Determinação de parâmetros cinéticos de fermentação alcoólica em diferentes substratos

DETERMINAÇÂO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM DIFERENTES SUBSTRATOS

JULIANO TONIATO

Dissertação apresentada à Faculdade de

Ciências Agronômicas da UNESP–Campus de

Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Agronomia (Energia na Agricultura)

CAMPUS DE BOTUCATU

DETERMINAÇÂO DE PARÂMETROS CINÉTICOS DE

FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA EM DIFERENTES SUBSTRATOS

JULIANO TONIATO

Orientador: Prof. Dr. Waldemar Gastoni Venturini Filho

Dissertação apresentada à Faculdade de

Ciências Agronômicas da UNESP–Campus de

Botucatu, para obtenção do título de Doutor em Agronomia (Energia na Agricultura)

Todo homem seria covarde se tivesse coragem para isso.

À Faculdade de Ciências Agronômicas de Botucatu (FCA) da Universidade Estadual Paulista (UNESP).

ÀFAPESPpela bolsa concedida, apoio financeiro e técnico.

Ao coordenador da Pós-graduação em Agronomia (Energia na Agricultura) da Faculdade de Ciências Agronômicas.

Ao professor orientador Waldemar Gastoni Venturini Filho, pela orientação e ensinamentos transmitidos

Ao prof. Cesar Martins e prof. Pedro Novelli, pela ajuda força, amizade e ensinamentos.

A todos amigos que me ajudaram nesse trabalho: Jamile Bassetto, Andressa Nogueira, Fernanda Bronzatto, Bruno da Silva Jubileu, Francine Boesso e Maíra Uliana, um muito obrigado.

Ao Quadripé, pelos dias homéricos que passamos juntos e, que ainda estão claros como Cristal em minha memória.

Ao meu grande amigo Bruno Innocenti pela amizade e em segundo, pela ajuda na obtenção das leveduras junto À LNF-Brasil, e à empresa por ter ajudado.

À Miriam Roberta Henrique e à Usina Açucareira São Manoel pela ajuda e suporte com material e tempo.

À Márcia Garcia (Técnica Horticultura) por toda ajuda, paciência e conversas.

Aos amigos verdadeiros; por mesmo não tendo seus nomes aqui, ainda saberem o quanto são importantes.

SUMÁRIO

Página

LISTA DE TABELAS... X LISTA DE FIGURAS... XII LISTA DE EQUAÇÕES... XIII

RESUMO... 1

SUMMARY... 4

CAPÍTULO I... 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS... 6

1.1. INTRODUÇÃO... 6

1.2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA... 7

1.2.1. Leveduras alcoólicas -Saccharomyces cerevisiae... 7

1.2.2. Taxonomia... 7

1.2.3. Metabolismo: Fermentação alcoólica e respiração... 8

1.2.4. Fermentação alcoólica... 9

1.2.5. Cinética ... 9

1.3. REFERÊNCIAS... 14

CAPÍTULO II... 16

VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS………..………... 16

RESUMO... 16

SUMMARY... 16

2.1. INTRODUÇÃO... 17

2.2. MATERIAL E MÉTODOS... 19

2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 22

2.4. CONCLUSÕES... 29

2.5. AGRADECIMENTOS... 29

LISTA DE TABELAS

Página

CAPÍTULO II... 16

VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS... 16

Tabela 2.1: Velocidade especifica () a partir da fermentação dos três mostos... 22

Tabela 2.2. Consumo de açúcar, produção de etanol e quociente respiratório.…… 25

Tabela 2.3. Fatores de conversão paras os mostostestados ………..……. 27

Tabela 2.4. Caracterização da matéria prima utilizada no preparo dos mostos ... 28

CAPÍTULO III... 35

FERMENTAÇÃO DO MELAÇO... 36

Tabela 3.1– Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto de melaço…. 36 Tabela 3.2–Açúcar (g/L) consumido durante a fermentação do mosto de melaço 37 Tabela 3.3 – Biomassa (g/L) produzida durante a fermentação do mosto de melaço... 38

Tabela 3.4 – Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) produzida durante a fermentação do mosto de melaço………... 38

Tabela 3.5 –Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço... 39

Tabela 3.6– Velocidades Instantâneas de produção de Biomassa (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço... 39

Tabela 3.7 - Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol (цP), e biomassa (цX)... 40

Tabela 3.8 – Comparação estatística entre os fatores de conversão calculados a partir dos dados experimentais... 41

FERMENTAÇÃO DO CALDO DE CANA………...……… 43

Tabela 3.12–Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h)………. 46

Tabela 3.13–Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h)...……… 47

Tabela 3.14–Velocidades Instantâneas de produção de biomassa substrato (g/L.h) 48

Tabela 3.15: Valores de цMax para a consumo de substrato (µS), produção de

etanol (µP), e biomassa (µX)……….……….………...……….…... 49

Tabela 3.16–Comparação estatística entre os fatores de conversão referentes à

fermentação do caldo-de-cana.……….……….……….……….……….……….… 49

FERMENTAÇÃO DO MOSTO MISTO... 51 Tabela 3.17–Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto misto……... 51

Tabela 3.18–Substrato consumido (g/L) durante a fermentação do mosto misto... 52

Tabela 3.19–Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) durante a

fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……….…... 53

Tabela 3.20–Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h) durante a

fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….……….…… 54

Tabela 3.21–Velocidades Instantâneas de produção de biomassa (g/L.h) durante a

fermentação do mosto misto……….……….……….……….……….………. 55

Tabela 3.22– Valores de цMax……….……….……….……….……….……….... 56

Tabela 3.23 - Comparação estatística entre os fatores de conversão referentes à

LISTA DE FIGURAS

Página

CAPÍTULO I... 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS... 6

Figura 1.1. (A) representação linear das fases do crescimento e (B) representação semilogarítmica... 11

Figura 1.2: Curvas típicas da variação das concentrações dos componentes de uma fermentação……... 12

CAPÍTULO II... 15

VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS………... 16

Figure 2.1: Ethanol production (g L-1_{) during the 10 hours of experiment……… 23}

Figure 2.2: Sugar consumption (g L-1_{) during the 10 hours of experiment………... 24}

Figure 2.3: Biomass production (g L-1_{) during the 10 hours of experiment……….. 26}

CAPÍTULO III... 35

FERMENTAÇÃO DO MELAÇO... 36

Figura 3.1–Planilha do Excel utilizada para o cálculo das velocidades específicas... 40

Figura 3.2 – Representações gráficas dos dados obtidos durante a fermentação do melaço... 42

FERMENTAÇÃO DO CALDO DE CANA... 39

Figura 3.3–Representações gráficas dos dados obtidos durante a fermentação do caldo de cana... 50

