Universidade Estadual Paulista
Faculdade de Odontologia-Campus
Araraquara
Aurora Esmeralda Traverso Martínez
Efeito do condicionamento com
Nicotina e Cotinina na morfologia,
densidade e viabilidade de
fibroblastos. Estudo “in vitro”
ARARAQUARA
2002
Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, do Campus de Araraquara, como requisito para a obtenção do Título de Mestre em Odontologia (Área de concentração: Periodontia).
DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho
Aos meus pais, Jorge e Rebeca, pelo amor, atenção, dignidade e exemplo de
vida. De vocês recebi o dom mais precioso, a vida. Já por isso seria infinitamente
grata, mas me presentearam com uma vida cheia de carinho e dedicação,
cultivando na criança todos os valores que me transformaram num adulto
responsável e consciente. Sacrificaram os seus sonhos em favor dos meus e não
foram apenas pais, mas amigos e companheiros, mesmo nas horas difíceis em que
meu cansaço e preocupação foram sentidos e compartilhados por vocês.
Mas você pai teve que ir embora, no entanto, as lembranças de seus
conselhos, sempre feitos com amor e sabedoria ficaram por sempre no meu coração
AGRADECIMENTOS
Se hoje estou aqui, é porque pessoas maravilhosas, verdadeiras e, sobre
tudo, singulares, caminharam junto conmigo, acreditando em minha capacidade.
Mas existe a essência maior sobre todos nós, Deus, o qual nos uniu neste
momento, por isso quero agradecer-lhe o dom da vida e a graça de poder concluir
mais uma etapa de minha vida. E hoje quero dizer-lhe muito obrigado por tudo o
que fui, o que sou e que ainda serei.
O meu agradecimento especial a meu orientador Prof. Dr. Carlos Rossa Jr.,
quem sempre esteve para escutar-me, como professor e como amigo. Para mim, é
um exemplo de dedicação a ser seguido, dele aprendi que se acreditas numa idéia,
não deves descansar enquanto não consigas colocá-las em prática. São pessoas
assim que se superam, que insistem, e persistem as que movem o mundo e ampliam
os horizontes. São pessoas assim que fazem as coisas acontecerem.
De igual forma agradeço aos professores: Egbert C. de Toledo, José
Eduardo César Sampaio, Joni Augusto Cirelli, Elcio Marcantonio Jr, por terem
compartilhado conosco suas experiências e seus conhecimentos, e que além de
simples instrutores foram grandes amigos.
À Prof.a Dr.a Adriana Chérici Marcantonio, um exemplo de
responsabilidade e dedicação, sem dúvida uma pessoa que sempre procura fazer o
Aos meus colegas de mestrado: Ana Carolina, Cliciane, Cris, Celso, José
Marcos, Marinella, Luis Henrique, Rogerio, Rodrigo, pelas inúmeras
demonstrações de amizade e companheirismo.
Meu agradecimento especial a minha colega e amiga Karina pela seu apoio,
companheirismo e afeto que ajudaram a suavizar o caminho nesta jornada.
A minha amiga e irmã Ana Maria, pela verdadeira amizade e por seu apoio
e carinho incondicional.
Aos meus compatriotas: Víctor, Edgardo, Pablo, Renán pela sua amizade e
pelo alegre convívio nos fins de semana.
Agradeço a esta Faculdade de Odontologia por dar-me a oportunidade de
ser melhor e pelo apoio recebido.
Muitas vezes, a base do sucesso é o trabalho nos bastidores, por isso eu não
poderia esquecer de agradecer aos funcionários : Zezé, Maria do Rosário,
Teresinha e Claudia, pela generosidade de dar antes de serem solicitados. Meu
agradecimento a Regina Lúcia pela disponibilidade e dedicação, sempre
incansáveis e principalmente pela sua amizade.
Ao Sr. Sebastião, funcionário do Instituto de Química, pelas análises ao
Ao CNPq, Capes, pela bolsa de estudo concedida.
A todos pela presença, pela palavra, pelo sorriso ou pela simples lembrança,
me deram coragem e determinação para traçar um caminho na busca de meus
SUMÁRIO
1.- INTRODUÇÃO 8
2.- REVISÃO DA LITERATURA 12
3.- PROPOSIÇÀO 20
4.- MATERIAL E MÉTODO 21
4.1 Linhagem Celular 21
4.2 Concentrações de nicotina e cotinina 21
4.3 Amostra de estudo 22
4.3.1 Critérios de seleção dos pacientes 22 4.3.2 Critérios de seleção dos dentes 22
4.4 Preparo das Amostras 23
4.5 Grupos Experimentais 23
4.5.1 Apenas Condicionamento 23
4.5.2 Raspagem Após Condicionamento 24
4.6 Fixação e Preparo (MEV) 24
4.7 Análise das Amostras 25
4.7.1 Calibração 25
4.7.2 Índices de avaliação 25
a) Índice Morfologia 25
b) Índice Densidade 26
4.8 Teste de Viabilidade Celular 26
4.8.1 Grupos Experimentais 26
a) Nicotina 26
b) Cotinina 27
c) Avaliação 27
4.9.1 Morfologia e Densidade Celular 28 a) Análise do Ajuste do Modelo 28
4.9.2 Viabilidade Celular 29
5.- RESULTADO 33
5.1 Análise Descritiva 33
5.1.1 Descrição da amostra 33
5.1.2 Análise descritiva da Morfologia 33 5.1.3 Análise descritiva da Densidade 37
5.2 Análise Estatística 42
5.2.1 Análise Estatística da Morfologia 42 5.2.2 Análise Estatística da Densidade 46 5.2.3 Análise Estatística da Viabilidade 49
6.- DISCUSSÃO 66
7.- CONCLUSÃO 76
8.- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 77
9.- APÊNDICES 84
RESUMO 94
1.- Introdução
A relação entre o fumo e a prevalência e severidade da doença periodontal tem sido discutida há muito tempo,14 pesquisas recentes tem sugerido que o hábito de fumar é um dos fatores de risco mais significativos para o desenvolvimento e progressão da doença periodontal.17 As razões para esta associação entre fumo e doenças periodontais ainda são desconhecidas, alguns autores a atribuem a efeitos locais enquanto outros a efeitos sistêmicos que podem alterar e modificar a resposta do hospedeiro. Por exemplo, entre as influências locais presentes temos o nível de higiene bucal, que parece ser inferior nos fumantes o que pode ser resultado de hábitos pessoais de higiene deficiente.3,23
Outra influência local importante do fumo poderia se dar por meio da alteração na composição da microbiota subgengival com a presença de uma maior proporção de patógenos periodontais como Bacteroides forsythus, Actinobacillus actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis.13,41,53
superior a 4000 toxinas diferentes é derivado do tabaco; entre as substâncias encontradas se incluem venenos como monóxido de carbono, toxinas como os radicais oxigenados, aldeídos como acrolein e acetaldeído, substâncias carcinogênicas como as nitrosamidas e substâncias psicoaditivas como a nicotina.7,47,52
A nicotina é considerada um dos componentes mais importantes do tabaco devido ao seu potencial tóxico, podendo ser absorvida na cavidade oral pelos tecidos moles, aderir-se às superfícies dentárias, além de estar presente no plasma.39,50 Sua meia vida biológica no plasma é de aproximadamente 30 minutos,2 com a maior parte sendo rapidamente convertida em seu principal metabólito, a cotinina, a qual possui uma meia vida biológica de 10 a 30 horas no plasma.12
A cotinina permanece no organismo dos fumantes por muito tempo, razão pela qual tem sido usada recentemente como marcador bioquímico do uso de tabaco.11 As vantagens da utilização de cotinina como marcador do hábito de fumar e de sua intensidade incluem a presença de níveis constantes no plasma por longos períodos de tempo; além de, geralmente, ser encontrada em concentrações elevadas que facilitam sua mensuração.5,19 Mc Guire et al. (1989)34 demonstraram que a cotinina está presente na saliva e fluido sulcular de fumantes crônicos, sendo as concentrações no fluído de cinco a seis vezes maiores que na saliva. González et al.19 (1996), encontraram uma relação positiva entre os níveis da cotinina e a perda da inserção periodontal em fumantes.
colágeno tipo I;10,42,45,46 assim como pode aderir-se às superfícies do dente influenciando a evolução e resposta ao tratamento da doença periodontal11. Giannopolou et al.18 (1998), também com um estudo “in vitro” demonstraram que a nicotina inibe a proliferação, aderência e produção da fosfatasse alcalina e quimiotaxia de fibroblastos do ligamento periodontal.
