Expressão imuno-histoquímica das integrinas α2ß1, α3ß1, e α5ß1, em mucosa oral normal, hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral e displasia epitelial oral

(1)

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS INTEGRINAS

α

α2β

β

β1

, α

α

α3β

α

β1

β

e α

α

α5β

β

β1

β

EM MUCOSA ORAL NORMAL, HIPERPLASIA FIBROEPITELIAL

INFLAMATÓRIA ORAL E DISPLASIA EPITELIAL ORAL

Doutorando: Manuel Antonio Gordón Núñez Orientador: Prof. Dr. Leão Pereira Pinto

Natal / RN 2006

Tese apresentada ao Colegiado do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como parte dos requisitos para obtenção do grau de Doutor em Patologia Oral.

UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL

(2)

MANUEL ANTONIO GORDÓN NÚÑEZ

EXPRESSÃO IMUNO-HISTOQUÍMICA DAS INTEGRINAS

α

2

β

1

, α

α

3

β

1

e α

α

5

β

1

EM MUCOSA ORAL NORMAL, HIPERPLASIA FIBROEPITELIAL

INFLAMATÓRIA ORAL E DISPLASIA EPITELIAL ORAL

(3)

Catalogação da publicação. UFRN/Biblioteca Setorial de Odontologia

Gordón-Núñez, Manuel Antonio.

Expressão imuno-histoquímica das integrinas α2β1, α3β1 e α5β1 em mucosa oral normal, hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral e displasia epitelial oral/Manuel Antonio Gordón-Núñez.__Natal, RN, 2006.

128f. : il.

Orientador: Leão Pereira Pinto.

Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.

1. Moléculas de adesão celular – Tese. 2. Integrinas – Tese. 3. Mucosa oral – Tese. 4. Hiperplasia inflamatória oral –Tese. 5. Displasia epitelial oral – Tese. 6. Imuno-histoquímica. I Pereira Pinto, Leão. II. Título.

(4)

À MINHA MANEIRA À MINHA MANEIRA À MINHA MANEIRA À MINHA MANEIRA

Eu sei, se aqui cheguei, se conquistei o que eu queria Cheguei porque teimei, porque apostei na travessia Não fiz tudo o que eu quis, mas sou feliz, não fui perfeito Errei, mas procurei fazer direito

Andei, corri e voei, me atrapalhei, perdi o prumo Voltei, recomecei, replanejei, achei meu rumo Não fiz tudo o que eu quis, mas sou feliz, não fui perfeito Errei, mas eu tentei fazer direito

Se eu me enganei e eu me enganei, e me engasguei por querer demais Mas reagi, cuspi pra fora e aprendi a mastigar E me refiz e sou feliz, não tenho presa

Amei, sorri e chorei, perdi e ganhei, joguei errado Cresci, envelheci e agora eu vi como é engraçado Pensar no que eu já fiz pra ser feliz, quanta loucura Errei, mas acabei de alma pura

Pra ser alguém, a gente tem que se guardar, tem que se doar E ser real e ser fiel e não mentir e não fingir Se eu errei, errei tentando, fazer direito Se eu errei, errei tentando, fazer direito

(5)

(6)

Dedico esta nova vitória a MINHA FAMILIA, MINHA FAMILIA, MINHA FAMILIA, MINHA FAMILIA, ao Meu saudoso pai Fernando Antonio Gordón Torres Fernando Antonio Gordón Torres Fernando Antonio Gordón Torres Fernando Antonio Gordón Torres (in memórian), a minha mãe Gardênia Núñez García Gardênia Núñez García Gardênia Núñez García Gardênia Núñez García e aos meus irmãos Fernando Enrique, Julio César, Fernando Enrique, Julio César, Fernando Enrique, Julio César, Fernando Enrique, Julio César, Jorge Alberto

Jorge Alberto Jorge Alberto

(7)

(8)

É só esperar acontecer... É só continuar e não deixar que as lágrimas embacem o olhar... E não deixar que a tristeza tire a força do caminhar... do continuar!!! Olhando nos olhos de DEUSDEUSDEUSDEUS, enxergando a verdade, nada e ninguém poderá impedir!!!.

(9)

Ao meu orientador

Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto,

Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, lhe agradeço pelos ensinamentos, a confiança, o respeito e a liberdade de ação que sempre me proporcionou. “Existem pessoas que executam tarefas e outras que buscam “Existem pessoas que executam tarefas e outras que buscam “Existem pessoas que executam tarefas e outras que buscam “Existem pessoas que executam tarefas e outras que buscam acrescentar a cada dia um

acrescentar a cada dia um acrescentar a cada dia um

acrescentar a cada dia um valor diferenciado, melhorando o resultado e elevando o grau de satisfação e valor diferenciado, melhorando o resultado e elevando o grau de satisfação e valor diferenciado, melhorando o resultado e elevando o grau de satisfação e valor diferenciado, melhorando o resultado e elevando o grau de satisfação e admiração”.

admiração”. admiração”.

admiração”.(Parábolas eternas). A sua realização pessoal e profissional constitui um claro exemplo do valor diferenciado que imprime na sua vida e me servirá como referência para acreditar que misturando esforço pessoal e a Fé em Deus é mais fácil concretizar os meus projetos profissionais e de vida.

À coordenadora do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral

“Põe amor nas coisas e as coisas terão sentido. Retira “Põe amor nas coisas e as coisas terão sentido. Retira “Põe amor nas coisas e as coisas terão sentido. Retira

“Põe amor nas coisas e as coisas terão sentido. Retira----lhes o lhes o lhes o lhes o amor e se tornarão vazias”amor e se tornarão vazias”amor e se tornarão vazias”amor e se tornarão vazias”, Dra., Profa. Lélia Batista de Souza,

Lélia Batista de Souza, Lélia Batista de Souza,

(10)

Agradecimento especial

Ensinar é uma arte, requer dedicação, paciência, amor, respeito e humildade, Profa., Dra. Hébel Hébel Hébel Hébel Cavalcanti G

Cavalcanti G Cavalcanti G

Cavalcanti Galvãoalvãoalvãoalvão, você imprime equilibradamente todas essa qualidades na arte que escolheu como profissão, razão pela qual lhe admiro e respeito. O carinho e a amizade que a senhora e sua bela família me ofereceram permanecerão por sempre do lado esquerdo do meu peito. As lições que se aprendem de um professor amigo

professor amigo professor amigo

professor amigo dificilmente se esquecem e nos permitem tornar-nos academicamente mais sábios e humanamente mais evoluídos.

Aos professores:

Roseana de Almeida Freitas, Lélia Maria Guedes Queiroz e Antônio de Li Roseana de Almeida Freitas, Lélia Maria Guedes Queiroz e Antônio de Li Roseana de Almeida Freitas, Lélia Maria Guedes Queiroz e Antônio de Li

Roseana de Almeida Freitas, Lélia Maria Guedes Queiroz e Antônio de Lisboa Lopes Costasboa Lopes Costasboa Lopes Costasboa Lopes Costa, lhes agradeço de coração pelos ensinamentos e a amizade. Cada um de vocês possui um estilo particular de passar os seus conhecimentos acadêmicos, desde a minha posição de humilde receptor procurei ao máximo adquiri-los e espero poder aplicá-los e fazê-los frutificar onde quer que eu vá.

(11)

Aos meus avós

Enrique Núñez Jaramillo Enrique Núñez Jaramillo Enrique Núñez Jaramillo

Enrique Núñez Jaramillo (In memóriam), Maria Dominga García de NúñezMaria Dominga García de NúñezMaria Dominga García de Núñez, Marcelino GordónMaria Dominga García de Núñez Marcelino GordónMarcelino GordónMarcelino Gordón e Rosalia Torr

Rosalia Torr Rosalia Torr

Rosalia Torres de Gordónes de Gordónes de Gordón (In memóriam), primeiramente lhes agradeço a fortuna de ter gerado figuras es de Gordón maravilhosas como os meus pais, e conseqüentemente, pelo infinito carinho, respeito e confiança que sempre depositam em mim.

