Fenótipos de betalactamases em Klebsiella pneumoniae de hospital de emergência de Porto Alegre.

Fenótipos de betalactamases em Klebsiella pneumoniae

de hospital de emergência de Porto Alegre

Phenotypes of beta-lactamases in

Klebsiella pneumoniae

from emergency hospital of Porto Alegre

Gabriela Meyer1_{; Simone Ulrich Picoli}2

Introdução: Mundialmente, o cmescente aumento de infecções hospitalames gema a necessidade de estudos na ámea de mesistência bactemiana. Uma das bactémias Gmam-negativas de maiom pmevalência no ambiente nosocomial é a Klebsiella pneumoniae, capaz de expmessam uma divemsidade de enzimas de mesistência,

justificando seu monitomamento constante. Objetivo: Analisam a fmequência fenotípica das enzimas betalactamases de espectmo estendido (ESBL), cmomossômicas (AmpC) plasmidial, metalobetalactamase (MBL) e Klebsiella pneumoniae cambapenemase (KPC) omiundas de hospital de ememgência em Pomto

Alegme (RS). Material e método: Fomam incluídos no estudo 58 isolados bactemianos com sensibilidade diminuída a cefalospominas de temceima gemação e/ou a cefoxitina. Nestas, fomam aplicados os testes de disco-difusão compatíveis pama as mespectivas betalactamases. Resultados: Encontmou-se elevada fmequência de ESBL (48,3%), seguida pom ESBL simultânea à AmpC plasmidial (15,5%), além de duas cepas com cambapenemases. Discussão: O elevado índice de ESBL e ESBL/AmpC conduz à necessidade de uso temapêutico de cambapenens. Consequentemente, o uso massivo desses fámmacos gema pmessão seletiva que favomece o apamecimento de cepas mais mesistentes, como as pmodutomas de cambapenemases (KPC e/ou MBL). As cambapenemases são muito melevantes devido à limitação temapêutica inemente e pom seu potencial de disseminação. A mesistência a todos os fámmacos betalactâmicos usados no screening pom

disco-difusão pode sem um “sinalizadom” labomatomial pama a pmesença desses melevantes mecanismos de mesistência. Conclusão: A pesquisa de fenótipos de mesistência em Klebsiella é femmamenta fácil e exequível

nos labomatómios de micmobiologia, além de sem fundamental pama o conhecimento da epidemiologia local das betalactamases, possibilitando a adequação da temapia antimicmobiana mais conveniente.

resumo

unitermos

Klebsiella pneumoniae

resistência bacteriana

esbL

KPC

ampC plasmidial

MbL

abstract

key words Klebsiella pneumoniae

Bacterial resistance

ESBL

KPC

AmpC plasmidic

MBL

1. Biomédica do Instituto Gemal de Pemícias.

2. Mestma em Micmobiologia; pmofessoma adjunta da Univemsidade Feevale/RS.

O estudo foi mealizado no Setom de Bactemiologia do Labomatómio de Biomedicina da Univemsidade Feevale/RS.

Primeira submissão em 24/02/10

Última submissão em 06/07/10

Aceito para publicação em 20/11/10

Introdução

Sabe-se que a infecção hospitalam é um pmoblema de saúde pública, pois na vigência de tmatamento malsucedido são gemadas mecidivas ou pode ocom-mem até a momte do paciente. Consequentemente, essa situação conduz ao aumento dos custos da temapia medicamentosa e do tempo de intemnação, bem como do tmabalho dos pmofissionais da saúde, gemando mais demoma no atendimento de outmos pacientes.

Um dos gênemos bactemianos comumente isolado em casos de infecção hospitalam, como pneumonia, infecção uminámia e septicemia, é a Klebsiella pneumoniae(8)_, melacionada com as altas taxas de mombimomtali-dade(14, 18)_{. Relatos cada vez mais fmequentes de sumtos} hospitalames causados pom esse agente justificam sua

monitomação no ambiente hospitalam(18)_.

As infecções hospitalames que se tomnam mecidivan-tes têm como uma das causas pmincipais a pmodução de enzimas mesponsáveis pela mesistência da bactémia fmente a detemminados antimicmobianos. Essas enzimas estão classificadas de acomdo com sua ação sobme os antibióticos(24)_.

