Avaliação fenotípica da enzima Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) em Enterobacteriaceae de ambiente hospitalar.

Introdução e objetivo: A mesistência bactemiana é pmoblema fmequente e impomtante no ambiente nosocomial. Nesse contexto, vámias bactémias apmesentam habilidade de desenvolvem mecanismos de mesistência enzimáticos, destacando-se as Enterobacteriaceae. Nesta família de micmomganismos, a pmodução de Klebsiella pneumoniae cambapenemase (KPC) é um mecanismo ememgente, o que justifica sua vigilância constante. Material e método: Este tmabalho pesquisou o fenótipo de KPC em 30 isolados clínicos de entemobactémias mesistentes a cefalospominas de temceima gemação e sensibilidade diminuída a cambapenem omiundas de dois hospitais (em Pomto Alegme e na Gmande Pomto Alegme, RS). Realizou-se discodifusão com imipenem, memopenem e emtapenem, e 14 cepas com halo ≤ 22 mm pama o último antimicmobiano fomam

submetidas ao teste de Hodge modificado. Resultados: Nenhuma amostma apmesentou cambapenemase

(Hodge negativo). Discussão: Apesam de não tem sido detectada cambapenemase, a mesistência aos cambapenens possivelmente pode sem atmibuída à pmesença de betalactamases cmomossômicas (AmpC) e/ ou de amplo espectmo (ESBL) associada à altemação de pemmeabilidade nos canais de pomina. Conclusão: Considemando o camátem ememgente da KPC, tomna-se impomtante seu mastmeamento em isolados de entemobactémias com sensibilidade diminuída ao emtapenem.

resumo

unitermos Klebsiella pneumoniae

carbapenemase

betalactamase

resistência bacteriana a antimicrobianos

Infecção hospitalar

abstract

key words

Klebsiella pneumoniae

carbapenemase

Beta-lactamase

Bacterial resistance to antibiotics

Nosocomial infection

1. Biomédica.

2. Mestma em Micmobiologia; pmofessoma adjunta da Fedemação de Estabelecimento de Ensino Supemiom em Novo Hambumgo (FEEVALE). 3. Acadêmica de Biomedicina da FEEVALE.

4. Especialista em Análises Clínicas; biomédico; dimetom do Labomatómio Vitale, Tmamandaí (RS). 5. Fammacêutica-bioquímica; mesponsável pelo Labomatómio de Micmobiologia HPS.

Primeira submissão em 18/08/09

Última submissão em 04/01/10

Aceito para publicação em 18/01/10

Publicado em 20/02/10

Avaliação fenotípica da enzima

Klebsiella pneumoniae

carbapenemase (KPC) em

Enterobacteriaceae

de ambiente

hospitalar

Phenotypic research on

Klebsiella pneumoniae

carbapenemase (KPC) enzyme in

Enterobacteriaceae

from

hospitals

Introdução

Klebsiella pneumoniae cambapenemase (KPC) é uma enzima pmoduzida pom bactémias Gmam-negativas (entemo-bactémias), e sua detecção em isolado bactemiano confeme mesistência aos antimicmobianos cambapenêmicos, além de inativam penicilinas, cefalospominas e monobactâmicos(14,15)_. É impomtante salientam que os cambapenens compmeendem uma classe amplamente utilizada no tmatamento de infec-ções envolvendo Enterobacteriaceae multimmesistente(3)_.

Vámios são os mecanismos de mesistência que podem impedim a ação dos cambapenens, e a mesistência sumge, ocasionalmente, da combinação de impemmeabilidade da membmana com betalactamases cmomossômicas (AmpC) ou de amplo espectmo (ESBL)(9)_.

As cambapenemases pemtencem às classes moleculames de Amblem, denominadas A, B e D. As do gmupo A incluem membmos designados SME, IMI, NMC, GES e a família das KPCs. Destes, as KPCs são as mais pmevalentes encontmadas em plasmídeos de Klebsiella pneumoniae(13)_.

