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Expressão da Desiodase do Tipo III no cérebro de filhotes de ratas obesas

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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde

Programa de Pós Graduação em Distúrbios do Desenvolvimento

CYNTIA MORAES TEIXEIRA

EXPRESSÃO DA DESIODASE DO TIPO III NO CÉREBRO DE

FILHOTES DE RATAS OBESAS

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UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde

Programa de Pós Graduação em Distúrbios do Desenvolvimento

Cyntia Moraes Teixeira

EXPRESSÃO DA DESIODASE DO TIPO III NO CÉREBRO DE

FILHOTES DE RATAS OBESAS

Dissertação vinculada à linha de Pesquisa Básica em Neurobiologia e Comportamento no Desenvolvimento e seus transtornos, apresentada ao Programa de Pós Graduação em Distúrbios do Desenvolvimento da Universidade Presbiteriana Mackenzie de São Paulo para a obtenção do título de Mestre.

Orientadora: Profa. Dra. Miriam Oliveira Ribeiro.

(3)

T266e Teixeira, Cyntia Moraes

Expressão da Desiodase do Tipo III no cérebro de ratas obesas - Cyntia Moraes Teixeira. 2012.

43 f. ; 30 cm

Dissertação (Mestrado em Distúrbio do Desenvolvimento) - Universidade Presbiteriana Mackenzie. São Paulo, 2012. Referências bibliográficas: f. 36-39.

1. Transtorno do espectro do autismo. 2. Trajetória familiar. 3. Serviços de saúde. 4. Diagnóstico e tratamento. I. Título.

(4)

UNIVERSIDADE PRESBITERIANA MACKENZIE

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde

Programa de Pós Graduação em Distúrbios do Desenvolvimento

Aprovada em: 09 de agosto de 2012

Comissão Examinadora

Dissertação para a obtenção do título de mestre em Distúrbios do Desenvolvimento

Presidente e Orientadora: Profa. Dra. Miriam Oliveira Ribeiro Universidade Presbiteriana Mackenzie

Primeira Examinadora: Profa. Dra. Roberta Monterazzo Cysneiros Universidade Presbiteriana Mackenzie

(5)
(6)

AGRADECIMENTOS

Agradeço a Deus pela realização desse sonho, e por ter me ajudado a chegar até aqui.

Aos meus pais, que estiveram por perto, mesmo estando tão longe. Deles pude sentir

apoio, carinho, cuidado, estímulo. Esse trabalho é fruto de tudo o que aprendi com vocês!

À minha irmã Jacqueline, que me acolheu nos momentos de dificuldades e que sempre

esteve do meu lado quando precisei.

À minha querida orientadora Profa. Dra. Miriam Oliveira Ribeiro, por ter aceitado o

desafio de me instruir nesse processo, pela paciência em me esclarecer vezes coisas tão

simples. Pelo companheirismo, amizade e confiança que depositou em mim. Saiba que

descobri muitas coisas no decorrer desse processo e isso graças a você!

A Profa. Dra. Roberta Monterazzo Cysneiros, por sua contribuição, colaboração

incentivo e por me permitir acompanhar e aprender protocolos e métodos que me serviram de

grande aprendizado.

Ao Prof. Dr. Fúlvio pelas contribuições o e aceite de fazer parte deste processo.

A todos os professores do Programa de Distúrbios de Desenvolvimento.

A querida amiga Renata Nassif, pela companhia durante essa caminhada e por

partilhar comigo de conhecimentos específicos de pesquisa que foram de grande contribuição.

Sei que este agradecimento não é o suficiente para expressar o quanto sou grata e o quanto me

ajudou.

A querida Adelisandra Castelhano, pela contribuição em diversos momentos,

principalmente por mesmo impossibilitada em pleno feriado, ter vindo me instruir em como

(7)

Ao Gustavo Fernandes, pelo conhecimento específico de Western Blot divido. Muito

obrigada pela paciência em me ensinar cada faceta do processo, e pelas contribuições para que

este trabalho fosse realizado.

A Nailliw, Fabi e Babi pela amizade e disposição em ajudar.

As alunas de iniciação científica, em especial Cícera, Bruna e Loredana pelas

contribuições durante essa caminhada.

Aos laboratoristas: Nathália, Júnior, Vitor, Layor pelo auxílio, contribuição e

disposição em me ajudar sempre. Vocês são a base da realização desse trabalho.

Aos funcionários do Biotério de Ratos: Sr. Domingos e a veterinária Raquel.

Em especial aos amigos, Rafael, Fernando, Adriano Song, Paulo, Marta, Maísa, Paola

e Pritty por terem me dado forças nos momentos mais difíceis desta jornada. Muito obrigada

pelo colo e ombro amigo. Sem vocês e a força de vocês não teria conseguido chegar até aqui.

A todos amigos, colegas e companheiros de trabalho que respeitaram e entenderam

quando por alguns meses me ausentei e me silenciei...

À Universidade Presbiteriana Mackenzie, pela oportunidade de desfrutar até o final da

bolsa de estudos, mesmo não fazendo mais parte do corpo colaborativo da instituição.

(8)

Sem sonhos, as perdas se tornam insuportáveis, As pedras do caminho se tornam montanhas, Os fracassos se transformam em golpes fatais,

Mas, se você tiver grandes sonhos…

Seus erros produzirão crescimento, Seus desafios produzirão oportunidades, Seus medos produzirão coragem. Por isso, meu ardente desejo é que você Nunca desista dos seus sonhos.