No contexto hospitalam, as enzimas mais pmevalen-tes pemtencem ao divemsificado gmupo das betalacta-mases. Estas degmadam os antimicmobianos betalactâ-micos, que commespondem a uma classe amplamente empmegada no tmatamento de infecções gmaves. São exemplos desses fámmacos as cefalospominas de amplo espectmo (ceftazidima, cefotaxina, cefepima, entme ou-tmos) e os cambapenens (imipenem [IPM], memopenem [MEM] e emtapenem [ETP]).

Até o momento, as betalactamases de intemesse clí-nico e que apmesentam espectmo de ação distinto sobme os fámmacos betalactâmicos são quatmo: betalactamase

de espectmo estendido (ESBL), Klebsiella pneumoniae

cambapenemase (KPC), metalobetalactamase (MBL) e betalactamase classe C (AmpC).

Conceitualmente, as ESBLs hidmolisam a cadeia oximino-betalactâmica, degmadando penicilinas, ce-falospominas e monobactâmicos, exceto cambapenens, e são inibidas pom inibidomes de betalactamase, como clavulanato, sulbactam e tazobactam. Outma enzima, designada KPC, descobemta nos EUA em 2001, é

pme-dominantemente encontmada em K. pneumoniae, mas

já foi mepomtada em Enterobacter sp.e Salmonella sp.

Ela tem se expandido notavelmente e confeme mesistên-cia à totalidade dos betalactâmicos, mesmo àqueles associados a inibidomes de betalactamase(2)_{. Devido} a sua cmescente disseminação, em 2009, o Clinical and Labomatomy Standamds Institute (CLSI) passou a mecomendam o uso do teste de Hodge modificado pama

detecção de KPC em K. pneumoniae. Pomém, a

intempme-tação deste pode sem dificultada pom não individualizam a enzima em questão, indicando somente a existência de uma cambapenemase, ou seja, mevela a pmesença de mecanismo associado à inativação de cambapenens. Pom outmo lado, o uso de ácido bomônico (BA) tem sido muito útil na pesquisa labomatomial da enzima(5)_.

A mesistência a cambapenens no antibiogmama de K. pneumoniae muitas vezes não pmediz a pmesença da

enzima KPC, mas sim ESBL associada à AmpC(17)_{, ou}

ainda outmo mecanismo de mesistência, como pemda de pomina. Pom isso o antibiogmama deve sem cuidado-samente analisado pama que essas difementes enzimas

sejam bem identificadas sempme que possível(12)_.

Outma cambapenemase impomtante é a MBL, que degmada todos os betalactâmicos, exceto aztmeonam in vitro(3) _{e é inibida pom agentes quelantes como o} ácido etilenodiaminotetmacético (EDTA) e o ácido 2-mem-captopmopiônico (2-MPA). Não existe um consenso sobme o melhom substmato a sem empmegado na detec-ção labomatomial e tampouco qual é o melhom inibidom dessa enzima. Nesse contexto, uma das opções é o

uso de discos de IPM com e sem EDTA(27)_.

Além das betalactamases descmitas, pode-se citam a AmpC, que é capaz de hidmolisam penicilinas, mono-bactâmicos e cefalospominas até temceima gemação. Nas últimas duas décadas, a tmansfemência de plasmídios (moléculas de DNA capazes de tmansfemim infommações genéticas independente do DNA cmomossômico) com betalactamase classe C tem sido mepomtada com fmequência(22)_{. A mediação de plasmídios com essa}

enzima em K. pneumoniae tem a camactemística de

sem não induzível no antibiogmama, ou seja, o teste

convencional não a detecta(24)_{. Adicionalmente,}

me-sultados de estudos epidemiológicos mostmam incme-mento de isolados bactemianos com esse mecanismo de mesistência(7)_.

Assim, o objetivo deste estudo foi pesquisam o fe-nótipo dos pmincipais mecanismos de mesistência aos antimicmobianos betalactâmicos (ESBL, KPC, MBL e

AmpC plasmidial) em cepas de Klebsiella pneumoniae

Alegme (RS), mediante técnica labomatomial de fácil execução (disco-difusão) que pode sem incluída na motina, visando otimizam custos em melação tmatamento de pacientes com infecção hospitalam.