Numerosos estudos1,4,40,47,49,51 têm examinado o efeito do fumo na resposta à terapia periodontal e geralmente a maioria dos pesquisadores têm concluído que os pacientes fumantes apresentam uma resposta tecidual clinicamente menos favorável após diversas formas de tratamento. Bergstrom & Preber4 (1986) mostraram, em pacientes fumantes com doença periodontal moderada a severa, que a terapia não cirúrgica pode obter uma redução no sangramento à sondagem e uma diminuição na profundidade de sondagem, mas que esta resposta ao tratamento é menos favorável em comparação à obtida em pacientes não fumantes.
Por outro lado Ah et al. 1 (1994) num estudo longitudinal, em que pacientes fumantes e não fumantes foram submetidos à terapia não cirúrgica, cirúrgica e terapia de manutenção durante um período de seis anos, verificaram que a resposta ao tratamento freqüentemente está comprometida nos fumantes.
2.-Revisão da Literatura
A maior parte da literatura científica tem estudado o efeito do tabaco por meio de observações, mensurações e avaliações clínicas, sendo relativamente reduzido o número de estudos que demonstraram os efeitos biológicos do fumo e seus produtos no periodonto, especialmente sobre os fibroblastos. Uma das primeiras pesquisas nessa área foi desenvolvida por Raulin et al.39 (1988), que estudaram, in vitro, o efeito da aplicação da nicotina na aderência de fibroblastos oriundos de fetos humanos, empregando como substratos superfícies de vidro e dentina radicular. Os fibroblastos foram incubados com nicotina em diferentes concentrações (0-controle, 25, 50, 100, 200, 400 ng/ml) e por períodos de 24, 48 e 72 horas. Após a incubação as superfícies foram examinadas mediante microscopia óptica e eletrônica de varredura, revelando que no grupo controle os fibroblastos se encontraram firmemente aderidos às superfícies, com uma orientação paralela e com formato achatado. Nos grupos experimentais, os fibroblastos apresentaram alteração do padrão de aderência, sem alinhamento paralelo e elevada presença de vacúolos citoplasmáticos, sempre em proporção direta à dose. Os autores concluíram que a aderência de fibroblastos aos substratos utilizados era alterada pela nicotina.
amostras não raspadas não foi possível detectar a presença de nicotina e sim quantidades variáveis de cafeína e cotinina, metabólitos conhecidos da nicotina. Estes resultados sugerem que a nicotina está presente nas superfícies radiculares dos fumantes e que pode ser removida mediante raspagem, tornando estas superfícies mais compatíveis com a saúde periodontal.
McGuire et al.34 (1989) investigaram a presença de cotinina, principal metabólito da nicotina, na saliva e fluido crevicular de pacientes fumantes habituais com doença periodontal. Foram coletadas amostras de saliva e fluido em 16 pacientes fumantes e 30 não fumantes, sendo avaliadas mediante a técnica de cromatografia. Nos pacientes não fumantes não foram encontrados níveis detectáveis de nicotina e cotinina, enquanto nos pacientes fumantes os níveis de ambas substâncias foram elevados, principalmente as concentrações de cotinina provenientes do fluido crevicular (206-8056 ng/ml) as quais foram em média de 5 a 6 vezes mais elevadas que as concentrações encontradas na saliva (158-1054 ng/ml). Os autores acreditam que a presença da cotinina na saliva e fluido crevicular reflete a extensa distribuição sistêmica da nicotina em fumantes, bem como sua efetividade como marcador bioquímico.
levando a altos níveis intracelulares rapidamente. No entanto, um terço dos produtos excretados pelos fibroblastos era nicotina não metabolizada, a qual era mais lentamente eliminada do que absorvida. Os autores sugeriram que os altos índices de nicotina intracelular poderiam interferir com as funções celulares normais.
Peacock et al. 38 (1993) empregando concentrações de nicotina similares às encontradas no plasma de pacientes fumantes avaliaram, in vitro, o efeito da droga na proliferação e aderência de fibroblastos gengivais humanos. As células foram incubadas por 48 horas com concentrações de 0.025, 0.05, 0.1, 0.2 e 0.4 uM. O número de células foi determinado empregando MTT (diphenyl tetrazolium bromide -enzima que mede a atividade mitocondrial). Os resultados mostraram que baixas concentrações de nicotina tinham efeito estimulatório tanto sobre a aderência como na proliferação, sendo o efeito proporcional à concentração de nicotina utilizada persistindo o efeito mesmo após a remoção da substância.
Tipton & Dabbous45 (1995), empregando concentrações de nicotina superiores às utilizadas por Peacock et al. 38 (1993), mas similares às encontradas na saliva de pacientes fumantes (0.001% a 0.075% ou 0,06mM-5mM) demonstraram, por meio de testes imunológicos, que a droga tem capacidade de inibir significativamente a proliferação celular, induzir a formação de vacúolos transitórios e, nas doses maiores, causar a morte celular de fibroblastos gengivais. Além disso, a produção de fibronectina e colágeno tipo I foi inibida, enquanto a atividade da colagenase foi aumentada. O estudo sugeriu que a nicotina “in vitro” pode inibir a proliferação celular, a produção de fibronectina e colágeno de fibroblastos gengivais, efeito que pode levar a destruição da matriz extracelular, “in vivo”.
em pacientes fumantes e não fumantes, ao longo de um ano de acompanhamento, verificando que os níveis do composto se mantiveram estáveis em todos os pacientes participantes do estudo. Quanto à associação entre os níveis de cotinina e severidade da doença periodontal, os resultados mostraram uma alta correlação positiva entre os níveis séricos e a perda de inserção nos fumantes, sendo que os fatores de co-variação como idade, placa e cálculo não afetaram os níveis de associação. Os autores concluem que o uso dos níveis séricos de cotinina é um método objetivo, confiável e quantificável para avaliar o consumo de tabaco em fumantes.
Em 1998, Ito et al.24 , estudaram “in vitro” a absorção de nicotina pela dentina radicular , bem como o efeito do condicionamento com ácido cítrico das superfícies dentinárias expostas à nicotina. As amostras de dentina foram submetidas à raspagem e alisamento radicular, e posteriormente imersas numa solução de nicotina a 10-7M, concentração similar à encontrada na saliva de pacientes fumantes. Os resultados obtidos por meio de microautoradiografia mostraram a presença de nicotina nas superfícies dentinárias comprovando que é possível produzir “in vitro” dentina contaminada com nicotina. Numa segunda fase do experimento, as superfícies já condicionadas com nicotina foram tratadas com ácido cítrico por 5 minutos, sendo submetidas à mesma técnica de avaliação, que demostrou a remoção da nicotina da superfície dentinária. Na terceira fase do experimento, os blocos tratados quimicamente foram novamente imersos em nicotina e avaliados pela mesma técnica evidenciando a presença de nicotina tanto na superfície como nos túbulos dentinários.
horas de exposição à droga, verificaram que a maior concentração de nicotina reduzia a proliferação e viabilidade celular dos fibroblastos em ambos grupos de idade, tanto em fumantes como em não fumantes. A avaliação da proliferação, foi feita através do teste de Hoechst e a viabilidade pelo teste do corante vermelho neutro. Ao comparar os parâmetros mencionados anteriormente, as células provenientes de pacientes fumantes apresentaram melhores resultados nas propriedades de adesão e proliferação celular que as de doadores não fumantes, independentemente da idade. Os autores concluíram que os fibroblastos provenientes de fumantes são menos sensíveis à nicotina que os fibroblastos de não fumantes.