(9)

RESUMO

A obesidade é uma epidemia de ordem mundial que é fator de risco para o desenvolvimento

de hipertensão arterial, dislipidemia, hiperglicemia, diabetes tipo 2 e esteatose hepática. O

aumento de obesidade em gestantes além de aumentar o risco do desenvolvimento de doenças

cardiovasculares, também pode estar relacionado com anomalias no desenvolvimento do

Sistema Nervoso Central dos embriões como, por exemplo, redução dos potenciais de longa

duração (LTP) e da neurogênese no hipocampo. É possível que os níveis reduzidos de BDNF

observados nestes embriões, estejam envolvidos com o prejuízo nos processos de aprendizado

e memória exibidos por esses animais. Estudos também mostram que o BDNF se encontra

reduzidos em fetos de mães com hipotiroidismo subclínico materno. Estes filhotes apresentam

piora no desenvolvimento neurológico, demonstrando déficits na memória de longo e de curto

prazo. O presente avaliou se a obesidade materna pode alterar os níveis de BDNF e a

expressão da enzima desiodase do tipo III (D3) no cérebro dos filhotes, com consequente

alteração dos níveis locais de T3 ao 7°, 10° e 16° dias de vida pós-natal. Os nossos resultados

mostraram que a obesidade reduziu a expressão da D3 no 7º dia de vida pós-natal dos filhotes

de mães obesas, mas não nos dias posteriores, sem alteração significativa nos níveis de

BDNF. Não houve alteração significativa nos níveis de BDNF em nenhum dos dias avaliados.

Os nossos dados sugerem que é possível que o hormônio tiroideano esteja envolvido nas

alterações neurofisiológicas observadas em filhotes de ratas obesas.

Palavras– chaves: Obesidade Materna. Desiodase. Obesidade Infantil. BDNF.

(10)

ABSTRACT

Obesity has been considered epidemic in the whole world and is a risk factor for the

development of hypertension, dyslipidemia, hyperglycemia, type 2 diabetes and hepatic

steatosis. The increase of obesity in during pregnancy not only increases the risk of

developing cardiovascular diseases but may also be related to abnormalities in the developing

CNS of embryos, for example, reduction of potential long-term (LTP) in the hippocampus

and neurogenesis . It is possible that the reduced levels of BDNF observed in these embryos,

are involved with the injury in the processes of learning and memory observed in these

animals. Studies also show that BDNF is reduced in fetuses of mothers with maternal

subclinical hypothyroidism. These puppies have worsening neurological development, with

deficits in long and short term memory. Here we evaluated whether maternal obesity may

alter levels of BDNF and enzyme expression of type III deiodinase (D3) in the brains of pups,

with consequent alteration of local levels of T3 to 7 °, 10 ° and 16 ° day-old post -natal. Our

results showed that obesity reduced the expression of D3 on the 7th day of postnatal life of

the offspring of obese mothers, but not in later days. There were no significant alterations in

the levels of BDNF in any of the evaluated days. Our data suggest that it is possible that

thyroid hormone is involved in neurophysiological abnormalities observed in offspring of

obese rats.

(11)

LISTA DE FIGURAS

FIGURA 1: Peso corporal das ratas controle e tratadas com dieta rica em gordura (40%) antes do acasalamento...25 FIGURA 2: Variação do peso corporal das ratas controle e tratadas com dieta rica em gordura (40%) antes do acasalamento...26

FIGURA 3: Peso corporal das ratas controle e tratadas com dieta rica em gordura (40%) durante a gestação...26

FIGURA 4: Variação do peso corporal das ratas controle e tratadas com dieta rica em gordura (40%) ao longo da gestação...27

FIGURA 5: Consumo de ração das ratas controle e alimentadas com dieta rica em gordura (40%) ao longo da gestação...27

FIGURA 6: Peso corporal dos filhotes machos das mães controle e mães obesas aos 7, 10 e 16 dias de vida pós-natal...28

FIGURA 7: Peso corporal dos filhotes fêmeas das mães controle e mães obesas aos 7, 10 e 16 dias de vida pós-natal...28

FIGURA 8: Medida da concentração de BDNF em homogenato de cérebro de filhotes machos de mães controle e obesas aos 07, 10 e 16 dias de vida pós-natal...29

FIGURA 9: Medida da concentração de BDNF em homogenato de cérebro de filhotes fêmeas de mães controle e obesas aos 07, 10 e 16 dias de vida pós-natal...30

FIGURA 10: Medida da expressão de D3 por western blot de homogenato de cérebro de filhotes de mães controle e obesas aos 07 dias de vida pós-natal...31

FIGURA 11: Medida da expressão de D3 por western blot de homogenato de cérebro de filhotes de mães controle e obesas aos 10 dias de vida pós-natal...32

(12)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO... 12

1.2. Obesidade Materna e Prematuridade.... 16

1.3. BDNF e o desenvolvimento... 17

1.4. Hormônio Tireoidiano e Sistema Nervoso Central... 18

2. OBJETIVO... 20

3. MATERIAL E MÉTODOS... 21

3.1. Animais e procedimentos de alimentação... 21

3.2. Procedimento experimental... 22

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA... 24

5. RESULTADOS... 25

6. DISCUSSÃO... 33

REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 36

(13)

12

1. INTRODUÇÃO

A obesidade pode ser definida como um distúrbio multifatorial, caracterizado pela

deposição excessiva de gordura nos tecidos e está diretamente relacionada ao

desenvolvimento da Síndrome Metabólica (MORAES,2011) Pode ser compreendida como

um conjunto de fatores de risco associados ao desenvolvimento de doenças e distúrbios

cardiovasculares, tais como aumento nos níveis de triglicérides, diminuição nos níveis séricos

da lipoproteína de alta densidade (HDL), desenvolvimento de hipertensão arterial, aumento da

glicemia em jejum e resistência à insulina, o que pode preceder o desenvolvimento de

diabetes tipo II (ALBERTI, ZIMMET & SHAW, 2005; YAMADA, et al., 2012).

