Sequenciamento total do exoma como ferramenta de diagnóstico de acidose tubular renal distal.

(1)

www.jped.com.br

ARTIGO

ORIGINAL

Whole-exome

sequencing

as

a

diagnostic

tool

for

distal

renal

tubular

acidosis

夽

Paula

Cristina

Barros

Pereira

a

_,

_Flávia

_Medeiros

_Melo

a

_,

Luiz

Armando

Cunha

De

Marco

a,b

,

Eduardo

Araújo

Oliveira

a,c

,

Débora

Marques

Miranda

a,c

e

Ana

Cristina

Simões

e

Silva

a,c,∗

a_Instituto_Nacional_de_Ciência_e_Tecnologia_---_Medicina_Molecular_(INCT-MM),_Universidade_Federal_de_Minas_Gerais_(UFMG), BeloHorizonte,MG,Brasil

b_Departamento_de_Cirurgia,_Faculdade_de_Medicina,_Universidade_Federal_de_Minas_Gerais_(UFMG),_Belo_Horizonte,_MG,_Brasil c_Departamento_de_Pediatria,_Unidade_de_Nefrologia_Pediátrica,_Laboratório_{Interdisciplinar}_de_{Investigac¸ão}_Médica,

FaculdadedeMedicina,UniversidadeFederaldeMinasGerais(UFMG),BeloHorizonte,MG,Brasil

Recebidoem11denovembrode2014;aceitoem25defevereirode2015

KEYWORDS

ATP6V0A4; ATP6V1B1; Children;

Distalrenaltubular acidosis;

Genetics; Whole-exome sequencing

Abstract

Objective: Distalrenaltubularacidosis (dRTA)ischaracterized bymetabolicacidosis dueto impairedrenalacidexcretion.Theaimofthisstudywastodemonstratethegeneticdiagnosis offourchildrenwithdRTAthroughuseofwhole-exomesequencing.

Methods: Twounrelatedfamilieswereselected;atotaloffourchildrenwithdRTAandtheir parents,inordertoperformwhole-exomesequencing.Hearingwaspreservedinbothchildren fromthefirstfamily,butnotinthesecond,whereinatwinpairhadseveredeafness. Whole--exome sequencingwasperformedintwo pooledsamples andfindings wereconfirmedwith Sangersequencingmethod.

Results: Two mutations were identifiedin the ATP6V0A4 and ATP6V1B1 genes. In the first family,anovelmutationintheexon13oftheATP6V0A4genewithasinglenucleotidechange GAC→TAC (c.1232G>T)was found,which causedasubstitutionofaspartic acidtotyrosine inposition 411.In thesecond family,ahomozygousrecurrent mutationwithone base-pair insertion(c.11491155insC)inexon12oftheATP6V1B1genewasdetected.

Conclusion: Theseresultsconfirmthevalueofwhole-exomesequencingforthestudyofrare andcomplexgeneticnephropathies,allowingtheidentificationofnovelandrecurrent mutati-ons.Furthermore,forthefirsttimetheapplicationofthismolecularmethodinrenaltubular diseaseshasbeenclearlydemonstrated.

DOIserefereaoartigo:

http://dx.doi.org/10.1016/j.jped.2015.02.002

夽 _Como_citar_este_artigo:_Pereira_PC,_Melo_FM,_De_Marco_LA,_Oliveira_EA,_Miranda_DM,_Simões_e_Silva_AC._Whole-exome_sequencing_as_a diagnostictoolfordistalrenaltubularacidosis.JPediatr(RioJ).2015;91:583---89.

∗_Autor_para_{correspondência.}

E-mail:acssilva@hotmail.com(A.C.SimõeseSilva).

(2)

PALAVRAS-CHAVE

ATP6V0A4; ATP6V1B1; Crianc¸as;

Acidosetubularrenal distal;

Genética;

Sequenciamentototal doexoma

Sequenciamentototaldoexomacomoferramentadediagnósticodeacidosetubular renaldistal

Resumo

Objetivo: Aacidosetubularrenaldistal(ATRd)écaracterizadaporacidosemetabólicadevido àexcrec¸ãorenal de ácido prejudicada.O objetivo desteartigo é apresentar o diagnóstico genéticodequatrocrianc¸ascomATRdcomusodosequenciamentototaldoexoma.

