FRACIONAMENTO DO VENENO
C R O T A L U S DURISSUS TERRIFICUS
POR
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSÃO MOLECULAR (*)
Augusta Kiyomi TAKEDA (1), Sônia França Correia BARBOSA (2), Lucinda Maria da COSTA (3) e Maria das Graças Fernandes ADELINO (4)
R E S U M O
A t r a v é s da técnica d e c r o m a t o g r a f i a de exclusão m o l e c u l a r utilizando Se¬ phadex G-75 f o r a m estudadas as diferentes frações d o veneno d e Crotalus du¬ rissus terrificus, u m a das serpentes peçonhentas mais comuns no Brasil. F o r a m o b t i d o s 4 p i c o s ( c o r r e s p o n d e n t e s às frações 32, 60, 86 e 103) c o m peso m o l e c u l a r v a r i a n d o de 4.000 a 150.000. A s frações d e t o d o o d i a g r a m a de gel filtração f o r a m tríadas através de r e a ç ã o d e i m u n o e l e t r o f o r e s e a f i m de se v e r i f i c a r suas cargas e v e l o c i d a d e de m i g r a ç ã o . A s linhas de p r e c i p i t a ç ã o encontradas f o r a m compa-radas às 11 linhas apresentadas pela reação de i m u n o e l e t r o f o r e s e d o veneno total contra o s o r o anti-crotálico. Constatou-se que as frações de u m m e s m o p i c o apresentavam características p r ó p r i a s c o m e x c e ç ã o da fração 54 (subida d o p i c o I I ) que m o s t r o u diferenças significativas e m relação à fração 60. A p ó s a tria-g e m f o r a m escolhidas as frações d e cada p i c o onde as linhas de p r e c i p i t a ç ã o fo-r a m mais nítidas e intensas, p a fo-r a estudo d e identidade atfo-ravés da fo-reação d e difusão radial dupla e letalidade c o m p a r a d a a concentração de 0,0625 m g / m l d o v e n e n o total que c o r r e s p o n d e a D L5 Ü e m c a m u n d o n g o p e l o m é t o d o de S P E A R M
& K A R B E R . A s frações 32, 86 e 103 c o r r e s p o n d e n t e s r e s p e c t i v a m e n t e aos p i c o s I , I I I e I V a p r e s e n t a r a m letalidade nula ou negligenciada e a fração I I f o i a mais tóxica.
I N T R O D U Ç Ã O
E n t r e m u i t a s espécies d e serpentes peço-nhentas encontradas no Brasil, Crotalus duris-sus terrificus "> é u m a das m a i s c o m u n s . D a d o s da O r g a n i z a ç ã o M u n d i a l da Saúde m o s t r a m que 74% das v í t i m a s s u c u m b e m na ausência de tra-t a m e n tra-t o enquantra-to que nos pacientra-tes que rece-b e m s o r o anti-veneno a m o r t a l i d a d e tende a cair para 12% 5
. A s o r o t e r a p i a é p o r t a n t o o úni-c o m e i o efiúni-caz de t r a t a m e n t o3
.8
.1 1
e m b o r a não seja possível assegurar que os d i v e r s o s consti-tuintes d o veneno s e j a m neutralizados, d e v i d o à dose d o s o r o anti-veneno administrada ser fi-xada de m a n e i r a arbitrária.
N ã o existem, ainda, p r o v a s de l a b o r a t ó r i o que p e r m i t a m m e d i r c o m segurança a concen-tração d o v e n e n o , tanto circulante c o m o no te-cido após o t r a t a m e n t o c o m s o r o anti-veneno, p o d e n d o assim assegurar a neutralização d o m e s m o .
De outra feita, é p r e o c u p a ç ã o da Organiza-ção M u n d i a l da Saúde o p r o b l e m a d e reações precoces tipo anafiláticos que se o b s e r v a m e m pessoas tratadas c o m s o r o anti-veneno, d e v i d o a fatores tais c o m o : natureza d o s o r o , dose, via
(*) Realizado na Seção de Imunologia do Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, Brasil (1) Pesquisador Científico Nível V
(2) Pesquisador Científico Nível I (3) Biologista
e m o d o d e administração e e x p o s i ç ã o a estas substancias sensibilizantes.
