Expressão do fator de crescimento fibroblástico 10 (FGF-10) em folículos pré-antrais e antrais jovens durante o desenvolvimento ovariano em fetos bovinos

(1)

ANTHONY CÉSAR DE SOUZA CASTILHO

EXPRESSÃO DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 10

(FGF-10) EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS E ANTRAIS JOVENS

DURANTE O DESENVOLVIMENTO OVARIANO EM FETOS

BOVINOS

Orientador: Prof. Dr. José Buratini Júnior

(2)

ANTHONY CÉSAR DE SOUZA CASTILHO

EXPRESSÃO DO FATOR DE CRESCIMENTO FIBROBLÁSTICO 10

(FGF-10) EM FOLÍCULOS PRÉ-ANTRAIS E ANTRAIS JOVENS

DURANTE O DESENVOLVIMENTO OVARIANO EM FETOS

BOVINOS

Dissertação apresentada ao Programa de

Pós-Graduação do Instituto de Biociências

de Botucatu, Universidade Estadual

Paulista – UNESP, para obtenção do título

de mestre em Ciências Biológicas – Área:

Farmacologia.

Orientador: Prof. Dr. José Buratini Jr.

(3)

Anthony César de Souza Castilho – Mestrado- Farmacologia

FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA DE AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO

DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP

BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Selma Maria de Jesus

Castilho, Anthony César de Souza.

Expressão do fator de crescimento fibroblásitoco10 (FGF-10) em folículos pré-antrais e antrais jovens durante o desenvolvimento ovariano em fetos bovinos / Anthony César de Souza Castilho. – Botucatu : [s.n.], 2008.

Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências, Botucatu, 2008.

Orientador: José Buratini Júnior Assunto CAPES: 505051046

1. Bovino - Desenvolvimento - Genética 2. Bovino - Reprodução - Aspectos farmacológicos

CDD 636.20824

(4)

“

O decorrer da vida é como andar de

bicicleta. Para manter o equilíbrio, é

preciso se manter em movimento.

”

Albert Einstein

(5)

“... aprendi a entender que vocês são duas das

poucas pessoas que são capazes de me tornar

muito feliz! Parei de falar com a mente vazia e

comecei a falar palavras guardadas dentro do meu

coração que por bastante tempo ficaram caladas.

Hoje tenho vocês e meu maior bem: amor de pai e

mãe.”

Autor desconhecido

Aos meus queridos pais, Júlio e Cássia,

Pelo sacrifício, amor, dedicação e acima de tudo pela grande torcida nesses importantes anos da minha vida. Lágrimas existiram pela saudade ou até mesmo de

alegria, porém nos fizeram ser a cada dia mais: PAI,

MÃE E FILHO.

(6)

“...Se eu sei que no final fica tudo bem,

A gente se ajeita

numa cama pequena,

Te faço um poema, te cubro de amor...”

Saulo Fernandes

À minha namorada e grande amiga, Jamile.

Desculpas pela ausência, mas grato pela confiança e amor dedicados nessa importante fase da nossa vida.

Saiba que todas as conquistas também foram para você.

(7)

AGRADECIMENTOS

A Deus, por me ajudar sempre que precisei. Que assim seja.

Ao meu Mentor, e grande amigo, pela calma e serenidade dadas quando necessário.

Ao Prof. Dr. José Buratini Jr. (Orientador), pela oportunidade de me integrar a sua

equipe de laboratório e pelas imensas ajudas durante esses anos. Obrigado!

À minha avó, Maria Inês, por ser minha segunda mãe, pelo amor, carinho e torcida

sempre presentes em minha vida. Te amo, Vó.

Às minhas irmãs, Lais e Letícia, por fazerem meus fins de semana muito mais feliz.

Amo vocês garotas!

Aos meus sogros e torcedores natos, Dílson e Eloiza pela forma com que me tratam, pela confiança e acima de tudo por me ajudarem MUITO nesses anos.

Aos meus avós,tios, tias, primos (em especial meu afilhado José Carlos) e primas,

pelo carinho, torcida e atenção sempre presente.

À Paula Ripamonte, pelo convívio, ensinamentos, pelas dicas e aprendizagens mil que

(8)

À minha amiga, Isabela, pela amizade, pelas alegrias, risadas e caronas.

À minha outra amiga, Mariana, pelo alegre convívio nesses anos, pela vizinhança, pela amizade e diversão que fizeram o tempo voar!!

Ao amigo de “Lab” e de moradia agora, Diego, pela alegria de saber levar a vida e pela

grande amizade.

Aos meus amigos da pós-graduação da Farmacologia, pelo alegres momentos de

confraternizações.

Aos amigos da pós-graduação da FMVZ-Botucatu, pelas boas risadas que dei

nesses dois anos.

Aos meus sempre amigos, Lílian, Roberto, Luciana, Jaime, e Roberta, pela grande amizade, pelos raros, mas bons fins de semanas em Bauru. Valeu galera!

Aos professores e funcionários do Departamento de Fisiologia. Um agradecimento

especial para a secretária Luciana, pela atenção e disposição em sempre me ajudar.

Aos professores e funcionários do Departamento de Farmacologia pelas aulas

(9)

À Profa. Dra. Maria Dalva Cesário, pela importante ajuda durante as análises

histológicas e pelas dicas valiosas dadas.

À Profa. Dra. Reneé Laufer Amorin e seu aluno de mestrado Pedro, pela importante

ajuda durante as imunohistoquímicas pelas dicas valiosas dadas.

Aos funcionários da seção de pós-graduação, Lu, Maria Helena e Sérgio, pela ajuda e colaboração durante todo o meu mestrado.

Ao Prof. Cristopher A. Price, do Centro de Pesquisas em Reprodução animal, da

Faculdade de Medicina Veterinário, (Universidade de Montreal, Canadá) pela grande e constante ajuda no desenvolvimento desse trabalho. E pelas caipirinhas também !!!

Ao Prof. Ciro Moraes Barros, do Departamento de Farmacologia (Unesp-Botucatu),

por permitir o nosso acesso no seu laboratório e empréstimos de equipamentos.

Ao Frigorífico Frigol (Lençóis Paulistas - SP), pela receptividade, permitindo a coleta

dos ovários para realização do projeto.

A FAPESP (Fundação de amparo à pesquisa no Estado de São Paulo), pela concessão

da bolsa durante a realização do meu mestrado.

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para que eu alcançasse o título de

(10)

SUMÁRIO

RESUMO

ABSTRACT

LISTA DE FIGURAS

LISTA DE TABELAS

ABREVIATURAS

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 1

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Desenvolvimento do ovário fetal e dos folículos pré-antrais 3

2.2. Controle do desenvolvimento folicular pré-antral 5

2.3. O papel dos fatores de crescimento fibroblástico (FGFs) 6

2.4. Subfamília do FGF-7 10

3. OBJETIVOS E HIPÓTESES 14

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Obtenção de ovários fetais 15

4.2. Extração de RNA e Transcrição reversa 16

4.3. Expressão gênica de FGF-10 por PCR em tempo real 18

4.4. Preparações histológicas e Imunohistoquímica 22

4.5. População folicular em ovários fetais ao longo da gestação 23

4.6. Análise estatística 24

5. RESULTADOS

5.1. Análise Histológica 25

5.2. População folicular em ovários fetais ao longo da gestação 33

5.3.Expressão gênica de FGF-10 34

5.4.Imunohistoquímica 35

(11)

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Estrutura dos FGFRs e “splicing” alternativos no domínio extracelular D3 para

obtenção das isoformas b e c nos FGFR-1, 2 e 3. Domínio PTK (domínio intracelular tirosina

quinase). Porção transmembrana (TM). Adaptado de Eswarakumar et al., 2005. (Página 7)

Figura 2. Cascata intracelular (destacada na caixa preta) da ativação de FGFRs por FGFs.