Métodos: Selecionamosduasfamíliasnãorelacionadas,quatrocriançascomATRdeseuspais, parafazerosequenciamentototaldoexoma.Aaudiçãofoipreservadaemambasascriançasda famíliaum,porémemnenhumacriançadafamíliadois,naqualumpardegêmeasteveperda auditivasevera.Fizemososequenciamentototaldoexomaemdoisconjuntosdeamostrase confirmamososachadoscomométododesequenciamentodeSanger.

Resultados: Duasmutaçõesforamidentificadasnosgenes ATP6V0A4eATP6V1B1.Nafamília um,detectamosumanovamutaçãonoéxon13dogeneATP6V0A4comumaalteraçãoemum nucleotídeo únicoGAC→ TAC (c.1232G>T)que causousubstituiçãode ácido aspártico por tirosinanaposição411.Nafamíliadois,detectamosumamutaçãorecorrentedohomozigoto cominserçãodeumpardebases(c.11491155insC)noéxon12dogeneATP6V1B1.

Conclusão: Nossosresultados confirmamo valor dosequenciamento total doexoma para o estudodenefropatiasgenéticascomplexasepermitemaidentificaçãodemutaçõesnovase recorrentes.Adicionalmente,demonstramosclaramentepela primeiravezaaplicaçãodesse métodomolecularemdoençastubularesrenais.

Introduc

¸ão

Aacidose tubularrenal distal (ATRd)é uma doenc¸arenal raraecomplexadevidoaumdefeitonaexcrec¸ãodacarga de ácidos(H+ _e _íons _de _amônia) _em _células _alfa

interca-ladasdo ducto coletor. O acúmuloda cargade ácidos no néfrondistal resultanoconsumo e nareduçãodotampão debicarbonato/CO2nosangue.1 Asprincipais característi-casclínicasdaATRdsãovômito,diarreiae/ouconstipação, perdadeapetite,polidipsiaepoliúria.Aacidosecrônicaeas alteraçõessecundáriascomovômito,poliúriaedesidratação afetamocrescimentoelevamaumdéficitdecrescimento. Estudos de ultrassom podem mostrar nefrocalcinosee/ou nefrolitíase.2 _Em_geral,_a_ATRd_apresenta_bom_prognóstico casodiagnosticadaprecocementeeotratamentoalcalinoé contínuo.Casonãotratada,aATRdcausaretardodo cresci-mentoeraquitismoemcriançaseosteomalaciaemadultos. Pode ocorrer deterioração da função renal ao longo dos anos.3

A ATR distal pode ser transmitida como uma caracte-rística autossômica dominante ou recessiva.4 _O _fenótipo autossômico dominante normalmente aparece moderada-mente na adolescência ou na vida adulta;4 _um _dos _pais padece e é o portador da doença ou a doença se dá por meio de uma mutação de novo. Foram identificadas mutações nogeneSLC4A1em famílias comATRd autossô-micadominante.2,5,6 _Os_sintomas_no_fenótipo_autossômico recessivoaparecempredominantementenainfânciaouna primeirainfância,quandooretardodocrescimentoémuito comum.Essavariávelpodeocorrercomousemsurdezeos paisnãosãoafetados.2 _A_ATRd_autossômica_recessiva_está associada a mutações em quaisquer dos seguintes genes:

SLC4A1,7_ATP6V0A4_e_ATP6V1B1_.2,8_Indivíduos_sem deficiên-ciasauditivasnormalmentesãoportadoresdemutac¸õesno

geneATP6V0A4,aopassoqueaquelescomsurdez

apresen-tammutaçõesnogeneATP6V1B1.Emaproximadamente20% dospacientescomATRd,nenhumamutaçãofoiencontrada em quaisquer desses genes relacionados.3 _De _fato, exis-tempacientescomATRdcomsurdezsemmutaçõesnogene

ATP6V1B1eoutroscomaudic¸ãonormalquenãoapresentam

mutaçõesnogeneATP6V0A4.3_Esses_achados _sugerem_que outros transportadores oucanais podemcausar ATRd.Em termosdecomplexidade,sabe-sequealgunspacientescom mutaçõesnogeneATP6V0A4desenvolvemsurdezapenasna segundadécadadevida.Portanto,hámuitosfatoresaserem elucidadosemtermosdecorrelaçõesfenótipo-genótipo.8---10 Atéagora,jásãoconhecidasmaisde20mutaçõesnogene

ATP6V0A4.

