GASTROENTEROLOGIA
EXPERIMENT
AL
INTRODUÇÃO
OobjetivodotransplantedepâncreasoudeilhotasdeLangerhans éproverfontedeinsulinaquesejasuficienteparamanteraglicemia dentrodoslimitesdanormalidade.Comoconseqüência,otransplante deveprevenirascomplicaçõessecundáriasdodiabetes,como tambémmelhoraraqualidadedevidadospacientes,liberando-os dadependênciadeinjeçõesdeinsulina.
Amaiorindicaçãodotransplantedepâncreasoudeilhotas deLangerhanséodiabetesmellitusdotipoI,doençaemque ascélulasbetadasilhotasdeLangerhanssãodestruídaspor processoauto-imune,resultantedeinter-relaçãocomplexaentre fatoresgenéticoseambientaisdesconhecidos(5).
Antes do início da chamada era “insulínica”, o coma diabéticoeraacausademorteempelomenos2/3dospacientes comdiabetesmellitusdotipoI,dequalqueridade,porémcom aintroduçãodainsulina,em1922,houvenotávelregressão
nessesnúmeros,aumentando,significativamente,alongevidade dosdoentes(3).
Maisdemeioséculoapósaintroduçãodotratamentodo diabetes mellitus pela insulina, os diabéticos ainda morrem maiscedodoqueosnão-diabéticos.Ataxademortalidade porsexoeporidade,nosdiabéticos,émaisalta,emqualquer faixaetária,quandocomparadaàpopulaçãonormal.
Adiferençanataxademortalidadeé,emparte,dependenteda idade.Entre20e40anosdeidade,oriscodemorteé10oumais vezesmaiornodiabéticodotipoIdoqueemnão-diabéticos,enquanto emdiabéticosacimade50anos,é,apenas,deduasvezes.
Acausademorteestá,também,relacionadacomaidade: pacientesmaisjovenstendemamorrerdenefropatia,enquanto osmaisidososdedoençascardiovasculares(3).
NaInglaterra,acausamaiscomumdecegueira,noperíodo produtivodavida,éodiabetesmellitus.Aretinopatiadiabéticaé esperadaempraticamentetodososdiabéticosepodeserdetectada
ALOTRANSPLANTEDEILHOTAS
DELANGERHANSNOFÍGADODE
RATOSSUBMETIDOS
AMANIPULAÇÃOTÍMICA
COMCÉLULASDENDRÍTICAS
Eleazar
CHAIB
,Apostolos
PAPALOIS
,IngridG.M.
BRONS
eRoyY.
CALNE
RESUMO–Racional-AmaiorindicaçãodotransplantedepâncreasoudeilhotasdeLangerhanséodiabetesmellitusdotipoI.Oprocesso devesuprirasnecessidadesdeinsulina,mantendoosníveisglicêmicosdentrodanormalidade.Objetivos-Estudou-seoalotransplantede ilhotasdeLangerhansnofígadoderatosLewis,tendocomodoadoresdeilhotasratosWistar.Nogrupocontrole(n=8)injetava-se,notimo, soluçãodeHanksenogrupodeestudo(n=9),célulasdendríticas.MaterialeMétodos-Nogrupocontrolecomométododeseparaçãoe purificaçãodasilhotasdeLangerhansobteve-se3637±783,3ilhotascompurezade85%±3,52%.Nogrupodeestudoobteve-se3268± 378ilhotasdeLangerhanscompurezade87%±4,47%ecomométododeisolamentoepurificaçãodascélulasdendríticasdobaçoobteve-se3,34x105±1,16células.Resultados–Nogrupocontrole,otransplantede3637±783,3ilhotasdeLangerhansnofígado,normalizou aglicemiaquechegoua7,21±0,57mmol/Lnosegundopós-operatório(diferençasignificativacomrelaçãoaopré-operatório).Dopós-operatórioimediatoatéo8ºpós-operatórioaglicemianãoseelevousignificativamente,porémapartirdo10ºpós-operatóriohouveaumento significativodesteparâmetro,oquepodesercompatívelcomrejeiçãoagudadoenxerto.Nogrupodeestudo,otransplantede3258±378 ilhotasdeLangerhansnofígado,normalizouaglicemia,quechegoua9,3±2,85mmol/Lnosegundopós-operatório(diferençasignificativa comrelaçãoaopré-operatório).Do4ºao10ºpós-operatório,aglicemiaelevou-sesignificativamente,oquepodesercompatívelcomquadro derejeiçãoagudadoenxertoecertamenteprecoce.Conclusão-Ainoculaçãodecélulasalogênicasapresentadorasdeantígenos(células dendríticas)notimoderatosimunossuprimidosediabéticos,antesdoalotransplantedeilhotasdeLangerhansnofígado,aocontráriode inibirareaçãodoreceptorcontraoenxerto,prolongandoasobrevidamédiadasilhotase,possivelmente,levandoaoestadodetolerância imunológica,induziuaoprocessoderejeiçãoagudaprecoce.
DESCRITORES–TransplantedasilhotasdeLangerhans.Transplantehomólogo.Ratos.
TrabalhorealizadonoDepartamentodeCirurgiadaUniversidadedeCambridge,Inglaterra. Endereçoparacorrespondência:Dr.E.Chaib-RuaEmbaú,206-apt.131-04039-060-SãoPaulo,SP.
em,aproximadamente,80%dospacientesdoentespormaisde20anos eem100%daquelescom40anosdedoençadiagnosticada(12,30).
Aprevalênciadadoença,emnossomeio,aindanãoestábemestabelecida, porémnosEstadosUnidosébemconhecida.Existemaisde1milhão depacientescomdiabetesmellitusinsulino-dependente,nessePaís.A incidênciaanualdadoençaéde55novoscasospormilhãodepopulação, ou12.000novoscasosporano.Amaioriadoscasossãocrianças,embora emtodasasfaixasetáriasexistamgruposderisco(9,31).
A alternativa de tratamento para esses doentes é o transplante depâncreasque,comosesabe,podenormalizarometabolismode carboidratos(17). No entanto, se por um lado essa terapêutica pode
preveniroureverterascomplicaçõesvasculares,comumentevistasnos diabéticostratadoscominsulina,poroutro,pareceimprovávelqueo estritocontroledaglicemiapelaadministraçãodeinsulinaminimize ascomplicações(16,29).
Os resultados do transplante vascularizado de pâncreas têm melhoradonosúltimosanos,noentanto,acirurgiaeanecessidade deimunossupressãocontinuamsendoresponsáveispelasignificante morbimortalidadedoprocedimento.
Desdequemuitosdosproblemasrelacionadoscomesteprocedimento terapêuticosãoinerentesdatécnicacirúrgicaoudaporçãoexócrinado pâncreastransplantado,asimplesimplantaçãodeilhotaspurificadas deLangerhansseriaumaalternativaviável.
Muitotemsidofeitonosúltimos20anosparaoaperfeiçoamento dastécnicasdetransplantedeilhotasdeLangerhans:agrandeatração dessamodalidadeterapêuticaédequeelaspodemserinjetadas,por viaendovenosa,emórgãobemvascularizado(comoporexemploo baçoouofígado),evitando-seassim,anecessidadedeintervenção cirúrgica,comotambémasinconveniênciasimunólogicaseinflamatórias conseqüentesdotransplantedetecidoexócrinopancreático.