Nos últimos anos, o aumento significativo da prevalência da síndrome metabólica em

diversas populações e a sua manifestação tanto em crianças quanto em indivíduos adultos,

torna possível sua classificação como uma epidemia de ordem mundial (HELLERSTEIN &

PARKS, 2007).

Porém, é interessante considerar nesse quadro o crescimento da incidência da

obesidade em mulheres em idade reprodutiva. O que torna fundamental compreender nesta

população quais variáveis agem como determinantes no desenvolvimento deste problema

(SULLIVAN, et al., 2010).

No desenvolvimento da obesidade observa-se tanto a hipertrofia quanto a hiperplasia

das células adiposas no organismo (ARNER, et al,. 2010)

A gravidez é considerada um período de risco para o aumento dos depósitos de

gordura por hiperplasia, especialmente o ultimo trimestre (FAZIO, 2010). O aumento dos

casos de obesidade entre gestantes constitui um novo foco para o desenvolvimento de

(14)

13

desencadear doenças como diabetes gestacional, a pré-eclampsia e, consequentemente, o

aumento de cesarianas e nascimento de prematuros (FAZIO,2010).

Além disso, a obesidade gestacional pode estar envolvida no aumento das taxas de

anomalias congênitas e natimortalidade do feto (MORAES, 2011). Dessa forma, os riscos de

doenças no período de gestação, a obesidade na gravidez pode causar problemas de saúde em

longo prazo, tais como doenças cardíacas, hipertensão e diabetes. Estes riscos afetam também

a criança, que tem mais chance de desenvolver obesidade, doenças cardiovasculares e

diabetes (COSTA & SILVA, 2010).

Certamente, a principal causa de obesidade durante a gravidez esta relacionada à

ingestão de alimentação inadequada, (FAZIO, 2010). Por meio de consumo excessivo de

alimentos ricos em açúcares simples, de gorduras animais, ácidos graxos saturados, gorduras

trans (ALLEN, 2005). O acesso a alimentos com alto teor calórico facilita o desenvolvimento

da obesidade não apenas em mulheres, mas também na população infantil (PERGHER et al.,

2010).

Este fator sugere a restrição de crescimento fetal, como forma de resposta adaptativa a

insuficiente oferta de nutrientes necessários para o desenvolvimento do feto, ocasionando

mudanças estruturais e metabólicas resultando no desvio de nutrientes para o crescimento de

outros órgãos (COSTA & SILVA, 2010).

O consumo de micronutrientes e vitaminas considerados fundamentais para a saúde da

gestante e do feto, a saber, ácido fólico, iodo, cálcio e ferro (FAZIO, 2010) proporcionará um

estado nutricional compatível com as necessidades fisiológicas em cada etapa do período

reprodutivo e no período pós-parto (CASTRO, KAC & SICHIERI, 2009).A obesidade infantil

vem sendo objeto de estudos que buscam entender suas causas e consequências. No inicio da

década de 90, a Organização Mundial da Saúde emitiu alerta mundial, com base em

(15)

14

sobrepeso (PETROSKI, 2007). Dentre as causas sociais apontadas encontra-se o novo modelo

familiar moderno, que além de ter como prole apenas um filho, tem em muitos casos as

mulheres como chefe da economia familiar. Isso poderia resultar num alargamento na

disciplina cotidiana dos filhos, induzindo-os a ingestão exagerada de alimentos com altos

níveis de calorias (PETRINI, 2007 apud SANTOS & RABINOVICH, 2011).

Outro fator social evidenciado nessas pesquisas diz respeito à visão acerca do

problema da obesidade infantil. Países considerados economicamente desenvolvidos

apresentam uma relação negativa entre alto nível socioeconômico e obesidade, já os países em

desenvolvimento apresentam uma relação oposta, sendo possível encontrar uma relação

positiva entre alto nível socioeconômico e obesidade infantil (PETRINI, 2007 apud SANTOS

& RABINOVICH, 2011). A obesidade materna parece desempenhar um papel direto na

transmissão de traços obesogênico e diabéticos para a próxima geração. Estudos com animais

demonstraram que a obesidade materna aumenta os riscos de obesidade, hipertensão e outras

facetas de doenças metabólicas na prole (SRINIVASAN et al, 2006;. SAMUELSSON et al,

2008;. SHANKAR et al, 2008;. CHANG et al. , 2008).

Além disso, há a constatação recente que a obesidade materna pode modular a

formação de circuitos neurais, interferindo diretamente no desenvolvimento do Sistema

Nervoso Central da criança (WRIGHT, EVANS & VOIGT, 2011). Estudos recentes têm

relatado que filhos de mães obesas mostram anormalidades no desenvolvimento do circuito

neural (TOZUKA et al., 2009b).

O fator neurotrófico derivado do cérebero (BDNF) desempenha um papel importante

na sobrevivência, manutenção e diferenciação de muitos tipos de neurônios e é

abundantemente expressa no hipocampo. Evidências sugerem que reduções nos níveis de

BDNF interferem com potenciais de longa duração (LTP) e neurogênese (BINDER &

(16)

15

recém formados podem contribuir para a função do hipocampo, constituindo um possível

mecanismo celular para a aprendizagem e memória (SHORS et al, 2001;. SAXE et al, 2006;.

ZHANG et al, 2008;. DUPRET et al, 2008;. FARIOLI-VECCHIOLI et al, 2008;. IMAYOSHI

et al, 2008).

Animais alimentados com dieta rica em gordura (HFD) apresentam aprendizagem

hipocampo-dependentes prejudicada, baixos níveis de BDNF no hipocampo e neurogênese

reduzida em comparação com os animais alimentados com dieta normal (MOLTENI et al,

2002;. LINDQVIST et al, 2006;. STRANAHAN et al. , 2008b).