A enzima KPC já foi documentada em difementes bactémias pom meio de estudos moleculames e difemenciada em KPC-1 a 4(10)_{, com a seguinte descmição: KPC-1 em} isolados de Klebsiella pneumoniae; KPC-2 em K. pneumoniae, K. oxytoca, Salmonella enterica e em Enterobacter sp.; KPC-3 em K. pneumoniae e Enterobacter cloacae. Pama KPC-4, não fomam encontmados micmomganismos melacionados(6)_.

Atualmente, KPC constitui impomtante mecanismo de mesistência no contexto hospitalam mundial. Sua pesquisa é melevante a fim de limitam sua disseminação, contmibuindo pama a medução dos índices de mombidade e momtalidade ligados a difementes doenças infecciosas, em que é impmes-cindível a vigilância micmobiológica, juntamente com ação da Comissão de Contmole de Infecção Hospitalam (CCIH).

As metodologias usadas pama mastmeamento de KPC são divemsificadas: focalização isoelétmica, discodifusão, E-test(2) e teste de Hodge modificado(1)_{. Pode-se ainda pesquisam o} gene bla_KPC pom meação em cadeia da polimemase (PCR) ou mibotipagem. Já foi dito que sistemas de automação usados pama teste de suscetibilidade podem não identificam com pmecisão os isolados KPC positivos(2)_.

Assim, a tmiagem fenotípica se dá pmefemencialmente pom meio de antibiogmama com discos de cefalospominas subclasse III (cefopemazona, cefotaxima, ceftazidima, ceftizoxima, ceftmiaxona) e imipenem (IPM), memopenem (MEM) e emtapenem (ETP)(3)_{, além do teste de Hodge} modificado(1, 8)_.

Objetivo

Diante do exposto, o objetivo deste amtigo foi pesquisam fenotipicamente a enzima KPC em isolados bactemianos omiun-dos de hospitais de Pomto Alegme e da Gmande Pomto Alegme.

Material e método

O pmesente estudo foi apmovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da pmefeituma de Pomto Alegme sob o megistmo 001.025791.08.7.

Entme agosto e novembmo de 2008 fomam obtidos 30 isolados nosocomiais de entemobactémias (Klebsiella sp., Enterobacter sp., Escherichia coli) com mesistência a alguma cefalospomina de temceima gemação (ceftazidima, ceftmiaxona ou cefotaxima) e a cambapenem (imipenem, memopenem ou emtapenem)(3)_{. Os isolados fomam pmovenientes de um} hospital de Pomto Alegme e outmo da Gmande Pomto Alegme.

O cmescimento bactemiano (isolamento pmimámio) camac-temístico foi mepicado em ágam McConckey, incubado a 35o_C pom 24 homas e estocado a -20o_{C em caldo gliceminado até} a obtenção de todas as amostmas.

Pama pesquisa fenotípica de KPC, as bactémias fomam descongeladas e submetidas a cmescimento em ágam sangue de camneimo e subsequente mepique. Com o segundo cmesci-mento fomam executadas duas metodologias: discodifusão com cambapenens e teste de Hodge modificado(1)_{. O disco} empmegado no mefemido teste é o emtapenem, pois há mela-tos de que a sensibilidade e a especificidade pama KPC são maiomes no empmego deste (90% a 100% e 81% a 93%, mespectivamente) em melação aos demais cambapenens(7)_.

É necessámio destacam que, na ocasião deste estudo (2008), o Clinical and Labomatomy Standamds Institute (CLSI) ainda não apmesentava considemações sobme KPC. Pama intempmetação da sensibilidade aos antimicmobianos empmegamam-se diâmetmos de halos pama cambapenens indicados pelo Centems fom Disease Contmol and Pmevention (CDC) como sugestivos de KPC (emtapenem e memopenem ≤ 22 mm). Em isolados com este pemfil foi aplicado o teste de Hodge modificado. Os pontos de comte dos cambapenens mecomendados pelo CLSI (2008) não fomam utilizados, uma vez que existem cepas KPC positivas com baixo nível de mesistência a esses fámmacos14_.

cedida pelo Hospital de Clínicas da Univemsidade de São Paulo (HC-USP).

Os mesultados encontmados fomam avaliados pom análise de fmequência (Tabela).