Os estudos prévios têm avaliado os diversos efeitos da nicotina sobre os fibroblastos gengivais. Giannopoulou et al.18 (1999), testaram, “in vitro”, o efeito de diferentes concentrações de nicotina (5ng /mL – 250ug/mL) na proliferação (3H- timidina), aderência, produção de fosfatasse alcalina ( substrato p-nitrofenil fosfato) e quimiotaxia (Teste de Boyden) empregando fibroblastos oriundos do ligamento periodontal. Em baixas concentrações não foram observadas alterações na morfologia, proliferação, e aderência celular, enquanto nas concentrações superiores a 100ng/ml verificou-se inibição da proliferação e aderência das células. A produção de fosfatasse alcalina e quimiotaxia diminuiu de forma proporcional à concentração de nicotina. Segundo os autores, a nicotina pode ocasionar efeitos adversos nas principais funções das células do ligamento periodontal.
concentrações maiores de 0,5mg/ml em passagens celulares maiores. No entanto, a cotinina só inibiu a proliferação e aderência nas concentrações superiores a 10ug/ml. Os autores concluem que os produtos do tabaco, como nicotina e cotinina podem inibir a aderência e proliferação de fibroblastos oriundos do ligamento periodontal.
Leonardi et al.33 (1999), avaliaram o efeito da nicotina na expressão imunohistoquímica da molécula de adesão intercelular alfa 2. Esta molécula é um importante receptor, responsável por funções celulares relacionadas à remodelação da matriz extracelular, como a indução da colagenase e à adesão dos fibroblastos à matriz. Foram usados fibroblastos gengivais de pacientes sem doença periodontal, e incubadas com soluções de nicotina a 0.0025 e 0.075 uM. Os autores concluíram que a nicotina promove a degradação do colágeno e a produção de colagenase mediante o incremento da expressão da integrina alfa 2, sendo esta regulação dose-dependente e proporcional ao tempo de exposição à nicotina.
concluíram que a adesão das células ao vidro e ás superfícies radiculares é alterada pela exposição à nicotina.
Lahmouzi et al. 31 (2000), estudaram in vitro, o efeito direto da nicotina nos fibroblastos gengivais oriundos de rato. Os resultados mostraram que tanto o conteúdo de DNA assim como a síntese de colágeno tipo I e tipo III, não eram alterados nas concentrações testadas (0.05, 0.1, 200uM). Já no teste da morfologia, as concentrações de nicotina foram variáveis, empregando microscopia de contraste de fase, verificaram que até com 1mM da droga os fibroblastos mantinham seu padrão morfológico achatado, similar aos controles. Concluíram que a morfologia não era alterada nessas concentrações. No entanto, a partir de concentrações de 3mM de nicotina, um maior número de células apresentou um formato arredondado, número que aumentou notoriamente com concentrações de 5mM. A densidade celular também foi avaliada (teste MTT), observando que em baixas concentrações (0,05uM-1mM) não foi alterada, por outro lado a partir de concentrações de 4-6mM a densidade diminuiu em 50%. Quanto ao teste de necrose e apoptose celular, verificaram que a principal forma de morte celular após 24 horas de exposição a elevadas concentrações de nicotina (3-5mM) era a necrose, no entanto após 48 horas a proporção de morte celular por apoptose aumentou significativamente nestas mesmas concentrações. Os autores sugerem que a nicotina pode alterar a morfologia e proliferação em fibroblastos gengivais, assim como estimular a morte celular por apoptose e necroses.
3.-
Proposição
1) Avaliar “in vitro”, por meio de microscopia eletrônica de varredura (MEV), o efeito do condicionamento radicular com nicotina ou cotinina sobre a morfologia e densidade de fibroblastos;
2) Determinar se a raspagem mecânica das superfícies radiculares condicionadas com nicotina ou cotinina modifica os resultados relativos à densidade e morfologia celulares;
4.-
Material e Método
4.1-Linhagem Celular
Foram utilizadas células McCoy∗, uma linhagem celular contínua com morfologia de fibroblastos, mantidas em frascos para cultura∗∗(25 cm2 de área de crescimento celular) contendo meio Eagle* suplementado (MEM), com 7.5% de soro fetal bovino∗∗∗ e 40 ug/mL de gentamicinaδ. O cultivo foi feito em incubadoraα com umidade controlada de aproximadamente 98% e temperatura de 370C.
4.2-Concentrações de Nicotina e Cotinina :
Foram preparadas soluções de Nicotinaϕ e Cotininaπ, por meio de uma diluição em meio de Eagle. As concentrações testadas foram:
Nicotina: 0 (controle)- 100ng/ml-1ug/ml-100ug/ml-1mg/ml
Cotinina: 0 (controle)- 50ng/ml-100ng/ml-500ng/ml-1ug/ml
Estas concentrações foram utilizadas com base na literatura relativa aos valores mínimo e máximo destas substâncias encontrados no plasma e saliva de pacientes fumantes (Cuff et al. 1989; 11 Curvall & Enzell 1986).12
∗
Instituto Adolfo Lutz-SP,Brasil
∗∗
Corning Incorporated-NY,U.S.A.
∗∗∗
Cultilab-Campinas,SP, Brasil
δ
Garamicina 60 mgr/Schering-Plough-R.J., Brasil
α
Nuaire US-Autoflow,CO2 water-Jacketed Incubator-U.S.A.
ϕ
N-3876-Sigma Chemical Products-U.S.A
π
- Nicotina em saliva: 96ng a 1.6 mg/ml - Nicotina em plasma: 15ng a 1.8 ug/ml; - Cotinina em saliva: 106ng a 1.0 ug/ml - Cotinina em plasma: 48ng a 1.1 ug/ml
4.3- Amostra de estudo:
Foram empregados 60 dentes uniradiculares, extraídos por severo envolvimento periodontal, selecionados com os seguintes critérios:
4.3.1- Critérios de seleção dos pacientes
a) Sem doenças sistêmicas (diabetes, alterações hormonais pronunciadas). b) Sem história de uso de medicamentos que influenciem os sinais clínicas da periodontite (antinflamatórios, corticoides, antibióticos, hormônios esteróides ) nos últimos 3 meses.
c) Não fumantes.
d) Sem tratamento periodontal prévio (mínimo de 3 meses).
4.3.2- Critérios de seleção dos dentes
a) Com diagnóstico clínico compatível com periodontite do adulto Idade de 35 anos ou mais.
História de evolução lenta.
Presença de placa bacteriana e cálculo.
Perda de inserção clínica e reabsorção óssea (determinada radiograficamente).
4.4- -Preparo das Amostras :
Os dentes selecionados foram colocados em soroβ fisiológico estéril e mantidos sob refrigeração a 40 C até o momento do preparo das amostras. Empregando um disco diamantado em baixa rotação, cada dente foi seccionado em sentido transversal a 2 mm da junção cemento-esmalte para a remoção da coroa do dente, em seguida foi feita a remoção da parte da raiz sem presença de cálculo e placa bacteriana ( figura 1). As superfícies dentinárias que apresentavam cálculo e placa bacteriana foram preparadas com tratamento de raspagem, sendo realizado por um mesmo operador e padronizado com a realização de 20 golpes com cureta Graceyθ 5/6 por superfície dental. Empregando o mesmo disco as porções radiculares já raspadas foram então seccionadas em sentido longitudinal, obtendo finalmente as amostras de superfícies dentinárias com 5x5mm (área total de superfície 25mm2 -figura 2). As amostras foram esterilizadas em autoclaveσ, sendo posteriormente aleatoriamente distribuídas nos grupos experimentais.
4.5 - Grupos Experimentais:
4.5.1.- Apenas Condicionamento
Raiz +sol de Nicotina. (20 amostras divididas em 5 por concentração)
Raiz +sol de Cotinina. (20 amostras divididas em 5 por concentração)
Raiz + sol Controle. (05 amostras)
As amostras foram incluídas em placas para cultivo celular (24 orifícios por placa). No primeiro subgrupo cada orifício recebeu 2ml de solução de Nicotina (concentrações de 100ng, 1ug, 100ug, 1mg/ml). No segundo subgrupo cada orifício recebeu 2 ml de solução de Cotinina ( concentrações de 50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml).
β
Fresenius Kabi- Campinas, SP, Brasil
θ
Neumar-SP, Brasil
σ
O terceiro subgrupo foi o Controle (apenas meio de Eagle). O tempo de condicionamento das amostras de dentina com as respectivas soluções foi de 24 horas. Uma vez condicionadas as superfícies dentinárias, foram lavadas duas vezes com tampão fosfato sendo adicionado posteriormente 1ml de meio de cultura + 1ml de meio de cultura contendo aproximadamente 1x105 células/ml e levadas para incubação por 24 horas.