Adaptado de Eswarakumar et al., 2005. (Página 8)

Figura 3. A) Fêmea bovina obtida em abatedouro com aproximadamente 90 dias de gestação.

B) Aspecto anatômico do sistema reprodutivo feminino: útero (seta delgada) e ovário direito

(seta larga). (Página 16)

Figura 4. Curvas de amplificação e de dissociação para CYC-A em ovários fetais bovinos aos

60, 75, 90, 120, 150, 210 dias de gestação. (Página 19)

Figura 5. Curvas de amplificação e de dissociação para FGF-10 em ovários fetais bovinos aos

60, 75, 90, 120, 150, 210 dias de gestação. (Página 20)

Figura 6. Exemplo de curva de amplificação para a determinação da eficiência por amostra utilizando o software “LinRegPCR”. (Página 21)

(12)

a eficiência do transcrito gene referência; ΔCPalvo é desvio de CP do controle – amostra do gene

alvo transcrito; ΔCPref é desvio de CP do controle – amostra do gene referência transcrito.

(Página 22)

Figura 8. Análise histológica de ovário fetal bovino aos 60 dias de gestação. Presença de

cordões ovígeros (círculo), oogônias (seta delgada) e células da pré-granulosa (seta curta).

(Página 26)

folículos primordiais (seta) em pequeno número na região cortical. (Página 27)

folículos primários (seta). (Página 28)

Figura 11. Análise histológica de ovário fetal bovino aos 120 dias de gestação. Destaca-se a

majoritária presença de folículos primários (seta). (Página 29)

Figura 12. Análise histológica de ovário fetal bovino aos 150 dias de gestação. Destaca-se o

aparecimento de folículos secundários, com a presença das células da teca (CT), granulosa

(CG) e oócito (*).(Página 30)

folículo antral jovem bem caracterizado pelas células da teca (CT), células da granulosa (CG) e

oócito (asterisco). (Página 31)

Figura 14. Análise histológica do feto aos 210 dias mostrando a presença de tecido luteal (TL).

(13)

Figura 15. Número de folículos contados em 36 campos fotomicrografados de 3 ovários (12

campos por ovário) fetais para cada idade gestacional avaliada (A,B _{valores diferentes para uma}

mesma categoria entre as idades; a,b _{valores diferentes entre as categorias na mesma idade; P<}

0,05). (Página 34)

Figura 16. Expressão gênica de FGF-10 quantificada por PCR em tempo real em ovários fetais

bovinos ao longo do período gestacional. (Página 35)

Figura 17. Imunolocalização do FGF-10 em folículos pré-antrais de ovário fetal aos 210 dias de

gestação. (Página 36)

Figura 18. Controle negativo (pré-incubação de proteína recombinante FGF-10 com anticorpo

primário) para imunolocalização do FGF-10. (Página 37)

Figura 19. Imunolocalização do FGF-10 nas oogônias (seta) em ovários fetais bovinos aos 60

dias de gestação. (Página 38)

Figura 20. Imunolocalização do FGF-10 nas células da granulosa (CG), células da teca (CT) e

oócito (asterisco) de folículo antral jovem bovino. (Página 39)

Figura 21. Imunolocalização (A) e controle negativo (B) do FGF-10 em tecido luteal de feto

bovino aos 210 dias. (Página 40)

Figura 22. Imunolocalização (A) e controle negativo (B) do FGF-10 em vasos sanguíneos.

(14)

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Relação entre idade gestacional e medida de crowm-rump. (Página 16)

Tabela 2. Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores para ciclofilina A e FGF-10. (S:

oligonucleotídeo iniciador “sense” A: oligonucleotídeo iniciador “antisense”); pb (pares de base).

(Página 18)

Tabela 3. Número de folículos contados em 36 campos fotomicrografados de 3 ovários (12

campos por ovário) fetais para cada idade gestacional avaliada. Porcentagens das diferentes

categorias foliculares em relação ao número total de folículos para cada idade gestacional

mostradas entre parênteses (A,B _{valores diferentes entre linhas;}a,b _{valores diferentes entre}

(15)

LISTA DE ABREVIATURAS

°°C graus Celsius

µg micrograma

µl microlitro

µM micromolar A “antisense”

ANOVA análise de variância

bFGF fator de crescimento fibroblástico básico

BMP-15 proteína morfogenênica óssea 15

cDNA ácido desoxirribonucléico complementar

CG células da granulosa

CGP células germinativas primordiais

CT células da teca

ct ciclo “threshold”

CYC-A ciclofilina A

DNA ácido desoxirribonucléico

DNAse enzima que degrada o ácido desoxirribonucléico

EGF fator de crescimento epidermal

FGF fator de crescimento fibroblástico

FGF-2 fator de crescimento fibroblástico 2

(16)

FGFR-1b receptor 1b para o fator de crescimento fibroblástico

FGFR-2b receptor 2b para o fator de crescimento fibroblástico

FGFR-3c receptor 3c para o fator de crescimento fibroblástico

FGFR-4 receptor 4 para o fator de crescimento fibroblástico

FSH hormônio folículo estimulante

FSHR receptor para o hormônio folículo estimulante

hFGF fator de crescimento fibroblástico homólogo

iFGF fator de crescimento fibroblástico intracelular

KDa quilodalton

GDF-9 fator de crescimento e diferenciação 9

KGF-I fator de crescimento de queratinócitos 1

KGF-II fator de crescimento de queratinócitos 2

KL “Kit-ligand”

LH hormônio luteinizante

M molar

mg miligrama

ml mililitro

mM milimolar

MOIFOPA manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais

ng nanograma

(17)

PCR reação em cadeia pela polimerase

RNAm ácido ribonucléico mensageiro

RNAse enzima que degrada o ácido ribonucléico

rpm rotações por minuto

RT transcrição reversa

RT-PCR reação de transcrição reversa seguida de reação em cadeia pela polimerase

S “sense”

SCF fator de células troncos

TGF fator de crescimento transformante

(18)

CASTILHO, A.C.S. Expressão do fator de crescimento fibroblástico 10 (FGF-10) em folículos pré-antrais e antrais jovens durante o desenvolvimento ovariano em fetos bovinos. Botucatu, 2008. Dissertação (Mestrado Ciências Biológicas -Farmacologia) - Instituto de Biociências, IBB, Universidade Estadual Paulista - UNESP.

O desenvolvimento folicular pré-antral é controlado predominantemente por peptídeos intraovarianos, incluindo os FGFs. O FGF-10 participa de interações parácrinas entre

células mesenquimais e epiteliais, regulando a proliferação e diferenciação celular e também tem sido detectado em folículos pré-antrais. No entanto, a expressão do FGF-10 durante o desenvolvimento ovariano fetal e a possível associação com a dinâmica folicular ainda não haviam sido investigados. O objetivo do presente estudo foi

investigar o padrão da expressão do FGF-10 durante o desenvolvimento ovariano fetal ao longo da gestação. Trinta fetos bovinos (predominantemente Bos indicus) foram

obtidos em matadouro e divididos em seis grupos (n=5) de acordo com a idade gestacional, estimada pelo comprimento entre o topo da cabeça e o início da cauda

(grupos: 60, 75, 90, 120, 150 e 210 dias de gestação). Um ovário de cada feto foi destinado à análise histológica da população folicular e imunohistoquímica e o outro submetido à extração de RNA total. A expressão gênica do FGF-10 foi investigada por RT-PCR em tempo real utilizando oligonucleotídeos iniciadores bovino-específico. Os

valores da expressão foram calculados usando ciclofilina A como controle interno. A imunohistoquímica foi realizada utilizando anticorpo policlonal anti-FGF-10 humano produzido em coelho. A análise histológica revelou presença somente de cordões ovígeros aos 60 dias, aparecimento de folículos primordiais aos 75 dias, presença de

(19)

jovens aos 210 dias de gestação. A expressão gênica do FGF-10 foi maior aos 210 dias quando comparados com aos 60, 75 e 90. A proteína FGF-10 foi detectada em células germinativas primordiais, oócitos e células da granulosa de todos os tipos foliculares presente; bem como em células da teca de folículos secundários e antrais jovens. O

aumento da expressão gênica do FGF-10 foi temporalmente associado ao aparecimento de folículos antrais jovens exibindo uma camada da teca mais desenvolvida aos 210 dias de gestação. Em conclusão, a expressão de FGF-10 está presente ao longo do desenvolvimento ovariano fetal em todas as classes foliculares e

aumentada no fim da gestação, sugerindo sua participação no controle da foliculogênese em pré-antral e, particularmente, da foliculogênese antral em bovinos.