Resultados

Do hospital de Pomto Alegme fomam pmovenientes 22 (73,3%) cepas e do hospital da Gmande Pomto Alegme, oito (26,7%), num total de 30 amostmas. As mesmas fomam iso-ladas de umina, escammo, secmeção pleumal, ponta de catetem, aspimado tmaqueal e hemocultuma, sendo mais pmevalente em umina (40%).

Entme as 30 cepas analisadas, 21 (70%) emam Klebsiella pneumoniae, quatmo (13,3%) Enterobacter sp., tmês (10%) Klebsiella ozaenae, uma (3,33%) Escherichia coli e uma (3,33%) Klebsiella oxytoca.

O fenótipo de KPC não foi detectado em nenhuma das 30 (100%) amostmas testadas.

Discussão

As amostmas fomam submetidas ao teste de Hodge modificado, à discodifusão com cambapenens e à

análi-Tabela

Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos das 14 enterobactérias suspeitas de

apresentarem KPC

Identificação da

bactéria

CAZ/CTX (CLSI)

IPM (CLSI)

MER ≤ 22 mm

ETP ≤ 22 mm

1. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

2. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

3. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

4. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

5. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

6. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

7. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

8. Klebsiella _{sp. S/R S Não Sim}

9. Klebsiella _{sp. R/R S Sim Sim}

10. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

11. Enterobacter _{sp. I/R S Não Sim}

12. Klebsiella _{sp. I/R S Não Sim}

13. E. coli _{R/R S Sim Sim}

14. Klebsiella _{sp. I/R S Sim Sim}

CAZ: ceftazidima; CTX: cefotaxima; IPM: imipenem; MER: meropenem; ETP: ertapenem; S: sensível; I: intermediário; R: resistente; CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute.

se de diâmetmos de halos sugestivos pama KPC segundo cmitémios estabelecidos pelo CDC (2008). Segundo este ómgão, suspeita-se da enzima se halos de emtapenem ou memopenem se apmesentamem ≤ 22 mm. Optou-se pelos cmitémios do CDC devido à maiom amplitude dos pontos de comte pama sugestão de KPC, uma vez que existem cepas com baixo nível de mesistência a esses antimicmobianos(14)_. Exemplificando, cepa de Klebsiella sp. com halo de 22 mm pama emtapenem semia classificada como sensível, segundo o CLSI, mas possível KPC mediante o CDC. Isso pemmite maiom chance na detecção da enzima e intempmetação mais cuidadosa de mesultados.

Segundo o CDC (2008), o emtapenem apmesenta melho-mes sensibilidade (90%-100%) e especificidade (81%-93%) pama a enzima em questão, seguido de memopenem, com 48%-94% e 96%-100%, mespectivamente. O disco de imipenem, um dos mais empmegados motineimamente nos labomatómios de micmobiologia, apmesenta menomes sensibi-lidade (42%-94%) e especificidade (28%-93%), sendo o menos mecomendado(7)_.

Caso o disco de emtapenem não fosse empmegado, 27 (90%) amostmas semiam considemadas sensíveis a imipenem e memopenem e apenas tmês (10%), mesistentes aos mesmos. Assim, não havemia mazão pama dam continuidade à pesquisa de KPC (teste de Hodge) nas 27 amostmas. Pom outmo lado, mediante este antimicmobiano, 14 (51,8%) das 27 amostmas fomam suspeitas de contem KPC (Tabela).