FERMENTAÇÃO DO CALDO DE MOSTO MISTO... 51

Página

CAPÍTULO I... 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS... 6

Equação 1.1: Cálculo das velocidades instantâneas de consumo de substrato, produção de etanol e biomassa... 12

Equação 1.2. Cálculo das velocidades especificas de consumo de substrato, produção de etanol e biomassa... 12

Equação 1.3.Fator de conversão de substrato em produto……... 13

Equação 1.4.Fator de conversão de substrato em Biomassa…... 13

Equação 1.5: Tempo de geração característico de cada cepa ... 13

CAPÍTULO II... 16

VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURA... 16

Equação 2.1. Cálculo das velocidades instantâneas de consumo de substrato, produção de etanol e biomassa... 20

Equação 2.2. Cálculo das velocidades especificas de consumo de substrato, produção de etanol e biomassa... 20

Equação 2.3. Cálculo dos fatores de conversão ... 21

Equação 2.4. Cálculo dos fatores de conversão ... 21

Equação 2.5. Quociente respiratório... 21

RESUMO

O etanol é um combustível verde que além da influência na econômica possui grande

impacto social, político e ambiental. O objetivo deste trabalho foi descrever a cinética

fermentativa e o rendimento de quatro linhagens de leveduras na fermentação em três mostos

compostos de melaço, Caldo de cana e misto de melaço e caldo de cana. As linhagens

escolhidas foram BG-1, CAT-2 e PE-2 (de destilarias) e UNIFERM (levedura seca de

panificação. A fermentação ocorreu em triplicada e a cada hora foram medidos o teor de

açúcares redutores, etanol e massa celular. A linhagem BK foi a que apresentou maior

velocidade de produção de etanol e consumo de substrato. CAT-1 foi a que mais produziu

etanol. As duas linhagens formam o grupo das rápidas enquanto as linhagens PE-2 e BG-1

foram as que apresentaram as menores velocidades ficando no grupo das lentas. PE-2

apresentou dois dos maiores fatores de conversão YP/S enquanto a BG-2 tendeu a consumir

densidade da espuma.

SPECIFIC VELOCITY AS A TOOL TO COMPARE PERFOMANCE OF FOUR STRAINS

OF ALCOHOLIC YEAST Botucatu, 2013. 50p. Dissertacao (Mestrado em

Agronomia/Energia na Agricultura) – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade

Estadual Paulista.

Author: JULIANO TONIATO

Adviser: WALDEMAR GASTONI VENTURINI FILHO

SUMMARY

Ethanol is a greenhouse-friendly fuel with immense social, political and environmental

impact. Our objective was to describe fermentative performance and yield for four yeast

strains from Brazilian ethanol plants during the fermentation of three types of must - molasses,

Sugar cane and mixed must (sugarcane and molasses). We used BG-1, CAT-2 e PE-2 (ethanol

plant strains) eUNIFERM (dry baker’s yeast). Fermentations were carried in triplicates. Each

hour we collected and analyzed samples for reducing sugars, ethanol and biomass. Yeasts

the highest ethanol yield. For the slow fermenter PE-2 had two of the greatest YP/S factors

while BG-1 tended to use sugar through aerobic pathways. Kinetic parameters could not be

related to ethanol yielding although, they are directly connected to foam formation and its

characteristics.

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

1.1 INTRODUÇÃO

Atualmente o petróleo fornece aproximadamente 1/3 da energia primária consumida no mundo, sendo considerada a principal fonte energética, desde o bem estar pessoal até o desenvolvimento industrial, e a prestação de serviços. Assim alterações no suprimento ou no uso do petróleo teriam desdobramentos econômicos, políticos e sociais importantes para a maior parte das nações do mundo. Devido à combustão crescente de combustíveis fosseis iniciada à 60 anos, nota-se uma escassez e o aumento do preço desta fonte não renovável de energia. Portanto essas alterações que estão sendo gradualmente intensificadas exigem mudanças nos padrões industriais e de consumo da sociedade humana, de forma a reduzir a emissão de gases do efeito estufa. (PEREIRA et al., 2008)

e seu custo é competitivo sem os subsídios que viabilizaram o programa no seu início, o Proálcool. Além disso, desde os tempos do Brasil colônia, a cultura da cana-de-açúcar tem sido uma grande fonte de riqueza para a economia brasileira (SCHNEIDER. et al., 2012).

Hoje, o Brasil é o maior produtor mundial de cana-de-açúcar e etanol com crescente aumento na produção. No primeiro semestre de 2012 foram exportados mais de 595 mil litros e em 2011 foram exportados mais de 2 milhões de litros (UNICA, 2012).

1.2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.2.1 Leveduras alcoólicas -Saccharomyces cerevisiae

A leveduraS. cerevisiaeé a responsável pela produção do etanol através da fermentação no Brasil. O processo utiliza a sacarose proveniente da cana-de-açúcar, na forma de caldo de cana e melaço, como substrato para fermentação. Durante os processos de fermentação industrial, as leveduras passam por diversas formas de stress (BATISTOTE et al., 2011 e BROSNAN et al., 2000 assim as cepas de S. cerevisiae utilizadas como inóculos nas usinas

devem apresent ar elevada velocidade de ferm ent ação, bom rendim ent o de conversão de subst rat o para et anol e células, resist ência aos elevados t eores alcoólicos e resist ência à elevada t em perat ura de ferm ent ação.

1.2.2 Taxonomia

A levedura alcoólica Saccharomyces cerevisiae pertence ao Filo Ascomycota, Classe

Saccharomycetes, Ordem Saccharomycetales, Família Saccharomycetaceae, gênero

Saccharomyces (SUH e BLACKWELL, 2006). Elas têm passado por inúmeras mudanças

1.2.3 Metabolismo: fermentação alcoólica e respiração

Os fungos, reino aos quais as leveduras pertencem, são seres que não possuem maquinária autotrófica; produzem energia através de fontes externas (TRABULSI, 2008). As leveduras alcoólicas metabolizam anaerobicamente o açúcar, para gerar energia (ATP) que será empregada na realização de diversos trabalhos fisiológicos (absorção, excreção e outros) e biossíntese necessários à manutenção da vida, crescimento e multiplicação, para perpetuar a espécie. O etanol e o CO2 resultantes se constituem tão somente de produtos de excreção (TORIJA, 2003).