Aos meus tios: Benilda D`Jesus, Benilda D`Jesus, Benilda D`Jesus, Benilda D`Jesus, ItItItsa Itsa sa sa Teresa Núñez, Maria Vicenta de Villaverde, Lúz Amália Núñez, Teresa Núñez, Maria Vicenta de Villaverde, Lúz Amália Núñez, Teresa Núñez, Maria Vicenta de Villaverde, Lúz Amália Núñez, Teresa Núñez, Maria Vicenta de Villaverde, Lúz Amália Núñez, Júlio Núñez, José de la Rosa Núñez, José Antonio Núñez,

Júlio Núñez, José de la Rosa Núñez, José Antonio Núñez, Júlio Núñez, José de la Rosa Núñez, José Antonio Núñez,

Júlio Núñez, José de la Rosa Núñez, José Antonio Núñez, JoséJoséJoséJosé Gordón, Mirian Gordón Gordón, Mirian Gordón e Gloriela Gordón, Mirian Gordón Gordón, Mirian Gordón Gloriela Gloriela Gloriela Gordón

Gordón Gordón

(12)

Márcia Cristina da Costa Miguel – Marcinha,

Gustavo Pina Godoy - Gustavito e

Kenio Costa Lima - Hermanito...

"Deus criou o AMORAMORAMORAMOR e nós, humanos, não soubemos utilizá-lo. Ele então numa inspiração divina criou a AMIZADEAMIZADEAMIZADE e foi assim que o amor passou a ser utilizado na essência de seu significado. AMIZADE Quem está ligado por esse amor, distância alguma separa, pois a verdadeira amizade não une corpos, não une mentes, mas une corações e essa união é feita por Deus e o que Deus une, homem algum é capaz de separar”.

William Shakespeare William Shakespeare William Shakespeare William Shakespeare

(13)

Meus caros e inesquecíveis amigos do mestrado e doutorado:

Danielle, Danielle, Danielle,

Danielle, Karuzita, Joãozinho, Cassiano, Georgiño,Karuzita, Joãozinho, Cassiano, Georgiño,Karuzita, Joãozinho, Cassiano, Georgiño, Simonita, Karuzita, Joãozinho, Cassiano, Georgiño, Simonita, Simonita, Simonita, Flávio, Flávio, Flávio, Flávio, Carmencita, Fernandita, Antônio Carmencita, Fernandita, Antônio Carmencita, Fernandita, Antônio Carmencita, Fernandita, Antônio

Luis, Robertita, Rivadávio Luis, Robertita, Rivadávio Luis, Robertita, Rivadávio

Luis, Robertita, Rivadávio,,,, Rosilene Rosilene Rosilene Rosilene,,,, Marcinho Marcinho Marcinho Marcinho, , , , Erickinha, AndrErickinha, Andréa, Marthica, Claudine,Erickinha, AndrErickinha, Andréa, Marthica, Claudine,éa, Marthica, Claudine,éa, Marthica, Claudine, Janaina Janaina Janaina Janaina, Poliana, , Poliana, , Poliana, , Poliana,

Débora, Beth Débora, Beth Débora, Beth

Débora, Bethânia, Ruth, Pedro Paulo, Marcelo e Domingosânia, Ruth, Pedro Paulo, Marcelo e Domingosânia, Ruth, Pedro Paulo, Marcelo e Domingosânia, Ruth, Pedro Paulo, Marcelo e Domingos

... De uma ou outra forma, nas minhas saudosas lembranças vou levando a essência da bondade e amizade de vocês, espero ter deixado pelo menos uma pequena marquinha indelével nas suas, obrigado por tudo.

“Aqueles que passam por nós não vão sós, não nos deixam sós. Deixam um pouco de si, levam um pouco de nós”.

(14)

Meus amigos: Meus amigos: Meus amigos: Meus amigos:

Pensando no tempo que tenho vivido nesta Terra Maravilhosa chamada Brasil, ao chegar ao final desta

jornada estou plenamente convencido de que as lições aprendidas, a experiência adquirida, as lágrimas

derramadas, as melodias cantadas, os sonhos realizados e incubados, o amor vivido e desejado não

teriam o valor incalculável que lhes percebo se não tivessem passado por minha vida pessoa fantásticas

como Minhas Mães brasileiras: Dona Rosário DantasDona Rosário DantasDona Rosário Dantas, Dona Socorro Paraguai Dona Rosário Dantas Dona Socorro Paraguai Dona Socorro Paraguai Dona Socorro Paraguai e Dona Íris Ce Dona Íris Ce Dona Íris Cerrrrqueira Dona Íris Cequeiraqueira; queira

meus amigos Márvin Márvin Márvin Márvin, sua esposa Cira Cira Cira e seus filhos, meus sobrinhos Edgar e Eloísa Cira Edgar e Eloísa Edgar e Eloísa Edgar e Eloísa, meu amigo-irmão

Manoel Quaresma Manoel Quaresma Manoel Quaresma

Manoel Quaresma Filho Filho Filho Filho e familia, Ketsia Ketsia Ketsia Ketsia, Sormani Sormani Sormani Sormani, RuthinéiaRuthinéia, Emanuel SávioRuthinéiaRuthinéia Emanuel Sávio Emanuel Sávio, João Luis Emanuel Sávio João Luis João Luis, Néstor João Luis Néstor Néstor Néstor

Alberto Sánchez, Alberto Sánchez, Alberto Sánchez,

Alberto Sánchez, Álvaro ParaguaiÁlvaro ParaguaiÁlvaro Paraguai, DemersonÁlvaro Paraguai Demerson Demerson, Lêda Maria Demerson Lêda Maria, Luiz Lêda Maria Lêda Maria LuizLuizLuiz Carlos Azevedo, Suzete Carlos Azevedo, Suzete Carlos Azevedo, Suzete Carlos Azevedo, Suzete e familia, , , ,

Allann e Francisco Lopes da Silva Junior Allann e Francisco Lopes da Silva Junior Allann e Francisco Lopes da Silva Junior

Allann e Francisco Lopes da Silva Junior. A todos vocês que com pequenos e grandes detalhes me

apresentaram as diversas facetas do amor, da amizade e da compreensão, me incentivaram a ter coragem

e sobre todo me mostraram a grandeza do Coração Verde AmareloCoração Verde AmareloCoração Verde AmareloCoração Verde Amarelo, lhes sou eternamente grato.

"O valor das coisas não está no tempo que elas duram, mas na intensidade com que acontecem. Por isso, existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis”.

(15)

Aos funcionários Aos funcionários Aos funcionários Aos funcionários Sandovania (Sandy) Sandovania (Sandy) Sandovania (Sandy)

Sandovania (Sandy), Maria das Graças (Grace)Maria das Graças (Grace)Maria das Graças (Grace), IdMaria das Graças (Grace) IdIdelzuiteIdelzuiteelzuiteelzuite, HévioHévioHévioHévio e CanindéCanindéCanindé, agradeço todo o apoio que me Canindé

ofereceram durante a minha passagem por esta escola, pelas manifestações de carinho e pela colaboração

técnica proporcionada na elaboração desta tese.

“Quando fizeres o bem, oculta-o; quando te fizerem o bem, proclama-o”.

(Sabedoria árabe) (Sabedoria árabe)(Sabedoria árabe) (Sabedoria árabe)

Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológi Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológi Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico co co ---- CNPq e ao Ministério das Relações CNPq e ao Ministério das Relações CNPq e ao Ministério das Relações CNPq e ao Ministério das Relações

Exteriores do Brasil Exteriores do Brasil Exteriores do Brasil

Exteriores do Brasil, agradeço pela oportunidade e pelo apoio financeiro que me ofereceram durante esta

nova etapa da minha formação acadêmica.

“Fomentar a ciência e o crescimento humano é o caminho certo que nos leva a um futuro promissório”

O O O

O

bbbbrigado Brasil, terra querida, terra abençoada, terra maravilhosa, por sempre estarás no

rigado Brasil, terra querida, terra abençoada, terra maravilhosa, por sempre estarás no

lado esquerdo do meu pe

(16)

(17)

RESUMO

Este estudo se propôs analisar através da técnica da estreptoavidina-biotina a expressão imuno-histoquímica das integrinas α2β1,α3β1 e α5β1 em 11 espécimes de mucosa oral normal

(MON), 16 de hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral (HFIO) e 25 de displasia epitelial oral (DEO) (16 leves, 2 moderadas e 7 graves), procurando determinar se existe alteração qualitativa na expressão destas integrinas e se a mesma guarda relação com as modificações sofridas pelo epitélio oral. Para a integrina α2β1 a maioria dos espécimes exibiu uma marcação

predominantemente intensa e difusa nos contatos intercelulares e no citoplasma celular das camadas basal e suprabasal, sem diferença desse perfil entre os diferentes tipos de espécimes, porém com uma tendência a fraca ou perda da expressão em 21.1% das DEOs, sendo todos os espécimes que não expressaram marcação para este heterodímero DEOs graves. Para a integrina α3β1 a maioria da amostra exibiu uma marcação fraca ou ausente

predominantemente em camada basal. A integrina α5β1 exibiu uma forte marcação difusa nos

contatos intercelulares e citoplasmática na camada suprabasal, com diferença apenas na intensidade de marcação entre os tipos de espécimes, residindo essa diferença nas DEOs, onde 12 (48%) espécimes exibiram uma fraca marcação. Concluiu-se que as integrinas avaliadas podem estar envolvidas nas interações célula-célula e célula-MEC que garantem a diferenciação celular e manutenção do arranjo estrutural tecidual. A variável expressão da integrina α5β1 nas DEOs, poderia sugerir, respectivamente, um papel dessa molécula na

sobrevida celular, com o intuito de perpetuar o fenótipo alterado nessas lesões, ou uma ação supressora desse fenótipo devido à falta de interação desta molécula com a fibronectina da MEC.