4.5.2 - Raspagem após condicionamento-
Raiz +sol de Nicotina. ( 20 amostras divididas em 5 por concentração)
Raiz +sol de Cotinina. (20 amostras divididas em 5 por concentração)
Raiz + sol Controle. (05 amostras)
Foram empregadas as mesmas concentrações de Nicotina e Cotinina descritas anteriormente. O condicionamento foi realizado da mesma forma descrita no item 4.5.1, e foi seguido de raspagem manual da mesma forma descrita no item 4. Posteriormente, foi acrescentado 1 ml de meio de cultura + 1ml de meio de cultura contendo aproximadamente 1x105 células/ml e levadas para incubação por 24 horas.
4.6 - Fixação e Preparo (MEV)
Após o período de incubação, o meio foi removido por pipetagem e as amostras lavadas com solução de Hanks*** para remoção das células não aderidas. As amostras de estudo obtidas de cada grupo de trabalho foram fixadas em gluteraldeídoA(2.5% - microscopia eletrônica) por 15 minutos, depois passaram por uma desidratação seriada em concentrações crescentes de etanol (10, 30, 50, 70, 90-100%) por 15 minutos em cada concentração, permanecendo após esta etapa, em temperatura ambiente por 24 horas. As amostras foram, então, montadas em “stabs”
metálicos utilizando-se uma mistura de esmalte incolor com grafite em pó, sendo identificadas de acordo com cada grupo, e levadas ao dessecador a vácuo onde permaneceram por três dias para remoção de umidade. Após período de desidratação foram metalizadas com ouro (20nm) por 120 segundos e levadas ao microscópio eletrônico de varredura do Instituto de Química de Araraquara - UNESP para exame e fotografias. Para avaliação da densidade celular cada amostra foi fotografada por o técnico do laboratório de química, sem conhecimento dos grupos experimentais em um aumento de 500x em 3 áreas aleatórias. Para a descrição da morfologia cada amostra foi fotografada 1 vez em um aumento de 1000x por cada amostra, utilizando uma das áreas selecionadas para a densidade.
4.7- Análise das Amostras
As fotografias de cada amostra foram submetidas a três examinadores independentes, cegos para os grupos de tratamento e previamente calibrados para a realização da descrição da densidade e morfologia de fibroblastos.
4.7.1 - Calibração:
Os três examinadores realizaram duas leituras (intervalo de tempo entre as leituras 15 dias), cada uma em 40 fotos selecionadas aleatoriamente, de forma cega. Os dados foram avaliados para concordância intra e inter examinador pelo teste de Kappa, neste último caso realizado por dupla de examinadores (1 x 2; 1 x 3; 2 x 3, dados apresentados no Apéndice-Quadros 7-18).
4.7.2 - Índices de avaliação
a) Índice Morfologia:
( 0 ): sem células (Figura. 3).
( 1 ): células arredondadas (Figura. 4).
( 2 ): células achatadas (Figura. 5).
( 3 ): combinação de células arredondadas e achatadas.(Figura. 6). As células com morfologia achatada foram consideradas aderidas, as células com morfologia arredondada foram consideradas não aderidas.
b) Índice Densidade:
Para a descrição da densidade, foi utilizada uma escala com escores de 0 a 3 pontos, avaliando a densidade dos fibroblastos em cada amostra (Jenkins et al. 26 1988).
(0): nenhuma célula ou células ocasionalmente presentes.(Figura. 7).
(1): células sem formação de nenhuma confluência.(Figura. 8).
(2): formação de confluência celular sem cobertura total.(Figura. 9).
(3): formação de uma densa camada celular ocupando toda a área avaliada.(Figura. 10).
4.8 - Teste de Viabilidade Celular
A viabilidade foi determinada pelo teste de exclusão do corante azul de trypan. Células viáveis são impermeáveis a este corante, uma vez que sua penetração na célula indica a perda da integridade de sua membrana (Kaltenbach et. al. 1958).28
4.8.1 Grupos Experimentais
a) Nicotina
concentrações de Nicotina: 0-controle, 10ug, 100ug, 0,5mg e 1mg/ml. Imediatamente foi acrescentado 1ml de suspensão de meio de cultura contendo aproximadamente 1x104 cels/ml. Os fibroblastos foram incubados por períodos de 1 e 24 horas. Terminado o período de incubação, o meio de cultura foi removido e as células foram coradas com Azul de trypanΩ 0,4% por 5 minutos. Após remoção do corante por aspiração as células foram lavadas duas vezes com solução de tampão fosfato (pH: 7,4), sendo finalmente colocado 2ml de tampão para determinar a viabilidade celular mediante a contagem das células em microscópio invertido. Todos os experimentos foram repetidos 5 vezes para cada concentração e período.
b) Cotinina
O teste foi realizado da mesma maneira descrita para a Nicotina, porém empregando as seguintes concentrações de cotinina: 0-controle, 50ng, 100ng, 500ng e 1ug/ml. Imediatamente foi acrescentado 1ml de suspensão de meio de cultura contendo aproximadamente 1x104 cels/ml. Os fibroblastos foram incubados por períodos de 1, 24 e 48 horas. Os experimentos também foram repetidos 5 vezes para cada concentração e período.
c) Avaliação
A avaliação foi feita por um único examinador cego para os grupos experimentais, sendo selecionado um campo aleatório por amostra efetuando-se uma contagem de até 200 células, determinando o número de células coradas e não coradas em aumento de 40x.
Ω
4.9. Análise Estatística
4.9.1 - Morfologia e Densidade Celular
Como os dados de morfologia e densidade são baseados em escores de um sistema de índice, foram utilizados métodos não paramétricos de análise. Foi empregada a técnica de classificação e regressão por árvore que é uma técnica explanatória inicialmente estudada e divulgada por Breiman et al. 6 (1984). Trata-se de uma ferramenta útil para estudar associações entre variáveis em problemas em que se tem um conjunto de variáveis preditoras, X = (X1,X2,X3,....,Xp), e uma variável resposta Y, e deseja-se identificar a forma de associação entre X e Y, não exatamente em termos de modelagem matemática do tipo Y = f(X), e sim em termos de estrutura de associação, indicada por partições do espaço gerado por X.
O mecanismo esperado para esse modelo deverá ser o de classificar cada indivíduo, a partir dos valores registrados de todas suas variáveis independentes.
Como é bastante comum a presença de variáveis categóricas, nestes conjuntos de dados, temos como opções as seguintes técnicas: AID (Automatic Interaction Detection) e Regressão por Árvore (Classification and Regression Trees – CART)
(Breiman et al. 1984).6
a) Análise do Ajuste do Modelo
Uma forma de analisar a falta de ajuste do modelo consiste em separar uma amostra especificamente para isso, e fazer a contagem do número de indivíduos que foram classificados erradamente, calculando-se assim a taxa de má-classificação. Normalmente esta amostra é tomada como uma parcela do conjunto de dados.
Taxa de Má-Classificação
Considera-se que, a sua amostra é dividida em duas partes. A primeira parte é a amostra propriamente dita, com a qual se constrói a árvore, e a segunda parte é a amostra em teste, cujos elementos serão classificados segundo a árvore criada pela primeira parte. A probabilidade de classificar erroneamente um elemento da segunda amostra é usada para se construir a de Taxa de Má-classificação, e é usada para quantificar a eficiência da árvore, quanto à sua capacidade de classificação.6 Estas análises de regressão por árvore foram realizadas com o software S-Plus 2000.