(20)

CASTILHO, A.C.S. Expression of fibroblastic growth factor 10 (FGF-10) in preantral and early antral follicles during ovarian development in bovine fetuses.

Dissertação (Mestrado em Ciências biológicas -Farmacologia)Instituto de Biociências, IBB, Universidade Estadual Paulista - UNESP.

Preantral follicular development is controlled predominantly by intraovarian peptides including FGFs. FGF-10 participates in paracrine interactions between epithelial and

mesenchymal cells, regulating cellular differentiation and proliferation, and has already been detected in preantral follicles. The expression of FGF-10 during fetal ovary development and the possible association with formation of preantral follicles in the fetal ovary has not been investigated. The objective of this study was to investigate the

expression pattern of FGF-10 during fetal ovarian development along gestation. Thirty bovine fetuses (predominantly Bos indicus) were obtained at a local abattoir, and

divided into six groups (n=5) according to the crown-rump length as an estimative of age (groups: 60, 75, 90, 120, 150 e 210 days of gestation). One ovary of each fetus was

submitted to histological analysis of the follicle population and immunohistochemistry, and the other was reserved for total RNA extraction. FGF-10 mRNA expression was investigated by Real time PCR using bovine specific primers. Expression values were calculated using Cyclofilin A as the internal control. Immunohistochemistry was

performed using a rabbit polyclonal anti-human FGF-10 antibody. The histological analysis revealed the presence of only ovigerous cords at 60 days, disappearance of ovigerous cords and appearance of primordial follicles at 75 days, appearance of primary follicles at 90 days, an increased in primary follicles number at 120 days,

(21)

and was greater at 210 days in comparison with 60, 75 and 90 days of gestation. FGF-10 protein was detected in germ cells, oocytes and granulosa cells of all follicle classes, and in theca cells of secondary and early antral follicles. The increase in FGF-10 gene expression was temporally associated with the appearance of early antral follicles

exhibiting a more developed theca layer at 210 days of gestation. In conclusion, FGF-10 expression is present along fetal ovary development in all follicle classes and increases towards the end of gestation, suggesting its participation in the control of preantral and, particularly, early antral folliculogenesis in cattle.

(22)

1. INTRODUÇÃO

O entendimento da fisiologia ovariana em espécies de interesse econômico ou ameaçadas de extinção é de grande interesse para um melhor aproveitamento do

potencial reprodutivo dessas espécies, além de seu valor como conhecimento básico. Neste contexto, uma maior compreensão dos fatores que controlam a atividade ovariana é necessária para o progresso das biotécnicas da reprodução que otimizam a utilização de material genético feminino, entre elas, a manipulação de oócitos inclusos

em folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA).

Embora a maioria dos estudos sobre o desenvolvimento folicular foque o estágio antral, um melhor entendimento da fisiologia pré-antral é necessário para a compreensão do processo em sua totalidade, uma vez que eventos pré-antrais podem

determinar o desempenho dos folículos no estágio antral. Sabe-se que as gonadotrofinas desempenham um papel essencial na regulação do desenvolvimento folicular antral, bem como nos estágios finais do desenvolvimento pré-antral, o que motivou numerosas pesquisas nessa área. Porém, peptídeos intra-ovarianos têm

função preponderante no controle dos folículos pré-antrais, tema menos explorado e conhecido, sobretudo em bovinos.

Dentre os vários fatores de crescimento envolvidos no controle do desenvolvimento pré-antral incluem-se os fatores de crescimento fibroblástico (FGFs).

Vários membros desta família (FGF-2, FGF-8, FGF-7 e FGF-10) mostraram-se expressos em folículos pré-antrais bovinos.

(23)

espécies. No ovário bovino, a sua expressão foi detectada em células da teca e oócitos de folículos antrais, onde ele parece regular a diferenciação esteroidogênica das células da granulosa. No entanto, embora se saiba da expressão de FGF-10 em folículos pré-antrais bovinos, é desconhecida a participação do mesmo nos mecanismos que

regulam o desenvolvimento do ovário fetal e o aparecimento das distintas populações foliculares pré-antrais durante a gestação. Deste modo, a análise do padrão de expressão do FGF-10 ao longo do desenvolvimento ovariano fetal, utilizando-se como referência a dinâmica folicular pré-antral, pode contribuir para esclarecer a participação

(24)

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. Desenvolvimento do ovário fetal e dos folículos pré-antrais

Na ausência de genes que determinem a formação dos testículos, o primórdio gonadal se desenvolve em ovário (PARROT & SKINNER, 1999) pelo estabelecimento

da linhagem germinativa no ovário fetal. Tal processo ocorre pela migração das células germinativas primordiais (CGPs) até a crista genital, através do endoderma intestinal e mesentério dorsal. Essas células são oriundas do mesoderma extraembrionário (saco vitelíneo), tem formato grande e apresentam poucas organelas citoplasmáticas, além de

um número variável de partículas de glicogênio e lipídeos (MOTTTA et al., 1997), que são utilizadas como fonte de energia durante o processo migratório. Vale ressaltar, que esse processo é dividido em duas fases: na primeira destaca-se a transferência passiva para a crista genital devido ao crescimento do embrião, seguida de auto-propulsão

independente de movimentos morfogênicos, estimulada e direcionada por substâncias quiomiotáxicas produzidas localmente (GOSDEN, 1995). Uma característica marcante da fase de migração é a multiplicação das CGPs, que passam por de 6 a 8 divisões mitóticas durante esse processo (ERICKSON, 2001). A estruturação e estabelecimento

folicular pré-antral também incluem intensa colonização do ovário fetal por células mesonéfricas, que se acredita serem as precursoras das células foliculares somáticas (células da pré-granulosa; PICTON, 2000).

A formação dos folículos acontece quando os oócitos primários tornam-se

(25)

estrutura folicular, caracterizando-se pelo aumento de organelas citoplasmáticas e interrupção da meiose oocitária em dictióteno da prófase I (oócito quiescente; GOSDEN & BOWNES, 1995).

Após sua formação, na dependência de estímulos ainda não completamente

elucidados, os folículos primordiais deixam o pool dos folículos em repouso, iniciando o crescimento oocitário, enquanto as células da granulosa tornam-se cubóides e começam a se multiplicar, constituindo assim, a transição do folículo primordial para o primário (WANDJI et al., 1996).

O aparecimento das células da granulosa cuboidais não é um evento randômico. Em bovinos, isto se dá quando existem pelo menos sete células visíveis em corte-transversal, tornando-se cada vez menor a porcentagem de células achatadas presentes nos folículos (BRAW-TAL, 2002). Posteriormente, o aparecimento de

folículos secundários inicia-se com o desenvolvimento da segunda camada de células da granulosa, progredindo com a adição de outras (FORTUNE & EPPIG, 1979).