É d e grande interesse o estudo das fra-ções ou características d o s o r o , responsáveis p o r estas desvantagens e, especialmente se os fatores sensibilizantes estão ou não ligados aos a n t i c o r p o s p r o t e t o r e s .
P o r t a n t o , para que se conheça m e l h o r os aspectos acima r e f e r i d o s é necessário que se estude as características químicas e b i o l ó g i c a s d o v e n e n o Crotalus durissus tcrrificus e que se obtenha u m v e n e n o p a d r ã o , que a l é m disso possibilitará a obtenção de s o r o s m o n o e s p e c í -ficos e l i m i n a n d o acidentes indesejáveis c o m a administração d e s o r o s p o l i v a l e n t e s .
N e s t e trabalho, p r o p o m o - n o s a estudar as diferentes frações d o v e n e n o Crotalus durissus terrificus obtidas p o r gel filtração e m Sephadex G 7 5 super fino através d e i m u n o e l e t r o f o -rese, imunodifusão dupla radial e letalidade c o m p a r a d a c o m D L5 0 d o v e n e n o total e m
ca-m u n d o n g o s N H I - N de 15 g d e a c o r d o c o ca-m o m é t o d o S P E R M A N «fe K A R G E R da O r g a n i z a ç ã o Mundial da S a u d e4
.
M A T E R I A L E M É T O D O S
E m p r e g o u - s e 250 m g d o v e n e n o de Crotalus durissus terrificus o b t i d o e m 1982 ( I n s t i t u t o Butantan — S ã o P a u l o — B r a s i l ) secos a vá-cuo e c o n s e r v a d o s a 5°C, que f o r a m d i s s o l v i d o s e m 5 m l de acetato de a m ó n i a 0,2M p H 7,0. Esta a m o s t r a f o i fracionada e m coluna de 2,5 c m de d i â m e t r o p o r 72 c m de altura c o m Sephadex G-75 super fino ( P h a r m a c i a F i n e Chemicals A B , Uppsala, S w e d e n ) . O eluente usado f o i acetato de a m ó n i o 0,2M p H 7,0 e as frações de 4 m l e r a m coletadas e m intervalos d e 30 m i n u t o s p o r m e i o d e u m c o l e t o r a u t o m á t i c o ( T o y o - S F 160K) à t e m p e r a t u r a de 4°C. O s eluatos f o r a m lidos a 280 n m e m e s p e c t o f o t ô m e t r o ( V a r i a m — Série 634 U V - V I S ) , t e n d o sido calculado o peso m o l e c u l a r das frações colhidas e analisa-das segundo seu perfil i m u n o e l e t r o f o r é t i c o e le-talidade e m c a m u n d o n g o s . Os pesos molecula-res f o r a m e s t i m a d o s p o r gel filtração i usando p a d r õ e s d o K i t de calibração d e peso molecu-lar ( P h a r m a c i a Fine Chemicals A B , Uppsala, S w e d e n ) .
Imunoeletroforese
A reação de i m u n o e l e t r o f o r e s e9
f o i feita c o m agarose a 1% e m T a m p ã o T r i s HC1 p H 8,6 n 0,6 e m fonte estabilizada d e e l e t r o f o r e s e
( F a n e m 1050) contra t a m p ã o T r i s HC1 p H 8,6 ii 0,113. F o i utilizado suporte c o n t e n d o 6
lâ-minas de 26 x 76 c m espessura 0,8 — 1,0 m m sobre o qual f o r a m depositados 30 m l d e aga-rose acima citada e analisando-se seis frações e m cada placa. Cada fração f o i testada frente ao v e n e n o total na concentração d e 10 m g / m l . O t e m p o de c o r r i d a f o i de 50 m i n u t o s c o m cor-rente de 10 m A colocando-se e m seguida o s o r o anti-veneno c r o t á l i c o d o Instituto Butantan, lo-te 8210003, deixando-se p o r 20 horas e m difusão e m c â m a r a úmida.