Esses resultados sugerem que a obesidade pode levar a uma redução na aprendizagem

e a memória como resultado da diminuição dos níveis de BDNF resultante da menor

arborização dendrítica no hipocampo de novos neurônios. Em filhotes de camundongas

alimentadas com dieta rica em gordura também se observa prejuízo na realização de tarefas

comportamentais dependentes do hipocampo. O teste de labirinto Barnes mostra que filhotes

de mães tratadas com HFD apresentam prejuízos na aquisição de aprendizado espacial nos

jovens. Também foi observada nesses animais, redução na produção de BDNF no hipocampo

(TOZUKA, et al.,2010).

Tomados em conjunto, esses dados sugerem que a obesidade durante a gravidez

interfere no desenvolvimento do Sistema Nervoso Central dos filhotes e, que esse fenômeno

(17)

16

1.2. Obesidade Materna e Prematuridade

A prematuridade teve um aumento significativo nos últimos anos e é dependente da

idade gestacional (IG), mas é multifatorial. Mesmo havendo a implantação de políticas de

assistência e de acompanhamento obstetrícia por parte dos governos de diversos países, esse é

um evento que não sofreu redução, mesmo em países desenvolvidos. Infecções maternas

possuem a maior predominância como causa do nascimento prematuro, como também o

estresse e a distensão abdominal (DEMARTINI, BAGATIN & BOGUDZEWAKI, 2011). O

parto prematuro espontâneo está diretamente relacionado ao histórico familiar da mãe e ao

baixo nível econômico, sendo assim, entre 40% e 50% nascimentos prematuros são

considerados de causas desconhecidas (DEMARTINI, BAGATIN &

BOGUDZEWAKI,2011).

A Síndrome Metabólica (SM) também pode estar envolvida no aumento da

prematuridade, devido às doenças cardiovasculares, diabetes e infecções que são ocasionadas

pela alimentação desregrada e rica em gordura (DAMIANI, et al., 2011). Desta forma,

mulheres com sobrepeso e obesas, possuem o risco maior de parto prematuro, nascimento

pré-termo induzido e aumento do risco de parto prematuro antes de 33 semanas (NOMURA,

2012). Quanto mais pesada a mulher, maior o risco de pré-termo precoce, assim como

também é maior o risco de ter um bebê de peso extremamente baixo ao nascer (COSTA &

SILVA, 2011; YESSOUFOU & MOUTAIROU, 2011). Há avanços contínuos na terapia

intensiva dos neonatos, levando a diminuição da mortalidade que, na sua maioria, possuem

peso de nascimento e idade gestacional inferior, comprometendo a qualidade de vida, seu

crescimento e o desenvolvimento neuropsicomotor (DEMARTINI, BAGATIN &

(18)

17

No período de desenvolvimento da criança, identificar o excesso de peso durante o

crescimento é de grande importância por constituir um grande risco de sobrepeso e obesidade

na vida adulta, afinal a obesidade infantil está correlacionada com fatores de risco comuns na

idade adulta para doenças crônicas como a diabetes, doença cardiovascular, e outras

morbidades. Como também, há uma forte correlação do excesso de gordura visceral

abdominal e uma moderada correlação de deposição no músculo esquelético e hepática de

lípidos (BOUCHARD, 2009; DUARTE & SILVA).

1.3. BDNF e o desenvolvimento

O BDNF é um membro da família das neurotrofinas (NT), juntamente com o fator de

crescimento do nervo (NGF) e as neurotrofinas-3 e -4/ 5 (NT-3 e NT-4/5), que é constituída

por pequenas proteínas que desempenham importante papel no desenvolvimento do sistema

nervoso em vertebrados. Uma característica comum de organização do gene nesta família é a

existência de um exon de codificação única cuja expressão é complexa devido à

multiplicidade do promotor e por splicing alternativo de transcritos.

As várias funções de BDNF são significativas no sistema nervoso periférico (PNS) e

do sistema nervoso central (SNC), exercendo proliferação, diferenciação e sobrevivência de

efeitos, bem como funções de execução essenciais para sustentar os processos normais de

comportamento.

BDNF desempenha um papel chave na regulação da atividade sináptica, na

neurotransmissão e na plasticidade em muitos grupos de neurônios maduros.

Na obesidade sua importância está atrelada ao desenvolvimento neurológico,

plasticidade sináptica e tem papel importante em processos de aprendizagem e memória. Há

(19)

18

energia (NOBLE et al., 2010) . Por exemplo, os baixos níveis circulantes de BDNF têm sido

encontrados em indivíduos com obesidade e diabetes tipo 2 (DAVIDSON et al.,2009), bem

como uma relação inversa entre a concentração de BDNF periférica e índice de massa

corporal (IMC) em crianças e adultos (DAVIDSON et al.,2005). No entanto, em humanos

com diabetes tipo 2, os níveis plasmáticos de BDNF são mais baixos independentemente da

obesidade, sugerindo que o BDNF pode regular a obesidade e resistência à insulina através de

mecanismos diferentes (SCHWARTZ &MOBBS, 2012).

1.4. Hormônio Tireoidiano e Sistema Nervoso Central

Os produtos sintetizados pela tireoide, que incluem a 3,5,3’-triiodotironina (T3) e a

3,5,3’,5’-tetraiodotironina ou tiroxina (T4), requerem a presença de quantidades adequadas de

iodo, que oscilam entre 100 a 150 µg/dia em um indivíduo adulto (LARSEN; DAVIES; HAY,

1999). Na maior parte do mundo há pequenas quantidades de iodo nos alimentos devido a sua

escassez no solo (GRANNER, 2003). Uma maneira simples e eficiente de se evitar a

deficiência de iodo e a ocorrência de bócio endêmico foi a implantação de política pública de

se acrescentar o iodo no sal de cozinha.

