BARBARA COLATTO FERNANDES
CARACTERIZAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO E FUNÇÃO DE GENES DE REPARO DE DNA NA ESTABILIDADE GENÔMICA DE CÉLULAS DE
GLIOBLASTOMA MULTIFORME
BARBARA COLATTO FERNANDES
CARACTERIZAÇÃO DO PADRÃO DE EXPRESSÃO E FUNÇÃO DE GENES DE REPARO DE DNA NA ESTABILIDADE GENÔMICA DE CÉLULAS DE
GLIOBLASTOMA MULTIFORME
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao Curso de Graduação em Farmácia-Bioquímica da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, para a obtenção do grau de Farmacêutica-Bioquímica.
Orientador: Prof. Dra. Valeria Valente
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ... 6
1.1.GLIOBLASTOMA MULTIFORME (GBM) ... 6
1.2.PROCESSO DE FORMAÇÃO TUMORAL ... 7
1.3.ATIVAÇÃO DA VIA DE REPARO POR RECOMBINAÇÃO HOMÓLOGA (RH) ... 11
2. OBJETIVO GERAL ... 16
2.1.OBJETIVOSESPECÍFICOS ... 16
3. MATERIAIS E MÉTODOS ... 17
3.1.CULTURA CELULAR ... 17
3.2.AVALIÇÃO DA EXPRESSÃO GÊNICA POR QRT-PCR ... 18
3.2.1. Extração de RNA ... 18
3.2.2. Síntese de cDNA ... 19
3.2.3. Análise de PCR quantativo - qRT-PCR ... 19
3.3. Cálculo da expressão relativa dos genes selecionados ... 21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 22
4.1PADRONIZAÇÃO DAS CONDIÇÕES DE REAÇÃO DE RT-PCR QUANTITATIVO UTILIZANDO SYBRGREEN .. 22
4.1.1. Definição da concentração ótima dos primers ... 22
4.1.2. Verificação da eficiência de amplificação dos primers ... 24
4.1.3. Perfil dos níveis de expressão dos genes selecionados nas linhagens celulares de GBM avaliados por RT-qPCR ... 27
5. DISCUSSÃO ... 30
6. CONCLUSÃO ... 32
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Tipos de danos ao DNA e mecanismos de reparo
Figura 2 - Heatmap representativo dos níveis de expressão dos transcritos de genes de reparo de DNA alterados linhagens celulares de GBM
Figura 3 - Curva de proliferação das linhagens celulares de glioblastoma multiforme Figura 4 - Mecanismos de reparo por recombinação homóloga (HR) e junção de pontas não-homólogas (NHEJ)
Figura 5 - Curva padrão das reações de padronização para RPA1
Figura 6 - Curva padrão das reações de padronização para ATR
Figura 7 - Curva padrão das reações de padronização para NBS1
Figura 8 - Curva padrão das reações de padronização para BRCA1
Figura 9 - Expressão relativa dos transcritos dos genes RPA1, NBS1, ATR e BRCA1 nas linhagens de GBM e nos astrócitos não tumorais (ACBRI371)
Figura 10 – Comparação entre os valores de expressão relativa obtidos através de qRT-PCR e RNA-seq
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Características das linhagens de Glioblastoma Multiforme
Tabela 2 - Sequências de primers utilizados nas reações de PCR quantitativo
Tabela 3 - Valores de Ct obtidos na padronização do gene RPA1
Tabela 4 - Valores de Ct obtidos na padronização do gene NBS1
Tabela 5 - Valores de Ct obtidos na padronização do gene ATR
Tabela 6 - Valores de Ct obtidos na padronização do gene BRCA1
RESUMO
Os glioblastomas multiformes (GBMs) são os tumores cerebrais primários
agressivos que normalmente levam o paciente à óbito em cerca de 14 meses após o
diagnóstico. O desenvolvimento tumoral é marcado pela proliferação celular
descontrolada associada ao acúmulo de mutações, que podem surgir
espontaneamente, ou por exposição a agentes lesivos ao DNA (radiação UV,
espécies reativas de oxigênio). Dados recentes da literatura e de nosso grupo
revelaram que genes envolvidos na sinalização do dano e na execução do reparo de
DNA estão altamente superexpressos nos GBMs. Nossas observações sugerem que
o aumento na competência para corrigir lesões no DNA pode estar associado com a
progressão tumoral, conferindo maior resistência, estabilidade genômica e
capacidade proliferativa para as células. Dados prévios de RNA-seq indicaram que
genes envolvidos em reparo de DNA através do mecanismo de recombinação
homóloga estão potencialmente superexpressos em linhagens mais proliferativas de
células de GBM. Em nosso trabalho, determinamos os níveis de expressão dos
genes RPA1, NBS1, ATR e BRCA1 nas linhagens de GBM e em astrócitos não
tumorais através de qPCR . As análises de qPCR revelaram que todos os genes
pertencentes à via de recombinação homóloga encontram-se aumentados em todas
as linhagens de GBM. Portanto, a superexpressão desses genes selecionados nas
linhagens mais proliferativas permitiu que selecionássemos BRCA1 como o alvo
6 1. INTRODUÇÃO
1.1. Glioblastoma Multiforme (GBM)
Os glioblastomas multiformes (GBMs) são um tipo de astrocitoma de rápido
crescimento, que se espalha rapidamente e acomete o tecido cerebral sadio. Eles
são considerados os tumores primários mais agressivos – tumores de grau IV
conforme o sistema de classificação desenvolvido pela Organização Mundial da
Saúde (OMS).
