em ceratinócitos levou lesões papilomatosas a se transformarem em carcinomas, assim como no câncer cervical, porém, as células cancerígenas desenvolvem uma resistência parcial ou total a essa inibição nas células transformadas (DONALISIO et al., 2008).
fisiológico de remodelação que são aproveitadas e adaptadas pelas células tumorais para promover crescimento e invasão tumoral.
Logullo et al. (2003) estudaram a expressão do TGF-E1 em 140 casos de Carcinoma Epidermóide de cabeça e Pescoço, observando positividade em apenas 52 (37,1%) casos sendo que, 16 (11,4%) destes apresentaram reatividade em >60% das células e 9/16 ocorreram na cavidade oral. Nas adjacências, aparentemente normais, foi observado positividade em todos os casos estudados, sendo que em apenas 16 destes, tal expressão estendeu-se até as camadas superficiais, estando os mesmos associados com positividade tumoral. Os receptores de TGF-E I e II foram avaliados em 20 casos da cavidade oral (17 positivos para TGF-E e 3 negativos). Forte e difusa positividade foi observada para RII nos 17 casos positivo e 2/3 foram negativos enquanto, apenas 9/17 casos positivos para RI, sugerindo uma interrupção na trajetória do TGF-E.
Iamaroon, Pattamapun e Piboonniyom (2006) também sugeriram alteração no caminho do TGF-E indicada pela redução ou ausência na expressão da molécula sinalizadora de TGF-E (Smad4), observando expressão desta em apenas 60% dos 15 casos de CEO comparados aos 82% dos 11 tecidos normais utilizados como controle.
Vagenas et al. (2007) ao estudarem 110 casos de carcinoma gástricos, encontraram 71% de positividade para o TGF-E, a qual não foi observada no tecido normal, sendo considerada como um fator prognóstico independente.
$R HVWXGDU D DWLYLGDGH LQLELWyULD GR 7*)ȕ H ,/-4 em linhagens de células de câncer cervical CasKi e SiHa, HPV-16 positivas, Donalisio et al. (2008) concluíram que estas células são resistenWHV D DPEDV DV FLWRFLQDV HPERUD R 7*)ȕ WHQKD VLGR PDLV eficiente que a IL-4 no controle da infecção por HPV-16, funcionando como supressor tumoral.
$V %03 VmR FLWRFLQDV GD VXSHUIDPtOLD 7*)ȕ TXH H[HUFHP P~OWLSODV funções que influenciam na diferenciação de muitos tipos celulares, sendo seu efeito limitado ao tempo de exposição e à concentração no desenvolvimento embrionário e na vida adulta, em eventos da tomorigênese como apoptose, esteve relacionado ao tempo de exposição, já no processo de migração não foi encontrada essa relação, em linhagens de células do câncer de mama (MCF-7) (STEINERT et al., 2008).
Via de sinalização das BMPs tem mostrado inibir a tumorigênese de vários tipos tumorais, incluindo cérebro, estômago e carcinoma de células basais da pele, mas Katsuno et al. (2008) esWXGDQGRDDomRGR7*)ȕH%03-2 em uma linhagem celular (MDA-231-D) de câncer de mama, observaram que o crescimento dessas células não foram afetados, porém verificou uma indução da motilidade e invasividade dessas células através da degradação do colágeno tipo I.
O TNFDé considerado um dos maiores mediadores da inflamação, que induz outros mediadores e proteases na orquestra da resposta inflamatória (BALKWILL, 2002), estando envolvido em diversos passos da tumorigênese, incluindo transformação, promoção, sobrevivência, proliferação, angiogênese e metástase (AGGARWAL et al., 2006).
Para Aggarwal (2003), o TNFDquando expresso localmente por células do sistema imune, tem um papel terapêutico, todavia quando desregulado e secretado na circulação, pode mediar uma variedade de doenças, inclusive o câncer. Inicialmente pensou-se que só os macrófagos produziam TNFD, mas segundo Digel et al. (1990) o TNFD é produzido por uma grande variedade de células tumorais.