Vale destacar que o aparecimento dos estágios pré-antrais no ovário tem padrão temporal espécie-específico. Nos bovinos, todos os estágios pré-antrais manifestam-se

no ovário fetal durante a gestação (ERICKSON, 1986). Os dados sobre o momento específico de aparecimento de cada categoria pré-antral são divergentes. RUSSE (1983) relatou o aparecimento de folículos primordiais, primários e secundários com aproximadamente 90, 140 e 210 dias de gestação, respectivamente, no feto bovino. Já

(26)

2.2. Controle do desenvolvimento folicular pré-antral

O papel das gonadotrofinas no controle do desenvolvimento folicular pré-antral é controverso. Receptores de FSH (FSHR) foram detectados em folículos primários

bovinos (WANDJI et al., 1992) e a estimulação do desenvolvimento folicular pré-antral foi alcançada pela adição de FSH ao meio de cultura. Entretanto, considera-se que o FSH desempenha um papel secundário neste estágio de desenvolvimento (GUTIERREZ et al., 2000; MCNATTY et al., 1999; WEBB et al, 2003). Alternativamente,

o início e a regulação do desenvolvimento folicular pré-antral são predominantemente conduzidos por fatores produzidos localmente (MCNATTY et al., 1999).

O oócito tem papel ativo na coordenação da proliferação e diferenciação das células da granulosa ao seu redor (GILCHRIST et al., 2004). Comunicação intercelular

é proporcionada por processos citoplasmáticos trans-zonais (TZP), que são extensões das células da granulosa que penetram através da zona pelúcida e atingem a membrana do oócito, onde junções do tipo gap permitem transporte bidirecional de

íons, metabólitos, aminoácidos e pequenas moléculas reguladoras (ALBERTINI et al.,

2001). Interessantemente, este tipo de comunicação entre o oócito e células somáticas parece ser regulada durante o desenvolvimento, uma vez que as TZPs retraem quando o folículo atinge o estágio antral, o que se acredita ser, pelo menos em parte, um efeito da ação do FSH (ALBERTINI et al., 2001).

A comunicação entre o oócito e as células somáticas também ocorre por sinalização parácrina. Dentre vários fatores de crescimento produzidos pelo oócito ou células da granulosa, o fator de células tronco (SCF; também conhecido como

(27)

particularmente o fator de crescimento diferencial-9 (GDF-9) e a proteína morfogenêtica óssea-15 (BMP-15, também conhecida como GDF-9B) têm recebido a maior parte da atenção recentemente (WEBB et al., 2003). Contudo, vários outros fatores de crescimento estão envolvidos na sinalização parácrina/endócrina pré-antral incluindo

ativina e folistatina (SILVA et al., 2006), inibina, EGFs (fatores de crescimento epidermal), VEGF (fator de crescimento endotélio vascular; YANG & FORTUNE, 2007) e fatores de crescimento fibroblástico (FGFs; MCNATTY et al., 1999).

2.3. O papel dos fatores de crescimento fibroblástico (FGFs)

Os FGFs compõem uma família de pelo menos 25 membros (FGF 1-25);

(KATOH & KATOH, 2005), tendo sido apenas 23 membros descritos em mamíferos (ITOH & ORNITZ, 2004). Esses peptídeos apresentam padrões temporais e espaciais de expressão específicos e estão envolvidos em inúmeros processos fisiológicos ou patológicos, como o desenvolvimento embrionário, angiogênese,

cicatrização e oncogênese (BASILICO et al., 1992).

Análises filogenéticas em ratos demonstram que essa família de peptídeos encontra-se dividida em sete subfamílias: FGF-1, FGF-4, FGF-7, FGF-8, FGF-9, iFGF e hFGF, (ITOH & ORNITZ, 2008). Além da habilidade de estimular a proliferação de uma grande variedade de células, os FGFs apresentam potentes

(28)

indica que elas desempenham papel importante como fatores de crescimento e diferenciação durante toda a vida (IGARASHI et al., 1998).

Os eventos celulares mediados pelos FGFs acontecem via ativação de quatro principais receptores, FGFR-1 a FGFR-4, que se localizam na membrana plasmática e têm atividade intracelular tirosina quinase. Estruturalmente esses receptores são

caracterizados por uma porção extracelular, um domínio transmembrana e um domínio intracelular responsável pela ativação e fosforilação de tirosinas, quando estimulados por FGFs. A porção extracelular por sua está dividida em três domínios semelhantes à imunoglobulina (Ig-like); D1, D2 e D3, que são responsáveis pela

interação e especificidade com os FGFs. São nos domínios D3 que “splicing” alternativos nos FGFR-1, 2 e 3 geram isoformas funcionais dos tipos b e c (FGFRIIIb e FGFRIIIc; Figura 1; revisado por Eswarakumar et al., 2005).

Figura 1. Estrutura dos FGFRs e “splicing” alternativos no domínio extracelular D3 para

obtenção das isoformas b e c nos FGFR-1, 2 e 3. Domínio PTK (domínio intracelular tirosina

quinase). Porção transmembrana (TM). Adaptado de Eswarakumar et al., 2005.

Região Ácida Região

Ácida

Domínio PTK Domínio PTK

Região Ácida Região

Ácida

(29)

A interação ligante-receptor é coordenada pela conjugação desse complexo com heparina ou proteoglicanos (heparan sulfato) conferindo maior estabilidade à ligação e dimerização dos FGFRs. A sinalização intracelular desse complexo (FGF-FGFR-Heparina) é mediada através do recrutamento de uma família de proteínas

sinalizadoras, conhecidas como FRS2, até os locais de ligação com as tirosinas fosforiladas. Após essa ligação, complexos do tipo Grb2 são responsáveis pela ativação da via intracelular, Ras/Raf/ MAP quinase (Eswarakumar et al., 2005; Figura 2).

Figura 2. Cascata intracelular (destacada na caixa preta) da ativação de FGFRs por FGFs.

(30)

A foliculogênese está incluída dentre os processos fisiológicos nos quais participam os FGFs, sendo o FGF-2, também conhecido como fator de crescimento fibroblástico básico (bFGF), o membro da família melhor estudado nesse contexto. No ovário bovino, o FGF-2 foi localizado nos oócitos de folículos primordiais e

primários e em células da granulosa (CG) e da teca (CT) de folículos pré-antrais em crescimento e antrais (VAN WEZEL et al., 1995). Estudos de ligação revelaram que os receptores para FGF-2 estão principalmente localizados na camada de células da granulosa (WANDJI et al., 1992). Demonstrou-se que o FGF-2 é capaz de estimular

a ativação de folículos primordiais em culturas de fragmentos de ovários de ratas e de promover proliferação de células da granulosa (NILSSON et al., 2001; GOSPODAROWICZ et al., 1989). Entretanto, o FGF-2 não teve efeito sobre a ativação espontânea de folículos primordiais, que é comumente observada em

cultura de explantes ovarianos bovinos (DERRAR et al., 2000).

Outro membro desta família de peptídeos potencialmente interessante para foliculogênese pré-antral é o FGF-8, primeiramente descrito como um fator sinalizador crucial para o desenvolvimento embrionário e oncogênese (CROSSLEY & MARTIN, 1995; TANAKA et al., 1992). Dos cinco genes codificadores de receptores para FGF

(FGFR; (KIM et al., 2001; SLEEMAN et al., 2001), o FGF-8 ativa preferencialmente o FGFR-4 e o subtipo ‘c’ do FGFR-3 (ORNITZ et al., 1996). No ovário de camundongas, a expressão gênica do FGF-8 mostrou-se restrita ao oócito (VALVE et al., 1997), sugerindo sua participação na sinalização às células foliculares a partir do oócito.