Comparativamente a outros tipos de câncer, os GBMs apresentam uma baixa
incidência na população. Cerca de 100.000 adultos são acometidos por essa doença
a cada ano, totalizando 52% de todos os casos de cânceres cerebrais primários
(AANS, 2015). Apesar de raro, sua alta agressividade e resistência aos tratamentos
disponíveis determinam um péssimo prognóstico ao paciente, o que torna essa
doença um grande problema de saúde pública (Meir, Van et al., 2010; Yi Chieh Lim
et al.,2012).
Os GBMs podem derivar de lesões primárias denominadas como
glioblastomas de novo, ou ainda, originar-se a partir de transformações malignas de um astrocitoma de menor grau ou de um oligodendroglioma, que são provenientes
de astrócitos ou oligodendrócitos, respectivamente (Atlas, 2002; Ohgaki & Kleihues,
2007). Geralmente, acometem os hemisférios cerebrais, especialmente nos lóbulos
frontais e temporais (AANS, 2015).
Histologicamente eles são caracterizados por um pleomorfismo celular, com
células gigantes multinucleadas (Sousa, G. et al, 2002). O aspecto multiforme desse
tumor está relacionado com sua alta heterogeneidade celular e morfológica, assim
7 Meese, 2007), que decorrem da extensa desdiferenciação e elevadas taxas de
proliferação.
Os principais sintomas associados a esse tipo de câncer são decorrentes do
aumento da pressão intracraniana, e estão relacionados a sua localização no
cérebro e sua extensa capacidade proliferativa (ABTA, 2016). O diagnóstico, por sua
vez, é feito a partir de manifestação clínicas acompanhadas do exame
histopatológico e de outros exames complementares como ressonância magnética e
tomografia computadorizada (BEHIN et al., 2003).
Apesar de todos os avanços terapêuticos, as opções de tratamento para
portadores de GBMS ainda são bem limitadas. Geralmente, eles são submetidos a
remoção cirúrgica do tumor, seguida pela radioterapia e quimioterapia. No entanto, a
alta agressividade desse tipo de câncer, assim como sua capacidade proliferativa
elevada, fazem com que ele seja resistente aos tratamentos disponíveis.
1.2. Processo de formação tumoral
O processo de formação tumoral geralmente deriva de um acúmulo de
sucessivas alterações genéticas em decorrência de influências ambientais,
mutações espontâneas, erros durante o processo de replicação celular (Alberts et
al., 2010 , Lin et al., 2010 e Clancy, S., 2008), ou ainda, por exposição a agentes
lesivos (Hoeijmakers, 2001).
Os danos ao DNA induzem a ativação de diversos complexos proteicos e
respostas celulares, com o objetivo de conter a progressão tumoral. Normalmente,
as células atingidas ativam mecanismos de reparo de DNA e/ou de apoptose, que
8
Figura 1. Tipos de danos ao DNA e mecanismos de reparo. A figura representa os agentes lesivos mais comuns (topo), os danos provocados ao DNA (meio) e os mecanismos de reparo associados a cada tipo de lesão ao material genético (abaixo). Hoeijmakers, 2001 (adaptado).
As etapas iniciais da formação de um tumor estão fortemente correlacionadas
com a ocorrência de alterações genéticas que levam a perda de função nestas vias,
o que permite a proliferação de células com acúmulo de mutações. Desse modo, a
ineficiência dos mecanismos de reparo está diretamente relacionadas à
tumorigênese por meio da ativação de proto-oncogenes ou inativação dos genes
9 Entretanto, dados recentes na literatura tem demonstrado que o ganho de
competência na atividade de reparo de DNA é fundamental para a evolução do
tumor e progressão para os estágios mais agressivos do câncer. Esse aumento na
competência se faz necessário para a manutenção da crescente instabilidade
genômica que decorre da proliferação cada vez mais acelerada nos tumores de
maior grau (Bartek J et al., 2012).