Em seres humanos o principal produto da tireoide é o T4. No entanto, o T3 é a forma

biologicamente ativa que se liga ao seu receptor, fazendo do T4 apenas um pró-hormônio

(CATALDO et al., 2001). Menos de 20% do total de T3 circulante é oriundo da secreção

direta pela glândula (MEDEIROS-NETO; KNOBEL, 1992) sendo a maior parte derivada da

desiodação do anel externo da molécula de T4 nos tecidos por ação de enzimas chamadas

(20)

19

A desiodação do hormônio tireoidiano é dependente das desiodases do tipo I, II e III

(D1, D2, D3, respectivamente). Essas três enzimas constituem um grupo de proteínas que

podem ativar ou inativar o hormônio da tireoide. D1 e D2 agem ativando o pró-hormônio T4

em T3. A D1 é considerada cineticamente menos eficiente quando comparada à D2 e seu

papel ainda não está muito claro. (BIANCO & KIM, 2006). A D2 é encontrada na tireoide,

cérebro, hipófise anterior, gordura marrom, coração, músculo esquelético e placenta e parece

ser a principal responsável pelo T3 circulante (BIANCO & KIM, 2006).

Em contraste, a desiodase tipo III (D3), previne a ativação do T4, convertendo-o em

T3 reverso (rT3) e transformando T3 em T2, que são consideradas formas inativas do

hormônio, o que confere à D3 o papel único de causar hipotireoidismo local, ou seja, apenas

em alguns tecidos específicos. A D3 pode ser encontrada no cérebro, pele, intestino, útero e

placenta. Embora seja expressa em poucos tecidos na vida pós-natal, é vastamente observada

em pacientes criticamente doentes, durante inflamação crônica e em hipóxia e sua atividade

está associada à redução de T3 sistêmico (FISHER, 1990; BURROW et AL., 1994;

SIMONIDES, W.S., et al 2008).

Os hormônios tireoidianos produzidos pela mãe durante a gravidez, especialmente

tiroxina (T4), são cruciais para o desenvolvimento do cérebro no início da fase embrionária de

mamífero. Estudos epidemiológicos e relatos de caso têm mostrado que o hipotireoidismo

subclínico materno pode resultar em efeitos negativos significativos na gravidez e

desenvolvimento neurológico do feto. Filhotes de ratas com hipotiroidismo subclínico

mostram déficits na memória de longo e de curto prazo.

Além disso, esses animais também apresentam níveis reduzidos de RNAm para o gene

do BDNF assim como a expressão do próprio BNDF no hipocampo, o que pode explicar o

(21)

20

Assim, é razoável supor que as alterações observadas nos filhotes de grávidas obesas

podem estar relacionadas a variações no conteúdo de T3 disponível no Sistema Nervoso

Central, que levariam a mudanças na expressão do BNDF com consequente prejuízo nos

processos de aprendizado e memória.

O balanço energético positivo causado pela ingestão prolongada de HFD induz à

hiperativação do eixo hipotálamo-hipófise-tireoide, caracterizada por elevações do TRH

hipotalâmico, aumento na captação de iodeto pela tiróide e aumento dos níveis plasmáticos de

TSH. No entanto, os níveis de T3 e T4 permanecem normais sugerindo uma alteração na

atividade das desiodases. De fato, a atividade da desiodase do tipo 1 no fígado encontra-se

aumentada no fígado e no rim com consequente elevação dos níveis de rT3 (ARAUJO et al.,

2010). É possível que o aumento da atividade do eixo HPT leve ao aumento na atividade da

atividade da D3.

Assim, a hipótese deste trabalho contemplou a possibilidade de que durante a obesidade

materna observe-se aumento na expressão da enzima desiodase do tipo III no cérebro dos

filhotes, com consequente redução dos níveis de T3. De modo que o hipotireoidismo local

possa estar envolvido com os prejuízos nos processos de aprendizado e memória observados

nos filhotes de mães obesas.

2. OBJETIVO

Avaliar a expressão da enzima desiodase do tipo III (DIII) e o índice do BDNF presente no

(22)

21

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Animais e procedimentos de alimentação

Os procedimentos foram realizados sob a autorização do Conselho de Ética da

Universidade Presbiteriana Mackenzie, Processo CEUA/UPM Nº 089/03/2012 (anexo 1).

Foram utilizadas 10 ratas fêmeas Wistar, com 2 meses de vida alojadas em gaiolas

de plástico e submetidas a um ciclo 12h claro/escuro, na temperatura de 22°C e acesso ad

libitum à água e comida divididas nos seguintes grupos:

Controle (n=10): Ratas alimentadas com ração padrão

Experimental (n=10): Ratas alimentadas com dieta rica em gordura (40%) por 1 mês

para o desenvolvimento da obesidade.

Após esse período as ratas foram expostas a ratos machos para o acasalamento.

As fêmeas foram acompanhadas para observação do dia da fecundação e separadas

em gaiolas individuais. O peso corporal das ratas foi avaliado diariamente até o dia do

nascimento dos filhotes. O peso corporal dos filhotes foi determinado desde o nascimento até

o final dos protocolos experimentais.

Cada rata permaneceu com apenas 6 filhotes e os filhotes excedentes foram

eutanasiados por excesso de anestésico injetável (uretana). Os protocolos experimentais

(23)

22

3.2. Procedimento experimental:

Quantificação da D3 por Western blot: Aos 7 dias de idade, 2 filhotes de cada

fêmea foram anestesiados com Uretana (1200 mg/kg) e o cérebro foi removido e

imediatamente congelado para a quantificação da desiodase do tipo 3 por Western

blotting, a fim de determinar se a obesidade materna eleva a expressão da D3 nos

seus filhotes. O mesmo procedimento foi realizado para os animais de 10 dias e 16 dias.