(31)

Recentemente, em bovinos, a expressão gênica do FGF-8, FGFR-3c e -4 foi detectada em “pools” de folículos primordiais, primários e secundários obtidos a partir de ovários fetais (BURATINI et al., 2005). Os sinais de expressão do FGF-8 e FGFR-3c mostraram-se simultâneos e foram mais freqüentes em folículos secundários do que

primordiais. Desta forma, o padrão de expressão gênica observado sugere que a expressão do FGF-8 e de seus receptores é regulada ao longo do desenvolvimento e que o FGFR-3c é o receptor predominante para o FGF-8 em folículos pré-antrais bovinos (BURATINI et al., 2005).

Dados disponíveis na literatura também indicam participação do FGF-7 e FGF-10 no controle da foliculogênese pré-antral em bovinos (BERISHA et al., 2004; BURATINI et al., 2007).

2.4. Subfamília do FGF-7

Há discordâncias sobre quais membros constituem essa família. Porém, segundo ITOH & ORNITZ (2008), a mesma é composta por 4 membros (FGFs 3, 7, 10

e 22), que interagem com dois principais receptores, o FGFR-2b e o FGFR-1b (ITOH & ORNITZ, 2004). Esses fatores estão envolvidos em uma série de processos e interações celulares epitélio-mesenquimais, como, proliferação de queratinócitos, morfogênese endometrial e pulmonar e reparo tecidual (MIN et al., 1998; SEKINE et al.,

1999; TAYLOR et al., 2001; BEER et al., 2000).

(32)

Devido ao seu potente efeito mitogênico em queratinócitos de camundongos, é também conhecido como fator de crescimento dos queratinócitos I ou KGF-I (WARE & MATTHAY, 2002). A expressão do FGF-7 foi detectada em vários tecidos como pele, folículos capilares, pulmão, próstata, glândula mamária, útero e ovário, onde se

sustenta que ele promova diferenciação e proliferação de células epiteliais (RUBIN et al., 1995).

A expressão do RNAm do FGF-7 foi detectada em todas as categorias foliculares pré-antrais em bovinos (BURATINI et al., 2007). O tratamento com FGF-7 inibiu a

fragmentação apoptótica do DNA e aumentou o diâmetro e a expressão da inibina-a de folículos pré-antrais cultivados (HSUEH et al., 2000). Embora os mecanismos não tenham sido esclarecidos, estes resultados indicam o FGF-7 como um fator de diferenciação e sobrevivência celular envolvido no controle da foliculogênese pré-antral.

O FGF-10, também conhecido como KGF-II (fator de crescimento dos queratinócitos II), é uma proteína de aproximadamente 26 Kda, originalmente isolada do mesênquima pulmonar de ratos e identificada como essencial para a regulação de eventos morfogênicos. Sendo assim, acredita-se que o FGF-10 desempenha papel

importante na organogênese, especialmente no pulmão (IGARASHI et al., 1998), o que pode ser confirmado pela ausência completa de pulmões em camundongos “knock out” para o FGF-10 (MIN et al., 1998; SEKINE et al., 1999). Atribuiu-se ao FGF-10, a função de potente fator quimiotático para as porções distais do pulmão, agindo como

(33)

O FGF-10 é bastante semelhante ao FGF-7, tanto no que se refere à estrutura e seqüência do gene, quanto às propriedades funcionais. Ambos apresentam alta afinidade pelo FGFR-2b, o qual é altamente expresso no epitélio pulmonar de embriões nos estágios inicias de desenvolvimento (PETER et al., 1992; IGARASHI et al., 1998,

OHUCHI et al., 2000). Esta similaridade sugere que o FGF-7 e o FGF-10 atuam de forma sinérgica ou redundante em algumas situações (IGARASHI et al., 1998). Contudo, o FGF-10 não atua somente via ativação de FGFR-2b, mas também por intermédio do FGFR-1b, que se mostrou capaz de ativar a via da MAP Kinase em

explantes de pele e cérebro de ratos após tratamento com FGF-10 (BEER et al., 2000). Em relação a sua participação no controle da fisiologia reprodutiva, destaca-se inicialmente a detecção da expressão gênica do FGF-10, juntamente com a do FGF-7, no útero neonatal ovino. Acredita-se que ambos participem da regulação da

morfogênese endometrial, onde o FGF-10 atuaria como fator quimiotático direcionador do crescimento e ramificação glandular, e o FGF-7 estimularia a proliferação de células epiteliais (TAYLOR et al., 2001).

Recentemente, a expressão do RNAm do FGF-10 foi detectada em oócitos e células da teca de folículos antrais bovinos (BURATINI et al., 2007), bem como no corpo lúteo

bovino (CASTILHO et al., 2008). Como as células da granulosa expressam os receptores para o FGF-10 (o FGFR-2b; BERISHA et al., 2004), sugere-se o envolvimento do FGF-10 na sinalização parácrina oriunda do oócito e células da teca alvejando as células da granulosa (BURATINI et al., 2007). Além disso, os níveis de

(34)

desenvolvimento. Dados funcionais indicam que o FGF-10 não altera a atividade proliferativa, mas inibe a produção de estradiol em meio de cultivo de células da granulosa (BURATINI et al., 2007). Esses resultados, aliados à observação de que o FSH estimula a expressão do FGFR-2b em células da granulosa (BURATINI et al.,

2007), sugerem que o FGF-10 de origem tecal regula a diferenciação das células da granulosa de folículos antrais recém-recrutados e que a sua expressão deve ser suprimida para a continuidade do desenvolvimento folicular.

Dados preliminares obtidos recentemente em nosso laboratório indicam a participação do FGF-10 também no controle da fase pré-antral do desenvolvimento

folicular. Em congruência com esta hipótese, o RNAm codificador do FGF-10 foi detectado em folículos pré-antrais primordiais, primários e secundários obtidos de fetos bovinos (BURATINI et al., 2007). No entanto, a possível regulação da expressão do FGF-10, bem como sua relação com a dinâmica folicular pré-antral durante o

(35)

3. OBJETIVOS E HIPÓTESES

3.1. Objetivo Geral

Investigar o padrão de expressão do FGF-10 em ovários fetais bovinos ao longo

da gestação.

3.2. Objetivos específicos

a) Investigar o padrão da expressão gênica do FGF-10 ao longo do

desenvolvimento ovariano fetal em bovinos.

b) Investigar o padrão de expressão protéica do FGF-10 ao longo do desenvolvimento ovariano fetal em bovinos.

c) Investigar a associação da dinâmica folicular em ovários fetais e a expressão

de FGF-10 ao longo da gestação.

3.3. Hipóteses

A intensidade de expressão do FGF-10 varia ao longo do desenvolvimento ovariano fetal bovino.

(36)

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Obtenção de ovários fetais

Pares de ovários fetais foram obtidos de fêmeas bovinas em matadouro (Figura 3), sendo um deles destinado à extração de RNA total e posterior investigação da

expressão gênica do FGF-10 por RT-PCR em tempo real e o outro para análise histológica, contagem folicular e investigação da expressão protéica do FGF-10 por imunohistoquímica.

A idade dos fetos foi estimada pelo comprimento entre o topo da cabeça e o início

da cauda (medida crown rump), utilizando-se como referência RÜSSE (1983) e TANAKA et al., (2001). Trinta fetos foram utilizados (n=5 para cada grupo) com aproximadamente 75, 90, 120 e 150 dias de gestação, os quais, de acordo com TANAKA et al, (2001), são os momentos aproximados em que ocorre o aparecimento

dos folículos primordiais, primários, secundários e antrais jovens, respectivamente, no ovário fetal bovino em Bos taurus. Animais com 60 dias de gestação também foram

utilizados, a fim de investigar a expressão do FGF-10 no período em que o ovário já está diferenciado e povoado por células germinativas primordiais em diferenciação

(37)

Os ovários fetais bovinos utilizados para extração de RNA total foram transportados em RNA later® (Ambion) até o laboratório, enquanto que aqueles destinados à imunohistoquímica foram transportados em solução de formol a 10%.