A análise d e identidade das linhas d e pre-cipitação das frações f o i feita utilizando-se pla-ca de i m u n o e l e t r o f o r e s e de 18 x 11 c m e m 40 m l d e agarose c o r r i d a s durante 1:30 hs c o m 20 m A e difusão de 48 hs e r e a ç ã o d e imunodifu-são.
T o d a s as reações f o r a m coradas c o m n e g r o de a m i d o .
Reação de difusão radial d u p l a2
Realizada e m placa de P e t r i , nas quais fo-r a m c o l o c a d a s 10 m l de agafo-rose 1% e m solução fisiológica 0,85%. Os orifícios m e d i a m 8 m m de d i â m e t r o , c o n t e n d o 70 /ã das frações a se-r e m analisadas e d o v e n e n o c se-r o t á l i c o total nas concentrações d e l m g / m l . N o o r i f í c i o central foi c o l o c a d o s o r o anti-crotálico d o Instituto Bu-tantan s e m diluir. A s placas f o r a m deixadas p o r 48 h o r a s e m c â m a r a ú m i d a e coradas c o m ne-g r o de a m i d o 1%.
Letalidade
A D L5 0 d o v e n e n o c r o t á l i c o total f o i
calcu-lada e m c a m u n d o n g o s N H I - N ( I n s t i t u t o Adolfo L u t z — S ã o P a u l o — B r a s i l ) d e 15 g p e l o mé-t o d o de S P E A R M & K Â R B E R4
.
A s frações analisadas f o r a m inoculadas e m concentrações p r ó x i m a s à concentração obtida na D L5 0 e m c a m u n d o n g o s da m e s m a cepa,
R E S U L T A D O S
A t r a v é s da técnica de f r a c i o n a m e n t o e m Se-p h a d e x G-75 suSe-per fino í o r a m o b t i d o s 4 Se-p i c o s ( f r a ç õ e s n.° 32, 60, 86 e 103) cujos pesos m o -leculares f o r a m de 150.000, 39.000, 10.000 e 4.000 r e s p e c t i v a m e n t e ( F i g . , 1 ) . Estas m e s m a s frações f o r a m analisadas através da técnica d e imu-n o e l e t r o f o r e s e , c o m a fiimu-nalidade de se estudar
quanto à sua pureza, c a r g a e v e l o c i d a d e de mi-g r a ç ã o , t o m a n d o c o m o p a r â m e t r o o v e n e n o bru-to ou bru-total ( P i g s . 2 e 3 ) . Constabru-tou-se que as frações de u m m e s m o p i c o p o s s u i a m caracte-rísticas p r ó p r i a s c o m e x c e ç ã o da fração 54 que m o s t r o u diferenças significativas q u a n d o com-p a r a d a a da fração 60, d o m e s m o com-p i c o . D e a c o r d o c o m esta técnica f o i v e r i f i c a d a a exis-tência no v e n e n o bruto, de 11 linhas d e preci-pitação.
A fração n ú m e r o 32 apresenta 2 linhas de p r e c i p i t a ç ã o sendo que u m a delas m i g r a p a r a a r e g i ã o d o c á t o d o e a o u t r a p e r m a n e c e n o pon-to d e aplicação. N a fração n ú m e r o 54 f o r a m detectadas 4 linhas d e p r e c i p i t a ç ã o correspon-dentes às linhas 2, 8, 9 e 11 d o v e n e n o b r u t o . A f r a ç ã o 60 apresenta 3 linhas, sendo que a 11 e 9 f o r a m c o m u n s à fração 54; p o r é m , apre-sentou a linha n.° 5 n ã o e n c o n t r a d a nas d e m a i s . A f r a ç ã o 86 apresentou, a l é m da linha n.° 11 c o m u m às f r a ç õ e s 54 e 60, as linhas específicas n.° 3 e 4. F i n a l m e n t e , a fração 103 apresentou u m a única linha, a n ú m e r o 1.