4.9.2 -Viabilidade Celular
INDICE DE MORFOLOGIA CELULAR
Figura 3:
Escore 0
Figura 4
: Escore 1
INDICE DE DENSIDADE CELULAR
Figura 7:
Escore 0
Figura 8:
Escore 1
5.-Resultado
5.1. Análise Descritiva
5.1.1 Descrição da amostra
Inicialmente, as amostras de dentina foram condicionadas pela Nicotina ou pela Cotinina, sendo que também foi constituído um grupo controle sem passar por nenhum condicionamento. Este tratamento químico, no entanto, foi aplicado de duas maneiras distintas: um grupo passou pela aplicação direta das duas substâncias e um segundo grupo foi condicionado com as sustâncias sendo após submetido a raspagem mecânica. Como cada amostra foi fotografada em 3 campos para avaliação da densidade celular, e em apenas 1 campo para avaliação da morfologia, e considerando que havia 5 amostras para cada concentração de Nicotina e Cotinina testadas, cada concentração contribuiu com 15 dados para a análise da densidade e 5 dados para a análise da morfologia. Como houve perda de apenas uma amostra na avaliação da Densidade do grupo tratado com Nicotina, os totais amostrais foram de 149 e 150 para a avaliação da Densidade nos grupos tratados por Nicotina e Cotinina respectivamente e de 50 para ambos casos da avaliação da Morfologia.
5.1.2 Análise descritiva da Morfologia
achatadas- Foton0 18) enquanto que no grupo com concentração de 1 mg/ml, ocorre uma inversão, com ampla maioria dos casos com Morfologia 3 (combinação de células arredondadas e achatadas- Foton0 8), com 80% das observações.
Para as amostras tratadas com Nicotina sem raspagem posterior ao condicionamento, verificamos uma grande variabilidade nos resultados, porém com uma predominância de casos com Morfologia 3 (Foto n0 1,3,4). No grupo Controle, foi verificada a menor diferença entre as duas categorias (Foto n0 17). e no grupo com concentração de 1 ug/ml, a grande maioria dos casos, 80%, apresentou Morfologia 2 (Foto n0 2). Nenhuma das amostras foi classificada com Morfologia 0 e 1.
Quadro 1-Contagens da classificação da Morfologia - condicionamento com Nicotina.
Valor Porcentagens Condicionamento Raspagem Concen.
2 3 Total 2 3
0 5 0 5 100 0
1mg 1 4 5 20 80
100ug 3 2 5 60 40
1ug 3 2 5 60 40
SIM
100ng 3 2 5 60 40 Subtotal 15 10 25 60 40
0 2 3 5 40 60
1mg 1 4 5 20 80
100ug 2 3 5 40 60
1ug 4 1 5 80 20
NÃO
100ng 1 4 5 20 80 Subtotal 10 15 25 40 60
0 7 3 10 70 30
1mg 4 6 10 40 60
100ug 5 5 10 50 50
1ug 7 3 10 70 30
GLOBAL
100ng 2 8 10 20 80 NICOTINA
No Quadro 2, observamos a classificação das amostras condicionadas com Cotinina. Podemos observar que, nas amostras submetidas à raspagem após condicionamento, novamente ocorre uma grande variabilidade nos resultados, porém sem predominância em nenhuma categoria. Podemos observar que há uma maior ocorrência de Morfologia 2 (Foto n0 14, 15) , porém, no grupo com concentração 50 ng/ml a ampla maioria dos casos apresentaram Morfologia 3 (Foto n0 13), com 80%. O grupo Controle, apresentou 100% dos casos com Morfologia 2 (Foto n0 18).
Para as amostras tratadas com Cotinina sem raspagem mecânica, podemos notar que para as concentrações 500 ng/ml, 100 ng/ml e 50 ng/ml, a maioria das amostras apresentou Morfologia 2 (Foto n0 9,10,11) enquanto que para o grupo Controle e com concentração 1 ug/ml, houve uma predominância de casos com Morfologia 3 (Foto n0 12). Podemos destacar, ainda, o grupo com concentração 1 ug/ml que apresentou o maior percentual de casos com Morfologia 3, com 80% destes.
Quadro 2- Contagens da classificação de Morfologia - condicionamento com Cotinina.
Valor Porcentagens Condicionamento Raspagem Concen.
2 3 Total 2 3
0 5 0 5 100 0
1ug 2 3 5 40 60
500 ng 3 2 5 60 40 100 ng 4 1 5 80 20 SIM
50 ng 1 4 5 20 80 Subtotal 15 10 25 60 40
0 2 3 5 40 60
1 ug 1 4 5 20 80 500 ng 3 2 5 60 40 100 ng 3 2 5 60 40 NÃO
50 ng 3 2 5 60 40 Subtotal 12 13 25 48 52
0 7 3 10 70 30
1 ug 3 7 10 30 70 500 ng 6 4 10 60 40 100 ng 7 3 10 70 30 GLOBAL
50 ng 4 6 10 40 60 COTININA
As análises feitas nos quadros 1 e 2, em que apresentamos os resultados das contagens de Morfologia, devem ser vistas com um certo cuidado uma vez que envolve um reduzido número de amostras, portanto, pequenas variações nas quantidades observadas podem representar muito em termos relativos. Este fato, pode explicar a grande variabilidade apresentada para estes casos.
O Quadro 3 apresenta o resultado do cruzamento de Morfologia com o tratamento de raspagem independente da concentração utilizada para cada substância. Pelos valores apresentados no grupo condicionado com Nicotina, podemos observar uma situação inversa nas amostras submetidas à raspagem em comparação das amostras não raspadas após o condicionamento. Desta forma no grupo tratado com raspagem mecânica, a maioria das amostras apresentou Morfologia 2, numa proporção de 60% em comparação a 40% das amostras não raspadas.
O cruzamento de Morfologia com a realização de raspagem após o condicionamento para o grupo tratado com Cotinina, independente da concentração, apresentou resultados semelhantes, porém menos evidentes. No grupo com raspagem mecânica, a maioria das amostras (60%) foi classificado com Morfologia 2. No grupo que não sofreu raspagem, apesar de haver uma maioria de amostras com Morfologia 3, a diferença é mais equilibrada, com 52% de amostras nessa categoria e 48% na categoria 2.
Quadro 3- Contagens da classificação de Morfologia - Condicionamento x Raspagem Mecânica
Valor Porcentagens Condicionamento Raspagem
2 3 Total 2 3
SIM 15 10 25 60 40
NÃO 10 15 25 40 60
NICOTINA
Subtotal 25 25 50 50 50
SIM 15 10 25 60 40
NÃO 12 13 25 48 52
COTININA
Subtotal 27 23 50 54 46
SIM 5 0 5 100 0
NÃO 2 3 5 40 60
GRUPO CONTROLE
Subtotal 7 3 10 70 30
5.1.3 Análise descritiva da Densidade
O Quadro 4 apresenta as contagens da classificação de densidade das amostras condicionadas com Nicotina. Pode-se observar que, para as amostras condicionadas com Nicotina e tratadas com raspagem mecânica, há um aumento na proporção de amostras classificadas na categoria 2 (Foto 23,24,25) (confluência celular sem cobertura), inversamente proporcional à concentração de Nicotina utilizada. No grupo Controle observamos uma predominância de casos com Densidade 3 (Foto 36) (densa camada celular), cujo percentual observado para este grupo foi de 73.3%.
Densidade 3 (Foto 35), porém com uma presença ligeiramente maior de casos com Densidade 2, 33.3% % em comparação aos 20% do grupo controle nas amostras submetidas à raspagem.
Quadro 4 - Contagens da classificação de Densidade - condicionamento com Nicotina.
Valor Porcentagens Condicionamento Raspagem Concen.
1 2 3 Total 1 2 3 0 1 3 11 15 6.7 20.0 73.3 1mg 7 5 3 15 46.7 33.3 20.0 100ug 7 8 0 15 46.7 53.3 0.0
1ug 6 9 0 15 40.0 60.0 0.0 SIM
100ng 6 9 0 15 40.0 60.0 0.0 Subtotal 27 34 14 75 36.0 45.3 18.7
0 1 5 9 15 6.7 33.3 60.0
1mg 11 4 0 15 73.3 26.7 0.0 100ug 9 4 1 14 64.3 28.6 7.1
1ug 12 3 0 15 80.0 20.0 0.0 NÃO
100ng 6 9 0 15 40.0 60.0 0.0 Subtotal 39 25 10 74 52.7 33.8 13.5
0 2 8 20 30 6.7 26.7 66.7 1mg 18 9 3 30 60.0 30.0 10.0 100ug 16 12 1 29 55.2 41.4 3.4
1ug 18 12 0 30 60.0 40.0 0.0 GLOBAL
100ng 12 18 0 30 40.0 60.0 0.0
NICOTINA
Total 66 59 24 149 44.3 39.6 16.1
grupo com concentração 1 ug/ml foi o único onde a proporção de casos com Densidade 2 (Foto 34) foi maior do que com Densidade 3.