O ganho de competência na capacidade de reparar o DNA parece ser,
portanto, uma característica fundamental na manutenção da viabilidade das células
tumorais. A superexpressão da proteína HJURP (Holliday junction–recognizing
protein), observada em glioblastomas (VALENTE et al., 2009), além de estar
relacionada com o péssimo prognóstico do paciente, foi recentemente associada a
manutenção da viabilidade das células tumorais (Valente V et al, 2009; Valente V et
al, 2013) e a atividade de reparo de DNA através do mecanismo de recombinação
homóloga (Kato et al., 2007) na biologia tumoral das células de GBM.
Neste cenário, nosso laboratório tem se dedicado aos estudo de genes que
apresentam expressão alterada nas células tumorais e que, potencialmente, estejam
envolvidos com estes processos. Em trabalho anterior, identificamos 19 genes
relacionados ao reparo de DNA com expressão bastante alterada em amostras de
astrocitomas de diferentes graus e também em linhagens celulares de GBM (Sousa
JF et al., Dissertação de Mestrado, 2014).
Além disso, estudos preliminares de RNA-seq das linhagens celulares de
GBM que utilizamos como modelo mostraram o aumento na expressão de vários
10 BRCA1, NBS1, ATR e RPA1, que mostraram um acentuado aumento na expressão
em ambas as linhagens mais proliferativas (figura 2), com o intuito de confirmar e melhor quantificar as alterações de expressão e investigar sua potencial participação
na manutenção do estresse replicativo.
11
1.3. Ativação da via de reparo por recombinação homóloga (RH)
Dentre as alterações genômicas mais comuns, as quebras na dupla fita de
DNA (DSBs) são consideradas as lesões mais citotóxicas para a célula (Sung, P.,
Klein, H., 2006). Elas podem ser causadas por agentes exógenos e endógenos, tais
como: compostos químicos, radiação UV, estresse mecânico, radiação ionizante e
radicais livres formados durante o processo metabólico (Modesti, M., et al., 2001). Lesões do tipo DSBs requerem pelo menos três habilidades diferentes para
iniciar o processo de reparo: capacidade de detecção do dano, controle do ciclo
celular e dos processos transicionais envolvidos no reparo e catálise dos
mecanismos envolvidos no processo de correção da lesão (Lamarche, J. B., et al., 2010).
12 O reparo de lesões de dupla fita de DNA é, portanto, um procedimento crítico
para a manutenção da integridade genômica e a sobrevivência celular, o qual pode
ser feito por duas vias diferentes (figura 4) que competem entre si: a via de junção não homóloga - NHEJ (Non-Homologous End Joining) e a via de recombinação homóloga HR (Homologous Recombination) (Sung, P., Klein, H., 2006). A preferência por cada uma dessas vias é dependente da fase do ciclo celular na qual
a célula se encontra, com NHEJ atuando na fase G1 e HR no final da fase S até G2
do ciclo celular (Hoeijmakers, 2001).
Durante a fase G1 o material genético (não duplicado) encontra-se na forma
condensada e, portanto, de difícil acesso. Dessa forma, a via NHEJ é então ativada
e o reparo se dá a partir da junção das extremidades não homólogas do ponto de
quebra. Esse mecanismo não necessita da existência de um molde, porém
apresenta maior tendência a erros (Khanna & Jackson, 2001 e Van Gent et al.,
2001). No entanto, durante a fase S/G2 do ciclo celular, a cópia idêntica do DNA
lesado recém formada está mais acessível para servir como molde e isso faz com
que as enzimas da via de reparo por recombinação homóloga sejam
preferencialmente recrutadas (Hoeijmakers, 2001).
De uma forma geral, o reparo de lesões de dupla fita por recombinação
homóloga pode ser dividido em três fases: pré-sináptica, sináptica e pós-sináptica
(Dexheimer, T., 2013). Durante o estágio pré-sináptico ocorre o recrutamento do
complexo MRN (formado pelas proteínas Mre11, Rad50 e NBS1) e a região do DNA
próxima a área danificada é processada para que haja a formação de uma região de
13
Figura 4. Mecanismos de reparo por recombinação homóloga (HR) e junção de pontas não-homólogas (NHEJ). A ativação preferencial de cada uma das vias de reparo depende da etapa do ciclo celular que a célula se encontra. Adaptado de Hoeijmakers, 2001.
O complexo MRN, em conjunto com a proteína RBBP8, atua no
processamento das extremidades danificadas, ocasionando o desenrolamento do
duplex de DNA e a exposição das extremidades de fita simples (Dexheimer, T.,
2013). Após o processamento, RPA se liga a porção de fita simples com o objetivo
de eliminar estruturas secundárias que venham impedir a ligação de Rad51 à
14 No estágio sináptico, a proteína Rad51, juntamente com outras proteínas
mediadoras, tais como Rad52, BRCA1 e BRCA2, atua na procura de regiões
homólogas na fita de DNA. Uma vez encontrada, Rad51 promove a mediação da
reação de invasão da dupla fita de DNA (Zaha, A., et al.,2014), sendo crucial para o início do processo de reparo (NLM, 2015).