O sequenciamento total do exoma fornece cober-tura de mais de 95% dos éxons, que contêm 85% das mutações causadoras de doenças em doenças mendelia-nas e muitos polimorfismosde nucleotídeo simples(SNPs) compredisposiçãoparadoençasem todoogenoma.11,12 _O sequenciamento total doexoma é interessante para ava-liar a patogênese da doença e reconhecer novos genes ou mutações patogênicos relacionados a doenças, princi-palmenteàsdoençasmendelianas.11,12 _Nesse_sentido,_este estudo pretendeu avaliar a utilidade do sequenciamento totaldoexomaparaodiagnósticogenéticodeATRd.

Pacientes

e

métodos

Avaliac¸ãoindividualeclínica

(3)

Nefrologia Pediátrica da Universidade Federal de Minas Gerais(UFMG),Brasil.Aprimeirafamília(famíliaum) con-sistiaemdoisirmãosafetados,umameninaeummenino, com ATRd, porém sem surdez, com pais não afetados. A segunda família (família dois) apresentava um par de gêmeasmonozigóticas(duasmeninas),diagnosticadascom ATRd e surdez nervosa, com mãe saudável; o pai é des-conhecido. Todos os pacientes foram submetidos a um protocolosistemático,incluindoavaliaçãoclínicae nutricio-nal,mediçõeslaboratoriais,ultrassonografiarenaleanálise genética.Oconsentimentoinformado,aprovadopelo con-selhodeéticainstitucionaldaUFMG,foiobtidodetodosos participantes;nocasodascrianças, tambémfoiobtidode seuspaise/ouresponsáveislegais.

Extrac¸ãodoDNA

ODNAgenômicofoiextraídode5mLdesangueperiférico depacientescomATRdedeseuspais,comousodominikit QiampBloodDNA (Qiagen®_, _Milão,_Itália), _de_acordo _com

as instruc¸ões do fabricante. Todas as amostras tiveramo controledequalidadeverificadocomrelac¸ãoàpurezacomo usodeumespectrofotômetroNanodrop(ThermoScientific®_,

Waltham,EUA).AsamostrasdeDNAforamarmazenadasa −20◦Catéouso.

Sequenciamentototaldoexoma

Osequenciamentodoexomafoifeitoemdoisconjuntosde amostrasparaaprimorarosresultados.As amostrasforam divididasemconjuntosnoquedizrespeitoàscaracterísticas clínicasdospacientes.OprimeiroconjuntoapresentavaDNA dosdoisirmãoscomATRdsemsurdezeosegundo,dasirmãs gêmeascomATRdrelacionadaàsurdez.Acaptac¸ãodoarray foi usada para isolar os respectivos genes humanos (Seq-CapEZHumanExomeLibraryv2.0,Roche®_,_Basileia,_Suíc_¸a)

e esses genes foram sequenciadosna plataformaIllumina HiSeq2000(Sigma-AldrichCorporation®_,_Missouri,_EUA).

Dadosdefiltragem

Asprincipaisetapasaseguirforamfeitasparapriorizaras variáveisdealta qualidade:(i)variáveisemregiões inter-genéticas, intrônicas e não traduzidas (UTR) e mutações sinônimasforamexcluídasdaanálise ajusante;(ii) variá-veis com índice de qualidade menor do que 20 foram excluídas; (iii) somente o índice de conservação (phy-loP) da comparação de humanos e 43 vertebrados acima de 3 foi considerado; (iv) após essa seleção inicial, os genes restantes foram filtrados pela função. O software Polyphen2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/) pre-viu possíveis impactos de variáveis. O conjunto final de variáveis selecionadas passou por inspeção visual com o uso do Integrative Genomics Viewer.13 _Variáveis polimór-ficas anteriormente descritas em dados públicos foram investigadas e comparadas com as variações encontra-das no exoma atual. As mutações selecionadas para investigação em cada grupo deste estudo não foram encontradas em sequenciamentos de exomas anteriores (http://evs.gs.washington.edu/EVS/).

Validac¸ãodedados

O sequenciamento de Sanger da reac¸ão em cadeia da polimerase (PCR) foi usado na análise para confirmar os dados.Todosospacientese seuspaisforamsubmetidosa PCR.Produtosdeamplificac¸ãodetamanhoadequadoforam identificadoscomousodeeletroforeseemgelde poliacri-lamida.Osprodutos forampurificadoscomo kitQIAquick PCR (Qiagen®_, _Milão, _Itália) _e _então _submetidos _a _uma

reac¸ão de sequenciamento com o uso tanto de

iniciado-resforward quanto reversecom o ABI BigDye Terminator

CycleSequencing Kit v3.1em umanalisadorgenético ABI PRISM3730XL(AppliedBiosystems®_,_Foster_City,_EUA)._Cada

leiturafoialinhadaao sequenciamentode referênciae as mutac¸ões foramidentificadascomo softwareSequencher