NF-NB tem um importante papel anti-apoptótico, crítico para a sobrevivência das células cancerosas, sendo cotado como um importante alvo para a terapia do câncer. A ativação de NF-NB induzida por TNF, protege as células contra apoptose através da supressão da ativação de JNK e indução de fatores de sobrevivência tais como XIAP e survivin (WANG, CHEN e LIN, 2007; LUEDDE et al., 2007). Porém, a morte persistente das células do fígado, induzida por TNF, provavelmente se deve à atividade persistente de JNK mediada por TNFR2 (SCHWABE e BRENNER, 2006).
As citocinas pró-inflamatórias TNF e IL-1 dependem do complexo da kinase que degrada INB para ativação do fator de transcrição NF-NB. Esse complexo (IKK) é constituído por duas kinases, IKKD e IKKE e uma subunidade regulatória denominada NEMO, associadas com ambas IKKs, o qual regula a atividade dessas subunidades IKK por vias de sinalização distintas, onde a associação de NEMO com IKKD ou NEMO com IKKE podem formar complexos funcionais para ativação de NF-NB em resposta à IL-1, mas não ao TNF, que depende unicamente do complexo NEMO:IKKE para transcrição (SOLT et al., 2007).
Wang, Chen e Lin (2007) demonstraram que a supressão simultânea da ativação de IKKE e Akt, resulta no eficiente bloqueio do fator anti-apoptótico XIAP, obstruindo a via de sobrevivência mediada por NF-NB, a qual pode deixar as células cancerosas mais vulneráveis a citotoxidade induzida por TNF, melhorando dramaticamente a ação anti-câncer do TNF.
Segundo Greten et al. (2004), a deleção de IKKE não diminui a inflamação, mas reduz a incidência de câncer no intestino, assim como a supressão de TNFD ou indução de INB resulta na falha da progressão tumoral no fígado (PIKARSKY et al., 2004). Já Luedde et al. (2007) concluiram que NEMO é essencial para ativação do NF-NB que regula a resposta celular à inflamação, funcionando como um supressor tumoral no fígado de ratos, fornecendo um paradigma para o seu papel no câncer.
não encontraram o PHVPRUHVXOWDGRFRPDGHOHomRGDVXEXQLGDGH,..ȕ$OpPGRPDLV o estresse oxidativo pode induzir a apoptose e proliferação compensatória levando à diminuição da capacidade regenerativa e aumento de células ovais progenitoras (LUEDDE et al., 2007).
A sinaOL]DomR PHGLDGD SRU UHFHSWRU GH 71)Į 71)5 H )DV QHFHVViULD SDUD ativação do domínio de morte (FADD) em ceratinócitos e hepatócitos, é requerida para o desenvolvimento da inflamação e câncer de pele e fígado em ratos com inibição de NF-NB. Invasão massiva de polimorfonucleares está frenqüentemente presente (LIND et al., 2004; SCHWABE e BRENNER, 2006). Segundo Lind et al. (2004), a super-UHJXODomRGH71)ĮHPFHUDWLQyFLWRVLQGHSHQGHGDLQIODPDomRQHVVHVUDWRV
Os macrófagos próximos ao tumor são os maiores produtores de TNF, tendo papel na promoção, crescimento e invasão tumoral (MOORE et al, 1999; BALKWILL e MANTOVANI, 2001), embora seu fator inibitório tenha efeito anti-apoptótico, impedindo a transcrição de p53 (HUDSON et al., 1999).
Um dos membros da família TNF, conhecido como Fas (CD95), é expresso na superfície de muitos tipos celulares, inclusive do câncer, e inicia uma cascata de sinalização à morte apoptótica da célula no momento em que este se liga ao ligante Fas, expresso nas células T ativadas (ABBAS e LICHTMAN, 2005). Segundo Iwase et al. (2003), embora as células do câncer expressem Fas na sua superfície, são relativamente resistentes à apoptose mediada por Fas. Para Fujieda et al. (2000), não existe correlação entre a expressão de Fas ou FasL e qualquer fator clinicopatológico. A expressão de Fas não afetou a apoptose espontânea das células neoplásicas.