A F i g . 3 m o s t r a as linhas d e p r e c i p i t a ç ã o de cada f r a ç ã o correlacionando-as c o m as obti-das d o v e n e n o total frente a o s o r o anti-crotáli-c o .
A r e a ç ã o de imunodifusão radial dupla das frações contra o s o r o anti-crotálico, c o n f i r m a os dados o b t i d o s na reação de i m u n o e l e t r o f o
-rese, quanto a características p r ó p r i a s das mes-m a s ( F i g . 4 ) .
A s linhas de p r e c i p i t a ç ã o da f r a ç ã o 32 n ã o m o s t r a m identidade c o m n e n h u m a o u t r a fração ( F i g . 4 A ) . Já a fração 54 apresenta duas li-nhas d e p r e c i p i t a ç ã o c o m identidade total c o m as linhas da fração 60, sendo que u m a delas t a m b é m apresenta esta i d e n t i d a d e c o m a linha apresentada pela fração 86, p o s s i v e l m e n t e sen-do a linha n." 11 o b s e r v a d a na r e a ç ã o de imu-n o e l e t r o f o r e s e .
A s frações que a p r e s e n t a r a m na reação d e i m u n o e l e t r o f o r e s e linhas d e p r e c i p i t a ç ã o nas m e s m a s r e g i õ e s n ã o a p r e s e n t a r a m nenhum ti-p o de identidade f o r a as a c i m a m e n c i o n a d a s
( F i g s . 4B e C ) .
Quanto à letalidade das f r a ç õ e s ( T a b e l a I I ) , c o m p a r a d a c o m a D L5 0 d o v e n e n o b r u t o (0,0625
Fi8. 2 — Placa das ImunoHetro-[Oram <mi placas de 11 x 18 cmi do veneno crotállco total e das írações 32, 64. BO, 83 e 103 frente ao soro anti crotállco do instituto Butantan, onde sflo analisadas as caracl£rislica>. imunoeletrolitlcas de
rada fração
u m a l t o puder letal nas frações 54 e 60, a m b a s pertencentes a o p i c o I I responsável pela
mor-talidade do t o d o s os animais, a 1." e m 3 horas e a 2." n u m p e r í o d o d e 18 horas. A fração 103 d o p i c o I V m o s t r o u letalidade bastante redu-zida, p o i s o c o r r e u apenas u m c a s o d e ó b i t o a p ó s a inoculação d e uma concentração d e 0.0906 m g / m l no p e r i o d o d e 2 horas e o u t r o c o m
m e n o r concentração 10,0629 m g / m H 18 horas a p ó s . T o d o s os s o b r e v i v e n t e s f o r a m o b s e r v a d o s p o r 72 h o r a s .
D I S C U S S Ã O
o u t r o s c o m p o n e n t e s que são bastante hábeis e m solução; l o g o , as técnicas d e separação que m e l h o r se a d a p t a m a estas características são as de exclusão m o l e c u l a r e m S e p h a d e x2
.
G R I L L O & S C A N O N E « utilizando o Sepha-dex G-100 p a r a fracionar o v e n e n o d o Crotalus durissus cumanensis, conseguiu o b t e r e m u m d i a g r a m a d e f r a c i o n a m e n t o v á r i o s picos, sendo que as frações de m a i s alta letalidade f o r a m en-contradas e m três deles c o m peso m o l e c u l a r iguais a 25.000, 14.500 e 5.200.
Os p i c o s de altos P M (150.000 e 90.000) nos quais se c o n c e n t r a m a m a i o r i a das enzimas, n ã o a p r e s e n t a r a m atividade tóxica, o m e s m o acon-tecendo c o m c o m p o n e n t e s dos p i c o s de pesos m o l e c u l a r e s m e n o r e s (5.000).
N o presente trabalho e n c o n t r a m o s ativida-des letais nas frações c o m P M d e 30.000, sendo
O v e n e n o total apresentou, frente a o s o r o anti-crotálico, 11 linhas d e p r e c i p i t a ç ã o c o m cargas e v e l o c i d a d e s de m i g r a ç ã o diferentes.