(18)

(19)

ABSTRACT

The objective of this study was perform by the streptoavidin-biotin technique an immunohistochemical analysis of α2β1, α3β1 e α5β1 integrins in 11 normal oral mucosa

(NOM), 16 oral inflammatory fibroepithelial hyperplasia (OIFH) and 25 oral epithelial dysplasia (OED) (16 mild, 2 moderates and 7 severe), to determine if exists qualitative alteration in the expression of these integrins and if this guard relation with the oral epithelial modifications. It was observed that for the α2β1 integrin the majority of the sample showed a

predominantly intense labeling diffusely distributed in the intercellular contacts and the cytoplasm of cells of the basal and suprabasal layers, without difference of this profile between the different types of specimens, however with a trend to weak or loss of expression in 21.1% of the OEDs, being all the specimens that had not expressed this heterodimer, severe OEDs. For the α3β1 integrin the majority of the sample showed a weak or absent labeling in

basal layer. The α5β1 integrin showed a predominant strong diffuse labeling in the

intercellular contacts and cytoplasm in the suprabasal layer, with difference only in the labeling intensity between the types of specimens, inhabiting this difference in the OEDs, where 12 (48%) specimens had shown a weak labeling. It was concluded that the evaluated integrins can be involved in the cell-cell, cell-ECM interactions modulating the cellular differentiation and maintenance of the epithelial structural arrangement. The variable expression of the α5β1 integrin in the OEDs, could suggest, respectively, a role of this

molecule in the cellular survival, with intention to perpetuate the modified phenotype in these lesions, or a suppressor role on the modified phenotype due to lack of interaction of this molecule with the fibronectina of the MEC.

(20)

(21)

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

ILUSTRAÇÃO Página

Figura 1. Distribuição da amostra de mucosa oral normal (MON) em relação à

localização anatômica dos espécimes. Natal / RN, 2006 ... 71

Figura 2. Distribuição da amostra de hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral (HFIO) em relação à localização anatômica dos espécimes. Natal / RN, 2006 ... 71

Figura 3. Distribuição da amostra de displasia epitelial oral (DEO) em relação à localização anatômica dos espécimes. Natal / RN, 2006 ... 72

Figura 4. Distribuição da amostra de mucosa oral normal (MON) em relação aos diagnósticos clínicos dos espécimes. Natal / RN, 2006 ... 72

Figura 5. Distribuição da amostra de hiperplasia fibroepitelial oral (HFIO) em relação aos diagnósticos clínicos dos espécimes. Natal / RN, 2006 ... 73

Figura 6. Distribuição da amostra de displasia epitelial oral (DEO) em relação aos diagnósticos clínicos dos espécimes. Natal / RN, 2006 ... 73

Figura 7. Mucosa oral normal (MON). (H/E –100x) ... 75

Figura 8. Hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral (HFIO). (H/E –100x) ... 75

Figura 9. Hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral (HFIO). (H/E – 400x) ... 75

Figura 10. Displasia epitelial oral (DEO) leve. (H/E –100x) ... 76

Figura 11. Displasia epitelial oral (DEO) moderada. (H/E – 100x) ... 76

(22)

Figura 13. Forte imunomarcação granular difusa para integrina α2β1 em camadas

basal e suprabasal de MON (SABC – 100x) ... 88

Figura 14. Forte imunomarcação granular difusa para integrina α2β1 em camadas

basal e suprabasal de HFIO (SABC – 100x) ... 88

Figura 15. Forte imunomarcação granular difusa para integrina α2β1 em

citoplasma e contatos intercelulares das camadas basal e suprabasal de

HFIO (SABC – 400x) ... 88

Figura 16. Forte imunomarcação granular difusa para integrina α2β1 em camada

basal de DEO leve (SABC – 100x) ... 89

suprabasal de DEO leve (SABC – 100x) ... 89

basal/suprabasal de DEO leve (SABC - 100x) ... 89

Figura 19. Fraca imunomarcação linear difusa para integrina α3β1 em camada

basal de MON (SABC - 100x) ... 90

Figura 20. Fraca imunomarcação granular focal para integrina α3β1 em camada

basal de HFIO (SABC – 100x) ... 90

Figura 21. Fraca imunomarcação granular focal para integrina α3β1 em camada

basal DEO leve (SABC – 100x) ... 90

suprabasal de MON (SABC - 100x) ... 91

suprabasal de HFIO (SABC – 100x) ... 91

(23)

suprabasal de DOE leve (SABC - 400x) ... 92

Figura 26. Fraca imunomarcação granular difusa para integrina α5β1 em camada

suprabasal de DEO leve (SABC – 100x) ... 92

(24)

(25)

LISTA DE QUADROS E TABELAS

QUADRO/TABELA Página

Quadro 1. Anticorpos... 67

Tabela 1. Distribuição da amostra em relação ao tipo de espécime, sexo e cor dos

pacientes. Natal / RN, 2006... 70

Tabela 2. Distribuição da amostra em relação à média, desvio padrão (DP), mínimo e maximo das idades dos pacientes da amostra avaliada. Natal /

RN, 2006... 70

Tabela 3. Número absoluto e percentual da expressão imuno-histoquímica da integrina α2β1 em relação à intensidade, padrão, distribuição e

localização em mucosa oral normal (MON), hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral (HFIO) e displasia epitelial oral (DEO), Natal / RN,

2006... 82

localização em displasia epitelial oral (DEO) leve, moderada e grave, Natal / RN, 2006... 83

2006... 84

(26)

2006... 86

(27)

(28)

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

AKt - Serine/threonine kinase. Proteína envolvida na iniciação e/ou progressão

tumoral.

BSA – Bovine Serum Albumin (Albumina de soro bovino).

Ca++_{- Íon cálcio.}

CAM – Cellular adhesion molecules (Moléculas de adesão celular).

CEO – Carcinoma epidermóide oral.

c-fos – Proto-oncogene envolvido na proliferação celular que precede a expressão

gênica músculo-especfica e a diferenciação.

c-jun – Proto-oncogene com importante ação nas vias de sinalização que regulam o

crescimento, desenvolvimento e diferenciação celular normal.

CSA - Catalized Signal Amplification System for Mouse Primary Antibodies.

DEO – Displasia epitelial oral.

ERK - Extracellular signal-regulated kinase (kinases reguladas por sinais

extracelulares).

FADD - Fas-associating protein with a death domain.

FAK – Focal adhesion kinase (Kinase de adesão focal).

HFIO – Hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral.

junB – Proto-oncogene da família JUN antagonista das funções do jun na regulação

(29)

kD – Kilodalton.

Ki-67 - Antígeno nuclear associado com a proliferação celular, encontrado nas fases G1, S, G2 e M do ciclo celular e ausente em G0.

MAPK – Mitogen-actived protein kinase (Kinase mitógeno-ativada).

MEC – Matriz extracelular.

MEK - Kinase regulada por metiletilcetona-mitogénio.

ERK – Extracellular-regulated kinases.

Mg++ - Íon magnésio.

MMP – Metaloproteinase.

OMS – Organização Mundial da Saúde.

p130cas– Proteína adaptadora envolvida nos processos de adesão, migração e transformação celular.

PI3K – Phosphatidyinositol 3-kinase.

RGD – Seqüência tripeptídica constituída pelos aminoácidos arginina-glicina-ácido aspártico.

SABC - Streptoavidin biotin complex (Complexo estreptoavidina-biotina).

Src – Família de proteínas tirosino-kinase, encontradas nas adesões focais, representando componentes chaves na transdução de sinais mediados pelas integrinas e na ligação ao citoesqueleto de actina.