A degradação do açúcar até etanol e gás carbônico envolve 12 reações em seqüência ordenada, cada qual catalisada por uma enzima específica. Inicialmente, a sacarose, que é um dissacarídeo, se hidrolisa na presença da enzima invertase, produzindo os monossacarídeos glicose e frutose. A seguir, sob ação de outras enzimas, os monossacarídeos são fermentados, produzindo o etanol com a liberação de gás carbônico, o que pode ser expresso matematicamente pela equação química simplificada de Gay Lussac:

C12H22O11 + H2O→2 C6H12O6

C6H12O6→2 CH3CH2OH + 2 CO2+ 23,5 kcal

(CARVALHO et al., 2007). Thomson et al. (2005) confirma essas informações dizendo que a alta concentração de glicose acelera a glicólise, com produção de quantidades de ATP pela fosforização do substrato. Esse mecanismo reduz a necessidade da fosforilação oxidativa, diminuindo no final da via a necessidade de oxigênio. O autor afirma que esse fenômeno surgiu de mecanismos de competição derivados da natureza antisséptica do etanol.

1.2.4 Fermentação alcoólica

A fermentação alcoólica é fortemente afetada vários fatores como, por exemplo, os químicos (açúcar, oxigênio, pH, minerais, vitaminas), físicos (temperatura, agitação) e biológicos (bactérias contaminantes e leveduras selvagens).

Um dos fatores de maior importância é a temperatura de fermentação. Embora as leveduras alcoólicas sejam organismos que crescem em diferentes temperaturas, a fermentação pode ocorrer dentro de uma faixa de 10°C até 35°C. Em temperaturas maiores que 40ºC as células começam a se tornar inviáveis (ANGELIS, 1987). Dentro deste intervalo, quanto maior a temperatura, maior será a velocidade do processo fermentativo, sendo também maior a formação de produtos secundários a fermentação (KLEIN, 2006).

TORIJA et al. (2003) diz que com o aumento da temperatura há maior formação de metabólitos secundários como o glicerol, ácido acético e ácido succínico. Gutierrez (1993) também mostrou que com o aumento de temperatura e da concentração de sacarose ocorreu maior formação de álcool isoamílico pelas leveduras estudadas.

1.2.5 Cinética

Na fermentação alcoólica, os substratos (açúcares) são transformados em produtos (etanol), e parte da energia (ATP) gerada é usada para a produção de biomassa (células). Assim, as concentrações de substrato (açúcar), produto (etanol) e células (levedura) variam com o tempo da fermentação. Hiss (2001) define a variação dessas concentrações como

observa-se um comportamento característico dos valores de concentração celular, que didaticamente é dividida em fases (GRETSCHMANN 2009 e HISS, 2001):

- Fase 1: latência, que segue imediatamente à inoculação do meio com o microorganismo (Saccharomyces cerevisiae). Trata-se de um período de adaptação durante o qual a célula sintetiza as enzimas necessárias ao metabolismo dos componentes do meio. Durante esta fase não há reprodução celular;

- Fase 2: transição, onde se observa o início da reprodução microbiana propriamente dita, havendo um aumento gradual da velocidade de crescimento;

-Fase 3:logarítmica ou exponencial, em que a velocidade de crescimento é máxima;

-Fase 4: linear de crescimento, com velocidade de reprodução constante;

-Fase 5: desaceleração, devido ao esgotamento do meio de cultura e ao acúmulo de inibidoes, em que a velocidade de crescimento diminui até se anular;

-Fase 6: Nesta fase, os nutrientes estão escasseando e os produtos tóxicos estão tornando-se mais abundantes. Nesta etapa não há um crescimento líquido da população, ou seja, o número de células que se divide é equivalente ao número de células que morrem.

-Fase 7: declínio ou lise, a taxa de morte é maior que a taxa de produção de novas células.

Figura 1.1 - Parte superior (A), a representação linear das fases do crescimento e na parte inferior (B), a representação semilogarítmica (Fonte: HISS (2001).

Para estudos cinéticos, Nascimento et al. (2009) e Hiss (2001) recomendam o acompanhamento dos itens de acordo com os seguintes critérios. Como substrato, chamado de

“S” elege-se o composto que limita a reação; como produto, o de interesse econômico

(chamado de “P”), e finalmente X, como a concentração do microorganismo, chegando-se

assim à S=glicose, P=Etanol e X=Levedura.

Figura 1.2: Curvas típicas da variação das concentrações dos componentes de uma fermentação, onde S, X, P, representam substrato, levedura e produto respectivamente e S0,X0seus valores iniciais (HISS (2001).

É possível comparar quantitativamente as diferentes condições de cultivo através da diferença entre as concentrações finais e iniciais (denominadas dX, dP e dS).

Dividindo-se esses valores pelo tempo gasto (dt tendendo à zero) temos as velocidades

instantâneas de transformação (“r”) descritas pelas equação1.1, abaixo. Os autores chamam de

rX, rSe rPde produtividade de produção de biomassa, de consumo de substrato e produção de produto respectivamente (HISS, 2001).

(1.1)

Devido ao fato de X (concentração celular) variar como tempo e como conseqüência a concentração do complexo enzimático responsável pela conversão S-P, Gaden (1955) sugeriu

a normalização pelas velocidades especificas “µ” de crescimento, consumo de substrato e de

formação de produto, descrito pelas equação (1.2) a seguir.

(1.2)

 (1.3)

O autor também sugeriu o fator de conversão de substrato em biomassa (fórmula 4).

(1.4)

Hiss (2001) ainda descreve que a fase exponencial de crescimento também tem como característica o tempo de geração tg, ou seja, o tempo necessário para que o valor da concentração celular dobre (logo X = 2Xi)

Assim,

ou (1.5)

1.3 Referências bibliográficas

ANGELIS, D.F. Leveduras. In: _________ (Org):Microbiologia da fermentação alcoólica. Rio Claro: UNESP, 1987. p.41-62.

BATISTOTE, M. et al. Yeast selection for fuel ethanol production in Brazil.Ciência e Natura, Ufsm, v. 2, n. 32, p.83-95, 2010.

BROSNAM, M. P. et al. The estress response is repressed during fermentation in brewery strains of yeast.Revista Analytica, United Kingdom, v. 88, n. 5, p.746-755, 2000. doi: 10.1046/j.1365-2672.2000.01006.x.

DEANGELIS, D.F. (Org). Microbiologia da Fermentação Alcoólica. Rio Claro: UNESP, 1987, p.72-79.

GADEN, E.J. Fermentation kinectics and productivity.Chem. Ind., v.12, p.154-159, 1955.

GRETSCHMANN, A.S. Ajuste de curvas na produção de etanol num processo em

batelada. In: X ENCONTRO GAÚCHO DE EDUCAÇÃO MATEMÁTICA, 10., 2009, Ijui:

Anais... Ijui: Trabalhos X EGEM. 2009. Disponível em:

<http://www.projetos.unijui.edu.br/matematica/cd_egem/fscommand/CC/CC_61.pdf > . Acesso em : 22 abril. 2013.