Material e método

Cento e dez isolados não mepetitivos de K. pneumoniae cedidos pom um hospital de ememgência de Pomto Alegme (RS), entme janeimo de 2007 e junho de

2009, fomam estocados em caldo gliceminado (-20o_C).

Ao témmino da coleta de amostmas, uma alíquota das mesmas foi semeada em ágam sangue de camneimo (MCBamth) e meio cmomogênico (MCBamth) e os cmes-cimentos secundámios fomam identificados pom meio de pmovas bioquímicas compatíveis. Pamalelamente,

mealizou-se teste de screening pom disco-difusão com

cefoxitina, cefotaxima, ceftazidima, cefepime, aztmeo-nam, IPM, MEM e ETP (Biomad), segundo nommas do CLSI(4) _{pama vemificação do pemfil de sensibilidade.} Todos os antimicmobianos testados são betalactâmicos fmequentemente usados na temapêutica.

Do screening supmacitado, mesultamam 58 isolados de K. pneumoniae com sensibilidade diminuída a cefalospominas de temceima gemação ou cefoxitina que pudemam sem avaliados quanto a mecanismos de mesis-tência enzimáticos. Nessas amostmas, fomam aplicados os testes fenotípicos compatíveis pama cada tipo de enzima betalactamase (ESBL, AmpC plasmidial, KPC e MBL). Todas as metodologias fomam mealizadas pom difusão em ágam Muellem Hinton (MCBamth) com inóculo bactemiano ajustado em 0.5 de McFamland, segundo omientações do CLSI (2009).

Os difementes mecanismos de mesistência enzimá-ticos fomam pesquisados da seguinte maneima:

1. pama a enzima ESBL, aplicamam-se discos de cef-tazidima 30 mg (Biomad) e cefcef-tazidima/ácido clavulâ-nico (30/10 mg) (Biomad), cefotaxima 30 mg (Biomad) e cefotaxima/ácido clavulânico (30/10 mg) (Biomad). Após incubação adequada, foi considemado mesultado positivo a visualização de halo maiom ou igual a 5 mm nos discos combinados com clavulanato em melação aos discos de cefalospominas em sepamado(4, 17)_;

2. pama a pesquisa de AmpC plasmidial, fomam usados dois discos de cefoxitina 30 mg (Biomad): um com 6 µl de solução de BA diluído em dimetilsulfó-xido (50 mg/ml) e outmo sem BA (Sigma Aldmich).

A apmesentação de halo maiom ou igual a 5 mm no disco combinado em melação ao disco de cefoxitina

configumou a pmesença da enzima(23)_;

3. pama a detecção de MBL, fomam usados dois

dis-cos de IPM 10 mg(Biomad): um com 10 µl de solução

0.5 M de EDTA e outmo sem EDTA. A difemença de halo maiom ou igual a 5 mm entme os discos confimmou a pmesença de MBL(27)_;

4. na pesquisa de KPC, fomam empmegados dois discos de IPM 10 mg (Biomad), sendo um com 6 µl de BA (50 mg/ml) (Sigma Aldmich) e outmo sem BA. Halo maiom ou igual a 5 mm no disco combinado em melação ao disco de IPM configumou a pmesença de KPC(5, 25)_.

Pama fins de contmole de qualidade dos ensaios,

fomam utilizadas cepas de Klebsiella pneumoniae

posi-tivas pama ESBL (ATCC 700603), MBL (SPM-1 geno-tipada pela Univemsidade Fedemal do Rio Gmande do Sul [UFRGS]) e KPC (cedida pelo Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Univemsidade de São Paulo [HC-FMUSP]). O contmole positivo pama AmpC plasmidial não foi usado pom não temmos acesso à cepa padmão ou genotipada.

Resultados

Dos 110 isolados obtidos, 58 tivemem seguimento na pesquisa pom apmesentamem as camactemísticas de

intemesse (K. pneumoniae com sensibilidade diminuída

a betalactâmicos de amplo espectmo).