(http://www.genecodes.com). Todos os iniciadores foram

projetadoscomaferramentaon-linePrimer3.Osiniciadores

doéxon12dogeneATP6V1B1 foram:

5’TTGACCCCTCGGA-ATGTAGG3’ e 5’CCGGACCCTCTTCTCCTTAC3’ (tamanho do produto: 238 pares de bases). Os iniciadores do éxon 13 do gene ATP6V1B1 foram: 5’ATGCAAATCGTGGAGCTGTG3’ e 5’ATGAATCAGGGCAAGACGGT3’ (tamanho do produto: 264paresdebases).

Estudosestruturaisdasmutac¸ões

Osalinhamentos deproteínas e sequências deDNA foram feitos com os softwares ClustalW e MultAlin (http://

multalin.toulouse.inra.fr/multalin/), respectivamente. A

previsãodasubstituic¸ãodeaminoácidosnafunc¸ãobiológica da proteína foi avaliada com o uso tanto do soft-warePolyPhen-2quanto doProvean (http://provean.jcvi.

orgehttp://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/,

respectiva-mente).

Resultados

ATRdsemsurdez

Essa família consistia em dois irmãos, uma menina de 13 anos e seu irmão de sete, com uma ATRd bem defi-nida.Ameninafoiaprobanda,diagnosticadacomATRdaos quatromeses.Osachadosiniciais foramdéficit de cresci-mento,acidosemetabólicahiperclorêmicacompHdaurina excepcionalmentealto(7,0),pH dosanguevenosonormal (7,36),taxadefiltraçãoglomerularnormalenefrocalcinose. O menino foi diagnosticado no primeiro mês de vida, após uma desidratação grave com acidose metabólica, hipocalemia, elevação transitória da creatinina sérica e hipocalcemia.Sua primeiraultrassonografiarenalmostrou nefrocalcinosebilateral.Atabela1resumeasmanifestações clínicasebioquímicasbásicasquelevaramaodiagnósticode ATRdemcadapaciente.Ospaisnãoforamafetadose tive-ramumfilhomaisvelhoquefaleceuaosquatromesescom sintomassemelhantes.

(4)

Tabela1 AchadosclínicosebioquímicosiniciaisdepacientescomATRd

Achados/Pacientes II2---Família1 II3---Família1 II1---Família2 II2---Família2

Idade 4meses 1mês 2anos 2anos

Sexo Feminino Masculino Feminino Feminino

Surdez/SNHL Ausência Ausência Presenc¸a Presenc¸a

Pesoaonascer(g) Nãodisponível 3,450 2,340 2,300

Peso(g) 3,960 3,760 8,250 8,300

ZPI <−3 0 <−3 <−3

Altura(cm) 54,5 50,0 73,5 74,0

HAZ <−3 −2 <−3 <−3

Nefrocalcinose Presenc¸a Presenc¸a Ausência Ausência

Manifestac¸õesiniciais Déficitde crescimento, desidratac¸ão

Vômitoe desidratac¸ão

Raquitismo,déficitde crescimento,retardo docrescimento

Raquitismo,déficit decrescimento, retardodo crescimento

Creatininasérica(mg/dL) 0,4 1,7 0,5 0,5

pHdosanguevenoso 7,36 7,16 7,23 7,12

Bicarbonatosérico(mmol/L) 19,0 8,0 15,9 13,7

Potássiosérico(mEq/L) 3,8 2,0 4,0 4,1

Cloretosérico(mmol/L) 109 118 117 123

pHdaurina 7,5 7,1 7,0 7,0

Osnúmerosromanosindicamaposic¸ãodafamílianalinhagem:II2,família1significaasegundaprobanda(filha)dafamíliaum;II3,

família1significaoterceiroprobando(filho)dafamíliaum;II1,família2---aprimeirafilhagêmeadafamíliadois;II2,família2---a

segundafilhagêmea;SNHL,perdaauditivaneurossensorial;ZPI,escoreszdepesoporidade;HAZ,escoreszdealturaporidade.

Após filtrar os dados do exoma, selecionamos o gene

ATP6V0A4paraestudo.Observamosumaalterac¸ãoem um

nucleotídeoúnicoGAC→TAC(c.1232G>T)noéxon13que causousubstituiçãodeumaminoácido:ácidoaspárticopor tirosina na posição 411 (p.D411Y). Essa alteração no ami-noácido foi preditiva de ser danosa pelo Provean e pelo PolyPhen-2.Essamutaçãoocorreemumaminoácido evoluti-vamenteconservadoeafetaresíduosaltamentepreservados (dadosnãoapresentados).