GUIMARÃES, T.M. et al. Isolation and characterization of Saccharomyces cerevisiae strains of winery interest.Brazilian Journal Of Pharmaceutical Sciences, São Paulo, v. 1, n. 42, p.119-126, 2006.

GUTIERREZ, L.E. Produção de álcoois superiores por linhagens de saccharomyces durante afermentação alcoólica,Sci. Agric., v.50,p.464-472, 1993.

HISS, H. Cinética de processos fermentativos In: SCHMIDELL, W.; LIMA, U.A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W.R (Coord.) Biotecnologia Industrial. São Paulo: Edgard Blücher, 2001. p.93-122.

KLEIN, T. Avaliação de aromas característicos produzidos por diferentes

levedurascomerciais inoculadas no mosto da cv. Chardonnay. 2006. 51f. Tese (Conclusão) – CentroFederal de Educação tecnológica de Bento Gonçalves, Bento Gonçalves, 2006.

Disponível

NASCIMENTO, P.T.S. et al. Exogenous factors in the development of flexible fuel cars as a local dominant technology.Rev. J. Technol. Manag. Innov., v.4, p.110-119, 2009.

PEREIRA, Jr. N.; COUTO, M.A.P.G.; ANNA, L.M.M. Santa.Biomass of lignocellulosic composition for fuel ethanol production and the context of biorefinery.v.2 Rio de Janeiro: Ed. Amiga Digital Ufrj, 2008. 45 p. (Biotechnology).

RIBEIRO, C.A.F.; HORII, J. Potencialidades de linhagens de levedura Saccharomyces

cerevisiaepara a fermentação do caldo de cana.Sci. Agric., v. 56, p.255-263, 1999.

SCHNEIDER, C.F. et al. l.Revista Verde, Mossoró, v. 7, n. 5, p.8-17, dez. 2012. special edition.

SUH, S.O.; BLACKWELL, M. Phylogenetics of Saccharomycetales, the ascomycetesyeasts.

Mycologia, v.98, p.1006-1017, 2006.

THOMSON, J.M. et al. Resurrecting ancestral alcohol dehydrogenases from yeast. Nature genetics,v.6, p.630–635, 2005.

TORIJA, M.J. et al. Effects of fermentation temperature on de strain population ofSaccharomyces cerevisiae.Rev. Int J. Food Microbiol., v.80, p.47-53, 2003.

TRABULSI, L.R.; ALTESTHUM, F.Microbiologia. 5.ed. São Paulo: Atheneu, 2008. 760p.

VELOCIDADE ESPECIFICA COMO UMA FERRAMENTA PARA COMPARAR A PERFORMANCE DE QUATRO LINHAGENS DE LEVEDURAS DURANTE A FERMENTAÇÃO DE MOSTOS FEITO DE MELAÇO, CALDO DE CANA E MISTO.

RESUMO

Nosso objetivo foi comparar e descrever o comportamento cinético de quatro linhagens utilizadas nas usinas durante a fermentação do mosto misto de melaço e caldo de cana. Nós utilizamos as linhagens CAT-1, PE-2 e BG-1 (usinas) e fermento seco de panificação (marca UNIFERM). As leveduras foram testadas em triplicatas. Amostras foram coletadas a cada hora e analisadas quanto ao teor de açúcares redutores, etanol e biomassa. CAT-1 teve a maior produção de etanol e fator (YP/S), entretanto a linhagem BK apresentou as maiores velocidades

(rs, rp,sandp). BG-1 apresentou os altos valores de QR, logo bom crescimento celular, PE-2

correlacionados com a formação e características da espuma formada.

ABSTRACT

Since Pasteur yeast selection is used as technique for detecting strains with certain properties. Nowadays, some strains have been already isolated from Brazilian ethanol plants. Our objective was to describe and compare kinetic behavior of four strains used in Brazilian ethanol plants during the fermentation of musts made of sugar cane, molasses and mixed must

of sugarcane juice and molasses and check whether specific velocity () is a good tool to

compare yeasts’ performance. We used BG-1, CAT-2 e PE-2 (ethanol plant strains) and BK

(dry baker’s yeast). Fermentations were carried in triplicates. We collected samples each hour

and then, analyzed them for reducing sugars, ethanol and biomass. CAT-1 and BK are fast fermenters, BK was the fastest fermenter with the greatest velocities (rs, rp, sandp) while CAT-1 had the greatest ethanol yield and substrate conversion in two musts (YP/S) and the second highestsands. Yet, BG-1 tends to show high QR,thus good growth and PE-2 didn`t

finish the process. s and P values were not related to ethanol yielding and substrate conversion, although these parameters seem to have a direct correlation to foam formation and density.

2.1 INTRODUÇÃO

O etanol exerce grande influência na economia, sociedade e meio ambiente. O brasil produziu mais de 23 bilhões de litros durante a safra 2011/2012, o que representa U$48 bilhões do BIP, injetando em média U$23 milhões na economia (UNICA, 2013 e REYNOL, 2009). O setor representa 6% de todos os empregos da agroindústria (VILAÇA; PINTO, 2011). Além disso, o etanol de cana é altamente competitivo com o milho (LEITE, 2005).

O etanol é produzido durante a fermentação, nesse processo a leveduraSaccharomyces

oxidar o substrato na presença de oxigênio produzindo menos etanol; é o efeito Pasteur, um importante fator nas fermentações industriais.

O processo de produção de etanol, no Brasil, se utiliza principalmente da sacarose do caldo de cana e/ou melaço (BATISTOTE et al. 2010). Várias técnicas pode ser empregadas na obtenção do caldo, por exemplo, esmagamento mecânico ou difusão (ALCARDE et al., 2012 e MENEGUETTI et al., 2011), enquanto melaço é o resíduo da centrifugação durante a processo de produção do açúcar, e por essa razão mais impuro (MACHADO, 2012 e PAYNE, 1989).

A linhagem da levedura, juntamente com a composição do mosto, exercem importante papel na produção enzimática responsável pela fermentação. Diferentes perfis podem, por exemplo, aumentar a produção de componentes de crescimento celular (ácido nucleico e proteínas), enquanto outros podem ser de caráter adaptativo, o que de certa maneira, interfere na no etanol produzido. (BRANDÃO et. al., 2007; GUIMARÃES et al., 2006 e LIMA et al., 2001). Temperatura, pH e vitaminas do mosto também desempenham papel importante na fermentação (BRANDÃO et al., 2007 e THOMSON 2005).