Por fim, a última etapa do processo é marcada pela recombinação homóloga
propriamente dita. Nela, o processo de recombinação pode ocorrer por três
sub-caminhos diferentes: “dissolução” mediada pelo complexo BLM-TopIIIα, quebra
simétrica mediada pelas proteínas GEN1/Yen1 ou Slx1/Slx4, ou quebra assimétrica,
mediada pelas endonucleases Mus81/Eme1 (Dexheimer, T., 2013), o que garante a
correção sem erros da quebra de dupla fita no DNA.
A presença de componentes do complexo MRN e outros mediadores
proteicos no local da lesão induz o recrutamento das proteínas quinases ATR
(Ataxia Telangiectasia Mutated and Rad3-related) e ATM (Ataxia-Telangiectasia
Mutated) para a região danificada (Leite, F. T., 2009). Estas quinases são membros
da família das phosphoinositide-3-kinase-related kinases (PIKKS) (Dexheimer, T.,
2013), assim como a proteína kinase dependente de DNA (DNA-PK) (Hakem,
R.,2008), que atuam nos estágios iniciais da sinalização da resposta ao dano em
DNA.
O recrutamento das quinases ATR e ATM para o local da lesão está
relacionado primordialmente com a presença de DNA fita-simples e quebras na
dupla fita de DNA, respectivamente (Shiotan, B., Zou, L., 2009), e promove a
15 A ativação de ATM depende, portanto, majoritariamente do recrutamento do
complexo MRN que se liga no sítio de DSBs promovidas por danos exógenos. Por
outro lado, a via de ATR é ativada em resposta a presença de DNA fita-simples
proveniente do estresse replicativo, com o objetivo de estabilizar e reiniciar
forquilhas de replicação paralisadas.
A presença de DNA fita-simples promove o recrutamento de vários fatores
como: PRP19, ATRIP/RPA, TopBP1 e complexo 9-1-1 (Eiji, O. et al., 2014) o
culmina com a ativação de ATR. A ATR, por sua vez, é responsável pela fosforilação
de substratos que auxiliam a sobrevivência celular e a continuidade do processo de
replicação do DNA sob condições de estresse replicativo (Zeman, M.K., 2014).
Portanto, sabe-se que as vias de sinalização ativadas por ATR e ATM são
fundamentais para a manutenção da estabilidade genômica, especialmente na
situação de estresse replicativo das células tumorais, que torna o DNA mais
propenso à ocorrência de quebras e outros dados. Porém, pouco se conhece sobre
os mecanismos relacionados à atividade dos genes de reparo (ativados
downstream) na correção de lesões provenientes do estresse metabólico e replicativo. Desse modo, o estudo das funções destes genes nas células tumorais,
assim como sua relação com a capacidade proliferativa das mesmas, poderá ter
16 2. OBJETIVO GERAL
O objetivo deste trabalho é verificar a expressão de RPA1, NBS1, ATR e
BRCA1, genes de reparo de DNA da via recombinação homóloga, em linhagens
celulares de glioblastoma multiforme.
2.1. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Quantificar os níveis de expressão do mRNA dos genes BRCA1, NBS1, ATR
e RPA1 nas linhagens celulares de GBM T98G, U87MG, U138MG, U251MG, U343,
e nos astrócitos não tumorais ACBRI371.
• Selecionar o gene mais promissor para ensaios funcionais de silenciamento
17 3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Cultura Celular
As linhagens de GBM U87MG (HTB-14TM) e T98G (CRL-1690TM) foram
obtidas da coleção da ATCC. As linhagens de GBM U138MG e U251MG e os
astrócitos ACBRI371 foram obtidas no laboratório da professora Elza Tiemi
Sakamoto Hojo da Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto –
USP; e as células U343 foram cedidas pelo professor Carlos Gilberto Carlotti Junior
da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP.
Todas as linhagens foram cultivadas em meio Dulbecco's Modified Eagle
Medium (DMEM, Life Technologies) suplementado com 10% de soro fetal bovino
(Life Technologies), em estufa a 37ºC e 5% de CO2, até confluência de
aproximadamente 80%. Após atingir confluência adequada, as células eram
descoladas da garrafa de cultura através do uso de tripsina (Sigma) e transferidas
para microplacas adequadas para cada ensaio.
Tabela 2. Características das linhagens de Glioblastoma Multiforme
18 3.1.2. Obtenção de subculturas
A subcultura celular foi realizada a partir de culturas 70-80% confluentes. O
meio de cultivo foi removido com o auxílio de uma pipeta Pasteur e as células foram
lavadas duas vezes com 2mL de solução de HANKS 1x (0,4g KCL, 0,06g KH2PO4,
0,04g NaHCO3, 1,0g glicose, 8g NaCl, Água MiliQ) para remoção completa do meio.