Apesardosresultadosencorajadoresemroedores,otransplante alogênicodeilhotasdeLangerhansemgrandesanimaiscomotambém nohomem,nãotemdemonstradoproduçãosignificativadeinsulina, porlongosperíodos(14,24).Poroutrolado,otransplantedeilhotasde
Langerhansvemenfrentandodificuldadesnãosónarejeiçãoimunológica, comotambémproblemasanatômicosespecíficos(29).
Sabe-sequeasilhotasdeLangerhansdispersam-seentreosácinos pancreáticoseconstituementre1%e2%damassadopâncreas.Assim, oseutransplantetemnecessitadodemétodoscomplexoseàsvezes ineficientesdeseuisolamentoepurificação.
Um dos principais problemas da perda do enxerto é a rejeição aguda. Grande passo para a sua solução foi dado por POSSELT et al.(22),queobtiverampelaprimeiravezatolerânciaaoalotransplante
dasilhotasdeLangerhansemratos,inoculandonotimodessesanimais asmesmasilhotastransplantadasemoutroórgão,associando-sedose únicadesoroanti-linfocitário,porviasistêmica.
Nesteestudoserãoapresentadososefeitosdainoculaçãodecélulas apresentadoras de antígenos (células dendríticas) no timo de ratos submetidos ao alotransplante de ilhotas de Langerhans no fígado, como forma de manipulação para provável obtenção de tolerância imunológica.
MATERIALEMÉTODOS
Opresenteestudofoirealizadoem68Rattusalbinus,sendo51 doadoresfêmeasdaraçaWistar(RT1u)e17receptoresmachos,daraça Lewis(RT11).Águaedietaforamadministradasadlibitum.
ParaaseparaçãodasilhotasdeLangerhans,foramutilizadosratos fêmeas (Wistar (RT1u)), de peso corpóreo entre 120 e 210 g. Para receptoresdasilhotasdeLangerhans,utilizaram-seratosmachos(Lewis (RT11)),compesocorpóreoentre170e220g,ondeodiabetesfoi induzidoporinjeçãodeestreptozotocina,naveiapeniana.
SeparaçãoepurificaçãodasilhotasdeLangerhans
Digestãodopâncreas
– Opâncreasdistendidopelacolage-naseeracolocadoemtubocomsoluçãodeHankse,aseguir,em banho com água a 37ºC e incubado por 17 minutos.Tomava-se cuidadoparasemonitorizarotempoeatemperaturaapósaágua estara37ºC.Afimdeseinterromperadigestãopancreática,otuboeraretirado da água morna e a solução de Hanks aquecida era desprezada e substituída pela mesma solução fria, sendo o tecido pancreático colocadoemboxcomgeloe,aseguir,passadoporpeneiracom porosde400u.
Otecidodigeridoerare-suspensoem20mLdelíquidodelavagem (soluçãodeHanks)ecentrifugadopor2minutosà1000rpm,sendo esteprocedimentorepetidopor2ou3vezes.
Otempodecentrifugaçãoeracurtoeavelocidadenãomuitoalta pararemover-seapenascélulasexócrinaseos“debris”.
MétododepurificaçãodasilhotasdeLangerhans–
Após adigestãoenzimáticatecidual,opâncreaseralavadocomodescrito acima e após a decantação do sobrenadante, obtinha-se o material paraserpurificado.OmétododepurificaçãoutilizadofoicomDextran(SigmaIndustrial D-3759)compesomolecularentre70.000e90.000.Centoesessentae novemgdeDextraneramdissolvidosem500mLdeHanks(densidade = 1094) no período de 1 hora, sendo a densidade da nova solução conferidacomhidrômetro.
Omaterialdigeridoerare-suspensoem10mLdeDextrana31%, dissolvido em solução de Hanks e misturado cuidadosamente. Os gradientesdeDextranusadosforam:29%(11,27mLDextran+1,3 mLdeHanks),25%(9,8mLDextran+2mLdeHanks)e11%(4,4 mLDextran+6,4mLHanks).
Emtubouniversalcolocavam-se3mLdeDextrana31%,a seguirasoluçãoobtida(tecidopancreático)erasobrepostapor4 mLdeDextrana29%,4mLa25%e4mLa11%,sendotodoo materialcentrifugadoa400rpmpor4minutose2000rpmpor 16minutos(3).
SeparaçãodasilhotasdeLangerhans
Apósacentrifugação,aseparaçãodasilhotaseraobtidadainterface das seguintes concentrações de Dextran: 11%-25% e 25%-29%.A seguir,eramremovidascompipetaplásticadePasteurelavadasduas vezescomsoluçãodeHanks:aprimeirapor3minutosa1000rpm,e asegundapor1minuto.
Amostradecadainterfaceeraexaminadaecontadanumaplacade Petri,sobvisãodireta,comauxíliodemicroscópio.Asilhotasobtidas eram,então,utilizadasimediatamenteparaotransplante.
Métododecontagemdasilhotasisoladas
As ilhotas eram contadas sob visão direta de microscópio com aumentode10vezes.
Afórmulausadaparacalcularonúmerodeilhotasera: médiadonúmerototaldeilhotas(10gotas)x100=
númerototaldeilhotasem2mL
IdentificaçãodasilhotasdeLangerhans
Emboraasilhotasemroedorespossamserfacilmenteidentificadas usando-semicroscópiodedissecção,métodosimplesdecoloraçãodas mesmasfoiusadoparaquantificar-seapurezadapreparação.
AsilhotaspodemsercoradasantesoudepoisdaseparaçãocomDTZ (diphenylthiocarbazone-SigmaD-5130),quefacilitaavisualização dascélulasnainterfacedasconcentraçõesdoDextran.
Tambémfoidemonstradoqueestemétododecoloraçãonãoaltera afunçãodasilhotasinvitroeinvivo(11).ODTZésubstânciaque
seligaàsmoléculasdezinconosgrânulosdeinsulina,produzindo acoravermelhada.
Asoluçãodecoloraçãofoipreparadaacrescentando-seseisgotas de1mMoldehidróxidodeamônio(30%)à20mgdeDTZdissolvido em6mLdeetanola96%,oqueresultounumasoluçãode13mMol deDTZcompH=7,8.
AsoluçãofinalcomPh=7,4foiobtidaacrescentando-se300µLl dessasoluçãoa100mLdePBS(phosphate-bufferedsaline).Assim,um volumedopâncreasdigeridoenovevolumesdasoluçãodeDTZforam misturadoseincubadosàtemperaturaambientepor10a15minutos.
Procedimentooperatório
Todoprocedimentooperatóriofoirealizadosobcondiçõeslimpas. Osinstrumentoscirúrgicoseramcolocadosemrecipientecometanol a70%,pelomenos6horasantesdoatocirúrgico.
Osratoseramanestesiadosemcâmaradevidroutilizando-seéter etílico(May;BakerLtd.,Dagenham,Inglaterra).Essaanestesiaera utilizadaparaosprocedimentosdecurtaduração.Paraasintervenções prolongadasusava-seoHypnorm(0,04mL/100gdepesocorpóreo) (Janssen Pharmaceuticals Ltd., Grove, Oxford - OX12 ODQ, UK), citratodefentanyl(0,315mg/mL)efluanizone(10mg/mL)através de injeção intramuscular na coxa dos animais, juntamente com o Diazepan (CP Pharmaceuticals Ltd.,Wrexham, UK), 10 mg/2 mL, porviaintraperitonial.