Muitas são as moléculas que sinalizam apoptose mediada por Fas, podendo este ser modulado por fatores anti-apoptóticos, como c-FLIP, o qual forma um complexo estável com Fas, FADD e Caspase 8 (ASHKENAZI e DIXIT, 1998; KRUEGER et al., 2001), sendo o mesmo mais elevado em células cancerosas que em células normais (RIPPO et al., 2004).
de Fas com o domínio de morte (FADD). Porém envolve clivagem das caspases-3, -7 e -8, visto que o inibidor específico da caspase-8 (IETH) leva à expressão de c-FLIP em células cancerosas com déficit de caspase-8 e segundo Scaffidi et al. (1999) ocorre o bloqueio da clivagem da caspase-8 quando esta associa-se a c-FLIP.
Kondo et al. (2006) estudaram o papel da associação da Kinase (PI3-K) com Akt no controle da sobrevivência da célula do CEO, utilizando o inibidor de PI3-K, o qual suprimiu a fosforilação de Akt e acelerou apoptose mediada por Fas no CEO. Embora o inibidor de PI3-K não tenha afetado a expressão de Fas nas célula do CEO, regulou negativamente c-FLIP, proteína inibidora de morte programada por Fas, favorecendo a suscetibilidade da apoptose mediada por Fas.
3- PROPOSIÇÃO
4- MATERIAL E MÉTODOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O presente trabalho consta de um estudo observacional, transversal da expressão imuno-histoquímica dos anticorpos estudados, nos casos de Displasias Epiteliais e Carcinomas Epidermóides Orais selecionados.
4.2 POPULAÇÃO E AMOSTRA 4.2.1 População
Casos de Displasias Epiteliais Orais (DEO) e Carcinomas Epidermóides Orais (CEO) pertencentes aos arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da Universidade Federal de Sergipe em Aracaju-SE e do Laboratório de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, em Natal-RN, diagnosticados no período de 1996-2007.
4.2.2 Amostra
4.2.2.1 Critério de inclusão
Foram incluídos no estudo 20 casos de DEO e 40 casos de CEO de biópsias excisionais, dos referidos serviços, cujos blocos de parafina continham material suficiente para elaboração do estudo.
4.2.2.2 Critério de Exclusão
Foram excluídos aqueles casos cujos blocos de parafina continham material insuficiente para a análise proposta, bem como os espécimes provenientes de pacientes que haviam se submetido a tratamento prévio com quimio ou radioterapia.
4.3 IMPLICAÇÕES ÉTICAS
4.4 ESTUDO MORFOLÓGICO
Do material emblocado em parafina, foram obtidos cortes histológicos de 5Pde espessura, corados pela técnica da Hematoxilina e Eosina, os quais foram observados em microscopia de luz, para confirmação diagnóstica e análise dos critérios para classificação das DEO e gradação histológica dos casos de CEO.
4.4.1 DISPLASIAS EPITELIAIS
As displasias foram classificadas em Leve (L), Moderada (M) e Severa (S), a depender do grau de envolvimento das camadas epiteliais, baseando-se nos critérios sugeridos pela OMS em 2005, conforme descritos no quadro 01 (WARNAKULASURIYA et al., 2008).
Quando as alterações celulares e arquiteturais se restringiam ao terço inferior do epitélio as displasias foram classificadas como Leves; quando se estendiam até o terço médio, como Moderadas; e nos casos em que tais alterações ultrapassavam o terço médio e/ou as atipias citológicas estavam presentes em maior quantidade, como Severas.
Quadro 01- Critérios para diagnóstico de displasia.
ARQUITETURA CITOLOGIA
Perda de Estratificação Anisocariose (tamanho)
Perda de polaridade da camada basal Pleomorfismo nuclear (forma) Hiperplasia da camada basal Anisocitose
Projeção em forma de gota Pleomorfismo celular
Aumento do nº de mitoses Variação na relação núcleo/citoplasma Mitoses acima da basal Aumento do nº de núcleos Disceratose (ceratinização prematura) Mitoses atípicas
Pérolas córneas Aumento do número de nucléolos
- Hipercromatismo
4.4.2 CARCINOMA EPIDERMÓIDE
massas (Quadro 02), além de maturidade celular e tipo de invasão, conforme Martins Neto (1999).