Em seguida, removeu-se a solução de lavagem e 1-2 mL de tripsina foram
adicionados. As garrafas foram incubadas na estufa até que houvesse o
descolamento completo da monocamada celular. Após a tripsinização, cerca de 5mL
de meio de cultura (10% SFB) foram adicionados em cada garrafa, as células foram
coletadas em tubos falcon de 15mL e, então, centrifugadas a 1250 rpm por 3
minutos. As células foram ressuspendidas por pipetagem, transferidas para novas
garrafas previamente identificadas e posteriormente incubadas em estufa a 37ºC e
5% de CO2.
3.2. Avalição da expressão gênica por qRT-PCR
3.2.1. Extração de RNA
O procedimento de extração de RNA foi realizado com o auxílio do kit –
Rneasy (Qiagen®). Para a realização da extração, 1x105 células/poço de cada
linhagem foram plaqueadas em placas de 6 poços, as quais foram incubadas a 37ºC
com 5% de CO2 por 48 horas. Decorrido esse tempo, o meio de cultura foi retirado e
cada poço foi lavado duas vezes com Hanks 1x. Em seguida, adicionou-se 350µL do
tampão de lise em cada poço. O lisado foi transferido para tubos de 0,5mL e 350µL
de solução de etanol 70% foram adicionados em cada tubo. A mistura foi então
transferida para uma coluna (fornecida pelo fabricante do kit) acoplada a um
19 centrifugação, o etanol remanescente no reservatório foi descartado, 700µL do
tampão RW1 foram adicionados a cada coluna e os tubos foram centrifugados
novamente. O líquido do reservatório foi descartado, 500µL da solução RPE foram
adicionados à coluna e os tubos foram centrifugados. O procedimento de adição do
tampão RPE foi repetido e os tubos foram centrifugados por 2 minutos a 12000 rpm.
Em seguida, as colunas foram transferidas para novos reservatórios e centrifugadas
por um minuto. Feito isso, adicionou-se de 30-50 µL de água DEPC no centro da
coluna e os tubos foram centrifugados por um minuto a 12000 rpm para eluição do
RNA. A extração de RNA das amostras obtidas a partir das linhagens celulares de
GBMs tiveram sua pureza quantificada com o auxílio do um espectrofotômetro de luz
UV para medida da absorbância (A) nos comprimentos de onda 260 e 280 nm. O
grau de pureza foi avaliado a partir do valor médio da relação A260/280.
3.2.2. Síntese de cDNA
Após a extração de RNA, 2µg de RNA total de cada amostra foi utilizado na
produção de cDNAs. Primeiramente, as amostras foram tratadas com DNAsel
(Invitrogen® Invitrogen®) e então submetidas à reação de transcrição reversa com o
kit High Capacity) na presença de RNAse (RNAseOUT, (GE Health Care®),
conforme as especificações do fabricante.
3.2.3. Análise de PCR quantativo - qRT-PCR
A partir do produto da síntese de cDNA foi realizada a análise de PCR
quantitativo, utilizando SYBR Green (Applied Biosystems®) para detecção do
20 emissão de fluorescência verde após a ligação do reagente entre a dupla fita de
DNA. O procedimento de amplificação foi feito de acordo com o seguinte protocolo:
Ciclo Temperatura Tempo
1 50°C 2 min
1 95°C 10 min
40 95°C 15 seg
60°C 1 min
Todas as reações de qRT-PCR foram feitas em triplicatas (biológicas e
experimentais). Os resultados da amplificação foram processados pelo software do
equipamento (7500 Real Time PCR System – Applied Biosystems®) e analisados
conforme o método do 2–DDCt (Livak & Schmittgen, 2001). Os genes estudados neste
trabalho (tabela 2) tiveram seus valores de Ct (Threshold Cycle –nº de ciclos)
normalizados com os resultados de expressão obtidos para o gene HPRT, que não
apresenta variação significativa no modelo experimental que utilizamos (Valente et.
al., 2009).
Tabela 3. Sequências de primers utilizados nas reações de PCR quantitativo.
Nome Forward Primer (5'->3') Reverse Primer (5'->3') Tm (ºC)
RPA1 CAGAATGGAAGCTCGGGAAT CACCACTTTGGACTGTGTTC 60
ATR CCAGTGAAAGGGCATTCCAA CGCTGCTCAATGTCAAGAAC 60
NBS1 CCAAGAAGCAGCCTCCACAA CTGCCGTCCTGACAGATCA 62
BRCA1 GCTACAGAAACCGTGCCAAA GTCCTCAGAGTTCTCACAGT 60
21
3.3. Cálculo da expressão relativa dos genes selecionados
O padrão de expressão de cada gene foi analisado por meio do método 2DDCt
(Livak & Schmittgen, 2001). Esse cálculo permite que a quantidade de cDNA seja
estimada em relação a expressão de um gene padrão. Nesse projeto, os padrões de
expressão dos genes envolvidos foram normalizados com o gene controle (HPRT).