Figura 3. A) Fêmea bovina obtida em abatedouro com aproximadamente 90 dias de gestação.

B) Aspecto anatômico do sistema reprodutivo feminino: útero (seta delgada) e ovário direito

(seta larga).

Tabela 1. Relação entre idade gestacional e medida de crowm-rump.

A _B

Idade Gestacional (dias) Medida Crown Rump (cm)

60 6 a 8

75 9 a 11

90 14.6 a 15.6

120 23.4 a 25.4

150 36.9 a 40.9

(38)

4.2. Extração de RNA e Transcrição reversa

Ovários fetais inteiros foram imersos em 1ml de solução Trizol® (Invitrogen), triturados em homogenizador de tecidos (Polytron UltraTurrax T-25) e submetidos ao

protocolo Trizol® (Invitrogen) de extração de RNA total. Ao final da extração, as amostras de RNA total foram solubilizadas em 10 μl de água destilada e autoclavada. As concentrações das amostras de RNA total foram mensuradas por espectrofotometria (Biophotometer®_{, Eppendorf).}

A fim de evitar contaminação por DNA genômico, todas as amostras de RNA total foram tratadas com DNAse antes de serem submetidas à transcrição reversa. Conforme as instruções do protocolo DNAse I – Amplification Grade® (Invitrogen), o volume da solução de RNA total tratado com DNAse foi calculado a fim de conter 1μg de RNA

total. A este volume, foi adicionado 1μl de tampão DNAse, 1μl de DNAse I (1unidade/μl) e água “RNAse free” suficiente para completar 10μl. Essa solução permaneceu à

temperatura ambiente durante 15 minutos e, em seguida, foi acrescida de 1μl de EDTA (25mM) e incubada a 65°C por 10 minutos. Após esse procedimento, as amostras

foram transferidas para o gelo e imediatamente submetidas à reação de transcrição reversa.

Para a reação de transcrição reversa (RT), foi utilizado o “kit“ SuperScript III® (Invitrogen), cujo protocolo iniciou-se pela adição em tubo estéril de 8μl da solução de RNA total tratada com DNAse, 1μl de oligonucleotídeo iniciador Oligo (dT) (500μg/ml),

(39)

por 1,5 minuto. Após essas etapas, adicionou-se à solução 4μl de tampão “First Strand” 5X, 1μl de DTT (0,1M) e 1μl de “RNAse OUT Inhibitor” (40unidades/μl). Na seqüência, foi acrescido 1μl (200 U) de SuperScript III (transcriptase reversa) e iniciou-se a

incubação, primeiramente a 50°C por 50 minutos, depois a 70°C por 15 minutos e,

finalmente, em gelo por 2 minutos. As amostras foram armazenadas em freezer (-20°C) até a análise por PCR em tempo real.

4.3. Expressão gênica de FGF-10 por PCR em tempo real

Para avaliação da expressão gênica do FGF-10 nos ovários fetais ao longo da

gestação utilizou-se o protocolo de amplificação do “kit” Power Sybr Green Master Mix® – Applied Biosystems. A expressão do RNAm do gene constitutivo ciclofilina A foi utilizada como normalizadora da expressão gênica de FGF-10.

As reações de amplificação para CYC-A e FGF-10 foram realizadas em placas de 96 poços, as quais continham 12,5 μl de Power Sybr Green Master Mix® – Applied

(40)

Tabela 2. Seqüência dos oligonucleotídeos iniciadores para ciclofilina A e FGF-10. (S:

oligonucleotídeo iniciador “sense” A: oligonucleotídeo iniciador “antisense”); pb (pares de base).

As condições para amplificação dos genes foram: 95ºC por 10 min, 40 ciclos de 95ºC por 15s (desnaturação) e 60ºC (CYC-A) ou 61ºC (FGF-10) por 1 min (anelamento

e extensão), seguido de curva de dissociação padrão. Os dados de fluorescência foram coletados ao final de cada extensão.

A eficiência e especificidade dos oligonucleotídeos iniciadores dos genes foram caracterizadas pelas curvas de amplificação e dissociação, respectivamente (Figuras 4

e 5).

Gene Sequência

Tamanho do Fragmento

Temperatura de Anelamento

Eficiência de Amplificação

[ ] Final Primer

CYC-A S 5' GCC ATG GAG CGC TTT GG 3' A 5' CCA CAG TCA GCA ATG GTG ATC T 3'

FGF-10 S 5' CCA CCA ACT CCT CTT CTT CTT CCT 3' A 5' ATA CTG TAC GG CAG TTC TCC TTC 3'

300 nM

175 nM 90%

65 pb

202 pb

60ºC

61º C

(41)

Figura 4. Curvas de amplificação e de dissociação para CYC-A em ovários fetais bovinos aos

60, 75, 90, 120, 150, 210 dias de gestação.

Número de Ciclos Amplificação de CYC-A

De lt a R n (Fluor es cê nc ia )

Número de Ciclos Amplificação de CYC-A

De lt a R n (Fluor es cê nc ia )

Curva de Dissociação – CYC-A

Temperatura (ºC) In ten si d ad e d e F lu o re sc ên ci a

Temperatura (ºC)

(42)

Figura 5. Curvas de amplificação e de dissociação para FGF-10 em ovários fetais bovinos aos 60, 75, 90, 120, 150, 210 dias de gestação.

Número de Ciclos Amplificação de FGF-10

Delta Rn (flu o resc ênci a)

Número de Ciclos Amplificação de FGF-10

Delta Rn (flu o resc ênci a)

Curva de Dissociação – FGF-10

Temperatura (ºC) In ten si d a d e d e F lu o rescên ci a

Curva de Dissociação – FGF-10

Temperatura (ºC) Curva de Dissociação – FGF-10

(43)

A eficiência de amplificação de cada gene analisado foi estimada utilizando-se o programa “LinRegPCR” (RAMAKERS et al., 2003; Figura 6). Para tanto, considerou-se a eficiência média com base na curva de amplificação individual de cada amostra.

Já para a determinação do “threshold” de cada reação foram utilizadas as

médias de no mínimo 4 pontos da curva de amplificação durante a fase exponencial das amostras analisadas. Posteriormente, os valores de ct (ciclo “threshold”) foram exportados para uma planilha e organizados de acordo com as idades gestacionais de cada grupo.

(44)

Os valores de expressão gênica do FGF-10 foram normalizados pela expressão do gene constitutivo, ciclofilina A. A expressão relativa do FGF-10 em ovários nos diferentes dias gestacionais foi quantificada pela seguinte equação (Pfaffl et al., 2001; Figura 7).

Figura 7 - Modelo matemático para cálculo da expressão relativa derivada de dados obtidos por PCR em tempo real. A razão de um gene alvo é expressa em relação ao gene constitutivo e normalizada em relação à amostra controle. Ealvo é a eficiência do transcrito do gene alvo; Eref é

a eficiência do transcrito gene referência; ΔCPalvo é desvio de CP do controle – amostra do gene

alvo transcrito; ΔCPref é desvio de CP do controle – amostra do gene referência transcrito.

4.4. Preparações histológicas e Imunohistoquímica

As lâminas para as análises histológicas e para imunohistoquímica foram confeccionadas utilizando os protocolos do Laboratório de Imunohistoquímica, no Departamento de Patologia (FMVZ, Unesp-Botucatu).