Quadro 02- Critérios para avaliação do dismorfismo das massas epiteliais. CRITÉRIOS Favoráveis Contrários
Ceratina Muitas pérolas córneas Poucas pérolas córneas e/ou ceratinizações isoladas
Anisocitose/Anisocariose Leve Acentuada
Hipercromatismo Pouco Muito
Mitoses Poucas, na periferia Muitas, espalhadas
Dissociação das células Unidas Soltas
Arquitetura Organizada (lembrando as camadas do epitélio)
Desorganizada
Obs: Se 03 ou mais critérios representarem um prognóstico favorável, utiliza-VH ³´ ]HURFDVRFRQWUiULR³´XP
)RUDPDWULEXtGRVRVYDORUHV³´RX³´ para cada um dos parâmetros avaliados (Quadro 03), a fim de testar todas as combinações possíveis e ordená-las. Após análise de cada caso, estes foram agrupados e classificados como Estágio I (baixo grau) e Estágio II (alto grau), de acordo com o quadro 04, para viabilizar uma análise comparativa dos mesmos com a expressão dos anticorpos estudados e com a intensidade do infiltrado inflamatório.
Quadro 03- Parâmetros avaliados para definir o estágio dos CEO CARCINOMA EPIDERMÓIDE ORAL ESCOR
E
MASSAS FRONT INVASIVO
Presença Dismorfism
o Maturidade Tipo
0 Ausente Baixo Maduras
(Predominant e)
Massas Trabéculas 1 Presente Alto Imaturas
(Predominant e)
Ninhos Cordões
Para o presente estudo considerou-se os seguintes aspectos:
aproximam ou distanciam do normal, as massas e/ou células, da estrutura original do epitélio de revestimento, como a formação anormal de ceratina, anisocitose/anisocariose, hipercromatismo e nº de mitoses aumentado, associado à dissociação das células e desarranjo arquitetural, denunciando a incapacidade de diferenciação normal dessas células (Quadro 02). A maturidade, quando predominante no front invasivo dá a impressão de freio no processo de invasão, justificando a avaliação do tipo de invasão que revela uma menor ou maior rapidez no crescimento e/ou invasão, a exemplo dos casos de invasão em trabéculas ou massas, com predominância de células maduras, em relação àqueles que invadem como pequenos ninhos ou cordões de células imaturas, como utilizado na própria classificação de Bryne /RJR D ³SUHVHQoD GH PDVVDV´ H R ³WLSR GH LQYDVmR´ VmR RV IDWRUHV GHWHUPLQDQWHV HQTXDQWR R ³GLVPRUILVPR´ H D ³PDWXULGDGH FHOXODU´ VmR DWHQXDQWHV RX agravantes dos primeiros, respectivamente.
Quadro 04- Estadiamento do CEO SITUAÇÕES Tipo de
Invasão Maturidade Presença de Massas Dismorfismo ESTÁGIOS
1 0 0 0 0 I
2 0 0 0 1 I
3 0 0 1 0 I
4 0 0 1 1 I
5 0 1 0 0 I
6 0 1 0 1 I
7 0 1 1 0 II
8 0 1 1 1 II
9 1 0 0 0 II
10 1 0 0 1 II
11 1 0 1 0 II
12 1 0 1 1 II
13 1 1 0 0 II
14 1 1 0 1 II
15 1 1 1 0 II
16 1 1 1 1 II
A intensidade do infiltrado inflamatório foi avaliada tanto nas DEO como nos CEO, em Leve (L), Moderado (M) e Intenso (I), adaptado de Bryne (1998).