A análise estatísticas dos dados de expressão referentes as linhagens celulares foi
feita utilizando-se o teste T, que compara dois grupos entre si (controle x
22 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Padronização das condições de reação de RT-PCR quantitativo utilizando SYBR Green
4.1.1. Definição da concentração ótima dos primers
A primeira etapa de padronização consistiu na execução de uma reação de
PCR quantitativa, utilizando cinco diluições dos primers (0,5µM, 1,0µM, 1,5 µM, 2,0
µM e 2,5 µM) para a avaliação da concentração ideal de uso na reação de
qRT-PCR. Nestas reações foi utilizado como template, uma mistura dos cDNAs das linhagens U138MG, T98G, U343MG e dos astrócitos ACBRI371. A quantidade ideal
de cada oligonucleotídeo foi determinada pela menor concentração de primers
suficiente para obtenção do menor valor possível de Ct (Cycle threshold). Os valores de Ct são definidos na fase exponencial da reação e indicam o momento (em qual
ciclo) a fluorescência de cada reação atinge o limiar definido como limite. Portanto, a
quantidade de produto inicial na reação pode então ser estimada através do tempo
(número de ciclos) que foi necessário para atingir determinado nível de
fluorescência. Desse modo, os valores de Ct são inversamente proporcionais ao
número de cópias geradas e são utilizados para o cálculo de expressão relativa de
cada gene em estudo. Nas tabelas de 2 a 5 estão mostrados os valores de Ct das
reações feitas em triplicata para os genes RPA, NBS1, ATR e BRCA1,
respectivamente. As concentrações ideais obtidas para cada primer foram
23 Tabela 4. Valores de Ct na padronização do gene RPA1.
Ct
Curva 1 Curva 2 Curva 3 Média DPR (%)*
0,5μM 30,1796970 29,7308579 29,5206680 29,81040763 1,1292672
1,0μM 29,0458660 29,0532951 29,8036251 29,30092873 1,4858357
1,5μM 28,3114185 28,6068687 28,8428059 28,58703103 0,9313613
2,0μM 28,0162544 29,0323963 28,6132641 28,5539716 1,7883998
2,5μM 34,9659500 33,8558617 - 34,41090585 2,2811110
(*)DPR = desvio padrão relativo (%). Valores de 1 unidade de Ct entre as curvas foram excluídas por serem consideradas variações muito altas entre as medidas. A exclusão foi representada por um traço.
Tabela 5. Valores de Ct na padronização do gene NBS1.
Ct
Curva 1 Curva 2 Curva 3 Média DPR (%)*
0,5μM 27,2777920 28,2133656 - 27,7455788 2,3843454
1,0μM 25,8502655 25,7537212 26,2211475 25,9417114 0,9512336
1,5μM 25,5453796 25,5876274 25,7377338 25,62358027 0,3945253
2,0μM - 28,9188042 27,0539608 27,9863825 4,7117323
2,5μM - 26,4040527 25,9519062 26,17797945 1,2213160
(*)DPR = desvio padrão relativo (%). Valores de 1 unidade de Ct entre as curvas foram excluídas por serem consideradas variações muito altas entre as medidas. A exclusão foi representada por um traço.
Tabela 5. Valores de Ct na padronização do gene ATR.
Ct
Curva 1 Curva 2 Curva 3 Média DPR (%)*
0,5μM 29,8168545 - 29,9830093 29,8999319 0,3929413
1,0μM 29,4725704 30,5027981 - 29,98768425 2,4292673
1,5μM 29,4484558 29,2403507 29,5534573 29,41408793 0,5417726
2,0μM - 27,7373619 27,1932049 27,4652834 1,4009581
2,5μM 28,5058956 28,8976345 28,0060177 28,46984927 1,5697309
24
Tabela 5. Valores de Ct na padronização do gene BRCA1.
Ct
Curva 1 Curva 2 Curva 3 Média DPR (%)*
0,5μM 21,83597374 21,74578476 21,7301407 21,77063306 0,2142435
1,0μM 21,58351135 21,50676727 21,5594730 21,54991722 0,1487290
1,5μM 21,63522530 21,55154228 21,5376434 21,57480367 0,1997686
2,0μM 21,60920715 21,59579468 21,5355740 21,58019193 0,1483829
2,5μM 21,91338539 21,67605209 21,5848770 21,7247715 0,6373687
(*)DP = desvio padrão (%).