Atricotomiadoabdomeerarealizadacommáquinaelétricaeo animaleracolocadoempranchadecortiçanaposiçãosupina,comos membrosfixados.
Induçãododiabetesmellitus
Oanimalerasubmetidoaanestesiasuperficialporinalaçãodeéter etílico(May;BakerLtd.,Dagenham,Inglaterra)ecolocadoemposição supinaempranchadecortiça.
Colhia-senestemomento,daveiadacaudadoanimal,amostra sangüíneaparadosagemdaglicemiasérica.Aseguir,aveiapeniana eracanulada(comseringadeinsulinade1mLeagulhade12mmx0,4 mm)eaestreptozotocina(60mg/kg)erainjetada(aestreptozotocina eradissolvidaemPBSnaconcentraçãode10mg/mL).OpHdoPBS eraajustadopreviamentepara4,5comácidocítrico).
Aseguir,suspendia-seaanestesiainalatóriaeoanimaleracolocado emgaiolaisoladaparacontroledaglicemiaacada2dias.
Osanimaiscomníveisdeglicemiaacimade13mmol/Lforam utilizadosparaotransplantedeilhotasdeLangerhans.
Cirurgiadodoador-pancreatectomia
Utilizaram-se51ratos,fêmeas,daraçaWistar(RT1u),compeso corpóreoquevarioude120a210gramas.
Incisãomedianaerafeitanoabdomedoanimaleoductobiliopancreático eravisualizado.Aligaduradaparteproximaldoductoerafeitaomais próximopossíveldoduodeno,usando-sefiomonofilamentar5-0(Ethicon Ltd.,UK)ereparando-ocomumapinçahemostáticatipo“mosquito” paravisualizaçãodesuapartedistal.
Oductoera,então,canuladocomauxíliodemicroscópio(Zeiss, Alemanha - OPM1 6-SH), inserindo-se cânula de plástico fina e amarrando-acomfiodealgodão4-0.
Antesdainjeçãoenzimáticaoanimaleraexsanguinado,porsecção daaortaabdominal,naemergênciadosvasosilíacos.
Apósocoraçãoparardebater,volumede4a5,5mL(25mL/kg) de solução de colagenase (Sigma do tipo XI, C-7657, na dosagem de0,7mg/mL+DNasedissolvidaemHBSS(Hanksbalancedsalt solution)-SigmaD-0876)erainjetadonoductobiliopancreático,onde seobservavaadistensãopancreática.
Apósoórgãoencontrar-setotalmentepreenchidopelacolagenase, erarealizadaapancreatectomia,dissecando-seopâncreasdagrande curvaturagástrica,doduodeno,doretroperitônio,dointestinogrosso, dointestinodelgadoedobaço,comtesourademicrocirurgia,tomando-seocuidadodenãoseromperacápsulapancreática,paraquenão houvesseextravazamentodacolagenase.
A seguir, o pâncreas era colocado em tubo universal que, imediatamente,eratransferidopara“box”degelo,elevadoaolaboratório. Otempodeisquemiafrianãoerasuperiora30minutos.
Cirurgiadoreceptor-transplantedeilhotas
deLangerhans
Nove ratos, machos da raça Lewis (RT11) pesando entre 170 e
220 g foram usados como receptores de ilhotas de Langerhans de doadoresfêmeasdaraçaWistar(RT1u).
Odiabeteserainduzidoporinjeção,endovenosa,naveiapenianade estreptozotocina(60mg/kg).Quatrodiasdepoisdainduçãododiabetes, oanimaleraanestesiadocomaassociaçãoHypnormintramuscular(0,04 mL/100gdepesocorpóreo)eDiazepanintraperitonial(0,05mL/100 gdepesocorpóreo)colhendo-seamostrasangüínea,daveiadacauda dorato,paradosagemdaglicemiaantesdalaparotomia.
Oestômago,ointestinogrossoeodelgadoeramenvolvidosem gazeúmidaeafastadosparaoladodireitodoabdome.Aveiaportaera visualizadaepuncionadacomButterflynº23(Venisystems,TM,Abbott, IrelandLtd.),comagulhade19,1mmediâmetrode0,5mm.
As ilhotas suspensas em 0,5 mL de PBS, eram aspiradas em seringade1mLcomsoluçãosalinaeinjetadas,viaveiaporta,no fígado.Apósainjeção,aagulhaeraretiradadaveiaportaeesponjade materialabsorvível(SpongostaneStandard70x50x10mm,Ferrosan -Denmark)eracolocadanolocaldapunção,comprimindo-seovaso suavementepor2minutos,paraevitarosangramento.
Oabdomeera,então,fechadoemdoisplanosdesuturacontínua usando-sealgofil4-0paraoplanomusculareparaapele.
Oanimaleraavaliadodiariamentenopós-operatório,edosagens deglicemiaseramfeitasacada2dias.
Separaçãoepurificaçãodascélulasdendríticasdobaço
Resumindo,oanimaleraesplenectomizadoetodotecidogorduroso e conectivo periesplênico era retirado, sendo o órgão colocado em solução de HBSS dentro de recipiente com gelo e transferido para o laboratório.A seguir, o material obtido era macerado e passado suavementeatravésdepeneirademetal,ondeosesplenócitoseram coletadosecolocadosemplacadePetri.
As células mononucleares eram obtidas por centrifugação (1200rpmpor10minutos),utilizando-segradientecom1mLde albuminabovinasérica(ABS),(densidade1,1g/mL,330mOsm) e4,85mLdePBS(densidadede1081g/mL).Aseguir,ascélulas eramrecobertaspor0,5mLdePBS(phosphate-bufferedsaline) e centrifugadas a 12500 rpm por 10 minutos, em centrífuga do tipoBeckeman.
Ascélulasaderenteseramremovidas,ficandoemculturade tecido por uma noite a 37º C com 5% de CO2 no ar ambiente. Coletavam-se,cuidadosamente,ascélulasdainterfaceelavavam-seasmesmas,porduasvezescomHBSS(Hanksbalancedsalt solution), sendo em seguida, centrifugadas (2300 rpm por 20 minutos),utilizando-se5mLdasoluçãodecélulasemisturando-asa3mLdemetrizamidea13,68%.
Ascélulasdendríticasobtidasdainterfacedassoluçõestinham purezademaisde90%,estavamcontaminadasporalgunslinfócitosdo tipoBeeramavaliadasporcoloraçãoimunoistoquímica,utilizando-se anticorposmonoclonais(Figura1).
Inoculaçãodecélulasdendríticas
Oanimaleraanestesiadoutilizando-seaassociaçãoHypnorm (0,04mL/100gdepesocorpóreo)eDiazepan(0,05mL/100gde pesocorpóreo),colocadoemposiçãosupina,comsuaregiãocervical sobmicroscópiocirúrgico(Zeiss,Alemanha,OPMI6-SH)ecomo cirurgiãoposicionando-senaextremidadecefálicadoanimal.
Incisãomediana,de3cm,naregiãocervicalanteriorerarealizada, estendendo-seatéo1/3superiordoesterno.Osmúsculospré-traqueais eramdissecadoseospólossuperioresdotimoeramexpostos.