Quando Pasteur (1866) notou que o tipo de levedura utilizado na produção de vinhos eram responsáveis por determinadas características, ele iniciou a busca por linhagens que culminariam em técnicas, em sua maioria dispendiosas, que permitem marcar linhagens e as escolher por suas características (SUÁREZ-LEPE, MORATA, 2012 e SUÁREZ-LEPE, IÑIGO, 2004). Recentemente, Basso et al. (2008) mostrou que as técnicas resultam em linhagens como as CAT-1, PE-2, BG-1, SA-1 e Y904. Não coincidentemente, Batistote et al. (2010) relatou que dentre essas linhagens, Catanduva 1 (CAT-1), Pedra 2 (PE-2), Barra Grande 1 (BG-1) e o fermento de panificação são as mais utilizadas pelas usinas sucoenergéticas do Brasil.

Foram comparadas quarto linhagens de leveduras–uma linhagem de panificação (BK)

e três marcas comerciais utilizadas em usinas no Brasil.

As marcas comerciais foram CATANDUVA (CAT-1), BARRA GRANDE (BG-1) e

USINA DA PEDRA (PE-2), uma vez que elas são as mais utilizadas nas destilarias (BATISTOTE et al. 2010); UNIFERM (BK) foi escolhida como a de panificação por ser facilmente encontrada em panificadoras e estabelecimentos comerciais.

O mosto, com 15ºBrix, foi obtido após a diluição em água da matéria prima. No caso do mosto misto, o caldo de cana e o melaço foram diluídos separadamente, seguidos da homogeneização e checagem do ºBrix. O teor de solido solúveis (ºBrix) foi checado em refratômetro digital. Pol, pH e pureza foram analisados e calculados de acordo com Copersucar (2001) e Brasil (2005).

Cada linhagem foi fermentada em triplicata perfazendo um total de 36 parcelas experimentais. Cada parcela consistia em 5 litros do respectivo mosto inoculados na proporção de 10% (m/m)–os volumes foram calculados em pré-teste de maneira que após as 11 coletas,

permanecesse um volume de no mínimo 90% do original e o processo se encerrasse dentro de 10 horas. As fermentações ocorreram em béqueres de 11 litros em temperatura ambiente.

Foram coletadas amostras horárias seguidas de congelamento com nitrogênio líquido. A técnica permitiu o processamento de amostras simultâneas, entretanto a formação de cristais influencia a viabilidade e possivelmente a quantificação da biomassa, Shi et al. (2013) provou que o congelamento à -18ºC pode diminuir em 50% a viabilidade, além disso, a viabilidade após a liofilização pode ser menor que 0,1% (BERNY; HENNEBERT, 1991).

Análises químicas

Após serem descongeladas, as amostras foram analisadas para açúcares redutores (AR), etanol e biomassa, de acordo com os seguintes protocolos.

 Açúcares redutores – Método colorimétrico através da oxidação com o ácido

 Etanol–Oxidação do etanol pelo dicromato de potássio descrito por Joslyn (1970)

 Biomassa–Método gravimétrico descrito por Cooney (1981).

Parâmetros cinéticos

Velocidade instantânea.

Velocidade Instantânea “r” é a velocidade medida em um determinado instante. A

equação 1 (mostra os cálculos aonde “rS” é a velocidade instante na de consumo de

substrato; “rP” é a velocidade instantânea de produção de etanol e r é a velocidade

instantânea do crescimento celular.

(1)

Velocidade especifica “”

As velocidades instantâneas são importantes ferramentas na descrição da performance em condições especificas entretanto, ela não é suficiente para comparar e descrever diferente mostos e diferentes concentrações de inóculo – a quantidade de complexo enzimático

responsável pela fermentação varia, o que afeta diretamente a transformação S-P. É possível normalizar as taxas, dividindo-se os valores de “r” pela sua biomassa correspondente. O

resultado é conhecido como velocidade especifica () descrita na fórmula 2 (GADEN, 1955).

(2)

Ribeiro e Horii (1999) relataram que os valores de  são maiores na fase exponencial

do crescimento microbiano, e que em muitos estudos o parâmetro pode ser chamado de MAX

Gretschmann (2009) descreve como o substrato consumido é convertido em produto e biomassa nos chamados fatores de conversão, sendoYP/Sofator de conversão de substrato em

produto(equação 3) eYX/Sofator de conversão de substrato em biomassa(equação 4).

(3)

(4)

Coeficiente respiratório

Kocková-Kratochvílová (1990) reporta que a relação entre fermentação e respiração pode ser expressa pelo quociente respiratório (QR) cujo valor varia com o tipo de levedura. A equação 5 permite afirmar que quanto maiores as condições de anaerobiose maior será o valor

de QR(FERNANDES, 2008 e KOCKOVÁ-KRATOCHVÍLOVÁ, 1990).

No presente trabalho, o quociente respiratório foi calculado a partir dos valores experimentais de açúcar e dos valores de CO2 e O2 obtidos a partir de cálculos estequiométricos.

(5)

Análise estatística

Os dados foram plotados e analisados através do programa estatístico OriginPro (versão 8, OriginLab). As curvas foram ajustadas utilizando a equação de Boltzmann para ajustes sigmoides como descrito na equação 6.

2.3.RESULTADOS E DISCUSSÃO

De acordo com os parâmetros cinéticos (tabela 1) as leveduras puderam ser divididas em dois grupos–rápidas e lentas.

Tabela 2.1:Velocidade especifica máxima para os três mostos testados.

BG-1 PE-2 CAT-1 BK

µS–melaço 0.38 0.27 0.48 0.56

µP–melaço 0.12 0.07 0.17 0.25

µX–melaço 0.06 0.02 0.03 0.01

µS–caldo de cana 0.08 0.09 0.15 0.21

µP–caldo de cana 0.22 0.24 0.36 0.84

µX–caldo de cana 0.01 0.01 0.02

---S–misto 0.19 0.24 0.37 0.51

P–misto 0.07 0.07 0.16 0.22

X–misto 0.02 0.01 0.05 0.03

Velocidades especificas máximas para consume de substrato (µS), produção de etanol (µP) e crescimento celular (µX) para os

mostos feitos de “melaço”, “caldo de cana” e “misto”, não foi

possível detectar crescimento na linhagem BK durante a fermentação do mosto de caldo de cana.

No grupo das rápidas estão as leveduras que apresentam altos valores de S e P e logo, os menores tempos de fermentação. BK foi a mais rápida das quatro quanto as velocidades de consumo de substrato e produção de etanol–a fermentação havia se completou

entre as 3 primeiras horas de experimento (figura 1 e 2).

Figura 1:Produção de etanol em (g L-1_{) durante as 10 horas de experimento.}

maiores velocidades de consumo de substrato.

1

1

volta da quinta hora. Mesmo estando em Segundo nos valores cinéticos deS eP, a levedura apresentou a maior produção absoluta de etanol nos três motos testados (tabela 2).