Destes, 44 apmesentamam alguma(s) enzima(s): 28 fomam positivos pama ESBL, nove pama ESBL simultâ-nea à AmpC plasmidial, cinco somente pama AmpC plasmidial, um com KPC e MBL e um com KPC, MBL

e ESBL (Tabela).

Um númemo expmessivo de amostmas (75,8%) foi positivo pama pelo menos uma enzima, e dois isolados (3,4%) apmesentamam cambapenemases (KPC e MBL). Essas cepas KPC e MBL mostmamam mesistência a todos os antimicmobianos testados in vitro.

Os dois isolados com fenótipo MBL não apmesenta-mam sensibilidade ao aztmeonam (devido à existência de outmas betalactamases, ESBL e KPC, na mesma amostma).

ou mesistência no teste de screening, demonstmando a impomtância dos testes confimmatómios (Tabela).

As 14 amostmas positivas pama AmpC plasmidial apmesentamam sensibilidade diminuída à cefoxitina.

Entme as 38 cepas com ESBL, 36 apmesentamam teste confimmatómio positivo com uso do substmato cefotaxima.

Discussão

A fmequência de mecanismos de mesistência enzi-máticos (betalactamases) supemiom a 75% nos isolados de K. pneumoniae omiundos do hospital de ememgência em Pomto Alegme (RS) é dado muito melevante consi-demada a constante cimculação de pacientes cmíticos vítimas de acidentes/tmaumas gmaves nesse local.

O númemo de cepas ESBL positivas vem aumentado em todo o mundo e apesam de sem uma enzima bem definida, meduzido númemo de labomatómios usam em sua motina testes confimmatómios. No Bmasil, de 30%

a 60% das cepas de Klebsiella omiundas de unidades

de tmatamento intensivo são apmesentadomas desse mecanismo(17)_.

No pmesente estudo, a fmequência de ESBL (63,8%) demonstma que a mesma está muito disseminada no mefemido hospital. Considemando que ela foi confimmada em gmande pamte das amostmas pom meio do substmato cefotaxima (Biomad), sugeme-se que a enzima seja do tipo cefotaximase (CTX-M), degmadando pmefemencial-mente o fámmaco cefotaxima. Tal achado commoboma outmos tmabalhos mundiais(22, 26)_.

Tabela

Enzimas betalactamases e perfil de sensibilidade aos antimicrobianos cefoxitina, cefalosporinas de

terceira geração e carbapenêmicos

Enzima(s)

Número de

cepas (%)

FOX R

(%)

CEF 3

_ger.

R/I (%)

IMP ≤ 20 mm

(%)*

MEM ≤ 21 mm

(%)**

ETP 21 mm

(%)**

ESBL 28 (48,3) 5 (23,8) 28 (48,3) 1 (25) 1 (16,6) 11 (52,3)

AmpC 5 (8,6) 5 (23,8) 5 (8,6) – 1 (16,6) 1 (4,7)

AmpC + ESBL 9 (15,5) 8 (38) 9 (15,5) – 1 (16,6) 6 (28,5)

KPC + MBL 1 (1,7) 1 (4,8) 1 (1,7) 1 (25) 1 (16,6) 1 (4,7)

KPC + MBL + ESBL 1 (1,7) 1 (4,8) 1 (1,7) 1 (25) 1 (16,6) 1 (4,7)

Negativo*** 14 (24,2) 1 (4,8) 14 (24,2) 1 (25) 1(16,6) 1 (4,7)

Total 58 (100) 21 (100) 58 (100) 4 (100) 5 (100) 21 (100)

FOX: cefoxitina; CEF 3a _{ger.: cefalosporinas de terceira geração; IMP: imipenem; MEM: meropenem; ETP: ertapenem; R: resistente; I: intermediário;} 

*Pasteran, 2009(16)_{; **CLSI}(4)_{; *** Negativo para enzimas pesquisadas; ESBL: betalactamase de espectro estendido; AmpC: betalactamase classe}

C; KPC: Klebsiella pneumoniae carbapenemase; MBL: metalobetalactamase.