Otimoera,então,liberadodoseuligamentomediastinalfixoao esterno.Amargemcefálicadoesternoeajunçãoesterno-clavicular
direita eram expostas, utilizando-se eletrocautério para pequenos animais.Aseguir,estajunçãoeraseccionada.
Neste momento, um assistente sentado em posição oposta ao cirurgião,afastavaoesternoeaclavículaparamelhordissecçãodos lobosdotimo.Essamobilizaçãopermitiaaocirurgiãocolocaro1/3 superiordotimosobvisãodireta,atravésdalentedomicroscópio, utilizando-se 16 vezes de aumento.A injeção celular era realizada utilizando-se seringa Hamilton de 100 µL, com agulha de 25 mm, injetando-se20µLdasuspensãocelular(célulasdendríticasdobaço -suspensãocelularcontendo4x105destascélulas,diluídasem20µL desoluçãodeHanks),emcadaumdoslobosdotimo.
Para evitar a ruptura capsular do timo, o seu 1/3 superior era afastadocuidadosamente,sendoaagulhaintroduzidanopólosuperior emovendo-seemdireçãoaopóloinferior,ondeainjeçãocelularera completada.Aagulhaeraretiradacuidadosamente,paraminimizara possibilidadedeextravazamento.
Olobocontra-lateraldotimoerainjetado,utilizando-seamesma técnica.Ajunçãoesterno-clavicularerareconstruídacompontoúnico, defiomonofilamentar4-0,sendoosplanosmusculareseapelefechados comalgofil4-0emsuturacontínua.
A inoculação destas células no timo era realizada 7 dias antes dotransplantedeilhotasdeLangerhanse3diasantesdainduçãodo diabetesmellitus.
Injeçãointraperitonialdesoroanti-linfocitário
Juntocomainoculaçãodascélulasdendríticasnotimodosanimais, um mililitro de soro antilinfocitário (Accurate Scientific Company, Westbury, EUA), era injetado na fossa ilíaca direita dos animais receptores(Lewis-RTIl),utilizando-seseringadeinsulinade1mLe agulhade12mmx0,4mm,7diasantesdotransplantedeilhotasde Langerhanse3diasantesdainduçãododiabetesmellitus.
Cirurgiadoreceptor-transplantedeilhotas
deLangerhans
Grupoalogênico-soluçãodeHanks(Controle)–
Oito ratosmachos,daraçaLewis(RT1l),pesandoentre140e320g,foram usadoscomoreceptoresparaotransplantedeilhotasdeLangerhans dedoadoresfêmeasdaraçaWistar(RT1u).Trêsdiasantesdainduçãododiabetes,osanimaishaviamsido submetidosainjeçãointra-tímicade20µLdesoluçãodeHanksem cadalobodotimo.
Odiabetesfoiinduzidonosratosporinjeçãoendovenosanaveiapeniana deestreptozotocina(60mg/kg).Quatrodiasdepoisdainduçãododiabetes, oanimaleraanestesiadocomaassociaçãoHypnormintramuscular(0,04 mL/100gdepesocorpóreo)eDiazepanintraperitonial(0,05mL/100g depesocorpóreo),colhendo-seamostrasangüíneadaveiadacaudado rato,paradosagemdaglicemiaantesdalaparotomia.
Oestômago,ointestinodelgadoeogrossoeramenvolvidosem gazeúmidaeafastadosparaoladodireitodoabdome.Aveiaportaera visualizadaepuncionadacomButterflynº23(Venisystems,TM,Abbott, IrelandLtd.),comagulhade19,1mmediâmetrode0,5mm.
Asilhotassuspensasem0,5mLdePBSeramaspiradasemseringa de1mLcomsoluçãosalinaeinjetadasnofígado,viaveiaporta.Apósa injeçãoaagulhaeraretiradadaveiaportaeesponjadematerialabsorvível (SpongostaneStandard70x50x10mm,Ferrosan-Dinamarca)era colocadanolocaldapunção,comprimindo-seovasosuavementepor 2minutos,paraevitar-seosangramento.
GRÁFICO1-Grupocontrole–(WAG-LEWIS).Injeçãointra-tímica
desoluçãodeHanks
30
25
20
15
10
5
0
-7 -4 0 2 4 6 8 >10dias
glicemia
Injeção
I.T.+SAL STZ lhotasTx Rej.Ag.
I.T.=intra-tímica,SAL=soroanti-linfocitário,STZ=Estreptozotocina, Tx=transplante,Rej.Ag.=rejeiçãoaguda
Oabdomeera,então,fechadoemdoisplanosdesuturacontínua, usando-sealgofil4-0paraoplanomusculareparaapele.Oanimal eraavaliadodiariamente,nopós-operatório.
Os níveis da glicemia foram medidos antes do transplante e valoresacimade15mmol/L(em2diasconsecutivos)confirmavam oestabelecimentododiabetese/ourejeiçãoagudaapósotransplante dasilhotas.
Grupoalogênico-célulasdendríticas–
Noveratos,machos, daraçaLewis(RT1l),pesandoentre170e220gforamusadoscomoreceptores de ilhotas de Langerhans de doadores fêmeas da raça Wistar(RT1u).
Trêsdiasantesdainduçãododiabetes,haviamsidosubmetidosa injeçãointra-tímicade4x105célulasdendríticasem20µLdesolução salina,emcadalobodotimo.
Odiabeteserainduzidoporinjeçãoendovenosanaveiapeniana, de estreptozotocina (60 mg/kg). Quatro dias depois desta indução, oanimaleraanestesiadocomaassociaçãoHypnormintramuscular (0,04mL/100gdepesocorpóreo)eDiazepan(0,05mL/100gdepeso corpóreo)colhendo-seumaamostrasangüínea,daveiadacaudado rato,paradosagemdaglicemiaantesdalaparotomia.
Oestômago,ointestinodelgadoeogrossoeramenvolvidosem gazeúmidaeafastadosparaoladodireitodoabdome.Aveiaporta eravisualizadaepuncionadacomButterflynº23(VenisystemsTM, Abbott,IrelandLtd.),comagulhade19,1mmediâmetrode0,5mm. Asilhotassuspensasem0,5mLdePBSeramaspiradasemseringade 1mLcomsoluçãosalinaeinjetadas,viaveiaporta,nofígado.Após ainjeção,aagulhaeraretiradadaveiaportaeesponjadematerial absorvível (Spongostan e Standard 70 x 50 x 10 mm, Ferrosan - Dinamarca)eracolocadanolocaldapunção,comprimindo-seovaso suavementepor2minutos,paraevitarosangramento.
Oabdomeera,então,fechadoemdoisplanosdesuturacontínua, usando-sealgofil4-0paraoplanomusculareapele.Oanimalera avaliadodiariamente,nopós-operatório.
Osníveisdeglicemiaforammedidosantesdotransplanteevaloresacima de15mmol/L(em2diasconsecutivos),confirmavamoestabelecimento dodiabetese/ourejeiçãoagudaapósotransplantedasilhotas.
Análiseestatística
Utilizou-se o teste, não-paramétrico, de Mann-Whitney na comparaçãoentreasglicemiasantesedepoisdotransplantedeilhotas deLangerhansdosseguintesgrupos:controle(soluçãodeHanks)x (célulasdendríticas).Paratodooestudofoiconsideradoonívelde significânciade5%.