Silva (2011) chama o grupo de Tumultuosa e mostra outra característica desse tipo de fermentação– para o autor toda a produção e liberação de CO2 e calor estão concentradas na

fase exponencial e consequentemente na espuma. Usinas cujo tempo é um fator importante e que estão preparadas para o calor e espuma formados podem se beneficiar das leveduras desse grupo.

No grupo das lentas estão as linhagens BG-1 e PE-2. PE-2 apresentou a maior quantidade de açúcar residual após as dez horas de experimento, por outro lado apresentou os maiores valores de conversão (yP/S) em dois dos três mostos testados (tabela 3). Conclui-se que

Tabela 2.2Consumo de açúcar (g), produção de etanol (g) e quociente respiratório dos três mostos testados.

BG-1 PE-2 CAT-1 BK

Δ S –melaço 108.13 105.16 107.61 106.58

Etanol–melaço 39.23 46.14 46.21 44.76

QR–melaço 2.92 4.27 4.00 3.78

Δ S –caldo de cana 106.17 81.01 109.47 108.11

Etanol–caldo de

cana 36.22 31.38 40.75 38.45

QR–caldo de cana 2.22 2.77 2.37 2.66

Δ S –misto 98.17 97.11 99.44 103.92

Etanol–misto 38.03 31.38 40.75 37.70

QR–misto 2.80 2.16 3.22 2.49

TA – Etanol total em g: Δ S açúcar residual após as 10 horas de fermentação e QR

a fermentação não havia acabado e que respeitado sua velocidade, ela poderia produziria quantidades satisfatórias de etanol. No gráfico isso é verificado pela baixa inclinação da curva.

BG-1 foi a quarta levedura testada e a que apresentou os menores valores de S eP, até três vezes menor que os de BK. Os valores de QR e de etanol produzidos indicam que a levedura foi quem mais utilizou substrato por vias aeróbicas, o que explica os fatores de crescimento YX/S e o crescimento celular (figura 3). Leveduras secas são utilizadas na alimentação animal há mais de seis décadas. Thrune et al. (2009) observaram que o uso da levedura triplicou nos últimos 10 anos nos Estados Unidos, passando de 16,9 para 50,8% o número de produtores que utilizam a levedura como fonte de aditivo alimentar no rebanho leiteiro. Além disso, os processos tradicionais de propagação de leveduras requerem entre 8 e 15 dias, chegando a 30 dias em alguns casos. Esses fatores reforçam a importância da linhagem para as empresas que comercializem a levedura seca.

Batistote et al. (2010) encontraram o mesmo desempenho em três linhagens de destilarias durante a fermentação do caldo de cana. Entretanto, em seu experimento BK foi a de menor desempenho cinético e em produção de etanol – a marca comercial de levedura de

panificação pode ser uma possível explicação.

Pavlak et al. (2011) por outro lado achou maiores valores de YP/S, entretanto o autor usou hidrolisado de batata doce como mosto–Muitos fatores podem influenciar a cinética dos

hidrolisados fazendo a diferir da do mosto de cana de açúcar. Dentre as diferenças que podemos citar estão pH, a presença de inibidores como ácidos fracos (ácido acético), furfural,

BG-1 PE-2 CAT-1 BK

YP/S–Melaço 0.36 0.44 0.43 0.42

YX/S–Melaço 0.12 0.05 0.05 0.04

YP/S–Caldo de

cana 0.34 0.39 0.37 0.36

YX/S–Caldo de

cana 0.04 0.06 0.04

-YP/S- Misto 0.39 0.32 0.41 0.36

hidroximetil furfural e componentes fenólicos (ANDRADE et al., 2013; LI et al., 2011 e ALMEIDA et al., 2009).

Alcarde et al. (2012) mostrou outro fator que pode explicar essas diferenças, o autor afirma que a microbiologia é um importante fator e que juntamente com as características físico-químicas do mosto podem afetar fortemente a formação de metabolitos secundários. A tabela 3 está de acordo com essas informações - o melaço apresenta baixa pureza, o que representa menos açúcares e mais componentes solubilizados, além disso, a maturação da cana no experimento 2 (15,6 ºBrix) pode ter influenciado a capacidade fermentativa do mosto(ALCARDE et al. 2012 e Rodrigues 1995).

Tabela 2.4: Caracterização da matéria prima usada no prepare dos mostos.

ºBrix pol pureza pH

Melaço 79.13 11.40 69.00 6.06

Caldo de cana 15.60 11.50 74.00 5.43

Misto–Caldo de cana 20.1 17.8 88.50 5.54

Misto - Melaço 86.00 4.60 53.20 6.26

ºBrix (ºBrix), pol (g L-1_{), pureza (%) e pH da material prima} empregada no prepare do mosto.

As curvas ajustadas de nosso experimento (figuras 1 e 2) seguem o padrão sigmoide de crescimento microbiano (HISS, 2001). Nesta curva, a fase exponencial representa a taxa mais rápida de metabolismo que a levedura pode apresentar, o que pode ser numericamente

representado pelos valores de “”. Além disso, o metabolismo consiste em fermentar a fonte

de carbono em etanol, calor e crescendo com a energia necessária. Durante nosso experimento

associadas à espuma e suas características.

2.4.CONCLUSÃO

As leveduras puderam ser divididas em dois grupos de acordo com a velocidade e tempo de fermentação.

CAT-1 e BK estão no grupo das rápidas –usinas que o tempo é um importante fator e

que estão preparadas para a espuma e o calor formado, associados à altos valores de , podem se beneficiar das linhagens

Além disso, BK foi a linhagem que apresentou a maior velocidade especifica de consume de substrato e produção de etanol em todos os mostos testados enquanto CAT-1 foi a que apresentou a maior produção de etanol

BG-1 e PE-2 são fermentadoras lentas por apresentarem valores de  até três vezes menores que os de BK. A espuma e o calor formados seguiram a tendência.

Ainda, PE-2 apresentou dois dos três maiores fatores de conversão de substrato em etanol, mesmo a fermentação não tendo se completado após as dez horas.

BG-1 apresentou as menores velocidades de consume de substrato e produção de etanol, entretanto ela apresentou altos valores de coeficiente respiratório o que pode ser um indicativo para usinas que vendam levedura seca para a alimentação animal.

Pela análise dos dados, as velocidades instantâneas e especificas não puderam ser relacionadas com a produção de etanol, entretanto elas foram diretamente proporcionais à espuma e suas características.