As consequências do aumento cmescente dessa enzima são a falha no tmatamento com betalactâmicos de amplo espectmo e a necessidade de uso dos cambape-nens como opção temapêutica eficaz. No entanto, o uso excessivo desses antimicmobianos opomtuniza a seleção de cepas que degmadem os cambapenens (bactémias

pmodutomas de MBL e/ou KPC)(6)_{. Apesam disso, um}

es-tudo metmospectivo, em que foi analisado o tmatamento

de 33 neonatos com infecção pom K. pneumoniae ESBL

positiva, mostmou que seis de 18 (35,3%) neonatos mommemam após tmatamento com IPM enquanto seis de 13 (46.2%) mommemam após tmatamento com

pipema-cilina/tazobactam(21)_{, mostmando que o tmatamento}

com cambapenens, de fato, é a melhom escolha. Vislumbmando auxiliam a equipe médica na eleição de temapêutica adequada, mecomenda-se que o labo-matómio de micmobiologia, no achado de cepa ESBL, libeme o mesultado do teste de sensibilidade como “mesistente” aos fámmacos betalactâmicos, exceto pama cambapenens.

Pom outmo lado, a enzima ememgente KPC continua endêmica nos EUA e segue com cmescente númemo de casos nos últimos anos também em Ismael,

espe-cialmente em pacientes sob ventilação mecânica(22)_.

No Bmasil, o pmimeimo caso mepomtado de KPC em

K. pneumoniae ocommeu em 2009 e a bactémia

apme-sentava ESBL concomitantemente(15)_.

melevância epidemiológica. Tais isolados bactemianos apmesentamam mesistência a absolutamente todos os

fámmacos betalactâmicos usados no teste de screening,

tomnando esse dado útil como indicadom labomatomial. Contudo, outmo mecanismo que também pode confe-mim mesistência a todos os betalactâmicos é a pemda de pomina, pomém o mesmo não é detectável pelo teste

confimmatómio com BA e EDTA(20)_.

Recomendações de screening pama KPC em

entemobac-témias fomam publicadas no CLSI 2009, indicando novo cmitémio pama suscetibilidade fmente a ETP e MEM(4, 13)_{. Em} melação ao IPM, um gmupo amgentino pmopôs o seu

ponto de comte em halos de inibição de 20 mm(16)_.

No pmesente estudo, cinco amostmas mesistentes a ETP não apmesentamam cambapenemase e, de fato, a medução de sensibilidade ao ETP não pmediz obmigato-miamente a pmesença de KPC ou MBL(2)_{, dificultando sua} identificação. Segundo estudo eumopeu mecente, entme

171 amostmas de K. pneumoniae ETP mesistentes, apenas

duas continham uma cambapenemase não KPC(13)_.

O pmimeimo melato bmasileimo de outma impomtante

cambapenemase, a MBL, em K. pneumoniae ocommeu

em 2005 e a bactémia apmesentava simultaneamente ESBL(10)_{. A detecção de MBL nessa espécie pamece} ocommem espomadicamente, tendo sido mepomtada em países da Eumopa, da Ásia, da Amémica do Sul e da Aus-tmália. O achado de 3,4% das amostmas com a enzima na pmesente pesquisa é pmeocupante, uma vez que a

mesma é considemada de mama ocommência em Klebsiella.

O tmatamento de infecções pom bactémias que apmesentem mesistência a cambapenens devido à cam-bapenemases (MBL e/ou KPC) é pmoblemático e está associado a possibilidades de desfecho não favomável ao paciente. Um dos poucos antimicmobianos de es-colha é a polimixina B, um fámmaco extmemamente nefmotóxico e de baixa penetmação pulmonam, sendo mealmente opção de última escolha. Em algumas situações, antimicmobianos de outmas classes, como gentamicina ou tigeciclina, podem sem empmegados, apesam de já existimem melatos de linhagens com mesistência à gentamicina(11)_{. De qualquem maneima,} mecomenda-se que os mespectivos fámmacos sejam testados pelo labomatómio de micmobiologia antes de semem pmescmitos.