Ospacientes e seuspais foramsubmetidos ao sequen-ciamento de Sanger ao usar o iniciador projetado para o

éxon13dogeneATP6V0A4.Osdoisirmãosapresentarama

mesmamutaçãoemhomozigose(c.1232G>T),aopassoque ambosospaisapresentaramumtraçoheterozigótico(fig.1A e B). Essa é umanova mutação autossômica recessivade ATRd.

ATRdcomsurdez

EssafamíliaconsistiaemumpardegêmeascomATRd asso-ciadaasurdeznervosa.Asmeninasforamdiagnosticadasaos doisanosapósumlongoperíododetratamentopara raqui-tismo e retardo do crescimento somente com assistência nutricional.Característicasclínicasebioquímicasnoinício sãoapresentadasnatabela1.

Osequenciamentototaldoexomaconduzidonafamília doisgerou4375SNVse2416INDELs.Apósfiltrarasvariáveis, obtivemossomenteumgenecandidatorestante(tabela2). Selecionamos, com base nos dados do exoma, o gene ATP6V1B1comocandidatonessegrupo.Umainserc¸ãodeum pardebaseshomozigótico(c.11491155insC)noexoma12 foidetectada(fig.2A).AsduasgêmeascomATRd apresenta-ramainserc¸ãodescrita.FizemosaPCRdamãenãoafetada

Tabela2 Priorizac¸ãodavariávelparaafamíliaumefamíliadois

Família1 Família2

Parâmetros Númerodevariáveis Númerodevariáveis

Totaldevariáveis 3.993 6.791

Regiõesintergênicas,intrônicaseUTRemutac¸õessinônimasforam excluídas

1.445 1.912

Variáveiscomíndicedequalidade<20foramexcluídas 879 1.012

PhyloP<3foramexcluídas 131 215

Selec¸ãoporfunc¸ão 15 14

PhyloP<0,7foramexcluídas 10 6

Selec¸ãocomousodabasededadosdegenescomreferênciacruzadaeo aplicativoIGV

1 1

Genecandidate 1 1

(5)

A

l:1

ll:1 ll:2 ll:3

l:2 _WT

T

G

G T

T

∗

G

A

C

I.1

I.2

II.2

II.3

B

Figura1 Identificação,linhagemdafamíliaumeresultadosdesequenciamentoparamutaçãoc.1232G>T.A)Alinhagemmostra osestadosafetados,identificadoresindividuaisegenótiposnocódon411.Asetaindicaoprobando.B)Cromatogramasdo sequen-ciamentodoDNAemqueosdoisirmãosafetadostêmsubstituiçãodohomozigotoGporTemc.1232.Essasubstituiçãoocorreem heterozigoseemambosospais.WT,aleloselvagem.*Sequêncianucleotídicamutada.

A

l:1 Allele1wt Allele2Ins Consensus

1.14 1.15 1.164 1.174

lI:1

lI:2 l:2

WT

T A AT A

C C C C C C CC C

I.2

II.1

II.2

B

C

Figura2 Identificação,linhagemdafamíliadoiseresultadosdesequenciamentoparamutaçãoc.11491155insC.A)Identificação damutaçãoc.11491155insCcomosoftwareMultAlin. B)A linhagemmostra osestadosafetados,identificadores individuaise genótiposemc.1149-1155insC.Asetaindicaosprobandoseoindivíduocom‘‘?’’temsituaçãodogenótipoincerta.C)Cromatogramas desequenciamentodeDNAdiretodemembrosdafamíliaemqueosdoisirmãosafetadostêminserçãohomozigóticadeumCea mãetemumtraçoheterozigótico,conformemarcadopelacaixavermelha.WT,aleloselvagem.

(paidesconhecido).Osdoisirmãosapresentaramamesma mutac¸ãohomozigótica,aopassoqueamãeapresentouessa inserc¸ãonaheterozigose(fig.2BeC).