2.5. AGRADECIMENTOS

À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo

(FAPESP – processo nº 2010/14318-7) e Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de

2.6. REFERÊNCIAS

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3.1 - Tabelas da fermentação do Melaço

Tabela 3.1–Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do

mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin

Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 4,46 4,81 8,78 16,25

2 9,12 8,84 20,12 30,73

3 16,71 13,02 30,48 39,03

4 25,72 17,37 37,71 42,64

5 33,13 21,87 41,84 44,02

6 37,59 26,55 43,94 44,52

7 39,79 31,40 44,95 44,69

8 40,77 36,44 45,42 44,76

9 41,19 41,65 45,63 44,78

mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

0 113,03 113,78 113,14 114,10

1 34,41 28,60 33,06 22,55

2 13,76 14,19 11,98 4,12

3 8,34 11,76 6,43 2,00

4 6,91 11,34 4,97 1,78

5 6,54 11,28 4,59 1,75

6 6,44 11,26 4,49 1,75

7 6,41 11,26 4,46 1,75

8 6,41 11,26 4,45 1,75

9 6,40 11,26 4,45 1,75

Tabela 3.3–Biomassa (g/L) produzida durante a fermentação do mosto de melaço. Os

valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

0 65,05 65,03 65,00 65,97

1 65,25 65,08 65,01 66,70

2 66,23 65,21 65,17 67,66

3 69,65 65,57 67,01 68,66

4 74,78 66,36 70,21 69,47

5 77,35 67,58 70,73 69,99

6 77,99 68,74 70,76 70,30

7 78,12 69,42 70,76 70,45

8 78,15 69,72 70,76 70,53

9 78,15 69,83 70,76 70,57

10 78,15 69,87 70,76 70,59

Tabela 3.4–Velocidades Instantâneas de produção de etanol (g/L.h) produzida

durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 2,33 3,88 9,25 16,22

2 4,66 4,03 11,34 14,48

3 7,59 4,18 10,37 8,30

4 9,01 4,34 7,22 3,61

5 7,40 4,51 4,13 1,38

6 4,46 4,68 2,10 0,50

7 2,20 4,85 1,01 0,18

8 0,98 5,03 0,47 0,06

9 0,42 5,22 0,21 0,02

durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 78,61 85,18 80,08 91,55

2 20,65 14,41 21,08 18,43

3 5,42 2,44 5,55 2,12

4 1,42 0,41 1,46 0,22

5 0,37 0,07 0,38 0,02

6 0,10 0,01 0,10 0,00

7 0,03 0,00 0,03 0,00

8 0,01 0,00 0,01 0,00

9 0,00 0,00 0,00 0,00

10 0,00 0,00 0,00 0,00

Tabela 3.6–Velocidades Instantâneas de produção de Biomassa (g/L.h)

durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 0,20 0,05 0,01 0,73

2 0,98 0,14 0,16 0,96

3 3,42 0,36 1,84 1,00

4 5,13 0,79 3,20 0,81

5 2,57 1,22 0,52 0,53

6 0,65 1,16 0,03 0,30

7 0,13 0,68 0,00 0,16

8 0,02 0,30 0,00 0,08

9 0,00 0,11 0,00 0,04

Figura 3.1 – Exemplo de planilha do Excel utilizada para o cálculo das velocidades

específicas. Ela foi construída de acordo com o proposto por Hiss (2001). X(g/L) é a concentração horária da Biomassa, M(g/L) é a concentração do componente que se prentende

calcular o ц, dM/dt é o a velocidade instanea “r” e цmé a velocidade específica.

Tabela 3.7 - Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol (цP), e biomassa (цX)

цS rS цP rP цX

BG-1 1.17a 86,70a 0.11b 13.86a 0,050b

PE-2 1.38a 88,90a 0.13ab 13.00a 0,013a

CAT-1 1.39a 90,97a 0.14ab 20.29a 0,08ab

BK 1.41a 91,54a 0.23 a 20.63a 0,11a

Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol (цP), e

biomassa (цX), bem como as velocidades instantâneas máximas para o consumo de

fatores de conversão calculados a partir dos dados experimentais, os dados são referentes à fermentação do melaço. Letras diferentes indicam valores diferentes (p>5).

Fator de conversão

BG-1 0.35 a

PE-2 0.37 a

CAT-1 0.41 a

Figura 3.2 – a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação do

Siglas

BG-1 - Usina Barra Grande, CAT-1 - Usina Catanduva PE-2 - Usina da Pedra

BK–Levedura de Panificação, marca UNIFERFM

Tabela 3.9 – Etanol produzido (g/L) durante a

fermentação do mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin

Tempo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

0 0,96 1,47 -0,53 0,00

1 3,02 3,00 5,52 12,02

2 6,22 5,17 15,36 38,02

3 10,78 8,07 26,07 38,45

4 16,44 11,71 33,64 38,45

5 22,41 15,90 37,52 38,45

6 27,72 20,28 39,18 38,45

7 31,76 24,41 39,84 38,45

8 34,49 27,96 40,09 38,45

9 36,18 30,77 40,19 38,45

Tabela 3.10 – Açúcar consumido (g/L) durante a

fermentação do mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin

Tempo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

0 111,1 111,1 111,1 111,1

1 104,09 101,12 108,49 111,16

2 97,87 99,99 87,40 52,82

3 88,54 97,55 62,19 20,78

4 75,69 92,58 38,73 8,66

5 59,96 83,41 21,48 4,75

6 43,25 69,24 10,87 3,55

7 27,98 52,45 5,04 3,19

8 15,82 37,81 2,03 3,09

9 7,15 28,09 0,54 3,05

Tabela 3.11 – Biomassa produzida (g/L) durante a

fermentação do mosto de melaço. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin. Pelo tratamento estatístico e pela a variabilidade próprio da metodologia a levedura BK aparentemente não cresceu.

Tempo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

0 72,68 66,18 65,50 69,16

1 72,75 66,18 65,56 69,16

2 72,94 66,18 66,53 69,16

3 73,41 66,18 68,89 69,16

4 74,32 66,18 69,28 69,16

5 75,49 66,18 69,30 69,16

6 76,42 66,69 69,30 69,16

7 76,91 71,77 69,30 69,16

8 77,11 72,61 69,30 69,16

9 77,18 72,62 69,30 69,16

Tabela 3.12 – Velocidades Instantâneas de produção de

etanol (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 2,05 1,53 6,05 12,02

2 3,21 2,16 9,84 26,00

3 4,56 2,90 10,71 0,43

4 5,66 3,64 7,57 0,00

5 5,97 4,19 3,88 0,00

6 5,30 4,38 1,66 0,00

7 4,04 4,14 0,66 0,00

8 2,73 3,55 0,25 0,00

9 1,70 2,81 0,10 0,00

substrato (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin.