Para os casos tratados com Cotinina sem raspagem mecânica, observou-se uma grande variação dos resultados entre as diferentes concentrações. Em geral, percebe-se uma predominância de casos com Densidade 3 (Foto 28, 29, 30) que varia de 40% a 87% das amostras. O grupo com concentração 50 ng/ml foi o único em que a proporção de casos com Densidade 2 (Foto 27) foi maior, com aproximadamente 47%, além de ter sido o grupo com menor percentual de casos com Densidade 3.
Observamos no Quadro 6, a contagem da Densidade contra raspagem mecânica independentemente da concentração de Nicotina e Cotinina. Para as amostras tratadas com Nicotina, observa-se, que as amostras que passaram pela raspagem após o condicionamento apresentaram um percentual maior de casos com Densidade 2, porém com pequena diferença em relação às amostras com Densidade 1. Já para as amostras não raspadas, a maior proporção de casos foi classificada como Densidade 1, com 64.4% dos casos, enquanto que a Densidade 2 apresentou praticamente a metade dos casos de Densidade 1, com 33.9%.
Independente da raspagem, entretanto, nota-se uma concentração dos casos nas Densidades 1 e 2, com mais de 95% das amostras sendo observadas nestas duas categorias.
Diferentemente do tratamento com Nicotina, para as amostras tratadas com Cotinina, observa-se a maioria dos casos classificados com Densidades 2 e 3, que englobam de 92% até a totalidade destes. Tanto para o grupo submetido à raspagem como para aquele não raspado após o condicionamento, houve uma predominância de casos com Densidade 3, porém, no grupo sem a raspagem mecânica observamos uma pequena proporção de casos, 8.3%, com Densidade 1,
Densidade 3, seguida pela Densidade 2. Foram poucos os casos com Densidade 1. Numa observação mais detalhada, entretanto, pode-se notar que para o grupo com raspagem a diferença entre as Densidades 2 e 3 foi maior do que para o grupo sem raspagem, sendo que os percentuais foram 20% e 73% para o primeiro grupo e 33% e 60% para o segundo, respectivamente.
Quadro 5 - Contagens da classificação de Densidade - condicionamento com Cotinina.
Valor Porcentagens Condicionamento Raspagem Concen.
1 2 3 Total 1 2 3 0 1 3 11 15 6.7 20.0 73.3 1ug 0 8 7 15 0.0 53.3 46.7 500ng 0 6 9 15 0.0 40.0 60.0 100ng 0 5 10 15 0.0 33.3 66.7 SIM
50ng 0 6 9 15 0.0 40.0 60.0 Subtotal 1 28 46 75 1.3 37.3 61.3
0 1 5 9 15 6.7 33.3 60.0
1ug 1 6 8 15 6.7 40.0 53.3 500ng 0 2 13 15 0.0 13.3 86.7 100ng 2 4 9 15 13.3 26.7 60.0 NÃO
50ng 2 7 6 15 13.3 46.7 40.0 Subtotal 6 24 45 75 8.0 32.0 60.0
0 2 8 20 30 6.7 26.7 66.7 1ug 1 14 15 30 3.3 46.7 50.0 500ng 0 8 22 30 0.0 26.7 73.3 100ng 2 9 19 30 6.7 30.0 63.3 GLOBAL
50ng 2 13 15 30 6.7 43.3 50.0 COTININA
Quadro 6 - Contagens da classificação de Densidade - Condicionamento x Raspagem Mecânica.
Valor Porcentagens Condicionamento Raspagem
1 2 3 Total 1 2 3 SIM 26 31 3 60 43.3 51.7 5.0 NÃO 38 20 1 59 64.4 33.9 1.7 NICOTINA
Subtotal 64 51 4 119 53.8 42.9 3.4
SIM 0 25 35 60 0.0 41.7 58.3
NÃO 5 19 36 60 8.3 31.7 60.0
COTININA
Subtotal 5 44 71 120 4.2 36.7 59.2
SIM 1 3 11 15 6.7 20.0 73.3
NÃO 1 5 9 15 6.7 33.3 60.0
GRUPO CONTROLE
5.2. ANÁLISE ESTATÍSTICA
5.2.1 Análise Estatística da Morfologia
Para possibilitar a regressão por árvore tanto para os grupos tratados com Nicotina e Cotinina, foram consideradas as categorias que só apresentavam amostras classificadas. Por tanto, só foram consideradas as categorias 2 e 3, sendo as categorias 0 e 1 eliminadas. Ainda para facilitar a representação das árvores, as unidades de medida das concentrações de Nicotina e Cotinina foram padronizadas (Apêndices -Tabela 4).
A Figura 11 representa a análise de regressão por Árvore para a variável Morfologia, no grupo tratado com nicotina. Podemos observar que houve diferença estatisticamente significante entre os grupos condicionados com 0-controle, 100ng, 1ug/ml representado pelo ramo 1 e os grupos condicionados com 100ug/ml, 1mg/ml representados pelo ramo 2. Observando melhor o ramo 1, encontramos diferenças estatisticamente significantes entre as amostras que não foram submetidas a raspagem e as que passaram por este tratamento mecânico.
Figura 11 - Análise de Regressão por Árvore pela técnica CART, para variável Morfologia, no grupo tratado com Nicotina
1 2
A Figura 12 representa a análise de regressão por Árvore para a variável Morfologia, no grupo tratado com Cotinina. Observamos diferenças estatisticamente entre os grupos condicionados com 0-Controle, 50ng, 100ng, 500ng/ml de Cotinina, representado pelo ramo 1 e o grupo condicionados com 1ug/ml, representado pelo ramo 2. Observando melhor o ramo 1, este se divide novamente no ramo 3, representado pelo grupo Controle e o ramo 4, representado por as concentrações de Cotinina menores de 1ug/ml. No ramo 4, houve diferenças estatisticamente significantes entre o grupo condicionado com 50ng/ml e os grupos condicionados com 100ng e 500ng/ml.
Figura 12 - Análise de Regressão por Árvore pela técnica CART, para variável
Morfologia, no grupo tratado com Cotinina
1 2
3 4
5.2.2 Análise Estatística da Densidade
A Figura 13 representa a análise de regressão por Árvore para a variável Densidade, no grupo tratado com Nicotina. Podemos observar que houve diferença estatisticamente significante entre o grupo não condicionado (0-Controle), representado pelo ramo 1, e todas as concentrações de Nicotina representadas pelo ramo 2. Observando o ramo 2, este se divide novamente no ramo 3, representado pelas amostras que passaram pela raspagem e o ramo 4 que representa as amostras que não foram submetidas à raspagem. Novamente o ramo 3 apresenta diferenças estatisticamente significantes, subdividindo-se novamente nos ramos 5 (1mg/ml de nicotina seguido de raspagem) e 6 (1ug, 100ug, 100ng/ml, seguido de raspagem). O próprio acontece com o ramo 4 dividindo-se nos ramos 7 e 8.
Pelo análise de ganho para as categorias (Apêndices- Tabelas 11, 12, 13, 14 ) o ramo que melhor explica a categoria 1 é o ramo 7, já para a categoria 2 podemos notar que a mesma é prevista mais fortemente pelo ramo 8, sendo que podemos citar como bom preditor o ramo 6. Os resultados para a categoria 3 nos mostram que o ramo 1 é quem a prevê melhor.
A Figura 14 representa a análise de regressão por Árvore para a variável Densidade, no grupo tratado com Cotinina. Podemos observar que houve diferença estatisticamente significante entre as amostras tratadas com 0-controle, 50ng, 100ng e 500ng/ml representadas pelo ramo 1 e as amostras tratadas com 1ug/ml representadas pelo ramo 2. Dentro do ramo 2, foram encontradas diferenças estatisticamente significantes entre as amostras submetidas e não submetidas à raspagem após condicionamento radicular.