RESULTADOS
GrupoAlogênico-(Wag-Lewis)
–Controle-soluçãodeHanks
Cirurgiadodoador
–
Comométododepurificaçãoeseparação dasilhotasdeLangerhansobteve-se3637±783,3ilhotascompureza de85,12±3,52%(Tabela1).Cirurgiadoreceptor
–
Adosedeestreptozotocinautilizada para a indução do diabetes mellitus, nos animais deste grupo, foi de11,51±3,39mg,obtendo-seníveisdeglicemiade26,48±7,07 mmol/L(Tabela1).Otransplantede3637±783,3ilhotasdeLangerhansnofígado desses animais, normalizou a glicemia que chegou a 7,21 ± 0,57 mmol/Lnosegundodiadepós-operatório(PO)(diferençasignificativa comrelaçãoaopré-operatório).DoPOimediatoatéo8ºdiadePO,a glicemianãoseelevousignificativamente,porémapartirdo10ºdia dePOhouveaumentosignificativodesseparâmetro,oquepodeser compatívelcomrejeiçãoagudadoenxerto(Tabela1).Ademonstração gráficadessesvalorespodeserobservadanaFigura1.
O tempo médio de sobrevida das ilhotas transplantadas está na Tabela5.
Grupoalogênico-(Wag-Lewis)-Célulasdendríticas
Cirurgiadodoador
–
Comométododeseparaçãoepurificação dasilhotasdeLangerhansobteve-se3268±378ilhotascompureza de87±4,47%(Tabela2).TABELA 1 -Grupo controle - transplante de ilhotas de Langerhans (WAG-RT1u - LEWIS-RT11) - Injeção intra-tímica de
soluçãodeHanks
STZ mg
Glic. dia4
Peso (g)
Glic. dia0
Glic. dia2
Glic. dia4
Glic. dia6
Glic. dia8
Glic. >10
Ilhotas (Nº)
Pureza %
rato1 19,2 7,34 320 31,6 7 8,8 28,4 32,8 28 3880 87
rato2 8,7 7,98 150 18,3 6,3 4,9 7 12,8 9,7 2440 85
rato3 11,4 6,89 220 25,8 7,1 5,8 5,4 6,4 29,8 4220 80
rato4 11,4 7,43 185 35,9 7,3 8,3 15,5 22,7 3520 85
rato5 12 8,23 200 35,1 8,3 8,7 27,8 2520 87
rato6 9,6 9,65 140 20,6 7,6 7,5 16,9 13,1 13,1 3740 87
rato7 8,4 7,57 140 18,8 7 7,4 12,5 15,3 9,7 4560 90
rato8 11,4 6,99 220 25,8 7,1 5,8 5,4 6,4 29,8 4220 80
média 11,51 6,88 196,8 26,48*7,21* 7,15 14,86 15,64 20,01* 3637 85,12
SD 3,39 2,78 59,81 7,07 0,57 1,48 9,27 9,39 10,15 783,3 3,52
*diferentesignificativamenteparaP<0,05
TABELA 2 -Grupo alogênico - transplante de ilhotas de Langerhans (WAG-RT1u - LEWIS-RT11) - Injeção intra-tímica de
célulasdendríticas
Nº células
STZ (mg)
Glic. dia
-4 Peso
(g) Glic. dia0
Glic. dia2
Glic. dia4
Glic. dia6
Glic. dia8
Glic. Dia >10
Ilhotas Nº
Pureza %
rato1 5 8,4 7,89 170 21 11,4 27,2 22,2 3100 90
rato2 4,3 10 7,34 190 33,3 11 29,8 26,8 26,7 3840 90
rato3 2,7 13,2 6,98 220 33,2 6,6 12,5 28,6 3460 90
rato4 2,7 13,2 8,95 220 16,7 5,8 7,4 20,7 28 31,1 2940 85
rato5 5 10,2 6,84 180 33,3 11,7 25,2 29,2 30,1 3000 80
média3,94** 11 7,60 196 27,5* 9,3* 20,42*25,5*28,26*31,1 3268 87
SD 1,16 2,12 0,85 23,02 8,04 2,85 9,86 3,83 1,71 378,0 4,47
*diferentesignificativamenteparaP<0,05
**ovalordonúmerodecélulasémultiplicadopor105
TABELA5-SobrevidadoalotransplantedeilhotasdeLangerhansno fígado de ratos(WAG-RT1u - LEWIS-RT11) diabéticos
eimunossuprimidos,7diasapósainoculaçãodecélulas dendríticasnotimo
Inoculaçãotimo n Diadarejeição Tempomédiode
sobrevidadasilhotas(dias)
SoluçãoHanks 8 5,5,5,7,9,9,>60,>60 9
CD**(4x105) 9 1,1,1,1,3,3,3,5,5 3
Comométododeseparaçãoepurificaçãodascélulasdendríticas dobaçoobteve-se3,34x105±1,16células(Tabela2).
Cirurgiadoreceptor
–
Adosedeestreptozotocinautilizada paraainduçãododiabetesmellitus,nosanimaisdestegrupo,foide 11±1,16mg,obtendo-seníveisdeglicemiaséricade27,5±8,04 mmol/L(Tabela2).Otransplantede3258±378ilhotasdeLangerhansnofígadodesses animais,normalizouaglicemiaquechegoua9,3±2,85mmol/Lno 2º PO (diferença significativa com relação ao pré-operatório). Do 4º POao10ºPOaglicemiaelevou-sesignificativamente,oquepodeser compatível com quadro de rejeição aguda do enxerto e certamente precoce (Tabela 2).A demonstração gráfica desses valores pode ser observadanaFigura2.
O tempo médio de sobrevida das ilhotas transplantadas está na Tabela5.
“Primarynon-function”
Cirurgiadodoador
–
Comométododeseparaçãoepurificação dasilhotasdeLangerhansobteve-se3080±878,3ilhotascompureza de86,75±2,36%(Tabela3).Comométododeseparaçãoepurificaçãodascélulasdendríticas dobaçoobteve-se4,12x105±1,04células(Tabela3).
Cirurgiadoreceptor
–
Adosedeestreptozotocinautilizada paraainduçãododiabetesmellitus,nosanimaisdestegrupo,foide 11,6±2,09mg,obtendo-seníveisdeglicemiaséricade26,37±7,77 mmol/L(Tabela3).Otransplantede3080±878,3ilhotasdeLangerhansnofígado dessesanimaisnãonormalizouaglicemia,quesemanteveemníveis superioresa20mmol/LportodooP.O.,oqueécompatívelcomo nãofuncionamentodotransplante(Tabela3).Ademonstraçãográfica dessesvalorespodeserobservadanaFigura3.
A média e o desvio-padrão do grupo controle (solução de Hanks)comparadoaodecélulasdendríticas,estãorepresentados naTabela4.