4.1.2. Verificação da eficiência de amplificação dos primers
Após a determinação da concentração ideal de cada primer, foram realizadas
diluições seriadas (1:10, 1:2 e 1:3) de uma mistura de RNAs para a verificação da
eficiência de amplificação dos primers. Conforme os padrões de diluição obtidos
para cada gene (1:10 para BRCA1, 1:2 para ATR e NBS1, 1:3 para RPA1), foi
possível obter a curva de eficiência ideal para cada par de primers (Figuras 5, 6, 7 e
8). As curvas foram obtidas a partir da interpolação dos valores de Ct obtidos de
cada reação (Eixo Y) e os respectivos logarítmos da concentração relativa de cDNA
das amostras (Eixo X). A reta média foi traçada a partir dos valores médios de Ct de
cada diluição de cDNA e a eficiência da reação (E) de qRT-PCR foi calculada
segundo Ramakers et al., 2003, utilizando a seguinte fórmula:
25 coeficiente de correlação (R2) determina a proximidade entre a regressão linear da
curva padrão e os valores individuais de Ct das amostras, onde valores próximos a 1
indicam uma proporção ideal entre esses parâmetros. Isso indica que, sob
condições ideais de amplificação, a quantidade de produto gerado aumenta
exponencialmente, dobrando a cada ciclo de reação.
Para esse estudo foram considerados razoáveis valores de eficiência entre 90
e 110%. As figuras 5, 6, 7 e 8 mostram as curvas padrão (valores de Ct plotados em
função do log10 da concentração de cDNA utilizado como template) obtidas para cada gene, assim como os valores de eficiência da reação, R2 e o coeficiente de
inclinação da reta (slope). Consideramos viável a utilização dos primers de ATR, embora sua eficiência tenha ficado abaixo da faixa determinada, pois o valor de E encontrado ficou bem próximo ao limite inferior.
Figura 5.Curva padrão das reações de padronização para RPA1.
1 10 100 1000
20 22 24 26 28 30
Quantidade de cDNA
Ct
RPA1
26
Figura 6.Curva padrão das reações de padronização para ATR.
Figura 7.Curva padrão das reações de padronização para NBS1.
1 10 100 1000
22 24 26 28 30 32
Quantidade de cDNA
Ct
ATR
Slope: -3,73 R2: 0,984 Ef%: 85,29
1 10 100 1000
18 20 22 24 26
Quantidade de cDNA
Ct
NBS1
27
Figura 8. Curva padrão das reações de padronização paraBRCA1.
4.1.3. Perfil dos níveis de expressão dos genes selecionados nas linhagens celulares de GBM avaliados por RT-qPCR
Os níveis de expressão dos genes de reparo de DNA RPA1, NBS1, ATR e
BRCA1 foram avaliados nas linhagens celulares de GBM (U138MG, T98G,
U343MG, U138MG, U251MG) e nos astrócitos não tumorais ACBRI371. Para a
quantificação, os genes alvos foram normalizados em relação ao gene HPRT
(controle endógeno de expressão constitutiva) em todas as amostras. Os dados
numéricos referentes à expressão relativa dos transcritos de cada gene são
mostrados na tabela 6 e, para facilitar a comparação, estão também apresentados
sob a forma de gráficos na figura 9.
0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000
15 20 25 30 35 40
Quantidade de cDNA
Ct
BRCA1
28 Tabela 7. Expressão relativa (fold change) dos genes RPA1, NBS1, ATR e BRCA1 nas
linhagens celulares tumorais em relação aos astrócitos não tumorais ACBRI371.
DP- desvio padrão. * p<0,05, **p<0,001 e *** p<0,0001.
Os quatro genes de reparo estudados apresentaram-se superexpressos em
todas as linhagens de GBM. Curiosamente, notamos que as células U138, que
apresentam a menor taxa de proliferação, mostraram os maiores níveis de RPA1,
NBS1 e ATR (tabela 6). O gene RPA1 mostrou um aumento bem pequeno nas
células U87 (1,17 vezes) e uma variação de fold change entre 3,55 a 6,33 vezes nas outras linhagens. NBS1 apresentou um aumento que variou entre 1,72 a 4,91. O
gene ATR mostrou variação entre 3,24 e 8,18 vezes. BRCA1 teve expressão
notavelmente alta nas células U343, com fold change de 7,66. Porém, nesta análise o desvio também é bastante grande e este dado ainda será confirmado. Nas outras
linhagens a variação ficou entre 2,56 e 6,88 (tabela 6). Interessantemente, o gene
BRCA1 mostrou níveis bastante acentuados na linhagem U343, que apresenta alta
taxa proliferativa, sugerindo que este seria um alvo promissor para os experimentos
29
Figura 9. Expressão relativa dos transcritos dos genes RPA1, NBS1, ATR e BRCA1 nas linhagens de GBM e nos astrócitos não tumorais (ACBRI371). O nível de mRNA dos genes em estudo foram avaliados através de PCR em tempo real utilizando-se o sistema baseado no fluorocromo SYBR Green, com kit "Power SYBR Green Master Mix" (Applied Biosystems). O gene HPRT foi utilizado como controle de expressão constitutiva. O cálculo de expressão relativa foi feito pelo método do 2-ΔΔCt e as células ACBRI371 foram usadas como referência. * p<0,05 ,**p<0,001 e ***p<0,0001.