Figura 13 - Análise de Regressão por Árvore pela técnica CART, para variável Densidade, no grupo tratado com Nicotina
1 2
3 4
Figura 14 - Análise de Regressão por Árvore pela técnica CART, para variável Densidade, no grupo tratado com Cotinina
1 2
5.2.3 Análise Estatístico da Viabilidade
Os Gráficos 1 e 2 apresentam os resultados para a análise de viabilidade celular em cada um dos períodos de condicionamento com Nicotina. O teste de Kruskal-Wallis indicou efeito significativo da substância sobre a viabilidade celular, tanto após 1 h (H=16,01; p=0.003) quanto após 24 h de condicionamento (H=17,55; p=0.001). Para o período de 1 hora, as comparações pareadas post-hoc indicaram diferenças entre o Controle e todos os grupos tratados com Nicotina (p<0.05), com menor número de células viáveis nos grupos que receberam Nicotina, porém não houve diferenças entre as diferentes concentrações testadas. Os valores de A e χ2 indicam tendência significativa (p=0.005) de aumento do número de células não-viáveis com o aumento da concentração da substância.
A=28,00 χ2=7,76
A=90,00 χ2=40,17
ATabela 1 apresenta as comparações dos percentuais de células viáveis entre os períodos de condicionamento (1 e 24 h) em cada uma das concentrações de Nicotina testadas. Estas comparações demonstram que há uma significativa redução de viabilidade celular com o aumento do tempo de condicionamento de 1 para 24h, em todas as concentrações de Nicotina, enquanto no grupo Controle a diferença no percentual de células viáveis não alcançou significância estatística (p=0,058).
Tabela 1 – Resultados do teste de Mann-Whitney para as comparações dos percentuais de células viáveis entre os períodos de 1 e 24 h, segundo a concentração de nicotina utilizada.
Grupo Período média d.p. Posto médio U P
Controle 1 h 95,8 2,74 13,0 25,0 0,058 ns
24 H 93,3 2,71 8,0
10 ug 1 h 88,2 3,76 38,0 2,0 0,02
24 h 73,0 8,03 17,0
100 ug 1 h 87,0 6,85 39,5 0,5 0,01
24 h 75,2 6,26 15,5
0.5 mg 1 h 82,0 6,74 38,0 2,0 0,02
24 h 64,8 4,38 17,0
1.0 mg 1 h 82,0 10,36 90,0 0,0 0,009
85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 médias céls viáveis
1 h 24 h 48 h
Cont 50ng 100ng 500ng 1ug
O Gráfico 3 apresentam os resultados para a análise de viabilidade celular em cada um dos períodos de condicionamento com cotinina. Pode-se observar que houve uma redução gradual do número de células viáveis com o aumento do tempo de condicionamento, porém esta redução ocorreu de forma bastante similar entre as diferentes concentrações de cotinina testadas, inclusive no grupo controle (sem cotinina). Esta redução de viabilidade em todos os grupos, inclusive no grupo controle, pode ser resultado da exaustão dos nutrientes do meio e acúmulo de toxinas e produtos de excreção celular. É interessante notar que embora a diferença seja bastante reduzida, nota-se também que as duas maiores concentrações de cotinina testadas apresentaram, consistentemente, os menores percentuais de células viáveis,
ao passo que as concentrações menores estiveram associadas a uma proporção ligeiramente superior de células viáveis, como que num “efeito protetor” da viabilidade celular exercido pela cotinina em baixas doses.
A verificação da influência das variáveis tempo de condicionamento, em cada concentração de cotinina testada, para cada um dos períodos de condicionamento utilizados, sobre a viabilidade celular é apresentada nas Tabelas 2 e 3.
Da Tabela 2, apenas para os grupos controle (sem cotinina) e 100 ng/mL a diferença entre os períodos tenha atingido significância estatística ao nível de 95%, pode-se observar um comportamento razoavelmente uniforme em todas as concentrações testadas, já que todas apresentaram significância ao nível de 90%, e o mesmo padrão de aumento gradativo dos postos médios, indicando diminuição da viabilidade celular, com o aumento do tempo de condicionamento.
Tabela 2– Resultados do teste de Kruskal-Wallis para avaliação da influência do período de condicionamento (3 grupos) sobre o percentual de células não viáveis em cada a concentração de cotinina utilizada (5 níveis).
Variável Níveis Grupos Posto médio H p
1 h 4.30
24 h 8.80 6.34 0.04
0 – controle
48 h 10.90
1 h 4.80
24 h 7.80 5.55 0.06
50 ng/mL
48 h 11.40
1 h 4.90
24 h 7.10 6.76 0.03
Concent. 100 ng/mL
48 h 12.00
1 h 4.30
24 h 8.80 5.85 0.05
500 ng/mL
48 h 10.90
1 h 3.38
24 h 7.38 5.19 0.07
1 ug/mL
Já a influência da concentração de cotinina sobre a viabilidade celular em cada período de condicionamento não foi significativa, exceto para o período de 24 horas, quando houve diferença ao nível de 90% de significância (p=0.07). Estes resultados podem ser visualizados na tabela 3, observando que no período de 24 horas a diferença entre as maiores concentrações (500 ng/mL e 1 ug/mL) foi mais evidente, enquanto nos períodos de 1 hora e 48 horas o percentual de células viáveis foi bastante similar entre as diferentes doses de cotinina, como pode ser observado no Gráfico 3, e também pela similaridade dos postos médios apresentados na Tabela 2.
Em relação à tendência de redução da viabilidade com o aumento do período de condicionamento, diferentemente dos dados da nicotina, esta não foi estatisticamente significante quando avaliada pelo teste de tendência.
Tabela 3– Resultados do teste de Kruskal-Wallis para avaliação da influência da concentração de cotinina (5 grupos) sobre o percentual de células não viáveis em cada período de condicionamento (3 níveis).
Variável Níveis Grupos Posto médio H p
0 – cont 9.90
50 ng/mL 11.10 2.40 0.66
100 ng/mL 11.60
500 ng/mL 14.60
1 hora
1 ug/mL 16.00 0 – cont 12.80
Período 50 ng/mL 8.30
100 ng/mL 7.90 8.47 0.07
500 ng/mL 17.60
24 horas
1 ug/mL 16.75 0 – cont 11.00
50 ng/mL 12.40
100 ng/mL 9.50 2.69 0.60
500 ng/mL 15.50
48 horas
MORFOLOGIA
Grupo Experimental “Apenas Condicionamento”-Subgrupo Nicotina-MEV-Aumento1000x
Foto 1: Amostra condicionada com Foto 2:Amostra condicionada com 100ng/ml de nicotina. Morfologia 3 1ug/ml de nicotina. Morfologia 2
MORFOLOGIA
Grupo Experimental “Raspagem após Condicionamento”-Subgrupo Nicotina-MEV-Aumento1000x
Foto 5: Amostra condicionada com Foto 6: Amostra condicionada com 100ng/ml de nicotina. Morfologia 2 1ug/ml de nicotina. Morfologia 2
Foto 7: Amostra condicionada com Foto 8: Amostra condicionada com 100ug/ml de nicotina. Morfologia 2 1mg/ml de nicotina. Morfologia 3
MORFOLOGIA
Grupo Experimental “Apenas Condicionamento”-Subgrupo Cotinina-MEV-Aumento1000x
Foto 9: Amostra condicionada com Foto 10:Amostra condicionada com 50ng/ml de cotinina. Morfologia 2 100ng/ml de cotinina. Morfologia 2
Foto11: Amostra condicionada com Foto 8: Amostra condicionada com 500ng/ml de cotinina. Morfologia 2 1ug/ml de cotinina. Morfologia 3
MORFOLOGIA
Grupo Experimental “Raspagem após Condicionamento”-Subgrupo Cotinina-MEV-Aumento1000x
Foto 13: Amostra condicionada com Foto 14:Amostra condicionada com 50ng/ml de cotinina. Morfologia 3 100ng/ml de cotinina. Morfologia 2
MORFOLOGIA
Grupo Experimental “Apenas Condicionamento”-Subgrupo Controle-MEV-Aumento1000x
Foto 17: Amostra sem condicionamento
Morfologia 3
Grupo Experimental “Raspagem após Condicionamento”-Subgrupo Controle-MEV-Aumento1000x
Foto 18: Amostra sem condicionamento
DENSIDADE
Grupo Experimental “Apenas Condicionamento”-Subgrupo Nicotina-MEV-Aumento 500x
Foto 19: Amostra condicionada com Foto 20 Amostra condicionada com 100ng/ml de nicotina. Densidade 2 1ug/ml de nicotina. Densidade 1
Foto 21: Amostra condicionada com Foto 22:Amostra condicionada com 100ug/ml de nicotina. Densidade 1 1mg/ml de nicotina. Densidade 1
DENSIDADE
Grupo Experimental “Raspagem após Condicionamento”-Subgrupo Nicotina-MEV-Aumento 500x
Foto 23: Amostra condicionada com Foto 24:Amostra condicionada com 100ng/ml de nicotina. Densidade 2 1ug/ml de nicotina. Densidade 2
Foto 25: Amostra condicionada com Foto 26:Amostra condicionada com 100ug/ml de nicotina. Densidade 2 1mg/ml de nicotina. Densidade 1
DENSIDADE
Grupo Experimental “Apenas Condicionamento”-Subgrupo Cotinina-MEV-Aumento 500x
Foto 27: Amostra condicionada com Foto 28:Amostra condicionada com 50ng/ml de cotinina. Densidade 2 100ng/ml de cotinina. Densidade 3
Foto29: Amostra condicionada com Foto 30:Amostra condicionada com 500ng/ml de cotinina. Densidade 3 1ug/ml de cotinina. Densidade 3
DENSIDADE
Grupo Experimental “Raspagem após Condicionamento”-Subgrupo Cotinina-MEV-Aumento 500x
Foto 31: Amostra condicionada com Foto 32:Amostra condicionada com 50ng/ml de cotinina. Densidade 3 100ng/ml de cotinina. Densidade 3
DENSIDADE
Grupo Experimental “Apenas Condicionamento”-Subgrupo Controle-MEV-Aumento 500x
Foto 35: Amostra sem condicionamento
Densidade 3
Grupo Experimental “Raspagem após Condicionamento”-Subgrupo Controle-MEV-Aumento 500x
Foto 36: Amostra sem condicionamento
6 -Discussão
Vários estudos (Checchi et al. 1999;9 Giannoupoulou et al. 1999; 18 Ito et al. 1998)24 têm investigado o papel do principal componente do tabaco, a nicotina assim como seu metabólito primário, a cotinina, nas diferentes funções das principais células do periodonto, os fibroblastos. No entanto há grande variabilidade nos resultados das pesquisas devido a diversos fatores como: concentrações das substâncias testadas, diferentes tipos de células utilizadas e as variações dos métodos de avaliação empregados.