Neste experimento iremos utilizar 20 animais.

Western blot: 20 mg de proteínas foram submetidas à corrida eletroforética em gel de

poliacrilamida para separação, de acordo com o peso molecular, sem perda de

unidades protéicas. O processo envolveu um sistema descontínuo de dois géis contíguos com

concentrações diferentes: o primeiro gel, o gel de resolução [stacking gel – 5% (acrilamida

5%; bisacrilamida 0,5%; stacking buffer – TRIS Buffer 0,125 M; SDS 1% pH 6,8;

Temed 0,025% e persulfato de amônio 0,025%)] e o segundo gel, o gel de separação [running

gel –10% (acrilamida 30%; bisacrilamida 0,8%; running buffer – TRIS Base 0,375 M pH 8,8;

SDS 0,1%; Temed 0,025% e persulfato de amônia 0,025%)] onde as proteínas foram

separadas de acordo com seus pesos moleculares. As amostras foram solubilizadas em

tampão contendo SDS 2%; glicerol 10% TRIS Base 0,0625 M pH 6,8; bromofenol blue

0,001% e 2- mercaptoentanol 5%. O tampão de corrida utilizado consiste de TRIS Base

0,025M; glicina 0,192M e SDS 0,1%. Paralelamente às proteínas mitocondriais, correu-se um

marcador de peso molecular. A 5D3, de 31 kD, foi localizada, utilizando-se como

referência a proteína anidrase carbônica de 30 kD. As amostras foram então transferidas

eletroforeticamente para uma membrana de nitrocelulose (Immobilon, Millipore Co, Bedford

MA), usando tampão de transferência (Tris base 0.17M, glicina 0.17M, metanol a15%,

pH 8.3). A membrana foi incubada overnight com tampão Tris e solução bloqueadora 0.5 %,

(24)

23

usando-se um kit comercial de quimioluminescência para western blot (Roche

Molecular Biochemicals, Indianapolis IN), de acordo com as instruções do fabricante.

A intensidade do sinal foi medida por densitometria, usando-se um programa de imagem

NIH (Scientific Computing Resource Center).

Determinação dos níveis de BDNF no cérebro. A fim de confirmar que a obesidade

materna leva à redução dos níveis de BDNF nos filhotes, quantificamos por imunoensaio esse

fator neurotrófico. Assim, anestesiamos 2 filhotes de fêmeas controles e experimentais

distintas com uretana (1200mg/Kg) aos 7, 10 e 16 dias de vida para remoção do cérebro que

foi imediatamente congelado. A homogeneização do tecido foi preparada com tampão (pH

7,0) e centrifugada para a realização do imunoensaio. O número total de animais utilizados

em cada grupo está especificado nas figuras.

Procedimento de imunoensaio: O imunoensaio foi realizado de acordo com a tecnologia

Multiplex, utilizando-se kit comercial Milliplex map, baseada na tecnologia Luminex® x

MAP®, que utiliza código interno de cores em microesferas

com dois corantes fluorescentes. Através de concentrações precisas destes corantes, 100

conjuntos de esferas coloridas distintas podem ser criados, cada uma das quais é revestida

com umanticorpo de captura. Após o analito da amostra ser capturado pelo grânulo, um

anticorpo biotinilado de detecção é introduzido. A mistura de reacção é, em seguida,

incubadas com estreptavidina-PE conjugado, a molécula repórter, para completar a reacção na

superfície de cada microesfera. As microesferas passam através de um laser, que excita os

corantes internos que marcam o conjunto de microsferas. Um segundo laser excita PE, o

(25)

24

velocidade identifica cada microesfera individualmente e quantifica o resultado do sua

bioensaio com base nos sinais fluorescentes repórteres.

4. ANÁLISE ESTATÍSTICA

A significância estatística da diferença entre os valores médios dos grupos foi testada pela

Anova One-way, seguido do teste Student-Newman- Keuls para detectar diferenças entre os

grupos. Para a realização dos testes estatísticos e construção dos gráficos foi utilizado o

software Prisma (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Para todos os testes p<0,05 foi

considerado estatisticamente significante. Todos os resultados foram expressos como média e

(26)

25

5. RESULTADOS

No presente estudo nós avaliamos o efeito da obesidade materna sobre a expressão da

D3 e dos níveis de BDNF no cérebro dos filhotes. Para tanto, induzimos a obesidade em ratas

fêmeas por meio do tratamento com dieta rica em gordura (40%) por três semanas antes do

acasalamento. Como podemos ver nas Figuras 1 e 2, as fêmeas tratadas com dieta rica em

gordura engordaram significativamente mais do que as fêmeas do grupo controle no período

que antecedeu a fecundação. Uma vez estabelecida a obesidade nas ratas fêmeas, elas foram

acasaladas e, como podemos observar na Figura 3, o aumento de peso nas ratas obesas não foi

diferente do aumento do peso observado nas ratas controles, ou seja, a dieta rica em gordura

não levou a maior ganho de peso durante a gestação.

0 10 20 30

140 160 180 200 220 240 260 Peso Controle Peso Experimental dias P e s o Co rp o ra l (g )

(27)

26 0 20 40 60 80 100 Controle Experimental

*

P e s o C o rp o ra l (g )

Figura 2. Variação do peso corporal das ratas controle e tratadas com dieta rica em gordura (40%) antes do acasalamento. Os valores estão expressos como média±EP. * vs. Controle com p< 0.008.