Discussão

Vários erros de DNA estão localizados em éxons e levam a alterações estruturais nasproteínas e alterações funcionais.3_Dessa_forma,_o_{sequenciamento}_total_do_exoma analisa esses éxons de uma maneira rápida e com bom custo-benefício e permiteavaliação genéticadas doenças

(6)

ainda é desafiadora, pois essas técnicas ainda são muito caraseainterpretaçãodedadosétrabalhosaedifícil.11,12 Estudos recentessugerem queo sequenciamento total do exoma seria útil para avaliar a patogênese da doença e reconhecernovosgenes oumutaçõespatogênicos relacio-nadosadoenças,principalmenteàsdoençasmendelianas.16 Assim,nopresenteestudo,usamososequenciamentototal doexomaseguidopelosequenciamentodeSangercomouma estratégiaparao diagnósticogenéticodeATRdem quatro crianças.

Nossos resultadosmostraram, pelaprimeira vez,a uti-lidade do sequenciamento total do exoma em doenças tubulares renais e permitiram a identificação de uma mutação recorrente e uma nova mutação patogênica na ATRd.As formasherdadas deATRdapresentamtrês variá-veis:autossômicadominanteeautossômicarecessiva,com ousemsurdez.4_A_doenc_¸a_dominante_normalmente_se apre-sentamaissuavementenaadolescênciaounavidaadultae temsidorelacionadaapenasamutaçõesnotrocador bicar-bonato/cloreto(AE1).Por outro lado,avariávelrecessiva ocorrenainfânciaounaprimeirainfância,quandooretardo docrescimentoémuito comum,4 _conforme_observado _em nossoscasos.AATRdautossômicarecessivatemsido rela-cionadaa mutaçõesnosgenes ATP6V1B1e ATP6V0A4,que codificamassubunidades a4e B1da ATPasede próton do tipovacuolar(V-ouH+-ATPase),respectivamente.17-22_Além disso,mutaçõesnogeneSLC4A1,responsávelpela expres-sãodeproteínasAE1,tambémforamdetectadasemcasos deATRdautossômicarecessivasemsurdez.23-28

Defato,mutac¸õesemdiferentessubunidadesdabomba deprótonexpressasemtecidosrenaisedeouvidospodem causardefeitostubularesrelacionadosàsurdez.17_A_ATPase deprótondotipovacuolar(V-ouH+-ATPase)éumabomba de várias subunidades essencial para a acidificac¸ão nor-mal. Dois domínios estruturais formam essa bomba: V0 ligado à membrana e V1 citoplasmático ou periférico. Cada domínio incluía múltiplas subunidades (a---e e A---H, respectivamente), responsáveis pela hidrólise do ATP e transportedeprótons,respectivamente.4_O_gene_ATP6V1B1 codifica a subunidade B1, ao mesmo tempo em que o

geneATP6V0A4codificaasubunidadea4.OprótonATPase

vacuolaréexpressoapicalmenteemcélulasrenais␣ inter-caladas,nacócleaenosacoendolinfático.Combasenotipo deperdaauditiva,otipodemutaçõespodesersuspeito.A perdaauditivacondutivafoiobservadaemmutaçõesda iso-formaintracelulardeanidrasecarbônica(AC),considerando queaperdaauditivaneurossensorial(SNHL)foiassociadaa mutaçõesnosgenesATP6V1B1eATP6V0A4.18-20_Dessa_forma, encontramosumainserçãodeumpardebaseshomozigótico (c.1149 1155insC)noéxon12dogeneATP6V1B1emgêmeas comSNHL.MutaçõesnogeneSLC4A1normalmentenão apre-sentamassociaçãocomsurdez.22-28 _Portanto,_a_presenc_¸a_e otipodesurdezauxiliamnadistinçãodediferentesformas deATRd.

Nasduas famílias desteestudo, ospaisnãoforam afe-tados,aATRdteveinícioprecoceelevou aoimpedimento docrescimentodurante ainfância.Portanto,asmutac¸ões

nogene SLC4A1(proteínasAE1) foramaltamente

diferen-tesemnossospacientes.Nafamíliaum,osequenciamento doexomaidentificou umanova mutac¸ão homozigótica no

geneATP6V0A4.Combaseem relatóriosanteriores10 _e_em

nossascaracterísticasclínicasebioquímicas,essegenefoi

selecionadocomopossívelcandidatoparabuscarmutações, pois nenhuma perda auditivafoi detectada nos pacientes afetados.Observamosumaúnicaalteraçãonucleotídicano éxon13quecausou substituiçãodeumaminoácido:ácido aspárticoportirosinanaposição411.Essaalteraçãono ami-noácido foi preditiva de ser danosa pelo Provean e pelo PolyPhen-2. Infelizmente, não fizemos estudos funcionais paradecifrarafunçãoprecisadessamutação.Entretanto, deve-semencionarqueessamutaçãoocorreemum aminoá-cidoconservadoevolutivamenteeafetaresíduosaltamente preservados.Alémdisso, asubstituiçãodeácidoaspártico portirosinapodealteraraspropriedadesquímicasda pro-teínaemregiõescríticas.Porexemplo,essaalteraçãopode modificaropontoisoelétricodaproteína,considerandoque a tirosina é um aminoácidoneutro, ao passo queo ácido aspárticoéumácido.