DISCUSSÃO
Ométododeisolamento,purificaçãoetransplanteisogênicodas ilhotasdeLangerhansemratos,jáfoidescritoporCHAIBetal.(4),
assimpassou-seainvestigarotransplantealogênico(entreespécies), TABELA 3 -Grupo alogênico - transplante de ilhotas de Langerhans (WAG-RT1u - LEWIS-RT11) - Injeção intra-tímica de célulasdendríticas-“Primarynon-function”
Nº células
STZ (mg)
Glic. dia
-4 Peso
(g) Glic. dia0
Glic. dia2
Glic. dia4
Glic dia6
Glic. dia8
Glic. dia >10
Ilhotas Nº
Pureza %
rato1 2,7 14,4 6,31 240 18,9 19,7 18,3 17,3 2180 90
rato2 4,3 10 7,54 190 22,4 25,1 22,6 28,3 24 22 4240 87
rato3 4,3 10 7,98 190 36,8 26,3 27,4 33,5 2700 85
rato4 5,2 12 6,87 200 27,4 23,6 27,3 24,1 28,2 22 3200 85
Média4,12** 11,6 7,17 205 26,37*23,67*23,9*25,4*26,1* 22* 3080 86,75
SD 1,04 2,09 0,73 23,8 7,77 2,87 4,35 6,84 2,97 878,3 2,36
**ovalordonúmerodecélulasémultiplicadopor105.
*igualparaP<0,005
TABELA4-TransplantealogênicodeilhotasdeLangerhans(WAG-RT1u
-LEWIS-RT11).Médiaeodesviopadrãodogrupocontrole
(soluçãodeHanks)comparadoaodecélulasdendríticas
Controle soluçãoHanks
Células dendríticas
Glicemiadia0 26,48±7,07 27,5±8,04
Glicemiadia2 7,21±0,57 9,3±2,85
Glicemiadia4 7,15±1,48 20,42±9,86*
Glicemiadia6 14,86±9,27 25,5±3,83
Glicemiadia8 15,64±9,39 28,26±1,71
Glicemiadia>10 20,01±10,15 31,1
*diferentesignificativamenteparaP<0,05
GRÁFICO2-Grupoestudo(WAG-LEWIS).Injeçãointra-tímicade
célulasdendríticas
35
30
25
20
15
10
5
0
-7 -4 0 2 4 6 8 >10dias
glicemia
Injeção
I.T.+SAL STZ lhotasTx Rej.Ag.
I.T.=intra-tímica,SAL=soroanti-linfocitário,STZ=Estreptozotocina, Tx=transplante,Rej.Ag.=rejeiçãoaguda
GRÁFICO3
-Grupoalogênico-(WAG-RT1u-LEWIS-rt1I).Injeçãoin-tra-tímicadecélulasdendríticas.“Primarynon-function”
30
25
20
15
10
5
0
-7 -4 0 2 4 6 8 >10dias
glicemia
Injeção
I.T.+SAL STZ lhotasTx
I.T.=intra-tímica,SAL=soroanti-linfocitário, STZ=Estreptozotocina,Tx=transplante Glicemia(mmol/l)
emanimaismanipuladosnotimocominjeçãodecélulasalogênicas apresentadoras de antígenos (células dendríticas), com intuito de induzir-setolerânciaimunológica.
Optou-sepelautilizaçãoderatosdaraçaWistar,comodoadoresde células(ilhotasdeLangerhansecélulasdendríticas),comcomplexode histocompatibilidademaiorouhaplotipo(RT1u)eratosdaraçaLewis,como receptores,também,comhaplotipoconhecido(RT11)eincompatíveis.
NogrupocontroleseriamtransplantadasasilhotasdeLangerhans, dosratosdaraçaWistar,emratosdaraçaLewisdiabéticos(porinjeção deestreptozotocinaendovenosa)jáimunossuprimidos,comdoseúnica desoroantilinfocitário,emanipuladosnotimoapenascominjeçãode soluçãotampãodeHanks,7diasantesdotransplante.
Nestegrupoinjetava-seestreptozotocinanaveiapenianadosanimais receptores,4diasantesdotransplantedeilhotasdeLangerhans,na dosagemde11,51±3,39mg.Adoseerasuficienteparaaindução dodiabetes,mostrandoqueaglicemia,nodiadotransplante(dia0), erade26,48±7,07mmol/L,significativamentesuperioraosvalores pré-operatórios.
Otransplantede3637±783,3ilhotasdeLangerhansnofígado, viaveiaporta,foieficientenanormalizaçãodaglicemiaqueatéo4º diadePO,manteve-seigualaosvalorespré-operatórios.Apartirdaí, iniciou-seoprocessodeprovávelrejeiçãoagudaqueseestabeleceu, definitivamente,apartirdo9ºdiadePO,quandoaglicemiaséricasuperou osníveisde15mmol/L,chegandono10ºdiadePOa20,01±10,15 mmol/L,oqueé,significativamente,superioraosníveisencontrados atéo4ºdiadePO,comodemonstraaFigura1.
Sabendo-se que o alotransplante (Wag-Lewis) das ilhotas de Langerhans,emreceptoresimunossuprimidoscomsoroantilinfocitário, eramrejeitadasno9ºdiadePO,restavainvestigaremprimeiraetapa,sea inoculaçãodecélulasdendríticaspurificadasextraídasdobaçodosratos doadoresatuariamcomomoduladorasdarespostaimunológica.
O“rationale”paraestainferênciaseriaqueascélulasapresentadoras deantígenos(célulasdendríticas),provindasdosanimaisdoadores,quando injetadasnotimodosanimaisreceptores,entrariamemcontatodiretocom esteórgãoeporconseguintecomoslinfócitosTeB,queporcertosãoos responsáveispelaaceitaçãoourejeiçãodostransplantesdeórgãos.
Supondo-sequeduranteagêneseematuração,notimo,doslinfócitos T e B, estes reconhecessem as células apresentadoras de antígenos (célulasdendríticas)comopróprias,provavelmentenãorejeitariamas ilhotasdeLangerhansque,posteriormente,seriamtransplantadase provindas,também,dosmesmosdoadores,conseguindo-secomisto aobtençãodeumestadodenãorespostaimunológicaoutolerância aotransplante,comoconseguiuPOSSELTetal.(22),quandoinjetouas
própriasilhotasdeLangerhans,queseriamtransplantadasposteriormente notimodosanimaisreceptores.
Assim,nessegrupodeestudoosanimaisforam,7diasantesdo transplantedeilhotas,inoculadosemambososlobosdotimocom3,94 ±1,16x105célulasdendríticaspurificadas,aomesmotempoemque eraadministrado,porviaintraperitonial,osoroantilinfocitário.
Ainjeçãode11±2,12mgdeestreptozotocinaendovenosa,na veiapenianadessesanimais,4diasantesdotransplantedasilhotas deLangerhans,foieficientenaproduçãododiabetes,mostrandoque aglicemianodiadotransplante(dia0)erade27,5±8,04mmol/L,o queésignificativamentesuperioraosvalorespré-operatórios.
Otransplantede3268±378ilhotasnofígado,porviaportal,fez comqueaglicemiativessequedasignificativano2ºdiadoPO,chegando aníveisde9,3±2,85mmol/L,noentanto,apartirdo3ºdiadePO
observou-seelevaçãosignificativanosníveisdaglicemia,estandono 4ºdiadePOem20,42±9,86mmol/L,denotandocomissoiníciode processoderejeiçãoagudaaoenxerto,comomostraaFigura2.