TOA – Tumor odontogênico adenomatóide.

TRIS-HCl – Tris (hydroxymethyl) aminomethane Hydrochloride

µ µ µ

(30)

(31)

SUMÁRIO

Página

RESUMO

ABSTRACT

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

LISTA DE QUADROS E TABELAS

LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

1 INTRODUÇÃO ... 32

2 REVISÃO DA LITERATURA ... 34

2.1 Mucosa oral normal, hiperplasia fibroepitelial inflamatória e

displasia epitelial oral... 35

2.2 Matriz extracelular: Considerações gerais ... 39

2.2.1 Colágeno IV, laminina e fibronectina ... 41

2.3 Integrinas: Considerações gerais ... 46

2.3.1 Integrinas αααα2ββββ1, αααα3ββββ1 e αααα5ββββ1 ... 51

2.3.2 Estudos recentes sobre o papel das integrinas αααα2ββββ1, αααα3ββββ1 e αααα5ββββ1

nos eventos celulares epiteliais ... 54

3 PROPOSIÇÃO ... 60

4 MATERIAIS E MÉTODOS ... 62

4.1 Caracterização do estudo ... 63

4.2 População ... 63

4.3 Amostra ... 63

4.4 Critérios de seleção da amostra ... 64

(32)

4.4.2 Critérios de exclusão ... 64

4.5 Estudo morfológico ... 64

4.6 Estudo imuno-histoquímico ... 65

4.6.1 Método imuno-histoquímico ... 65

4.6.2 Análise do perfil imuno-histoquímico ... 67

4.7 Análise estatística ... 68

4.8 Considerações éticas ... 68

5 RESULTADOS ... 69

5.1 Caracterização da amostra ... 70

5.2 Resultados morfológicos ... 74

5.3 Resultados imuno-histoquímicos ... 77

5.3.1 Análise do perfil imuno-histoquímico ... 77

5.3.1.1 Expressão imuno-histoquímica da integrina α2β1... 77

6 DISCUSSÃO ... 93

7 CONCLUSÕES ... 110

REFERÊNCIAS

(33)

(34)

1. INTRODUÇÃO

Em condições de normalidade, durante o processo de renovação constante experimentado pelo epitélio da mucosa oral, suas células migram através dos seus estratos e, nesse processo, sofrem modificações bioquímicas e morfológicas (KATCHBURIAN, ARANA,2004).

Alterações no equilíbrio homeostático tecidual por algum fator agressor, podem promover adaptações celulares, modificando sua estrutura morfológica e bioquímica ou sofrer um processo regressivo ou, até mesmo evoluir à morte. Nos casos em que a célula não se adapte e tenha sua função aumentada, ocorre, geralmente, uma alteração progressiva denominada hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral (HFIO) (MONTENEGRO, FRANCO, 1999). Ainda pela ação de agentes físicos, químicos e até genéticos, podem surgir lesões mais graves como a displasia epitelial oral (DEO) (GONZÁLEZ-MOLES, 1997).

A adesão celular está envolvida nos quatros eventos mais importantes da célula: proliferação, migração, diferenciação e morte, verificando-se destarte que, qualquer alteração nesses processos gera conseqüências que interferem no comportamento celular (THOMAS, JONES, SPEIGHT, 1997). Proteínas de superfície celular, principalmente as integrinas, estão envolvidas na interação célula-célula e célula-matriz extracelular (MEC), regulando tais eventos (PETRUZZELLI, TAKAMI , HUMES, 1999).

Atualmente, o foco dos estudos tem sido direcionado à pesquisa das integrinas e seu papel fundamental nas alterações sofridas pelo epitélio da mucosa oral, uma vez que, alterações na topografia, expressão e/ou função dessas moléculas, podem representar um mecanismo potencial para a adesão alterada e/ou reorganização citoesquelética de células com fenótipo transformado (KAWANO et al, 2001), as quais levam a uma proliferação e

diferenciação descontroladas, promovendo o surgimento de células com alterações malignas (ALBELDA, 1993).

Com o objetivo de obter informações que contribuam para uma melhor compreensão do papel das integrinas no comportamento biológico das células epiteliais da mucosa oral, este estudo se propôs realizar uma análise da expressão imuno-histoquímica das integrinas α2β1,α3β1 e α5β1, observando-se sua presença, localização, intensidade, padrão e distribuição

(35)

(36)

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Mucosa oral normal, hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral e displasia epitelial oral.

A mucosa oral é revestida por um epitélio pavimentoso estratificado de origem ectodérmica constituído por células justapostas e firmemente aderidas em camadas contínuas, cuja integridade estrutural é mantida através de um sistema homeostático de renovação constante, no qual as células são produzidas por divisão mitótica. Tais células são permeadas por uma substância intercelular conhecida como matriz extracelular (MEC) (JUNQUEIRA, CARNEIRO, 2004; OKAZAKI et al, 2002).

Os estratos ou camadas celulares do epitélio da mucosa oral são compostos pela camada basal, constituída pelas células fonte que estão em constante atividade proliferativa, se dividem e posteriormente, as células filhas migram pelos estratos subseqüentes, que são o espinhoso e granuloso até serem descamadas na superfície. Durante esse processo de migração, as células sofrem modificações bioquímicas e morfológicas caracterizadas pelo acúmulo de filamentos intermediários denominados tonofilamentos e, na maioria das vezes, filamentos de ceratina constituindo assim, os epitélios ceratinizados, daí a denominação de ceratinócitos para as células do epitélio oral. Dependendo da localização anatômica na cavidade oral, tal epitélio pode ser ceratinizado ou não ceratinizado (CASTTELLANOS, 2002a; KATCHBURIAN, ARANA, 2004; WINNING, TOWSEND, 2000).

É relatado que o processo normal de migração e diferenciação celular desde a camada basal até às camadas mais superficiais ocorre num constante equilíbrio homeostático, garantindo a renovação epitelial adequadamente, porém ao ser interrompido ou alterado esse equilíbrio por algum fator agressor, as células podem adaptar-se progressivamente modificando sua estrutura morfológica e bioquímica ou sofrer um processo regressivo, podendo até culminar com a morte. Nos casos em que a célula não se adapta e tem sua função aumentada, ocorre, geralmente, uma alteração progressiva denominada hiperplasia (MONTENEGRO, FRANCO, 1999).

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amplo espectro de alterações histológicas caracterizadas por anomalias celulares e estruturais, porém com preservação da membrana basal.

Geralmente as alterações epiteliais características da hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral são acompanhadas por certo grau de mudanças a nível subepitelial tais como, aumento da vascularização, fibrose e presença de infiltrado inflamatório predominantemente crônico (KAMBIC, 1997).

A hiperplasia fibroepitelial inflamatória oral (HFIO) é categorizada separadamente de outras hiperplasias orais devido à constante associação da lesão com fatores irritantes locais crônicos de baixa intensidade como trauma por próteses mal adaptadas, dentes fraturados, restos dentários, dentre outros (PRIDDY, 1992; NEIA, SHINIKE, CHICARELLI, 2001). Várias terminologias têm sido utilizadas para denominar a HFIO, como: epulis fissuratum

(BASSI, VIEIRA, GABRIELLI, 1998), granuloma de dentadura, fibromatose por dentadura (NAKAO, YONEDA, OSAKI, 1995); hiperplasia inflamatória, hiperplasia traumática, hiperplasia fibrosa inflamatória induzida por dentadura (ZANETTI, 1996).

Clinicamente a HFIO mostra-se, geralmente, como uma lesão elevada, de consistência que varia de firme a flácida à palpação, superfície lisa, implantação séssil ou por vezes pediculada e coloração semelhante à da mucosa normal, podendo exibir superfície ulcerada em conseqüência do trauma local; bem como apresenta crescimento lento e tamanhos variados, podendo ocorrer em qualquer idade. Embora possa acometer qualquer lugar da mucosa oral, é mais freqüente em regiões predispostas a irritação ou trauma, principalmente na gengiva, mucosa jugal, lábios e palato (COELHO, ZUCOLOTO, 1998; NEIA, SHINIKE, CHICARELLI, 2001).

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Segundo Zerdoner (2003) a classificação das HFIOs poderia auxiliar na avaliação do risco de progressão e transformação neoplásica, facilitando o seu manejo clínico e conseqüentemente o prognóstico das mesmas.