Asgêmeasdafamíliadoisapresentaramperdaauditiva neurossensorial e sintomasde início precocede ATRd.Os fenótipos juntamente com os dados do exoma total nos levaramainvestigarogeneATP6V1B1.Dessaforma, cons-tatamosumamutac¸ãopreviamentedescrita,9_que_também foiconfirmadapelosequenciamentodeSanger.Entretanto, deve-se destacarque asmutac¸õesdosgenes ATP6V1B1ou

ATP6V0A4nãoforamencontradasemalgumasfamíliascom

formasrecessivasprimáriasdeATRd.Háváriosoutrosgenes candidatosparaaATRdrecessiva,29_{principalmente}_os rela-cionados aostransportadores deprótons.Nesse sentido,o usodosequenciamentototaldoexoma,juntamentecomas característicasfenotípicas,poderesultarnadescobertade novasmutaçõese alteraçõesgenéticasnessadoença com-plexaerara.

Em resumo,o sequenciamentototal doexomaseguido pelo sequenciamento Sanger foi uma estratégia bem--sucedidanaidentificaçãodenovaserecorrentesmutações em nossoscasosdeATRd.Entretanto,asvariações genéti-caspossíveiscausadorasdealteraçõesnotransportetubular renal,principalmentenasformasrecessivasdeATRd,ainda devemserelucidadas.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

Este estudo foi parcialmente patrocinado pelo Conse-lho Nacionalde Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Brasil, e pelaFundac¸ão deAmparo à Pesquisado Estadode MinasGerais (Fapemig),Brasil, atravésda Con-cessão do Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia ---Medicina Molecular (INCT-MM): Fapemig: CBB-APQ-00075-09/CNPq573646/2008-2.Dr.LADeMarco,Dr.EAOliveira, Dr.DMMirandaeDr.ACSimõeseSilvareceberamumabolsa depesquisadoCNPq.

Referências

(7)

2.Fry AC, Karet FE. Inherited renal acidoses. Physiology (Bethesda).2007;22:202---11.

3.EscobarL,MejíaN,GilH,SantosF.Distalrenaltubularacidosis: ahereditarydiseasewithaninadequateurinaryH+_excretion. Nefrologia.2013;33:289---96.

4.Pereira PC, Miranda DM, Oliveira EA, Silva AC. Molecular pathophysiology of renal tubular acidosis. Curr Genomics. 2009;10:51---9.

5.BruceLJ,CopeDL,JonesGK,SchofieldAE,BurleyM,PoveyS, etal.Familialdistalrenal tubularacidosisisassociatedwith mutationsintheredcellanionexchanger(Band3,AE1)gene. JClinInvest.1997;100:1693---707.

6.KaretFE, Gainza FJ, Györy AZ, Unwin RJ,Wrong O, Tanner MJ, et al. Mutations in the chloride-bicarbonate exchanger geneAE1causeautosomaldominantbutnotautosomal reces-sivedistal renal tubular acidosis. Proc Natl AcadSci U SA. 1998;95:6337---42.

7.TanphaichitrVS,SumboonnanondaA,IdeguchiH,ShayakulC, BrugnaraC,TakaoM,etal.NovelAE1mutationsinrecessive distalrenaltubularacidosis.Loss-of-functionisrescuedby gly-cophorinA.JClinInvest.1998;102:2173---9.

8.Vargas-PoussouR,HouillierP,LePottierN,StrompfL,LoiratC, BaudouinV,etal.Geneticinvestigationofautosomalrecessive distalrenaltubularacidosis:evidencefor earlysensorineural hearinglossassociatedwithmutationsintheATP6V0A4gene.J AmSocNephrol.2006;17:1437---43.

9.KaretFE,FinbergKE,NelsonRD,NayirA,MocanH,SanjadSA, etal.MutationsinthegeneencodingB1subunitofH+_-ATPase causerenaltubularacidosiswithsensorineuraldeafness.Nat Genet.1999;21:84---90.