Dias

P

e

s

o

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 0 100 200 300 400 500 Controle Experimental

Figura 3. Peso corporal das ratas controle e tratadas com dieta rica em gordura (40%) durante a gestação. Os valores estão expressos como média±EP.

É intrigante o fato das ratas alimentadas com dieta rica em gordura apresentarem, ao

(28)

27

padrão. Seria de se esperar que esse aumento no consumo de ração hipercalórica resultasse em

maior ganho de peso corporal, mas isso não foi observado.

0 50 100 150 Controle Experimental  P e s o Co rp o ra l (g )

Figura 4. Variação do peso corporal das ratas controle e tratadas com dieta rica em gordura (40%) ao longo da gestação. Os valores estão expressos como média±EP.

0 5 10 15 20

0 10 20 30 Controle Experimental

*

* *

*

*

dias Co n s u m o d e r a ç ã o ( g /d ia )

Figura 5. Consumo de ração das ratas controle e alimentadas com dieta rica em gordura (40%) ao longo da gestação. Os valores estão expressos como média±EP. * vs. Controle com p< 0.0001.

Como podemos observar na Figura 6, os filhotes de mães obesas não apresentam

aumento no peso corporal a não ser no 16° dia de vida. O mesmo aconteceu com os filhotes

(29)

28 0 20 40 60 Controle Experimental

P07 P10 P16

*

P e s o ( g )

Machos

Figura 6. Peso corporal dos filhotes machos das mães controle e mães obesas aos 7, 10 e 16 dias de vida pós-natal. Os valores estão expressos como média±EP. * vs. P16 controle com p<0.001.

0 10 20 30 40 50 Controle Experimental

P07 P10 P16

*

P e s o ( g )

Fêmeas

Figura 7. Peso corporal dos filhotes fêmeas das mães controle e mães obesas aos 7, 10 e 16 dias de vida pós-natal. Os valores estão expressos como média±EP. * vs. P16 controle com p<0.001.

Como não fizemos o esfregaço nas fêmeas para determinar a data da fecundação, não

podemos incluir se houve algum caso de prematuridade. Mas três ninhadas de ratas obesas

apresentaram morte de neonatos, mas não observamos isso nos animais controles. Além disso,

em uma ninhada houve o óbito de um filhote que estava bem abaixo do peso em relação aos

(30)

29

Umas das alterações no cérebro de animais obesos descritas na literatura é a menor

expressão de BDNF (TOZUKA et al,.2010). Assim, nós nos perguntamos se a obesidade

materna poderia influenciar os níveis desse fator de crescimento nos seus filhotes. Para tanto,

nós medimos o BDNF no cérebro dos filhotes nos dia 07, 10 e 16 de vida pós-natal. Como

podemos observar nas Figuras 8 e 9, tanto filhotes machos quanto fêmeas apresentam

tendência de diminuição nos níveis de BDNF, mas sem significância estatística. É possível

que com um número maior de animais pudéssemos observar queda significativa.

0 100 200 300 400

500 Controle

Experimental

P07

P10

P16

Machos

BD

NF

(

g

/m

l)

(31)

30

BDNF

0 100 200

300 Controle

Experimental

P07

P10

P16

Fêmeas

Figura 9. Medida da concentração de BDNF em homogenato de cérebro de filhotes fêmeas de mães controle e obesas aos 07, 10 e 16 dias de vida pós-natal. Os valores estão expressos como média±EP.

A principal pergunta do presente estudo foi a se os níveis de D3 estariam alterados em

filhotes de mães obesas. Assim, medimos por Western blot a expressão dessa enzima no

cérebro dos filhotes a fim de tentar responder a essa questão.

Como podemos observar nas figuras 10,11 e 12 existe uma queda na expressão da D3

nos filhotes fêmeas de mães obesas ao 07º dia de vida pós-natal. No entanto, não se observa

esse efeito aos 10º e 16º dias de vida pós-natal. Embora nossos dados sejam ainda

preliminares, parece que a obesidade materna leva a alterações na expressão da D3, que leva a

alterações nas quantidades locais de T3 disponíveis no cérebro.

Além disso, há a constatação recente que a obesidade materna pode modular a

formação de circuitos neurais, interferindo diretamente no desenvolvimento do Sistema

Nervoso Central da criança (WRIGHT, EVANS & VOIGT, 2011). Estudos recentes têm

relatado que filhos de mães obesas mostram anormalidades no desenvolvimento do circuito

neural (TOZUKA et al., 2009b).

O fator neurotrófico derivado do cérebero (BDNF) desempenha um papel importante

(32)

31

abundantemente expressa no hipocampo. Evidências sugerem que reduções nos níveis de

BDNF interferem com potenciais de longa duração (LTP) e neurogênese (BINDER &

SCHARFMAN, 2004; MATTSON, 2008). Recentemente demonstrou-se que os neurônios

recém formados podem contribuir para a função do hipocampo, constituindo um possível

mecanismo celular para a aprendizagem e memória (SHORS et al, 2001;. SAXE et al, 2006;.

ZHANG et al, 2008;. DUPRET et al, 2008;. FARIOLI-VECCHIOLI et al, 2008;. IMAYOSHI

et al, 2008).

0.0

0.5

1.0

1.5

Fêmea Controle 07

Fêmea Experimental 07

Macho Controle 07

Macho Experimental 07

*

DI

O

3

(

u

a

)

*

(33)

32

0

600

1200

Fêmea Controle 10

Fêmea Experimental 10

Macho Controle 10

Macho Experimental 10

D

IO

3

(

u

a

)

Figura 11. Medida da expressão de D3 por western blot de homogenato de cérebro de filhotes de mães controle e obesas aos 10 dias de vida pós-natal. Os valores estão expressos como média±EP.