Dentre as alterações morfológicas que as células do epitélio da mucosa oral podem sofrer em conseqüência da ação agressora de agentes de natureza diversa, destaca-se a displasia epitelial oral (DEO). Segundo Focchi, Terreiro, Ribalta (1987) o termo displasia é de origem grega, e significa dificuldade ou transtorno de formação. Genericamente, o termo displasia epitelial enquadra diferentes mudanças estruturais do epitélio caracterizadas pela combinação variável de características histológicas indicadoras de uma desordem da maturação e proliferação celular, onde a gravidade da lesão depende do maior ou menor número de transtornos epiteliais verificados (CASTELLANOS, 2000b; GONZÁLEZ-MOLES, 1997).

De acordo com Reibel (2003) a DEO não é associada a nenhum aspecto clínico específico, no entanto, as leucoplasias e eritroplasias são lesões classicamente associadas a alterações histopatológicas características de displasias.

É relatado que mesmo sendo relativamente raras em relação às leucoplasia, as eritroplasias constituem lesões com alto potencial de transformação maligna, podendo representar, histopatologicamente, displasias epiteliais graves, estágios primários de lesões de carcinoma epidermóide in situ, ou até, carcinomas microinvasivos (REICHART e PHILPISEN, 2005). Segundo estes autores, as eritroplasias, são mais freqüentes em adultos, com maior incidência entre a sexta e sétima décadas de vida, no sexo masculino, principalmente em palato mole, assoalho bucal e mucosa jugal, com tamanhos variando de 1 cm até 4 cm e sua etiologia é desconhecida porém, muitos casos têm sido associados a fatores predisponentes como o álcool e o tabaco.

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As displasias são consideradas lesões potencialmente malignas e diversos fatores têm sido relacionados com sua etiologia, dentre eles o consumo crônico de álcool e tabaco

(JABER et al, 1999; JABER et al, 2003), até a participação de agentes biológicos (Mc CULLOUGH et al, 2002). Segundo a Organização Mundial da Saúde (OMS)

(PINDBORG et al, 1997) os seguintes critérios histomorfológicos devem ser considerados no diagnóstico dessas lesões:

Perda da polaridade das células basais;

Presença de mais de uma camada de células de aspecto basalóide; Perda da relação núcleo-citoplasma;

Projeções epiteliais em forma de gota; Estratificação irregular do epitélio;

Aumento do número de figuras de mitose; Figuras de mitose anômalas;

Presença de figuras de mitose na metade superficial do epitélio; Pleomorfismo celular e nuclear;

Hipercromatismo nuclear; Nucléolos volumosos; Perda da aderência celular;

Ceratinização individual ou de grupos de células na camada espinhosa.

Segundo Regezzi e Sciubba (2000), o diagnóstico de displasia epitelial pode ser estabelecido quando menos da espessura total do epitélio apresenta maturação desordenada. Enquanto que, quando a espessura total do mesmo está comprometida, porém sem invasão do tecido conjuntivo adjacente ou quando a atipia celular é intensa, mesmo sem comprometimento de toda a espessura epitelial, estaríamos frente a um quadro de carcinoma

in situ.

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Devido à subjetividade dos critérios de avaliação estabelecidos para a classificação da displasia não existe um sistema de gradação ideal que proporcione resultados consistentes e reproduzíveis (Van der WAAL et al, 1997).

Atualmente é bem aceito que a transição de mucosa normal para carcinoma epidermóide é um processo multifatorial extremamente complexo, o que justifica os inúmeros estudos que tentam identificar as alterações na mucosa oral normal que precedem a malignização. O desenvolvimento de alguns tipos de lesões pode representar passos diferentes nesse processo. Quando expostas a fatores carcinogênicos, algumas regiões anatômicas da mucosa oral como as bordas laterais e ventre de língua, assoalho bucal, palato mole, mucosa labial inferior e região retromolar são as mais susceptíveis a alterações displásicas (KUFFER, LOMBARDI, 2002).

Constitui tarefa difícil afirmar se a displasia epitelial severa e o carcinoma in situ

podem ser considerados entidades diferentes ou se a presença de displasia epitelial severa evoluiria para o desenvolvimento de carcinoma invasivo, mais do que a presença do carcinoma in situ (OKAZAKI et al, 2002; PINDBORG, DAFTARY, METHA, 1977).

Segundo Mincer, Coleman, Hopkins (1972) a progressão da displasia epitelial para carcinoma

in situ envolveria a identificação de uma linha divisória entre atipia reversível e carcinoma in situ, porém é precisamente neste instante que reside a dificuldade na obtenção de um

consenso de critérios entre os pesquisadores que auxiliem a identificar tal linha divisória. De acordo com Olever, Mc Donald e Feliz (2000) até hoje não existem marcadores confiáveis para predizer alterações malignas em lesões pré-cancerosas, porém, levando em consideração esse risco de transformação, o diagnóstico clínico e histopatológico de lesões displásicas orais é de suma importância (JABER et al, 2003).

2.2. Matriz extracelular: Considerações gerais

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componentes da MEC obedece a um programa perfeitamente orquestrado, o qual pode variar durante toda a vida do indivíduo (LABAT-ROBERT, 2001).

Segundo Winning e Towsend (2000), são relatados dois tipos de MEC, a matriz intersticial, que compreende todo o material existente entre as células mesenquimais, e a membrana basal, que é a MEC especializada, em forma de lâmina, a qual funciona como arcabouço físico, tendo papel bioativo na regulação do comportamento celular, influenciando seu desenvolvimento, regulação da expressão gênica, compartimentalização do tecido em reservatórios de substâncias produzidas pelas células, bem como medeia a ligação celular e participa da filtração de sais e pequenas moléculas (ALBERTS et al, 2004).

A membrana ou lâmina basal é uma MEC especializada, de estrutura elástica constituída principalmente por densas quantidades de colágenos IV e VI, proteoglicanas, heparan sulfato, condroitin sulfato e glicoproteínas, como fibronectina, laminina, tenascina, entactina (nidogênio) e trombospondina, as quais estão alternadamente dispostas pelas áreas de lâminas lúcida e densa (WILSON et al, 1999). Sua função principal é servir como ancoragem às células epiteliais separando-as do tecido conjuntivo subjacente (KARIYA, MIYAZAKI, 2004; PARK, BISSELL, BARCELLOS-HOFF, 2000).

Durante o processo de proliferação neoplásico, haja vista o papel da MEC como barreira natural, é preciso que ocorra a sua degradação sendo isto realizado pelas enzimas proteolíticas produzidas, principalmente pelas células tumorais, facilitando dessa forma a invasão neoplásica (BRYNE, 1998; De CLERCK, 2000; FODA, ZUCKER, 2001; THOMAS, LEWIS, SPEIGHT, 1999; ZIOBER et al, 2000). A invasão tumoral é acompanhada por

fragmentação, disfunção ou anormalidades da membrana basal, provavelmente devido a uma deposição alterada de seus componentes ou a uma aumentada atividade de proteinases degradadoras da MEC (KOHN, LIOTTA, 1995).

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Durante o desenvolvimento do carcinoma epidermóide oral, o tecido conjuntivo adjacente sofre um variado número de alterações dentre elas a lise do estroma tumoral com degradação da MEC (RICH, READE, 2001; THOMAS, LEWIS e SPEIGHT, 1999), levando a maioria dos autores a considera a degradação do tecido conjuntivo como o caminho preparatório para a invasão tumoral. Alternativamente, este tecido pode ter um papel significativamente mais ativo no processo de carcinogênese, podendo interagir com o epitélio e influenciá-lo diretamente, assim como o faz durante a embriogênese (RICH, READE, 2001).

2.2.1. Colágeno IV, laminina e fibronectina.

A MEC é constituída por uma intrínseca estrutura de proteínas, as quais podem atuar como reguladores de crescimento e diferenciação dos ceratinócitos do epitélio oral; por exemplo, a fibronectina pode inibir a diferenciação terminal dessas células em cultura, e componentes da lâmina basal como a laminina ou o colágeno IV estão envolvidos na determinação do fenótipo epitelial celular (MARAGOU et al, 1999).

Uma das proteínas mais abundantes da MEC é o colágeno, correspondendo a 25% da composição total de proteínas dos mamíferos. Cerca de 20 diferentes genes codificam as diversas formas de colágeno. Os diversos tipos de tecido conjuntivo devem suas características específicas ao tipo de colágeno que possuem, sua quantidade e a outros componentes distribuídos na MEC (ALBERTS et al, 1997). O colágeno tipo I está distribuído por todo o tecido conjuntivo, sendo um dos componentes mais abundantes da MEC intersticial deste tecido (ALBERTS et al, 1997; ZIOBER et al, 2000).