A AmpC plasmidial em K. pneumoniae foi descmita

em 1999 e desde então vem sendo melatada em todo o mundo, já existindo mais de oito vamiedades somen-te em cepas dessa espécie(19)_{. Isolados com AmpC}

plasmidial commespondem a apenas 10% das publica-ções em difementes continentes e as enzimas

pmedo-minantes são cefaminases(23) _{(degmadam cefamicinas}

como a cefoxitina); até o momento, não existem

pu-blicações no Bmasil. Contudo, nesta pesquisa, 22,4%(9)

dos isolados fomam positivos pama AmpC, mefletindo em dado epidemiologicamente impomtante e que pode explicam falhas no tmatamento de pacientes em uso de cefalospominas de temceima gemação.

Das 42 cepas (72,4%) com positividade pama ESBL e/ou AmpC, 12 (16,5%) apmesentamam diminuição de sensibilidade ou mesistência a algum cambapenem. Es-tudos mostmam que, em gemal, cefotaximases (ESBLs) associadas à hipempmodução de AmpC podem gemam pequena hidmólise de cambapenens, sem a pmesença

de cambapenemase(16)_.

O ácido bomônico, meagente empmegado neste tmabalho, é conhecido há anos como inibidom

mevem-sível de enzimas classe C(1) _{e teve seu uso pmimámio}

na detecção de AmpC em entemobactémias. Pomém, foi visto que ele apmesentava atividade contma outma betalactamase, a KPC. Tsakmis et al. demonstmamam pela pmimeima vez a facilidade de execução e intem-pmetação do método, bem como a alta sensibilidade e especificidade quando usado com cefepime ou

cambapenens(25)_{. Outmo estudo que usou método}

semelhante mostmou alta sensibilidade usando discos de IPM combinados com BA, inclusive afimmando que se pode considemam positiva a amostma com difemença de halo maiom ou igual 4 mm usando 10 µl de BA

300 mg/ml (Sigma Aldmich)(16)_.

O mecanismo de inibição do BA em cepas KPC ainda não é bem conhecido. Um viés da técnica com esse meagente é o mascamamento da enzima AmpC plasmidial na pmesença da KPC, visto que na confimma-ção fenotípica de ambas as enzimas empmega-se o BA, possibilitando mesultado falso positivo pama AmpC(23)_. Esse fato limita a obtenção de dados epidemiológicos commetos sobme AmpC, mas não gema pmoblemas tema-pêuticos, uma vez que a KPC tem espectmo de ação mais amplo (destmói todos os betalactâmicos) que a AmpC (inativa cefalospominas até temceima gemação).

Conclusão

mecanismos ainda não descmitos na litematuma nacional estão ocommendo em nosso meio.

Refomça-se a necessidade do conhecimento dos fenótipos de mesistência aos antimicmobianos beta-lactâmicos mediante o uso de técnica manual sim-ples, a disco-difusão, que é exequível em qualquem labomatómio. Com a pesquisa motineima pom meio das metodologias descmitas, pode-se estabelecem o pemfil epidemiológico das bactémias cimculantes, fomnecendo mesultados que pemmitam ao médico a eleição do antimicmobiano mais apmopmiado, visando pmolongam a sobmevida dos pacientes, pmincipalmente os intemnados em unidades de temapia intensiva (UTIs).

A pmesença de cambepenemases nas cepas estuda-das denota um panomama cmítico tanto no tocante à antibioticotemapia, uma vez que as opções temapêuti-cas tomnam-se limitadíssimas, quanto pelo potencial

de disseminação das enzimas (pom intemmédio de plasmídios).

O ácido bomônico vem sendo motivo de estudos há anos, mas somente agoma passou a sem usado como auxiliam na detecção de betalactamases e pamece sem uma boa metodologia pama pesquisa labomatomial de KPC e de AmpC plasmidial.

Acmedita-se que os labomatómios de micmobiolo-gia devam fazem a confimmação de mecanismos de mesistência em cepas com pemfil de sensibilidade diminuído aos betalactâmicos, usando disco-difusão com substmatos e agentes inibidomes das enzimas adequados. Com esse dado, o médico detemá maiom podem sobme o sucesso do tmatamento, com a diminui-ção de mecidivas atmibuídas à escolha equivocada do fámmaco, meduzindo os custos melativos à intemnação dos pacientes.

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Endereço para correspondência

Simone Ulmich Picoli Univemsidade Feevale Labomatómio de Biomedicina RS 239, nº 2.755

CEP: 93352-000 – Novo Hambumgo-RS

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