Razão =

(E

_alvo

)

∆CP

_alvo

(controle – amostra)

(E

_ref

)

∆CP

_ref

(controle – amostra)

Razão =

(E

_alvo

)

∆CP

_alvo

(controle – amostra)

(E

_ref

)

(45)

A expressão protéica do FGF-10 foi investigada por imunohistoquímica nos ovários fetais bovinos fixados em paraformaldeído. Para tanto, o tecido fixado foi mergulhado em parafina e cortado em micrótomo. Os cortes obtidos (5μm) foram colocados em lâminas com poli-L-lisina e desparafinizados em xilol e hidratados em

banhos sucessivos de 3 min em etanol 95% e 85%. A recuperação antigênica foi realizada por incubação dos cortes em solução EDTA (pH 8.0) a 96°C em banho-maria por 30 min. A peroxidase endógena foi bloqueada por incubação com metanol (95%) e peróxido de hidrogênio (5%) por 10 min, seguido por lavagens em água destilada e uma

lavagem em solução Tris 0.5 M (pH 7.4). Em seguida, as lâminas foram incubadas em câmara úmida com o anticorpo humano policlonal produzido em coelho anti-FGF-10 (1 μg/ul; cat. H-121, Santa Cruz) durante 2 horas a temperatura ambiente. Após a incubação, as lâminas foram lavadas em Tris (pH 7.4) e depois incubadas com o

anticorpo secundário conjugado a peroxidase (EnVision Dual Link System®; DakoCytomation). A imunomarcação foi detectada com DAB líquido (DakoCytomation). O controle negativo foi produzido através de pré-incubação do anticorpo primário (1.25 μg/mL) com FGF-10 recombinante (2,5 μg/mL; cat.100-27: Peprotech Inc) por duas

horas a temperatura ambiente, antes da incubação nas lâminas.

4.5. População folicular em ovários fetais ao longo da gestação

(46)

campos foi utilizado a fim de quantificar o número de folículos primordiais, primários, secundários e antrais jovens em cada período gestacional analisado. Posteriormente, calculou-se a proporção de cada categoria folicular nos ovários fetais em cada período gestacional.

4.6. Análise estatística

O efeito da idade gestacional sobre a expressão gênica de FGF-10 foi testado

por ANOVA paramétrica. No entanto, ANOVA não paramétrica foi utilizada para testar o efeito da população folicular sobre a expressão gênica de FGF-10, uma vez que esses dados não apresentaram distribuição normal. Posteriormente, as médias da expressão gênica do FGF-10 de cada idade gestacional foram comparadas por contraste ortogonal

(47)

5. RESULTADOS

5.1. Análise Histológica

Análise histológica revelou aos 60 dias de gestação um ovário fetal totalmente povoado por oogônias, sendo marcante a formação e estabelecimento dos cordões ovígeros contendo além de oogônias, células da pré-granulosa. Nas lâminas analisadas não foi encontrado nenhum folículo pré-antral ou antral jovem (Figura 8).

Aos 75 dias de gestação, observou-se aparecimento de folículos primordiais esparsos e circundados por poucas células da granulosa pavimentosas. Além disso, ainda havia o progressivo desaparecimento dos cordões ovígeros (Figura 9).

Aos 90 dias de gestação, notou-se o aparecimento de folículos primários (Figura

10), os quais se tornaram mais numerosos aos 120 dias de gestação (Figura 11).

Aos 150 dias de gestação observou-se o estabelecimento de folículos secundários (Figura 12). Já aos 210 dias de gestação, foram visualizados todos os tipos foliculares pré-antrais (primordial, primário e secundário), bem como folículos antrais

jovens com as camadas das células da granulosa e da teca, além de complexo cumulus

oophorus (Figura 13). Vale ressaltar que excepcionalmente nesse período, a análise

(48)

(49)

(50)

(51)

Figura 11. Análise histológica de ovário fetal bovino aos 120 dias de gestação. Destaca-se a

(52)

Figura 12. Análise histológica de ovário fetal bovino aos 150 dias de gestação. Destaca-se o

aparecimento de folículos secundários, com a presença das células da teca (CT), granulosa

(CG) e oócito (*).

CT

CG

*

CT

CG

(53)

folículo antral jovem bem caracterizado pelas células da teca (CT), células da granulosa (CG) e

oócito (asterisco).

*

CG

CT

*

CG

(54)

Figura 14. Análise histológica do feto aos 210 dias mostrando a presença de tecido luteal (TL).

Estroma (E).

B

TL

E

A

TL

E

(55)

5.2. Proporção folicular em ovários fetais ao longo da gestação

A proporção de folículos primários foi maior quando comparada com os demais

tipos foliculares presentes nos ovários fetais a partir dos 120 dias de gestação (Tabela 3, Figura 15).

Tabela 3. Número de folículos contados em 36 campos fotomicrografados de 3 ovários (12

campos por ovário) fetais para cada idade gestacional avaliada. Porcentagens das diferentes

categorias foliculares em relação ao número total de folículos para cada idade gestacional

mostradas entre parênteses (A,B _{valores diferentes entre linhas;}a,b _{valores diferentes entre}

colunas; P< 0,05).

414 38 (8%) Bc

66 (12%) Bc

134 (48%) Bb

176 (32%) Ca

210

464 0 (0%) Ac

76 (16%) Ba

252 (54%) Cb

136 (30%) Ca

150

490 0 (0%) Ac

0 (0%) Ac

346 (71%)Cb

144 (29%)Ca

120

508 0 (0%) Ac

0 (0%) Ac

140 (27%) Bb

368 (73%) Ba

90

478 0 (0%) Ab

0 (0%) Ab

478 (100%) Aa

75 Idade Gestacional Nº Total Antrais Jovens Secundários Primários Primordiais 414 38 (8%) Bc

66 (12%) Bc

134 (48%) Bb

176 (32%) Ca

210

464 0 (0%) Ac

76 (16%) Ba

252 (54%) Cb

136 (30%) Ca

150

490 0 (0%) Ac

0 (0%) Ac

346 (71%)Cb

144 (29%)Ca

120

508 0 (0%) Ac

0 (0%) Ac

140 (27%) Bb

368 (73%) Ba

90

478 0 (0%) Ab

0 (0%) Ab

478 (100%) Aa

(56)

Figura 15. Número de folículos contados em 36 campos fotomicrografados de 3 ovários (12

campos por ovário) fetais para cada idade gestacional avaliada (A,B _{valores diferentes para uma}

mesma categoria entre as idades; a,b _{valores diferentes entre as categorias na mesma idade; P<}

0,05).

5.3.Expressão gênica de FGF-10

A expressão do RNAm do FGF-10 esteve presente nos ovários bovinos de todas as idades gestacionais analisadas e mostrou-se maior aos 210 dias de gestação quando comparado aos 60, 75 e 90 dias (Figura 16).

1 2 3 4 5

75 90 120 150 210

Idades Gestacionais 0- 100- 200- 300- 500-N ú mero d e F o lícu lo s Primordial Primário Secundário Antral Jovem Aa

Ab Ab Ab Ba Bb Ac Ac Ca Cb Ac Ac Ca Cb Ba Ac Ca Bb Bc Bc 400- 100% 73% 27% 29% 71% 30% 54% 16% 32% 48% 12% 8%

1 2 3 4 5

75 90 120 150 210

Idades Gestacionais 0- 100- 200- 300- 500-N ú mero d e F o lícu lo s Primordial Primário Secundário Antral Jovem Aa

(57)

Figura 16. Expressão gênica de FGF-10 quantificada por PCR em tempo real em ovários fetais

bovinos ao longo do período gestacional.

5.4.Imunohistoquímica

Embora sem sinais aparentes na diferença de marcação nos folículos ovarianos ao longo da gestação, a proteína do FGF-10 foi detectada por imunohistoquímica em oogônias (Figura 19), oócitos de todos os tipos foliculares ao longo da gestação, células da granulosa de todos os tipos foliculares; células da teca de secundários e antrais

jovens (Figuras 17 e 20) e também no tecido de aparência luteal encontrado em um dos fetos analisados (Figura 21).Além disso, destaca-se a localização protéica do FGF-10 em vasos sanguíneos no ovário fetal (Figura 22).