Os fibroblastos em cultura, possuem a característica particular de precisar de uma superfície de contato, conhecida como substrato, e de um meio de cultura para manter a viabilidade e multiplicar-se. Entretanto qualquer contato com substâncias tóxicas que afetem estes processos celulares, se refletem em alterações da morfologia celular. A caracterização morfológica dos fibroblastos determina que estas células podem assumir aspectos fusiformes (células bipolares) ou estrelados (células multipolares) quando se encontram aderidos ao substrato. Desta forma, considera-se que fibroblastos arredondados podem estar sofrendo alterações na sua morfologia seja por estarem em processo de mitose ou por terem perdido as propriedades de adesão devido à ação direta de agentes injuriantes sobre sua estrutura. A observação das características morfológicas é uma técnica simples e direta usada para a identificação celular. (Freshney , 1994).15
500ug/ml. Resultados contrastantes foram os de Tanur et al. 44 (2000), ao verificaram que a exposição de fibroblastos fetais à baixas concentrações de nicotina (50ng/ml) originava alterações estruturais da célula que não permitiam sua adesão à superfície radicular. No entanto, os resultados de Tanur et al.44 (2000), foram influenciados por um componente adicional, pois além de terem sido aplicadas baixas doses de nicotina, foram empregadas forças rotacionais de agitação para avaliar o grau de adesão celular, o que influenciou notavelmente na diminuição da adesão dos fibroblastos aos respectivos substratos.
Para as avaliações feitas no grupo condicionado com cotinina, a morfologia só apresentou alterações com a maior concentração (1ug/ml), independentemente da raspagem posterior ao condicionamento, mostrando uma mistura de células de morfologia arredondada e achatada. Nas concentrações menores, a morfologia celular foi similar à observada no grupo controle (Figura 12). A similaridade estrutural das moléculas de cotinina e nicotina nos levaria a supor que os mesmos receptores celulares para nicotina poderiam interagir com a cotinina, sendo a resposta associada à dose e o tipo celular empregado. No entanto, James et al. 25 (1999), testaram o efeito da cotinina na aderência e proliferação de fibroblastos oriundos do ligamento periodontal, verificando que apenas em concentrações de 10ug/ml a cotinina parece inibir a proliferação e adesão celular. Esta dose foi superior à maior concentração empregada no presente trabalho, o que nos indicaria que apesar da cotinina ter uma estrutura química similar à nicotina seu comportamento biológico pode ser diferente.
Avaliações de densidade celular são empregadas para quantificar a resposta das células a diferentes fatores inibitórios ou estimulatórios como a concentração de nutrientes no meio, efeitos hormonais ou toxicidade às drogas. (Freshney, 1994).15 As avaliações feitas neste estudo no grupo condicionado com nicotina sugerem que esta substância pode influenciar negativamente a densidade celular. Todos os grupos testados com as diferentes concentrações da droga apresentaram uma diminuição gradual na densidade dos fibroblastos de forma proporcional à dose (Figura 13). Estes resultados são corroborados por Lahmouzi et al.31 (2000) que encontraram 50% de redução na densidade celular a partir de concentrações de 4mM (660 ug/ml).
nicotina pode não ter um efeito inibitório e sim um efeito estimulatório sobre a proliferação celular. Estes resultados estão de acordo com os de Peacock et al. 38 (1993), que observaram que a nicotina a baixas concentrações pode ter um efeito estimulatório tanto na aderência como na proliferação celular.
A avaliação da densidade celular nas superfícies tratadas com cotinina revelou que em concentrações iguais ou inferiores a 500 ng/ml, não ocorriam alterações da densidade celular, independentemente da realização de raspagem após condicionamento. Porém, no grupo condicionado com 1ug/ml, observou-se uma leve diminuição da densidade de fibroblastos nas amostras submetidas à raspagem. Embora exista uma maior densidade celular no grupo não raspado, a diferença foi mínima apenas para o grupo condicionado com 1ug/ml (Figura 14). Como mencionamos anteriormente, pode ser que a molécula de cotinina tenha um comportamento biológico diferente à nicotina.
Uma das principais propriedades nocivas atribuídas à nicotina é seu elevado poder citotóxico, que segundo alguns autores em doses elevadas pode levar até a morte celular (Chang et al. 2001;8 Chechi et al. 1999;9 Tipton & Dabbous 1995),45. No entanto, as concentrações da substância são variáveis entre os indivíduos, além da nicotina apresentar uma meia vida biológica muito curta, de aproximadamente 30 minutos. Devido a esta característica, podemos pensar que o potencial tóxico pode ser influênciado por o tempo de exposição das células a esta droga. Um dos métodos de avaliação do potencial tóxico de uma substância é o teste de viabilidade celular.
determinaram que os fibroblastos submetidos a concentrações de nicotina superiores a 3mM (500 ug/ml) por períodos de 24 horas podem sofrer mudanças intracelulares que levam à perda da integridade de membrana levando à morte por necrose. Por outro lado, para Checchi et al. 9 (1999), a morte celular só foi observada a partir de doses maiores que 600ug/ml. Chang et al.8 (2001) observaram 15% de morte celular com as mesmas concentrações testadas por Chechi et al.9 (1999), além de relatar que o efeito tóxico da nicotina pode ser potencializado pela aerocolina, substância presente em altas proporções no tabaco mastigável. A alta toxicidade atribuída à nicotina foi pesquisada por Hanes et al.20 (1991) que afirmaram que a molécula é reconhecida pelos fibroblastos como uma substância injuriante, sendo assim absorvida pela célula para sua posterior eliminação. O problema surge quando são absorvidas grandes quantidades da droga, pois o mecanismo de eliminação da nicotina pela célula é muito mais lento que o sistema de absorção. Portanto, a exposição prolongada e constante à altas concentrações pode originar uma toxicidade intracelular que altera o metabolismo e fisiologia das células, podendo culminar na morte celular.