Os colágenos fibrilares englobam os tipos I, II, III, V e XI presentes em pele, mucosas, ossos, ligamentos, vasos e órgãos. Os colágenos associados às fibrilas com tripla hélice ininterrupta agrupam os tipos IX, XII e XIV, localizando-se sobre os colágenos fibrilares e ligando-os entre si e a outros componentes da MEC, sendo encontrados em cartilagens, tendões e ligamentos. Os tipos IV e VII pertencem ao grupo dos colágenos formadores de rede, ricamente presentes nas membranas basais epiteliais (KUHN, 1994; O´TOOLE, 2001).

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colágeno liga-se indiretamente à superfície das células epiteliais, por meio de interações com a laminina e com o colágeno VII. Por outro lado, sua ligação com a matriz intersticial ocorre diretamente com o colágeno I, ou indiretamente, via laminina e fibronectina (AUMAILLEY, ROUSSELLE, 1999; WINNING, TOWNSEND, 2000).

Geralmente, durante a proliferação neoplásica e na migração através da membrana basal, o colágeno IV é degradado pela metaloproteinase do tipo 2 (MMP-2 ou gelatinase A) produzida pelas células epiteliais malignas (De CLERCK, 2000; ELLEBROECK, WU, STACK, 2001; FODA, ZUCKER, 2001).

Sekigushi et al (1995) observaram através de um estudo imuno-histoquímico de alguns tipos de colágeno em carcinoma epidermóide oral de humanos, que o colágeno IV encontrava-se restrito à membrana basal dos ninhos celulares neoplásicos invasivos, com um padrão variando entre descontinuidade e atenuação de expressão.

Hagedorn et al (2001) avaliando a expressão imuno-histoquímica dos colágenos tipo IV, VII e outros componentes da membrana basal em carcinomas de laringe verificaram defeitos na membrana basal peritumoral, associados principalmente a uma perda de expressão mais significativa de colágeno tipo VII do que o tipo IV. No entanto, observaram que mesmo exibindo maior expressão do que o colágeno VII, ainda assim, o colágeno IV mostrava pequena imunorreatividade.

Dentre outras proteínas da MEC avaliadas por Miranda (2002) numa amostra de carcinomas de lábio inferior e de língua, o autor observou ausência de expressão do colágeno IV na membrana basal dos ninhos celulares da maioria da amostra, sugerindo, segundo o autor que esse perfil imuno-histoquímico poderia ser resultante da ação de enzimas proteolíticas produzidas pelas células tumorais que promoveriam a lise e degradação dessa proteína da MEC durante a invasão neoplásica.

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a laminina-5 parece ser o tipo mais comumente produzido por células epiteliais maduras (AUMAILLEY, ROUSSELLE, 1999).

A laminina-5 apresenta uma estrutura molecular constituída por cadeias α3, β3 e γ2 e corresponde à contraparte dos hemidesmossomos na membrana basal (BERNDT et al, 1997; HAAS et al, 2001; WINNING, TOWSEND, 2000). Esta glicoproteína representa o maior substrato insolúvel de ancoragem dos filamentos celulares conectando as células epiteliais à membrana basal, formando um complexo de adesão epitelial (AUMAILLEY, ROUSSELLE, 1999). Porém, tem sido relatado que pode atuar também como fator solúvel, favorecendo a motilidade e conseqüentemente a invasão celular neoplásica (KARIYA, MIYAZAKI, 2004). Este componente da MEC pode ligar-se a ela mesma e formar uma rede com arranjo hexagonal, independente da presença do colágeno IV, com o qual interage indiretamente, formando complexos com o nidogênio. Sua expressão imuno-histoquímica na mucosa oral normal é vista como uma linha contínua e delicada na membrana basal (KAINULAINEN et al, 1997).

A interação das lamininas com as integrinas e outros componentes da superfície celular, lhes confere propriedades de controlar atividades celulares como migração, diferenciação, polarização, proliferação, apoptose e expressão gênica. Algumas isoformas como a laminina 1 e seus receptores são extremamente necessárias durante o período embrionário e morfogenético enquanto que, a laminina-5 é importante nas interações com o complexo de ancoragem, para manter a integridade arquitetural da membrana basal (AUMAILLEY, ROUSSELLE, 1999).

É relatado que a síntese da laminina poderia exercer um papel importante na promoção da invasão celular neoplásica uma vez que, em vários tipos de tumores, esta proteína é sintetizada pelas células neoplásicas dentro de massas tumorais formando uma membrana basal individual circundante nas mesmas, ou em torno de células desgarradas de carcinoma epidermóide oral (BERNDT 1997; HAGEDORN, et al, 2001; MEYER et al, 1985).

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Tosios, Kapranos, Papanicolaou (1998) analisando a expressão da laminina em displasias epiteliais e carcinoma epidermóide oral observaram expressão desta variando de linear a descontinua de acordo com o aumento gradativo da displasia, sendo mais descontínua em áreas de invasão tumoral profunda, do que em áreas centrais ou superficiais.

Berndt et al (2001) constataram que o comportamento invasivo do carcinoma epidermóide oral, entre outros fatores, está associado com a síntese de laminina pelas células tumorais, perda focal da mesma em membrana basal e deposição desta no estroma tumoral imediatamente próximo às células neoplásicas invasoras.

Miranda (2002) observou a predominância da ausência de imunorreatividade para a laminina numa amostra de carcinomas epidermóides de lábio inferior e língua, sugerindo, segundo o autor, que essa ausência estaria associada com uma maior capacidade invasiva das células tumorais, principalmente nos tumores de comportamento biológico mais agressivo como os de língua.

A fibronectina é uma glicoproteína adesiva existente na MEC como dímero constituído por duas longas subunidades ligadas por um par de pontes disulfeto localizadas próximo à carboxila terminal. Cada subunidade é dobrada numa série de domínios funcionais distintos separados por regiões de cadeia polipeptídica flexível. São conhecidos três diferentes tipos de domínios desta proteína; um liga-se ao colágeno, outro à heparina e outro a integrinas específicas da superfície de vários tipos de células (LYONS, CUI, 2000). Sua distribuição tecidual segue a mesma do tecido conjuntivo frouxo, mostrando-se em concentração aumentada nas membranas basais epiteliais (CASELITZ, 1987).

Em humanos são reconhecidos 20 subtipos diferentes da fibronectina, derivados de um único gene por processamento alternativo ou por modificações pós-transcricionais (MANDEL et al, 1994; MOHRI, 1996). Esta proteína liga-se ao colágeno, proteoglicanas e fibrina, através de domínios constituídos por uma seqüência específica de aminoácidos do tripeptídeo arginina-glicina-ácido aspártico (RGD), cuja seqüência é também reconhecida por receptores da superfície celular como as integrinas (ALBERTS et al, 1997), sendo a integrina α5β1

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Andrade et al (2003) dentre outras proteínas avaliou a expressão e distribuição da fibronectina em mucosa oral normal, hiperplasia fibroepitelial inflamatória e displasias epiteliais orais, observando uma expressão semelhante na lâmina própria papilar da mucosa oral normal, da HFIO e das displasias graves num padrão reticular, sugerindo, segundo a autora, a possibilidade do processo de proliferação celular não interferir na localização da fibronectina. Em relação às displasias, segundo a autora, levando em consideração o risco de malignização destas, poder-se-ia sugerir que para que ocorra a proliferação epitelial e invasão do tecido conjuntivo subjacente, seria necessário que houvesse uma maior interação entre estes dois tecidos para promover uma sinalização bioquímica efetiva que estimulasse as células epiteliais a produzirem enzimas proteolíticas da MEC, facilitando assim, a locomoção das células neoplásicas.

Miranda et al (2002) num estudo imuno-histoquímico observaram uma expressão variada da fibronectina em fibromas de células gigantes, hiperplasias fibrosas e fibromas da cavidade oral, sendo esta fraca e moderada nos fibromas de células gigantes e fibromas respectivamente, intensa num padrão fibrilar desorganizado e linear fino no tecido conjuntivo das hiperplasias fibrosas, e descontínua na membrana basal, principalmente nas áreas que exibiam infiltrado inflamatório mononuclear. Tais achados levaram os autores a concluir que nas hiperplasias fibrosas, a expressão da fibronectina poderia sugerir um papel modulador do processo inflamatório.

Num outro estudo, Miranda (2002) observou predominância de uma forte expressão para a fibronectina na membrana basal e no estroma peritumoral de carcinomas epidermóides de lábio e língua, levando o autor a sugerir que essa proteína da MEC poderia estar associada a mecanismos de migração e invasão tecidual pelas células neoplásicas.