0

500

1000

Fêmea Controle 16 Fêmea Experimental 16 Macho Controle 16 Macho Experimental 16

DI

O

3

(

u

a

)

(34)

33

6. DISCUSSÃO

A obesidade está relacionada com diversas alterações sistêmicas que são chamadas em

conjunto de Síndrome Metabólica (SM). A SM é caracterizada por adiposidade central,

hiperglicemia, dislipidemia, diabetes tipo 2 e esteatose hepática.

Recentemente a obesidade materna tem sido relacionada com alterações

neurofisiológicas que resultam em prejuízos nas funções cognitivas e de memória da criança

(WRIGHT, EVANS & VOIGT, 2011). De fato, filhotes de ratas obesas mostram

anormalidades no desenvolvimento do circuito neural principalmente em hipocampo

(TOZUKA et al., 2009b).

Um fator muito importante no desenvolvimento do SNC é o hormônio tiroideano. Sua

disponibilidade local é regulada pelas enzimas desiodases que são capazes de ativar o T4 em

T3 ou inativar o T4 em r T3 e o T3 a T2. No presente estudo nós avaliamos a expressão da

enzima desiodase do tipo 3, D3, no cérebro de filhotes de mães obesas em diferentes idades

de vida pós natal a fim de determinar a condição de obesidade materna leva a flutuações no

níveis locais de T3 que poderiam estar envolvidas nas alterações dos circuitos cerebrais

descritas na literatura (SHARMAR&FULTON, 2012).

Ao contrário do que esperávamos, houve redução na expressão da D3 no cérebro aos

07 dias de vida pós-natal, o que pode ser responsável pela menor inativação do T4 a rT3. É

possível que o aumento do T3 local durante fases críticas do desenvolvimento do SNC esteja

envolvido nas alterações observadas nos circuitos neurais do hipocampo de filhotes de maes

obesas. É sabido que o hipertiroidismo materno também resulta em alterações severas no

desenvolvimento do SNC (AHMED et al,.2012).

Sabe-se que os níveis de T3 ao longo do desenvolvimento do SNC apresenta

(35)

34

3. Se a obesidade materna altera a expressao da D3, então também teremos mudanças nos

niveis locais de T3, podendo resultar em modificações neurofisiologias importantes. No

entanto, não podemos descartar um possível envolvimento da D2. A expressão ou atividade

dessa enzima não foi avaliada no presente estudo. Se nos animais estudados houve diminuição

concomitante na atividade da D2, os níveis de T3 estariam normalizados, uma vez que a D2

ativa o T4 em T3. Assim, mais experimentos precisam ser realizados para confirmar esses

dados.

Nos dias 10 e 16 de vida pós natal não foram encontradas diferenças significativas na

expressão da D3. Sabe-se que nas fases mais tardias do desenvolvimento do SNC, a expressão

da D3 cai significativamente e sua importância nessa fase diminui. Talvez por isso não

tenhamos detectado alterações na expressão dessa enzima

No modelo estudado nao conseguimos mostrar alterações significativas nos niveis de

BDNF no cérebro dos filhotes de ratas obesas, apesar de haver clara tendência de queda tanto

em filhotes fêmeas quanto em machos em todos os dias de vida estudados. Talvez a obesidade

induzida no nosso modelo nao tenha sido suficiente para levar à alterações mensuráveis nos

níveis de BDNF. Ou ainda, a metodologia empregada, medida da expressão da D3 por

Western blot em homogenato do cérebro inteiro, não seja refinada o suficiente para detectar as

variações induzidas pela obesidade. Além disso, a análise no cérebro inteiro e não em regiões

específicas como o hipocampo, também podem prejudicar a análise dos resultados.

É necessário que outros experimentos sejam feitos em ratas com obesidade mais

severa e por mais tempo antes do acasalamento. De fato, esse seria um modelo mais adequado

por replicar mais fidedignamente o que se observa na população de humanos e deve ser

testado no futuro próximo.

Quando analisamos os pesos dos filhotes notamos que aos 07 e 10 dias não há

(36)

35

Portanto, no nosso modelo, não encontramos efeitos da obesidade materna sobre o peso dos

filhotes até o 10 dia de vida. No entanto, em animais mais velhos aos 16 dias de vida

pós-natal, tanto machos quanto fêmeas, apresentaram ganho significativo de peso quando

comparados aos animais filhos de maes tratadas com dieta padrão. Assim, é possível que a

obesidade materna tenha influência sobre o peso corporal dos filhotes nas fases mais tardias.

Outra possibilidade, no entanto, é dos filhotes estarem se alimentando da dieta da mãe. Isso

levaria ao aumento do peso corporal independente do peso materno.

Conclusão: A obesidade materna reduz a expressão da enzima D3 no SNC dos seus filhotes.

Esse aumento na ativadade da D3 pode levar a maior disponibilidade de T3 no SNC. Esse

“hipertiroidismo” local pode estar envolvido nas alterações dos circuitos neurais do filhotes

(37)

36

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(41)

40

ANEXO 1

Imagem

Figura 1. Peso corporal das ratas controle e tratadas com dieta rica em gordura (40%) antes do acasalamento
Figura  2.  Variação  do  peso  corporal  das  ratas  controle  e  tratadas  com  dieta  rica  em  gordura  (40%)  antes  do  acasalamento
Figura  5.  Consumo  de  ração  das  ratas  controle  e  alimentadas  com  dieta  rica  em  gordura  (40%)  ao  longo  da  gestação
Figura 6. Peso corporal dos filhotes machos das mães controle e mães obesas aos 7, 10 e 16 dias de vida  pós-natal
+4

Referências

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