Quadro 05- Gradação histológica de malignidade proposta por Bryne.(1998)
PARÂMETROS (Bryne)
ESCORE Grau de ceratinização
Pleomorfismo nuclear (maturidade)
Tipo de invasão Resposta inflamatória 1 altamente
ceratinizado (mais de 50%
das células)
pouco pleomorfismo nuclear (mais de
75% de células maduras) massas com bordas bem delimitadas Intenso 2 moderadament e ceratinizado (20 a 50% das
células)
moderado pleomorfismo nuclear (50 a 75% de
células maduras) cordões ou trabéculas sólidas e massas infiltrativas Moderado 3 mínima ceratinização
(5 a 20% das células)
abundante pleomorfismo (25 a 50 % de células maduras)
pequenos grupos ou cordões de
células infiltrativas (N>15) Escasso 4 nenhuma ceratinização (O a 5 % das
células)
pleomorfismo nuclear extremo (0 a
25% de células maduras)
dissociação celular difusa /ou
células individuais
(N<15)
Ausente
4.5 ESTUDO IMUNO-HISTOQUÍMICO
Os espécimes HPEORFDGRV HP SDUDILQD IRUDP VXEPHWLGRV D FRUWHV GH ȝ de espessura e estes, montados em lâminas histológicas previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo à base de organosilano (3-aminopropyltriethoxi-silano, Sigma Chemical Co, St Louis, MO, USA). Aos cortes histológicos foram aplicados anticorpos dirigidos contra as proteínas estudadas, cujas especificações estão contidas no quadro 06. Como controles negativos foram omitidos os anticorpos primários e para os positivos foram utilizadas secções de câncer de mama e granuloma periapical previamente testados.
4.5.1 Método da Imuno-histoquímica
Xilol 1 (30 minutos), estufa 59º - desparafinização
Etanol 95º/ 5minutos; Etanol 80º/ 5 minutos;
Etanol 95% + Hidróxido de amônio a 10%/ 10 minutos (retirada do pigmento formólico);
Lavagem das lâminas em água corrente, 10 minutos; Água destilada, 2 trocas, 5 minutos cada.
Recuperação antigênica; Água corrente, 10 minutos;
Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 VOL; Água corrente, 10 minutos;
Água destilada, 2 trocas, 5 minutos cada; TRIS pH 7,4, duas trocas, 5 minutos cada; Incubação do anticorpo primário + BSA;
Lavagem e imersão das lâminas em TRIS pH 7,4, duas trocas, 5 minutos cada; Tween 20, 2 trocas, 5 minutos cada;
Incubação do anticorpo secundário + SABC ou Envision;
Incubação do complexo avidina/biotina, diluído em TRIS gelado (A+B); Lavagem com TRIS;
Incubação da diaminobenzidina; Revelação;
Lavagem em água corrente, 10 minutos; Passagem em água destilada;
Contracoloração com Hemtoxilina de Mayer, 10 minutos; Lavagem em água corrente, 10 minutos;
Quadro 06- Especificações dos anticorpos primários. ANTICORPO CLONE DILUIÇÃO/
TEMPO DE INCUBAÇÃO
RECUPERAÇÃO
ANTIGÊNICA MÉTODO NFNN-B* NFN-B p65
(A)
1:100
3 horas Citrato Envision-HRP** TNFDD* TNFD(2C8) 1:100
Overnigth
Pepsina Envision-HRP** TGFEE* TGFE1 (V) 1:500
Overnigth Pepsina Envision-HRP** FOXP3* FOXP3(H190) 1:100
Overnigth
Tris-EDTA PH-9,0
Envision-HRP** CD8** C8/144B 1:200
¶ Tris-EDTA PH-9,0
SABC** * Santa Cruz Biotechnology, Inc. e ** DAKO
4.6 ANÁLISE DOS RESULTADOS 4.6.1 Análise Morfológica
Após a classificação dos casos de DEO e CEO, quanto ao grau histológico, conforme a metodologia descrita foi realizada análise de associação entre: os graus histológicos dos mesmos e a intensidade do infiltrado inflamatório; entre os estágios resultantes da gradação histológica de malignidade dos CEO elaborada para este estudo e a gradação histológica de malignidade proposta por Bryne (1998); e entre os estágios resultantes da gradação histológica de malignidade dos CEO elaborada para este estudo e os parâmetros utilizados pela mesma.
4.6.2 Análise Imuno-histoquímica
Os resultados foram analisados em relação ao tipo de lesão, grau histológico e intensidade do infiltrado inflamatório. Foram consideradas positivas as reações que apresentaram coloração marrom. As análises morfológicas e imuno-histoquímicas foram feitas por um único observador, por três vezes consecutivas.
Quadro 07- Análise semi-quantitativa dos anticorpos.
EXPRESSÃO DAS PROTEÍNAS CD8/FOXP3/7*)ȕ71)ĮNFNN-B
SEMI-QUANTITATIVA Baixa < 5% Moderada 5-50%
Alta > 50% Abbas (2007)
4.6.3 Análise Estatística
Os resultados obtidos foram submetidos ao tratamento estatístico com o objetivo de testar as hipóteses levantadas. Para isso, foi utilizado o software SPSS 13.0 para Windows.