Assim, ficou evidente que a sobrevida média dessas ilhotas de Langerhanstransplantadasnãofoisuperiora3diasequeainoculação dascélulasdendríticaspurificadasnotimodessesanimais,aocontrário doqueseesperava,nãoproporcionoumelhoraceitaçãodoenxertoe simacelerouoprocessoderejeiçãoaguda,fazendosuporquehouve, oquesepoderiachamarderejeiçãoagudaprecoce.
Valenestepontodestacarquenãoseacreditaquetenhahavido processo de sensibilização do receptor ao enxerto, uma vez que a imunossupressãocomsoroantilinfocitárioemratosébastantepotente paramanterosanimaisimunodeprimidosportemporelativamentelongo, pordepleçãodoslinfócitoscirculantes.Corroborandocomestefato, viu-sequenogrupocontrolearejeiçãoaguda,emanimaistambém imunodeprimidos,somenteseiniciouno9ºdiadePO.
Otratamentocomsoroantilinfocitáriorapidamentedepletaoslinfócitos Tperiféricoscirculantes,ocorrendoentão,profundalinfopeniaquepersiste por2-4semanas(18),ficandoarespostaimunológicabastantesuprimida,
comotambém,aceleraacinéticadecélulastoti-potentesparaotimo(13).
Emratos,comainjeçãoúnicadesoroantilinfocitárioapopulação decélulasTperiféricasétransitoriamente(14dias)depletadaa10% dosníveisnormais,quandoavaliadoporFACS(“fluorescence-activated cellsorter”)(22).
Outrospesquisadoresproduziramlinfopeniaemanimaistratando-oscomsoroantilinfocitário(32).
SACHS et al.(25) mostraram que em ratos tratados por soro
antilinfocitárioproduzidoemcoelho,porviaintraperitonil,ograude linfopeniaem24horasédosedependentee,aocontráriodeoutros, essesautoresnãoacharamperdadaefetividadedosoroemperíodos longosdeadministraçãodesteimunossupressor.
Nemtodososestudosapontamparapapelúnicodosoroantilinfocitário nocontroledarejeiçãodetransplante.Assim,sabe-sequeascélulasT periféricasnãoentramnotimo(28),permitindoquecélulastransplantadas
com antígenos estranhos sobrevivam em ambiente relativamente protegidodavigilânciaimunitária.
Outrosexperimentos(1),mostraramqueascélulasTmadurasinativadas,
quandoativadas,nãotêmcapacidadedemigrarparaotimo,domesmo modoqueainoculaçãodecélulassangüíneasestranhasnotimoevitaram ainteraçãodeantígenosdodoadorcomascélulasTperiféricascirculantes maduras(21),prevenindoassim,asuaativação.Istopermiteaostimócitos
madurosreconhecerantígenosestranhossemrejeição.
Alémdomais,osachadosdequeopré-tratamentocompequenas dosesdeimunossupressãoéirrelevanteparaalcançar-seasubseqüente tolerância,sugeremqueaslesõesdascélulastímicas,induzidaspor imunossupressão(27),nãosãoosmecanismosresponsáveispelasobrevida
dostransplantesemestudosprévios(23).
Quatrodosnoveanimaisdestegrupo(célulasdendríticas)apresentaram “primarynon-function”ouseja,omalfuncionamentoprimáriodoenxerto. Estefatoocorreuapesardoscuidadostécnicosnaseparaçãoepreparação dasilhotas,eassimosanimaisapósseremtransplantadoscom3080 ±878,3ilhotas,nãoconseguiramnormalizaraglicemiaséricaquese manteveempatamareselevados,nãomostrandodiferençasignificativa entreosvalorespréepós-transplantecomomostraaFigura3.
onãoresfriamentodopâncreaslogoapósainjeçãodacolagenase,ademora noprocessodedigestãopancreática,pelacolagenase,nolaboratório, aumentando,comisto,otempodeisquemiafriadasilhotasdeLangerhans, eporfim,oimplantenãoadequadodasilhotasnotecidohepático.
Os mecanismos celulares envolvidos na rejeição aguda dos alotransplantessãocomplexoseopapelprecisodasváriassubpopuplações decélulasTnesseprocesso,continuaobscuro.
MuitosestudostêmmostradoqueascélulasCD+4,sãoospivôsda induçãodarejeição(10),enquantooutrosestudostêm,também,identificado
aativaçãodependentedascélulasCD+4dascélulasTcitotóxicas(CD+8) comoimportantemecanismoefetornarejeiçãodosalotransplantescom complexodehistocompatibilidade,classeIeclasseII,incompatíveis(15).
Aexpressãocelulardoantígenodocomplexodehistocompatibilidade maior classe II é considerado como envolvido na iniciação ou na perpetuaçãodadestruiçãomediadaimunologicamente,queocorreem doençasauto-imunes(2)enarejeiçãodealotransplantes(19).
No transplante de ilhotas um decréscimo de suas células, que expressamantígenosclasseII,estácorrelacionadocomoprolongamento dasobrevidadosenxertos(6).
DentrodasilhotasdeLangerhans,célulasclasseIIpositivasresidem comcélulasendócrinasque,normalmente,nãoexpressamantígenos classeIIesim,apenaspequenosníveisdeantígenosclasseI(11).
EssascélulasclasseIIpositivas“leucócitospassageiros”,células dendríticas ou apresentadoras de antígenos são necessárias para a apresentaçãodoantígenoparaohospedeiroounaproduçãodeum co-estimulador (citocina primária ou secundária) para ativação do processodoantígenopelohospedeiroqueresultarianainiciaçãoda rejeiçãodoenxerto(11).
Asilhotaspodemserpreparadasdepâncreasderatosneonatosque estãosemcélulasapresentadorasdeantígenos,comotambémtransplantadas contragrandediferençasdeantígenosdehistocompatibilidade,sem rejeiçãoouimunossupressão(11).
ArejeiçãodealoilhotasdeLangerhansisoladasmostranúmero de achados que são típicos da rejeição de órgãos vascularizados, comotambémdeoutrosalotransplantescomo:controlegenético(20),
latência(26), dependência da dosagem(8), expressão sistêmica(7) e
dependênciadacélulaT(26).
Emconclusão,ainoculaçãodecélulasalogênicasapresentadoras deantígenos(célulasdendríticas)notimoderatosimunossuprimidos e diabéticos, antes do alotransplante de ilhotas de Langerhans no fígado,aocontráriodeinibirareaçãodoreceptorcontraoenxerto, prolongandoasobrevidamédiadasilhotase,possivelmente,levando aoestadodetolerânciaimunológica,induziuàaceleraçãodoprocesso derejeiçãoaguda.
ChaibE,PapaloisA,BronsIGM,CalneRY.Alogenicislettransplantationontheratliverafteralogenicdendriticcellsinjectioninthethymus.ArqGastroenterol 2005;42(1):41-9.