Intervalo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 CONTROLE

1 6,22 1,13 21,09 58,33

2 9,33 2,43 25,21 32,05

3 12,85 4,97 23,46 12,12

4 15,73 9,18 17,25 3,91

5 16,71 14,17 10,61 1,20

6 15,27 16,79 5,83 0,36

7 12,16 14,64 3,01 0,11

8 8,66 9,72 1,50 0,03

9 5,69 5,34 0,73 0,01

Tabela 3.14 – Velocidades Instantâneas de produção de

biomassa substrato (g/L.h) durante a fermentação do mosto de melaço a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin. As velocidades da linhagem BK é zero pois devido ao tratamento estatístico e à metodologia, a levedura aparentemente não cresceu.

Intervalo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 CONTROLE

1 0,07 0,00 0,06 0,00

2 0,19 0,00 0,97 0,00

3 0,47 0,00 2,36 0,00

4 0,91 0,00 0,39 0,00

5 1,17 0,01 0,02 0,00

6 0,93 0,51 0,00 0,00

7 0,49 5,07 0,00 0,00

8 0,20 0,84 0,00 0,00

9 0,08 0,01 0,00 0,00

Tabela 3.15 - Valores de цMax para a consumo de substrato (µS), produção de

etanol (µP), e biomassa (µX), bem como as velocidades instantâneas máximas

para o consumo de substrato (rS), produção de etanol (rP)e o intervalo de tempo.

Letras diferentes indicam valores diferentes (p>5). Os dados são referentes à fermentação do mosto de cana-de-açúcar.

µS rS µP rP цX

BG-1 0,27b 36.16b 0,08bc 16,49a 0,47a

PE-2 0,29b 30.09b 0,07c 13,51a 0,37a

CAT-1 0,56ab 42.75ab 0,16ab 19,35a 0,33a

Controle 0,82a 57.01a 0,21a 19,34a 0,50a

Tabela 3.16 – Comparação estatística entre os

fatores de conversão referentes à fermentação do caldo-de-cana. Letras diferentes indicam valores estatisticamente diferentes (p>5).

Fator de conversão

BG-1 0.35 a

PE-2 0.34 a

CAT-1 0.36 a

Figura 3.3 –a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação do

Siglas

BG-1 - Usina Barra Grande, CAT-1 - Usina Catanduva PE-2 - Usina da Pedra

BK–Levedura de Panificação, marca UNIFERFM

Tabela 3.17 – Etanol produzido (g/L) durante a fermentação do mosto

misto de melaço e caldo de cana. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin

Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

0 0,24 1,47 -0,53 0,00

1 2,13 3,00 5,52 12,02

2 4,51 5,17 15,36 37,70

3 7,45 8,07 26,07 37,70

4 10,98 11,71 33,64 37,70

5 15,05 15,90 37,52 37,70

6 19,58 20,28 39,18 37,70

7 24,38 24,41 39,84 37,70

8 29,25 27,96 40,09 37,70

9 33,94 30,77 40,19 37,70

Tabela 3.18–Substrato consumido (g/L) durante a fermentação do mosto

misto de melaço e caldo de cana. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin

Tempo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

0 103,82 107,94 102,00 107,74

1 99,91 106,05 97,76 88,62

2 94,61 103,07 86,26 47,40

3 87,60 98,49 62,83 16,27

4 78,70 91,67 34,25 6,48

5 67,89 82,06 15,08 4,35

6 55,51 69,48 6,79 3,92

7 42,22 54,50 3,88 3,84

8 28,92 38,56 2,95 3,82

9 16,50 23,52 2,65 3,82

durante a fermentação do mosto misto de melaço e cada-de- açúcar a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo

programa Origin

Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 1,89 1,53 6,05 12,02

2 2,39 2,16 9,84 25,68

3 2,94 2,90 10,71 0,00

4 3,52 3,64 7,57 0,00

5 4,07 4,19 3,88 0,00

6 4,53 4,38 1,66 0,00

7 4,80 4,14 0,66 0,00

8 4,86 3,55 0,25 0,00

9 4,69 2,81 0,10 0,00

Tabela 3.20 – Velocidades Instantâneas de consumo de substrato (g/L.h)

durante a fermentação do mosto misto de melaço e cana-de-açúcar a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin

Intervalo (h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 3,91 1,89 4,24 19,11

2 5,31 2,98 11,50 41,22

3 7,00 4,59 23,43 31,13

4 8,91 6,82 28,58 9,79

5 10,81 9,61 19,16 2,14

6 12,38 12,58 8,30 0,43

7 13,29 14,98 2,90 0,08

8 13,30 15,93 0,94 0,02

9 12,42 15,04 0,29 0,00

Tabela 3.21 – Velocidades Instantâneas de produção de

biomassa (g/L.h) durante a fermentação do mosto misto de melaço e cana-de-açúcar a cada intervalo de hora. Os valores foram calculados após o ajuste das curvas pelo programa Origin Intervalo

(h) BG-1 PE-2 CAT-1 BK

1 1,11 0,64 0,91 0,30

2 1,54 0,66 2,86 0,30

3 1,67 0,63 3,05 2,98

4 1,38 0,55 1,06 1,41

5 0,91 0,44 0,21 0,06

6 0,51 0,33 0,04 0,00

7 0,27 0,24 0,01 0,00

8 0,13 0,16 0,00 0,00

9 0,06 0,11 0,00 0,00

Tabela 3.22– Valores de цMax para a consumo de substrato (цS), produção de etanol (цP), e

biomassa (цX), bem como as velocidades instantâneas máximas para o consumo de substrato

(rS), produção de etanol (rP) e o intervalo de tempo. Letras diferentes indicam valores

diferentes (p>5). Os dados são referentes aos dados experimentais do mosto misto de melaço e cana-de-açúcar.

Tabela 3.23 - Comparação estatística entre os fatores de conversão referentes à fermentação do mosto misto de melaço e caldo de cana. Letras diferentes indicam valores estatisticamente diferentes (p>5).

Fator de conversão

BG-1 0.35 b

PE-2 0.27 c

CAT-1 0.39 ab

Figura 3.4–a) Representação gráfica do Açúcar consumido durante a fermentação

CONSIDERAÇÕES FINAIS

As quatro linhagens de leveduras testadas apresentaram comportamento cinético e características produtivas diferentes - tais características permitem a indicação das diferentes linhagens para diferentes finalidades.

Durante o experimento foi constatado que os parâmetros cinéticos estão associados com a produção de espuma e calor; uma vez que esses fatores em grande impacto na indústria, conhecer o perfil da levedura empregada no sistema pode reduzir gastos e diminuir perdas.

Foi verificado que para estudos cinéticos com amostragem horaria é necessário o congelamento das amostras em nitrogênio líquido - o que compromete a viabilidade celular e dificulta a mensuração da biomassa celular, uma possível saída seria emprego de técnicas como a espectrofotometria.

cromatografia gasosa.