Foi empregado o teste do Qui-quadrado e o exato de Fisher (para valores menores que 5%) a fim de verificar se havia associação na distribuição dos dados entre o grau histológico de malignidade dos CEO e os parâmetros utilizados nessa avaliação.
Para a verificação das hipóteses de igualdade de expressão dos anticorpos XWLOL]DGRV&')2;37*)ȕ71)ĮH1)NB) com relação aos tipos de lesão e grau histológico das displasias (DEO) e carcinomas (CEO), utilizou-se o teste não paramétrico de Mann-Whitney, uma vez que esta expressão foi avaliada por meio do estabelecimento de escores.
A existência de correlação entre a expressão dos marcadores imuno-KLVWRTXtPLFRV &' )2;3 7*)ȕ 71)Į H 1)-NB) e a intensidade do infiltrado inflamatório, segundo o tipo de lesão, foi investigada utilizando-se o coeficiente de correlação de Spearman.
5- RESULTADOS
5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS a) DISPLASIAS EPITELIAIS
Dos 20 casos de DEO estudados, 9 (45%) foram classificados como displasias leves (L), 3 (15%) moderadas e 8 (40%) severas. Quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, 5 (25%) eram leves (L), 10 (50%) moderados (M) e 5 (25%) intensos (I) (Tabela 01).
Tabela 01- Gradação histológica das displasias epiteliais baseada na OMS (2005) e sua relação com a intensidade do infiltrado inflamatório. Natal/RN 2009.
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
b) CARCINOMA EPIDERMÓIDE
No exame microscópico, os carcinomas exibiram uma gama muito grande de variações no que diz respeito à sua invasão, maturidade e organização, independente da localização anatômica e idade dos pacientes. Os CEO foram estadiados conforme a metodologia proposta (Quadro 08).
'RVSDUkPHWURVDYDOLDGRV³7LSRGHLQYDVmR´REWHYHFDVRVFRPHVFRUH ³´HFRPHVFRUH³´³0DWXULGDGH´ FRPHVFRUH³´H FRPHVFRH³´³3UHVHQoDGH0DVVDV´FRPHVFRUH³´HFRP HVFRUH ³´ H SRU ~OWLPR R FULWpULR ³'LVPRUILVPR´ FRQWDELOL]RX FDVRV FRP HVFRUH³´HFRPHVFRUH³´(Figuras 01-08).
Dos 40 casos analisados, 17 (42,5%) se encontravam no Estágio I e 23 (57,5%) no Estágio II. Quanto à intensidade do infiltrado inflamatório, 11 (27,5%) foram leves (L), 10 (25%) foram moderados (M) e 19 (47,5%) intensos (Tabela 02).
DEO L M I Infiltrado Inflamatório
GRAU N % n % n % n %
L 9 45 2 22,2 4 44,4 3 33,3
M 3 15 1 33,3 2 66,6 - -
S 8 40 2 25 4 50 2 25
Quadro 08- Gradação histológica de malignidade dos casos de Carcinomas Epidermóides de acordo com a metodologia desenvolvida para o presente estudo. Natal/RN 2009.
ESCORES CASOS Tipo de
invasão
Maturidade Presença de massas
Dismorfismo ESTÁGIO
01 0 0 1 0 I
02 1 0 1 1 II
03 1 0 1 0 II
04 1 1 0 0 II
05 1 1 0 0 II
06 1 0 1 1 II
07 0 1 1 1 II
08 1 1 1 1 II
09 0 0 0 0 I
10 1 0 1 0 II
11 1 0 1 1 II
12 1 0 1 1 II
13 0 0 1 0 I
14 1 1 1 1 II
15 1 1 1 1 II
16 0 0 0 0 I
17 1 1 0 1 II
18 0 0 0 0 I
19 1 1 0 0 II
20 1 0 1 0 II
21 0 0 1 1 I
22 0 0 1 1 I
23 0 1 1 1 II
24 0 0 0 0 I
25 0 1 0 1 I
26 0 0 1 1 I
27 0 0 0 0 I
28 0 0 0 1 I
29 0 0 0 0 I
30 0 1 1 1 II
31 0 1 1 1 II
32 0 0 1 0 I
33 1 1 1 1 II
34 1 1 1 1 II
35 0 1 1 1 II
36 0 1 1 1 II
37 0 0 0 0 I
38 0 0 1 1 I
39 0 1 1 1 II
40 0 0 1 1 I
Fonte: Serviços de Patologia Oral do HU da UFS e da UFRN.