ABSTRACT–Background-ThemajorindicationforpancreasorislettransplantationisdiabetesmellitustipeI.Thisprocesshastosuplytheinsulinnecessity keepingglucoseundercontrol.Aim-Westudiedalogenicislettransplantationontheratliver,Wistar(RT1u)toLewis(RT11)asarecipient.Controlgroup(n
=8)anddendriticcellgroup(n=9)respectivelywithinjectionofHankssolutionanddendriticcellsinthethymusbeforeislettransplantation.Materialand Methods-Withthemethodofisolationandpurificationoftheisletsweobtainedbothinthecontrolgroup3637±783,3isletswithpurityof85±3,52%and dendriticcellgroup3268±378isletswithpurityof87±4,47%.Thedendriticcellswereretrievedfromthespleenandweobtained3,34x105±1,16cells. Diabeteswasinducedbyi.v.streptozotocin.Results-Controlgroupthetransplantationof3637±783,3isletsintheratlivernormalizedglucosetest,7,21 ±0,57mmol/Linthesecondpost-operativeday.Acuterejectioncameinthe10postoperativedaywithsignificantlyincreaseofglucosetest.Dendriticcell group,thetransplantationof3258±378isletsintheratliver,normalizedtheglucosetestwas9,3±2,85mmoL/Linthesecondpostoperativeday.Fromthe 4thpostoperativedayto10thpostoperativedaytheglucosetestincreasesignificantlyshowinganearlyacuterejection.Conclusion-Theinjectionofdendritic
cellsinthethymusbeforealogenicislettransplantationintheratliverleadtoanearlyacuterejection.
HEADINGS–IsletsofLangerhanstransplantation.Transplantation,homologous.Rats.
REFERÊNCIASBIBLIOGRÁFICAS
1. AgusDB,SurchCD,SprentJ.ReentryofTcellstotheadultthymusisrestrictedto activatedTcells.JExpMed1991;173:1039-42.
2. BotazzoGF,Pujol-BorrellR,HanafusaT,FeldmannM.Hypothesis:roleofaberrant HLA-DRexpressionandantigenpresentationintheinductionofendocrineimmunity. Lancet1983;2:1115.
3. BrentL,SellsRA.Organtransplantation:currentclinicalandimmunologicalconcepts. London:BaillièreTindall;1989.
4. ChaibE,PapaloisA,BronsIGM,CalneRY.Transplanteisogênicodeilhotasde Langerhansnofígadoderatos.(Metodologiaparaseparaçãoepurificaçãodasilhotas deLangerhans).ArqGastroenterol2000;37:44-51.
5. EisenbarthGS.TipeIdiabetesmellitus:achronicautoimmunedisease.NEnglJ Med1986;314:1360-8.
6. FaustmannDL,HauptfieldV,LacyPE,DavieJ.Prolongationofimmuneisletallograft survivalbypretreatmentofisletwithantibodydirectedtoIadeterminants.ProcNatl AcadSciUSA1981;78:5156-9.
7. GrayDWR,MorrisPJ.Developmentsinisolatedpancreaticislettransplantation. Transplantation1987;43:321-31.
8. GotohM,MakiT,SatomiS,PorterJ,MonacoAP.Immunologicalcharacteristicsof purifiedpancreaticisletgrafts.Transplantation1986;42:387-90.
9. HarrisMJ,HanamanRF.DiabetesinAmerica.Bethesda,MD:NIHPubl.;1985. p.85-1468.
11. Kover K, Hegre O, Popiela H, BiggsT, MooreWV. Cross-reactivity of organs i allograftrejection.Comparisonofeffectofthyreoidallograftsonestablishedislet allografts.Diabetes1987;36:1268-70.
12. KrolewskiAS,WarramJR,RandLI.Riskofproliferativediabeticretinopathyin typeIdiabetes,a40yearfollow-upstudy.DiabetesCare1986;9:443.
13. Lance EM, Medawar PB,Taub RN. Antilymphocyte serum. Adv Immunol 1973;17:1-92.
14. LondonNJ.Clinicalstudiesofhumanislettransplantation.AnnRCollSurgEngl 1995;77:263.
15. LowryRP,ForbesRDC,BalckburnJH,MarghescoDM.Immunemechanismsinorgan allograftrejectionV.Pivotalroleofcytotoxic-supressorTcellsubsetintherejection ofheartgraftsbearingisolatedclassIdisparitiesintheimbredrat.Transplantation 1985;409:545-50.
16. MauerSM,SutherlandDER,SteffesMW.Pancreaticislettransplantation:effectson theglomerularlesionsofexperimentaldiabetesintherat.Diabetes1974;23:748. 17. Miranda MP. Estado atual e experiência clínica inicial com transplante de
pâncreas[dissertação].SãoPaulo:FaculdadedeMedicinadaUniversidadede SãoPaulo;1997.
18. MonacoAP,WoodML,GrayJG,RusselPS.Studiesonheterologousantilymphocyte seruminmice.II.Effectontheimmuneresponse.JImmunol1966;96:229. 19. Morris PJ,TingA. Studies of HLA-DR with relevance to renal transplantation.
ImmunolRev1982;66:103-31.
20. MorrowCE,SutherlandDE,SteffesMW,NajarianJS,BachFH.H2antigen-class: effectonmouseisletallograftrejection.Science1983;219:1337-9.
21. PericoN,RossiniM,ImbertiO,RemuzziG.Evidenceofthecentralroleofthe thymus in the induction of donor-specific unresponsiveness to a renal allograft. Transplantation1992;54:943-5.
22. PosseltAM,BarkerCF,TomaszweskiJE,MarkmannJF,ChatiMa,NajiA.Induction of donor-specific unresponsiveness by intrathymic islet transplantation. Science 1990;249:1293-5.
23. Remuzzi G, Rossini M, Imberti O, Perico N. Kidney graft survival in rats without immunossupression after intrathymic glomerular transplantation. Lancet 1991;337:750.
24. RicordiC,TsakisAG,CarrolPB,ZengY,RiloHLR,AlejandroR,ShapiroR,Fung JJ,DemetrisAJ,MintzDH,StarzlTE.Humanisletisolationandallotransplantation in22consecutivecases.Transplantation1992;53:407.
25. SachsJH,FilliponeDR,HumeDM.Studiesofimmunedestructionoflymphoidtissue. I.Lymphocitotoxiceffectofrabbitanti-ratlymphocyteantiserum.Transplantation 1964;56:1197-201.
26. ShizuruJA,GregoryAK,ChaoCTB,FathmanCG.Isletallograftsurvivalafterasingle courseoftreatmentofrecipientwithantibodytoL3T4.Science1987;237:278-80. 27. SmithCA,WilliansGT,KingstonR,JenkinsonEJ,OwenJJT.AntibodiestoCD3/Tcell
receptorcomplexinducedeathbyapoptosisinimmuneTcellsinthymiccultures. Nature1989;337:181-4.
28. Stutman O. Intrathymic and extrathymicT cell maturation. Immunol Rev 1978;42:138.
29. Sutherland DER, Najarian JS, Greenberg BZ, Senske BJ,Anderson GE, Francis RS,GoetzFC.Hormonalandmetaboliceffectsofanendocrinegraft:vascularized segmentaltransplantationofthepancreasininsulin-dependentpatients.AnnIntern Med1981;95:537.
30. Tchobroutrky G. Relation of diabetic control to development of microvascular complications.Diabetes1978;15:143.
31. WestKM.Epidemiologyofdiabetesanditsvascularlesions.NewYork:Elsevier;1978. 32. WoodruffMFA,AndersonN.Effectoflymphocytedepletionbythoracicductfistula
andadministrationofanti-lymphocyteserumonthesurvivalofskinhomograftsin rats.Nature1963;200:702.