ACBRI371
U87 U251 U343 T98 U138
0 2 4 6 8 10 Ex pr es sã o re la tiv a de m R N A RPA1
***
a) ACBRI371U87 U251 U343 T98 U138
0 2 4 6 8 10 Ex pr es sã o re la tiv a de m R N A NBS1
**
*
*
b)*
ACBRI371U87 U251 U343 T98 U138
0 2 4 6 8 10 12 14 Ex pr es sã o re la tiv a de m R N A ATR
*
**
*
c)*
ACBRI371U87 U251 U343 T98 U138
30 5. DISCUSSÃO
Um traço marcante dos diferentes tipos de câncer é a instabilidade genômica.
Essa característica está associada com a maior propensão em acumular danos ao
DNA. Organismos eucariotos desenvolveram um mecanismo complexo
multifacetado capaz de neutralizar efeitos deletérios que pudessem por em risco a
integridade genômica (Friedberg, E.C. et al.,1995) - os mecanismos de resposta ao dano do DNA (DDR – DNA Damage Response). Eles são responsáveis pela detecção de danos ao material genético e/ou paradas no processo de replicação por
meio da ativação de mecanismos de checkpoints.
Além da ativação dos pontos de verificação, o mecanismo de resposta ao
dano pode levar a indução de transcrição de genes, ao aumento da atividade das
vias de reparo e, em alguns casos, a apoptose (Zhou, B.B. & S.J. Elledge, 2000). Os
resultados de qPCR apresentados nesse trabalho indicam um aumento nos níveis
de mRNA dos genes RPA1, NBS1, ATR e BRCA1 em todas as linhagens tumorais
de GBM, sugerindo a possível ativação constitutiva de mecanismos de sinalização
de dano ao DNA nessas células.
Estudos recentes corroboram com essa ideia ao mostrarem que processos
intrínsecos ao normal funcionamento das células, decorrentes do estresse
replicativo, assim como dos danos oxidativos ao DNA, tem contribuído para a
ativação constitutiva exacerbada da sinalização de danos ao DNA em gliomas
humanos (Bartkova, J., et al., 2010). A ativação espontânea de DDR, isto é, sem nenhum estímulo genotóxico, tem ocorrido de maneira mais pronunciada durante o
31 gliomas de baixo grau, essa ativação tende a estar relacionada com a ocorrência de
estresse replicativo induzido por oncogenes, enquanto que em estágios mais
avançados, especialmente em GBMs, ela é alimentada pelo estresse replicativo
contínuo e aumentada pelo estresse oxidativo (Bartkova, J., et al., 2005; Di Micco R., et al., 2006).
Terapias padrão utilizadas no tratamento (não cirúrgico) dos GBMs
atualmente envolvem radiação ionizante e quimioterapias à base de temozolamida
(MGH Brain Tumor Center, 2016). Elas agem provocando quebras na dupla fita e
alquilações no DNA e, portanto, induzem mecanismos de resposta ao dano (Bartek
Jr, J., et al., 2012). Novas terapias para o tratamento de portadores de GBMs tem sido direcionadas para os mecanismos de resposta ao dano do DNA. O enfoque
dessas novas pesquisas recaem na inibição de pontos de regulagem downstream da via de sinalização ao dano do DNA (moléculas inibidoras da DDR quinases - ATM,
ATR, Chk1 and Chk2), nos efetores de reparo e em algumas vias de reparo
associadas a DSBs, tais como a via de recombinação homóloga (Zhou BB, Bartek
J., 2014).
Nesse contexto, nosso trabalho corrobora que o aumento da função de genes
da via de recombinação homóloga pode estar atrelado à capacidade proliferativa das
linhagens de GBM e a manutenção da estabilidade genômica. Estudos neste sentido
são de extrema importância para aumentar a compreensão da biologia tumoral e,
principalmente, para fornecer subsídios para o desenvolvimento de novas terapias
32 6. CONCLUSÃO
Os resultados desse trabalho mostraram que os níveis de mRNA para os
genes RPA1, NBS1, ATR e BRCA1 estão aumentados em todas as linhagens de
GBM. Adicionalmente, as células de GBM U343MG apresentaram um valor de
expressão de BRCA1 7,66 vezes maior em relação aos astrócitos não tumorais. Nas
demais linhagens vimos que o fold change para esse gene é relativamente alto (cerca de 2,5 vezes mais que o controle), fazendo com que ele fosse escolhido
como alvo para experimentos funcionais de silenciamento que pretendemos realizar
futuramente. Além disso, detectamos níveis consistentemente altos de três dos
genes analisados, RPA1, NBS1 e ATR, nas células U138. Este resultado nos
surpreendeu porque esta linhagem apresenta a menor taxa proliferativa e, portanto,
iremos investigar mais profundamente a atividade dos genes de reparo nestas
33 7 .REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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De acordo,