Do ponto de vista do infiltrado inflamatório, dos 11 casos com infiltrado inflamatório leve 2 (18,2%) pertenciam às lesões de grau I e 9 (81,8%) às de grau II; dos 10 casos com infiltrado inflamatório moderado 4 (40%) pertenciam às lesões de grau I e 6 (60%) às de grau II; e dos 19 casos com infiltrado inflamatório intenso 11 (57,9%) pertenciam às lesões de grau I e 8 (42,1%) às de grau II.
Os 40 casos de CEO também foram avaliados pelo método de Bryne para o front invasivo (1998) e em seguida classificados como Estágio I (para escores entre 3-6 e 4-8) e Estágio II (para escores entre 7-12 e 9-16), conforme metodologia proposta. Foi observada uma divergência de 13,3% e 20% para os casos sem e com o parâmetro em questão, respectivamente (Quadro 09) em relação aos resultados obtidos pelo método desenvolvido para este estudo (Quadro 08), embora o número total de casos de alto e baixo graus, tenham sido coincidentemente iguais (Gráfico 01).
Gráfico 01- Comparação das GHM
0 5 10 15 20 25
Alto Baixo
Grau Histológico de Malignidade
Pesquisa
Bryne CEO
Infiltrado Inflamatório
L M I Estágios N % N % n % n %
I 17 42,5 2 11,8 4 23,5 11 64,7
II 23 57,5 9 39,1 6 26,1 8 34,8
Quadro 09- Gradação histológica de malignidade dos Carcinomas Epidermóides de acordo com o método de Bryne (1998) para o front invasivo. Natal/RN 2009.
ESCORES
CASOS GC M TI RI TOTAL
s/RI c/RI
01 3 1 1 1 5 I 6 I
02 4 2 4 2 10 II 12 II
03 3 3 4 2 10 II 12 II
04 2 4 2 1 8 II 9 II
05 3 3 2 1 8 II 9 II
06 2 2 4 1 8 II 9 II
07 4 4 1 1 9 II 10 II
08 4 4 4 2 12 II 14 II
09 3 1 1 3 5 I 8 I
10 3 2 2 1 7 II 8 I
11 3 1 1 2 5 I 7 I
12 3 1 3 1 7 II 8 I
13 4 1 2 1 7 II 8 I
14 4 4 3 4 11 II 15 II
15 3 4 3 2 10 II 12 II
16 1 1 1 1 3 I 4 I
17 4 4 4 4 12 II 16 II
18 3 1 1 1 5 I 6 I
19 4 4 4 3 12 II 15 II
20 2 1 2 3 5 I 8 I
21 4 1 1 3 6 I 9 II
22 3 2 2 4 7 II 11 II
23 2 3 2 2 7 II 9 II
24 1 1 1 1 3 I 4 I
25 3 2 2 1 7 II 8 I
26 3 1 1 2 5 I 7 I
27 3 1 1 2 5 I 7 I
28 4 1 1 4 6 I 10 II
29 4 1 1 1 6 I 7 I
30 3 3 1 4 7 II 11 II
31 4 3 2 1 9 II 10 II
32 3 1 1 2 5 I 7 I
33 4 4 4 3 12 II 15 II
34 4 4 4 4 12 II 16 II
35 4 3 1 2 8 II 10 II
36 3 3 2 1 8 II 9 II
37 3 1 1 3 5 I 8 I
38 3 3 2 1 8 II 9 II
39 3 3 2 4 8 II 12 II
40 2 1 2 1 5 I 6 I
Grau de ceratinização (GC); Maturidade (M); Tipo de invasão (TI);Resposta inflamatória (RI); sem Resposta inflamatória (s/RI) e com Resposta inflamatória (c/RI).