10.SmithAN,SkaugJ,ChoateKA,NayirA,BakkalogluA,OzenS, etal.MutationsinATP6N1B,encodinganewkidneyvacuolar protonpump116-kDsubunit,causerecessivedistalrenal tubu-laracidosiswithpreservedhearing.NatGenet.2000;26:71---5.

11.SmithA,BoycottKM,JarinovaO.LakeLouisemutation detec-tion meeting 2013: clinical translation of next-generation sequencingrequiresoptimizationofworkflowsand interpreta-tionofvariants.HumMutat.2014;35:265---9.

12.RabbaniB,TekinM,MahdiehN.Thepromiseofwhole-exome sequencinginmedicalgenetics.JHumGenet.2014;59:5---15.

13.RobinsonJT,ThorvaldsdóttirH,WincklerW,GuttmanM,Lander ES,GetzG,etal.Integrativegenomicsviewer.NatBiotechnol. 2011;29:24---6.

14.ChoiM,SchollUI,JiW,LiuT,TikhonovaIR,ZumboP,etal. Gene-ticdiagnosisbywholeexome capture andmassively parallel DNAsequencing.ProcNatlAcadSciUSA.2009;106:19096---101.

15.BonnefondA,DurandE,SandO,DeGraeveF,GallinaS,Busiah K,etal.Moleculardiagnosisofneonataldiabetesmellitususing

next-generation sequencing ofthe whole exome.PLoS ONE. 2010;5:e13630.

16.YangY,MuznyDM,ReidJG,BainbridgeMN,WillisA,WardPA, etal.Clinicalwhole-exomesequencingforthediagnosisof Men-deliandisorders.NEnglJMed.2013;369:1502---11.

17.LangF,VallonV,KnipperM,WangemannP.Functional signifi-canceofchannelsandtransportersexpressedintheinnerear andkidney.AmJPhysiolCellPhysiol.2007;293:C1187---208.

18.StoverEH,BorthwickKJ,BavaliaC,EadyN,FritzDM,Rungroj N,etal.NovelATP6V1B1andATP6V0A4mutationsinautosomal recessivedistal renal tubularacidosiswithnew evidencefor hearingloss.JMedGenet.2002;39:796---803.

19.BatlleD,HaqueSK.Geneticcausesandmechanismsofdistal renaltubularacidosis.NephrolDialTranspl.2012;27:3691---704.

20.GilH,SantosF,GarcíaE,AlvarezMV,Ordó˜nezFA,MálagaS,etal. DistalRTAwithnervedeafness:clinicalspectrumand mutatio-nalanalysisinfivechildren.PediatrNephrol.2007;22:825---8.

21.MiuraK,SekineT,TakahashiK,TakitaJ,HaritaY,OhkiK,etal. Mutationalanalysesofthe ATP6V1B1and ATP6V0A4genes in patientswithprimarydistalrenaltubularacidosis.NephrolDial Transpl.2013;28:2123---30.

22.ElhayekD,PerezdeNanclaresG,ChouchaneS,HamamiS,Mlika A,TroudiM,etal.Moleculardiagnosisofdistalrenaltubular acidosisinTunisianpatients:proposedalgorithmforNorthern Africa populations for the ATP6V1B1, ATP6V0A4 and SCL4A1 genes.BMCMedGenet.2013;14:119.

23.AlperSL,DarmanRB,ChernovaMN,DahlNK.TheAEgenefamily ofCl/HCO3-exchangers.JNephrol.2002;15:S41---53.

24.SchusterVL.Functionandregulationofcollectingduct interca-latedcells.AnnuRevPhysiol.1993;55:267---88.

25.Chang YH, Shaw CF, Jian SH, Hsieh KH, Chiou YH, Lu PJ. Compoundmutationsinhumananionexchanger1are associ-atedwithcompletedistalrenaltubularacidosisandhereditary spherocytosis.KidneyInt.2009;76:774---83.

26.AlperSL.MolecularphysiologyandgeneticsofNa+_-independent SLC4anionexchangers.JExpBiol.2009;212:1672---83.

27.Cheidde L,Vieira TC,LimaPR,SaadST, HeilbergIP.Anovel mutation in the anion exchanger 1 gene is associated with familialdistalrenaltubularacidosisandnephrocalcinosis. Pedi-atrics.2003;112:1361---7.

28.Wrong O, Bruce LJ, Unwin RJ, Toye AM, Tanner MJ.Band 3 mutations,distal renal tubularacidosis, andSoutheast Asian ovalocytosis.KidneyInt.2002;62:10---9.