À s frações não tóxicas c o r r e s p o n d e r a m as linhas 3, 4, 6, 10 e 11 e, às tóxicas p r o v a v e l -m e n t e as linhas 2, 5, 8 e 9.
P o s s i v e l m e n t e as frações responsáveis p o r f o r m a ç ã o d e a n t i c o r p o s p r o t e t o r e s s e r i a m as dos determinantes antigênicos que r e a g i r a m c o m o s o r o anti-crotálico d a d o as linhas d e pre-cipitação 2, 8 e 9, p o i s a f r a ç ã o que as c o n t é m , a de n.° 54, é m a i s tóxica que a 60, u m a v e z que a linha 2 é m a i s imunogênica e a linha 9 está presente nas duas frações tóxicas.
Os dados d e i m u n o e l e t r o f o r e s e f o r a m con-f i r m a d o s p e l a imunodicon-fusão radial dupla, sen-d o v e r i f i c a sen-d o que as sen-duas frações c o m ativi-dade letal (54 e 60) a p r e s e n t a r a m identiativi-dade to-tal e m 2 linhas, u m a das quais corresponden-d o a linha corresponden-de n ú m e r o 11, pois apresentara icorresponden-den- iden-tidade total c o m u m a das linhas da fração 86.
Diante destes dados o b t i d o s e s t a m o s no presente m o m e n t o inoculando coelhos p a r a ob-tenção d e anti-soro específico p a r a as frações 54 e 60, a f i m d e estudar m e l h o r a atividade imunogênica e p r o t e t o r a .
p a d r o n i z a r m e l h o r o v e n e n o p a r a ser utiliza-d o n ã o só n o c o n t r o l e utiliza-d o s s o r o s h i p e r i m u n e s c o m o t a m h é m m e d i r a concentração d e v e n e n o n o sangue circulante e p o d e r o r i e n t a r m e l h o r a clínica terapêutica.
S U M M A R Y
Fractionation of Crotalus durissus terrificus of chromatography technique toy molecular
exclusion
B y m e a n s of c h r o m a t o g r a p h y technique b y m o l e c u l a r exclusion using S e p h a d e x G-75 w e r e studied different fractions o f v e n o m Crotalus durissus terrificus, o n e the m o s t c o m m o n poi-sonous snakes in B r a z i l .
I t w e r e o b t a i n e d f o u r p e a k s r e l a t e d t o frac-tions 32, 60, 86 and 103, w h i c h m o l e c u l a r w e i g h t v a r i e d f r o m 4.000 t o 150.000.
T h e fractions o f all g e l filtration d i a g r a m w e r e screened t h r o u g h I m m u n o e l e c t r o p h o r e s i s , in o r d e r t o v e r i f y its charges and m i g r a t i o n speed. T h e p r e c i p i t a t i o n lines w e r e c o m p a r e d w i t h 11 lines o b t a i n e d t h r o u g h I m m u n o e l e c t r o -phoresis o f t o t a l v e n o m against anti-Crotalus durissus terrificus serum. I t w a s o b s e r v e d that fractions of s a m e p e a k p r e s e n t e d peculiar cha-racteristics e x c e p t fraction 54 ( c o r r e s p o n d i n g t o the ascending of peak I I ) , w h i c h s h o w e d sig-nificant d i f f e r e n c e s w h e n c o m p a r e d w i t h frac-t i o n 60.
A f t e r screening, fractions o f each p e a k w e r e chosen in o r d e r t o identify m e a n s o f double ra-dial diffusion test and t h e letality w a s compar-e d w i t h 0,0625 m g / m l c o n c compar-e n t r a t i o n o f total v e n o m , w h i c h c o r r e s p o n d s t o D L5 0 in m i c e b y
S P E A R M & K A R B E R m e t h o d .
or negligibe lethality, and fraction I I w a s the m o s t t o x i c .
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