A fibronectina é o componente mais abundante na MEC do carcinoma epidermóide (RAMOS et al, 2002), o que somado ao conhecimento de sua capacidade de interação com o colágeno, glicosaminoglicanas, proteoglicanas e fibrinogênio, complementou a concepção da fibronectina como um constituinte da MEC com propriedade adesiva (ROUSLAHTI, 1998). A perda desta proteína na superfície celular no processo de transformação maligna das células tem sido associada à migração neoplásica, contribuindo assim com a invasão tumoral (MEYER et al, 1985). Sua função de adesão celular é comprometida em neoplasias malignas, com conseqüente desprendimento das células tumorais (CASELITZ, 1987).

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normal, estando intensamente expressa na membrana basal e nas células basais epiteliais da displasia severa e do carcinoma epidermóide. A laminina e colágeno IV mostraram marcação intensa e contínua na membrana basal da mucosa normal, sendo expressas de maneira descontínua, delgada e fraca na membrana basal da displasia oral severa e no carcinoma epidermóide.

Segundo Lyons e Cui (2000) e Lyons et al (2001) a isoforma oncofetal da fibronectina está intimamente associada com malignidade em carcinomas orais. Esta isoforma da fibronectina foi demonstrada em íntima relação com o carcinoma epidermóide invasivo e ausente em lesões pré-malignas e epitélio oral normal (MANDEL et al, 1994).

2.3. Integrinas: Considerações gerais.

As moléculas de adesão celular (CAMs) constituem um grupo heterogêneo de receptores da superfície celular, importantes no desenvolvimento de diversos processos fisiológicos e patológicos, tais como divisão, migração, diferenciação celular, apoptose e expressão gênica; além de estarem na superfície celular, as CAMs podem ser armazenadas intracitoplasmáticamente (FREEMONT, 1998; HYNES, 1987; HYNES, 1992; KUMAR, ABBAS, FAUSTO, 2005; LABAT-ROBERT, 2001 e THOMAS, SPEIGHT, 2001). Segundo os autores antes citados, a expressão das CAMs é regulada, controlando assim, subseqüentemente, os processos biológicos celulares. Muitos desses processos, porém, podem ser sub-regulados nas neoplasias malignas, sendo sugerido então que muitas das características das células tumorais tenham origem na expressão aberrante ou na função alterada das CAMs.

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gama específica de ligantes na superfície celular, na MEC ou a proteínas solúveis (BRAKEBUSCH et al, 2002; CALDERWOOD, 2004; SHEPPARD, 2000; WIESNER, LEGATE, FÄSLER, 2005).

Cada subunidade possui um domínio extracelular longo, responsável pelas interações cátion-dependentes com os componentes da MEC e/ou outros receptores da membrana citoplasmática; um domínio transmembrana e um domínio intracitoplasmático curto, o qual atua como mediador das interações com os componentes do citoesqueleto de actina, bem como com proteínas transdutoras de sinais, como as quinases e proteínas ligantes do cálcio (CLARK, BRUGGE, 1995; COPPOLINO, DEDHAR, 2000).

No domínio extracelular de cada subunidade encontra-se a região N-terminal ou “cabeça”, que é o sítio de ligação para as proteínas da MEC, na extremidade do domínio citoplasmático de cada subunidade também encontra-se a região C-terminal ou “cauda” que constitui o ponto de interação das integrinas com as proteínas do citoesqueleto. A adesividade do domínio extracelular é controlada por eventos de ligação da região C-terminal da cauda, dando lugar a mudanças conformacionais através da membrana citoplasmática, as quais são propagadas até a região de contato com o ligante da MEC (LIDDINGTON, BANKSTON, 2000).

O curto domínio citoplasmático de ambas subunidades de integrina não possui função catalítica, mas transmite sinais pela ligação a uma variedade de proteínas efetoras que podem estar direta ou indiretamente associadas ao citoesqueleto de actina (WIESNER, LEGATE, FÄSLER, 2005).

Segundo Liddington e Bankston (2000), é sugerido que o estado de baixa afinidade de adesão da integrina é mais estável na ausência do ligante, sendo o mesmo caracterizado pela ligação das regiões de contato dos domínios citoplasmáticos e/ou extracelulares das cadeias α e β, adotando assim, a integrina a conformação “T” ou fechada. Já na conformação “R” ou aberta, a ligação entre as subunidades α e β é quebrada para propiciar o estado de alta afinidade de adesão de integrina.

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peptídica RGD (Arg-Gly-Asp) que pode ser encontrada em muitas proteínas da MEC (COPPOLINO, DEDHAR, 2000; THOMAS, JONES, SPEIGHT, 1997).

As integrinas exercem um papel adicional alem de serem simples receptores da superfície celular, uma vez que, por intermédio do seu domínio citoplasmático, as mesmas ligam a MEC ao citoesqueleto, interagindo com os componentes deste, dando lugar a complexos mecanismos moleculares conhecidos como transmissão de sinais bioquímicos, os quais ocorrem num sentido bidirecional, constituindo assim, as denominadas sinalização

inside-out e sinalização outside-in, estes processos modulam a conformação estrutural e

função das integrinas e conseqüentemente, o comportamento biológico celular (CARY, GUAN, 1999; CLARK, BRUGGE, 1995; COPPOLINO, DEDHAR, 2000; CROSS, BURY, 2003; LIU, CALDERWOOD, GINSBERG, 2000; O´TOOLE, 2001; WIESNER. LEGATE, FÄSLER, 2005).

Na sinalização outside-in, a adesão do ligante à integrina promove a transmissão de

sinais para o interior da célula, resultando na reorganização do citoesqueleto, expressão gênica e diferenciação celular. Já na sinalização inside-out os sinais produzidos no meio

intracelular podem ser propagados através das integrinas e regular sua afinidade pelo ligante na MEC (LIU, CALDERWOOD, GINSBERG, 2000).

Embora seja preponderante o papel de integrinas na transmissão de sinais, segundo Cary e Guan (1999) tal função não sería possível sem a participação de proteínas citosólicas conhecidas como kinase de adesão focal (FAK), que junto com as integrinas constituem as denominadas adesões focais.

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A sinalização mediada pelas integrinas pode exercer algum papel na manutenção do ciclo celular, representando isto um mecanismo básico pelo qual estas moléculas de adesão promoveriam a sobrevivência celular (STUPACK, CHERESH, 2002).

Em relação ao processo de migração celular, a interação da integrina com a FAK promoveria a fosforilação da proteína p130cais contando ainda essa via de sinalização com a participação de outras proteínas citosólicas. Finalmente, os mecanismos de regulação da apoptose tampouco estão bem estabelecidos, porém é sugerido que a integrina ativaria a FAK e esta por sua vez interagiria coma proteína PI3K e provavelmente com a AKt, e conseqüentemente a cadeia de transmissão dos sinais progrediria com a participação de outras proteínas dando como resultado a sobrevida da célula (CARY, GUAN, 1999).

Por outro lado, segundo Kumar, Abbas e Fausto (2005) as integrinas podem promover interações com receptores de fatores de crescimento e conseqüentemente transmitir sinais

outside-in, tendo como objetivo regular a proliferação celular, apoptose e diferenciação.

Sugere-se que algumas integrinas possam funcionar como biossensores, ou seja, quando estiverem ligadas a uma matriz insolúvel, proporcionariam um mecanismo de ancoragem à MEC e ativariam sinais de sobrevivência. Porém quando os ligantes estiverem ausentes, ou na presença de um ligante solúvel endógeno ou um antagonista terapêutico, as integrinas ativariam as vias de morte celular. Integrinas não ligadas poderiam propiciar a “morte celular mediada por integrinas”, atuando assim como reguladores negativos da sobrevivência celular, uma vez que as integrinas não ligadas poderiam promover a apoptose através do recrutamento de caspase-8 na membrana plasmática independentemente de receptores de morte ou FADD (Fas-associating protein with a death domain) e induzir uma

forma diferente de morte celular denominada anoikis que se dá pela falta ou perda de adesão

celular (STUPACK et al, 2001)

De acordo com Stupack e Cheresh (2002), mesmo tendo um papel na prevenção da apoptose pela manutenção da função celular normal, as integrinas podem também estar implicadas na resistência a estímulos apoptóticos, particularmente a sinais que ativam a via intrínseca de morte celular, também conhecida como via do stress ou via mitocondrial. Nesse

contexto, é relatado que as integrinas preservam a viabilidade celular em resposta ao stress em

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As neoplasias malignas são caracterizadas pela invasão da célula neoplásica no tecido conjuntivo subjacente e pela sua capacidade de metástase à distância. Esses processos envolvem alterações nas interações célula - célula e célula-MEC, as quais podem estar associadas com alterações na expressão ou função das integrinas. O fenômeno de migração é iniciado pela proliferação celular e modificações morfológicas na membrana plasmática tais com as fímbrias ou protrusões. As integrinas teriam o papel de fixar essas fímbrias ou prolongamentos à MEC e promover a interação com os filamentos de actina do citoesqueleto, desencadeando assim, a associação de diferentes moléculas sinalizadoras aos contatos focais célula-MEC; seguidamente, os sinais transmitidos através das integrinas estimulam a contração celular, permitindo o movimento do corpo celular através dos contatos adesivos; finalmente, a polo apical da célula destaca-se do substrato pela inativação das integrinas e o desarranjo do complexo de adesão. Posteriormente, numa outra fase do processo, as integrinas facilitariam o movimento celular através da MEC ativando enzimas degradantes das suas proteínas. (CORD et al, 2000).