F G F -1 0 / C Y C-A

60 75 90 120 150 210

Idades Gestacionais (dias)

0 3 6 9 12 15 18 21 a b a a ab _ab F G F -1 0 / C Y C-A

60 75 90 120 150 210

Idades Gestacionais (dias)

(58)

Figura 17. Imunolocalização do FGF-10 em folículos pré-antrais de ovário fetal aos 210 dias de

(59)

Figura 18. Controle negativo (pré-incubação de proteína recombinante FGF-10 com anticorpo

(60)

Figura 19. Imunolocalização do FGF-10 nas oogônias (seta) em ovários fetais bovinos aos 60

(61)

Figura 20. Imunolocalização do FGF-10 nas células da granulosa (CG), células da teca (CT) e

oócito (asterisco) de folículo antral jovem bovino.

*

_CG

CT

*

_CG

(62)

Figura 21. Imunolocalização (A) e controle negativo (B) do FGF-10 em tecido luteal de feto

bovino aos 210 dias.

B

(63)

Figura 22. Imunolocalização (A) e controle negativo (B) do FGF-10 em vasos sanguíneos.

A

(64)

6. DISCUSSÃO

Os resultados presentes demonstram pela primeira vez a expressão do FGF-10 ao longo do desenvolvimento pré-antral em ovários fetais bovinos. A expressão gênica

do FGF-10 mostrou-se associada à dinâmica folicular fetal e acompanhada pela presença da respectiva proteína em oócitos, células da granulosa e da teca. Portanto, os dados presentes indicam a participação do FGF-10 na regulação da foliculogênese durante o desenvolvimento ovariano em fetos bovinos.

Ainda que o presente trabalho tenha sido desenvolvido predominantemente com

Bos indicus, os dados sobre o surgimento das categorias foliculares dos 75 até os 210

dias de gestação são, de maneira geral, concordantes com os dados obtidos em Bos

taurus por TANAKA et al. (2001). A divergência entre os dados presentes e os relatados

por TANAKA et al. (2001) se refere ao aparecimento de folículos secundários e antrais jovens. Enquanto essas categorias foram detectadas somente aos 150 e 210 dias, respectivamente, no presente estudo, TANAKA et al. (2001) as observaram aos 120 e 150, respectivamente. Esta discrepância pode ser decorrente de diferenças entre as

raças utilizadas nos experimentos, bem como do menor número de ovários fetais e idades gestacionais analisados no presente estudo. No entanto, os dados presentes e os relatados por TANAKA et al. (2001) divergem drasticamente em relação aos de RUSSE (1983), que descreve aparecimento tardio de todas as categorias foliculares.

Esta diferença pode ser decorrente dos diferentes e mais extensos intervalos gestacionais avaliados por RUSSE (1983).

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utilizando-se como referência estudo prévio em ovinos (SAWYER et al., 2002). No entanto, mesmo tratando-se de espécies diferentes, a histologia mostrou-se bastante similar, destacando-se a formação e estabelecimento dos cordões ovígeros, os quais além de possuírem oogônias, também eram compostos por células da pré-granulosa.

Interessantemente, em um único ovário fetal obtido aos 210 dias de gestação, observou-se tecido de característica bastante eosinofílica e extremamente vascularizado, histologicamente semelhante a um corpo lúteo de ovário adulto. No entanto, até o presente momento a ocorrência desse tipo tecidual não foi relatada em

ovários fetais. Além da presença de células com características histológicas muito semelhantes às de células luteínicas grandes e pequenas, a imunolocalização do FGF-10 nesse tecido reforça a hipótese de que de fato seja uma estrutura luteal, uma vez que CASTILHO et al. (2008) demonstraram através de imunohistoquímica e RT-PCR, a

expressão do FGF-10 em todos os estágios de desenvolvimento luteal em ovários bovinos adultos.

A expressão gênica do FGF-10 foi detectada em todas as idades gestacionais e foi maior aos 210 dias em comparação aos 60, 75 e 90 dias. Por outro lado,

observou-se aumento numérico gradativo da expressão gênica do FGF-10 entre os 60 e 120 dias. O padrão de expressão do FGF-10 parece estar associado à dinâmica folicular dos ovários fetais. O aumento numérico gradativo até os 120 dias mostrou-se temporalmente associado ao aparecimento dos folículos primordiais aos 75 dias e,

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Os valores significativamente superiores da expressão gênica do FGF-10 aos 210 dias coincidem com o aparecimento de folículos antrais jovens. Dados obtidos a partir de ovários bovinos adultos indicam as células da teca e os oócitos como os sítios de expressão do FGF-10 nos folículos antrais (BURATINI et al., 2007). Entre 150 e 210

dias houve queda no número de folículos primários e manutenção do número de secundários, o que sugere que a expressão aumentada aos 210 dias se deve de fato ao aparecimento de folículos antrais jovens com camada da teca mais desenvolvida, que sabidamente expressa o FGF-10 (BURATINI et al., 2007).

A análise imunohistoquímica revelou a presença do FGF-10 em oócitos e células da granulosa de todos os tipos foliculares, bem como em células da teca de folículos secundários e antrais jovens. A imunomarcação mostrou-se aparentemente homogênea em oócitos, células da granulosa e células da teca ao longo da gestação. Observou-se

fraca imunomarcação do FGF-10 no estroma ovariano ao longo da gestação, o que indica que o RNAm mensurado é majoritariamente proveniente de células foliculares e germinativas.

A imunolocalização do FGF-10 nas células da granulosa de todos os tipos

foliculares ao longo da gestação parece ser incongruente com a ausência de expressão gênica do FGF-10 em células da granulosa de folículos antrais bovinos, conforme relatado por BURATINI et al. (2007). No entanto, nesse mesmo estudo, o mesmo padrão de expressão protéica foi relatado em folículos antrais presentes em ovários

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FGF-10/FGFR-2b internalizado pelo anticorpo. Essa hipótese é suportada pela internalização de FGF-1 e FGF-2 mediada por receptores em diversos tipos celulares (OLSNES et al., 2003; WESCHE et al., 2006). Contudo, não podemos descartar a possível expressão do RNAm do FGF-10 em células da granulosa de folículos

pré-antrais.

O aumento de RNAm do FGF-10 simultâneo ao aparecimento dos folículos antrais jovens sugere o envolvimento desse FGF, particularmente, em estágios mais avançados do desenvolvimento folicular, podendo atuar como indutor de diferenciação

celular e regulador da produção estrogênica nas células da granulosa. Essa função é compatível com relatos anteriores em que o FGF-10 mostrou-se capaz de diminuir a produção de estradiol em células da granulosa de folículos antrais cultivadas (BURATINI et al., 2007).

A participação do FGF-10 no desenvolvimento de folículos ovarianos ao longo da gestação poderia estar associada a diversos processos celulares. A associação temporal entre a intensificação da expressão do FGF-10 e o aparecimento de folículos primordiais e primários, bem como aumento no número desses últimos entre os 75 e

120 dias de gestação, condiz com a participação desse fator de crescimento como modulador da ativação de folículos primordiais e formação de folículos primários, conforme descrito para o FGF-7 (McGee et al., 1999). O FGF-7 é estruturalmente bastante semelhante ao FGF-10 (IGARASHI et al., 1998), ativa o mesmo receptor

(FGFR-2b; IGARASHI et al., 1998) e estimulou a ativação de folículos primordiais bovinos in vitro (McGee et al., 1999). Há evidências de atuação conjunta do FGF-7 e do