Tem sido relatado que as funções das integrinas podem ser moduladas através da ligação destas com outras integrinas, podendo ainda ligar-se a receptores de fatores de crescimento, no intuito de regular os processos celulares, sendo assim, as integrinas podem potencializar os efeitos sinalizadores dos fatores de crescimento exercendo desta forma uma ação conjunta na regulação do ciclo e migração celular (SIEBER et al. 2005).

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2.3.1. Integrinas αααα2ββββ1, αααα3ββββ1 e αααα5ββββ1.

As integrinas α2β1, α3β1 e α5β1 são geralmente expressas nos epitélios pavimentosos

estratificados, mediando adesões célula-célula, célula-MEC. O padrão de diferenciação e ceratinização epitelial difere em diversas regiões do epitélio da mucosa oral e isto pode ser refletido na variação da expressão sítio-específica das integrinas (KAWANO et al, 2001).

A integrina α2β1 é descrita como receptor para colágeno e laminina e funciona não só

como receptor para essas proteínas na membrana basal, mas também como organizadora da MEC, moduladora da migração celular, na organização do citoesqueleto e na produção de metaloproteinases, podendo muitas dessas funções estar relacionadas à sua capacidade de associar-se com outras proteínas transmembranares (HEMLER, RUTISHAUSER, 2000). A integrina α2β1 pode interagir heterotípicamente com a E-caderina para regular o processo de

adesão celular e conseqüentemente a estratificação ou manutenção do arranjo arquitetural do epitelio (JENSEN, WHEELOCK, 1995; WHITTARD et al, 2002).

A integrina α3β1 está localizada numa posição basolateral nos ceratinócitos basais,

sendo relatada como receptor para fibronectina em alguns tipos celulares, porém atua principalmente como receptor da laminina-5 e do colágeno em menor escala (KREIDBERG, 2000). Tem sido relatado que esta integrina além de exercer um papel na adesão e migração celular, pode interagir com a laminina-5 estimulando a proliferação celular através da ativação de proteínas kinases mitógeno-ativadas (MAP-Kinases), favorecendo a migração e diferenciação dos ceratinócitos basais em contato com a MEC (DI PERSIO et al, 1997; GONZÁLEZ et al, 1999).

Esta integrina pode servir como receptor secundário na organização da MEC participando do arranjo inicial da membrana basal pela ligação à laminina-5 ou outras proteínas da MEC durante seu processamento ou recrutamento para os sítios de adesão celular. Pode ligar-se à laminina-5 ou outras proteínas da MEC na membrana basal pré-formada, no sentido de estabilizar as interações primárias das células com a MEC exercida pela α6β4 nos hemidesmossomos, sendo assim, a α3β1 seria requisitada para manter a

integridade da membrana basal independentemente do seu arranjo estrutural inicial.

Além do antes citado, as interações da α3β1 com os ligantes da membrana basal podem

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promovendo a atividade de MMPs ou outras enzimas degradantes da MEC (DI PERSIO et al, 1997). Neste sentido tem sido relatado que esta integrina pode modular a migração e invasão de células neoplásicas induzindo a produção e/ou ativação de MMPs 2 e 9, participando portanto da organização e remodelação da MEC (DYCE et al, 2002; GIANNELLI et al, 2002; HEMLER, RUTISHAUSER 2000).

Por outro lado, estudos têm mostrado uma reduzida expressão da integrina α3β1 em

tumores de origem epitelial, sugerindo que a interação desta molécula com a membrana basal poderia levar à transdução de sinais que inibem o comportamento invasivo das células epiteliais (KREIDBERG, 2000). Segundo o autor antes citado, a integrina α3β1 exerce um

papel muito mais complexo daquele de simples receptor para membrana basal, podendo também, modular a adesão, migração e organização citoesquelética; além de interagir com proteínas transmembranares da família da tetraspanina, com as quais pode formar complexos envolvidos na transdução de sinais.

A informação antes citada é reforçada por Darribère et al (2000) ao comentarem que a perda da expressão de integrina α3β1 pode comprometer a estrutura organizacional da

membrana basal epidérmica, promovendo com isto perda da integridade desta estrutura e conseqüentemente a perda de ancoragem celular devido à possível dimerização da subunidade α3 com a β1 para constituírem um receptor para a laminina e entactina. Ainda nesse tema, uma

reduzida expressão desta integrina tem sido relatada em associação a perda de fibronectina em lesões altamente metastáticas (KAWANO et al, 2001).

É relatado que as integrinas constituem os principais receptores de adesão celular à MEC, estando envolvidas na transmissão de sinais “outside-in” da MEC que inibem a apoptose e promovem a sobrevida celular (GIANCOTTI, ROUSLAHTI, 1999; HINES, 2000). Neste sentido, segundo Manohar et al (2004) a integrina α3β1 torna as células menos

susceptíveis a apoptose através da supressão da ativação da caspase-3 e ativação da sinalização de kinases de adesão focal (FAK) e das kinases reguladas por sinais extracelulares (ERK) dependentes da kinase mitógeno-ativada MEK. Sinalização esta que seria translocada para o núcleo celular onde ativariam a transcrição de genes que promovem a sobrevida celular.

As células epiteliais podem interagir com a laminina por meio de integrinas de vários tipos, principalmente a α3β1 e a α6β4, fazendo ligações célula-célula e célula-MEC,

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carcinoma epidermóide oral pobremente diferenciado ocorre pronunciada perda de expressão da laminina e seus receptores do tipo integrinas α e β, quando comparado com lesões pré-malignas e tecidos alterados por processos inflamatórios.

Já a integrina α5β1 é um receptor principal para fibronectina, cuja expressão aberrante

têm sido associada com tumorigenicidade. As células malignas, geralmente, são rodeadas pela MEC com baixa expressão da fibronectina e da integrina α5β1, a qual participa da

incorporação da fibronectina à MEC (LABAT-ROBERT, 2002; ROMBERGER, 1997). A integrina α5β1 liga-se à fibronectina através da seqüência RGD, porém, também possui um

sítio sinérgico separado na molécula dessa proteína da MEC, conferindo à célula um maior potencial de migração pelo aumento do nível de ligação, uma vez que quanto maior a afinidade da integrina pelo seu ligante, maior a capacidade migratória celular (ROBINSON et al, 2003).

Considerando a expressão de receptores para fibronectina em células embrionárias, segundo Pignatelli et al (1990) e Cavani et al (1993), o aumento numérico de células α5

positivas em CEOs pobremente diferenciados com intensa atividade proliferativa pode ser explicado como uma correlação do aumento da imaturidade celular, ou seja, um ressurgimento das propriedades embrionárias nas células tumorais.

Segundo Koivisto et al (2000) tem sido relatado que as células de CEOs podem usar cooperativamente outras integrinas, além da α5β1 na interação com a fibronectina da MEC

uma vez que, tais células poderiam adaptar-se adquirindo certa versatilidade de ligação mediante a utilização de diferentes integrinas para essa proteína da MEC e facilitar desta forma sua migração.

Por outro lado, Labat-Robert (2002) comenta que a expressão da α5β1 exerce um papel

no crescimento, migração e tumorigenicidade através da deposição ativa de fibronectina na MEC, promovendo desta forma sua remodelação. Comentam ainda esses autores que esta molécula pode inativar genes de proliferação celular como c-fos, c-jun e junB, e desta forma