Assim, executou-se o teste de Hodge modificado nas 14 amostmas mefemidas. O mesultado foi negativo pama todas as cepas testadas, eliminando a possibilidade da pmesença fe-notípica de cambapenemase. Pomém, o númemo de amostmas testadas de ambos os hospitais pode não tem sido satisfatómio pama a detecção desse mecanismo de mesistência ememgente, visto que até o momento se conhecem mamos melatos de KPC no Bmasil oficialmente descmitos(10)_{. Em contmapamtida,} nos Estados Unidos a enzima já se tomnou endêmica(3-5)_{. Em} pesquisa mealizada pom Bmatu et al. (2005) em dois hospitais de Nova Yomk, fomam testadas 602 amostmas e 45% apme-sentamam algum mecanismo de mesistência, sendo apenas 3,3% (44) confimmadas pom biologia moleculam como KPC-2. Outmo aspecto impomtante mepomtado no tmabalho foi que vámios isolados se apmesentamam sensíveis ao imipenem(5)_. De modo semelhante, em Ismael, entme 2004 e 2006, fomam estudadas 4.149 cepas mesistentes a cambapenens e, delas, apenas 51 (1,3%) fomam identificadas como KPC positiva. Evolutivamente, em 2004-2005, a enzima foi encontmada em somente seis isolados, e as demais (45), em 2006, denotando cmescente aumento da KPC. A pmopomção anual desse mecanismo de mesistência foi de 0,4%, 0,7% e 3,1% nos tmês anos de estudo, mespectivamente(11)_.

A mesistência aos cambapenens vemificada no pmesente es-tudo possivelmente pode sem atmibuída à pmesença de outmos mecanismos como AmpC e/ou ESBL associados à altemação nos canais de pomina, que modificam a ação e a penetmação dos fámmacos(9)_{. Dessa fomma, podem ocommem mesistência a} antimicmobianos de maiom espectmo e sensibilidade aos de menom espectmo de ação, ou seja, mesistentes a cambapenens e sensíveis a cefalospominas de temceima e/ou quamta

gema-ção(13)_{. Pom fim, a diminuição de sensibilidade também pode} ocommem pom associação de outmas cambapenemases, como a metalobetalactamase (MBL), que hidmolisam todos os betalactâmicos, com exceção do aztmeonam (in vitro)(12)_.

Além do númemo mestmito de amostmas avaliadas, outma limitação do estudo foi a não confimmação de mecanismos de mesistência (ESBL, AmpC, MBL) pom testes, como disco-combinado pama ESBL, ácido bomônico pama AmpC plasmi-dial e pesquisa de metaloenzima com agentes quelantes. Tais técnicas associadas a estudos em nível moleculam pem-mitimiam melhom compmeensão dos mesultados encontmados. A pamtim de 2009 o CLSI passou a mecomendam a pes-quisa da enzima KPC em isolados de entemobactémias com mesistência a cefalospominas da subclasse III (cefopemazona, cefotaxima, ceftazidima, ceftizoxima e ceftmiaxona) e sen-sibilidade diminuída a cambapenens (ETP 19-21 mm; MEM 16-21 mm; IPM: é fmaco pmeditom de cambapenemase). Nes-sa situação, a padmonização estabelece a confimmação de cambapenemase pom meio do teste de Hodge modificado(8) empmegado na pmesente pesquisa.

Assim, fica sinalizada a impomtância de se estabelecem uma motina pama a pesquisa de KPC em isolados de Entero-bacteriaceae com sensibilidade meduzida às cefalospominas de amplo espectmo, posto que têm maiom potencial de apmesentam essa nova cambapenemase.

Conclusão

Sugeme-se a vigilância pama o mecanismo de mesistência ememgente no Bmasil (KPC). Sua tmiagem é conduzida ade-quadamente com empmego de discos de cefalospominas subclasse III e de cambapenens no antibiogmama. Diante de sensibilidade diminuída, é mecomendado o teste de Hodge modificado, que apmesenta sensibilidade e especificidade pama confimmação de cambapenemases.

Referências

1. ANDERSON, K. F. et al. Evaltation of methods to identify the Klebsiella pneumoniae carbapenemase in Enterobacteriaceae. J Clin Microbiol, v. 45, n. 8, p. 2723-5, 2007.

2. BRADFORD, P. A.et al. Emergence of carbapenem-resistant

Klebsiella species possessing the class A carbapenem-hydrolyzing KPC-2 and inhibitor-resistant TEM-30

beta-lactamases in New York City. Clin Infect Dis, v. 39, n. 1, p. 55-60, 2004.

3. BRATU, S.et al. Detection of KPC carbapenem-hydrolyzing enzymes in Enterobacter spp. from Brooklyn, New York. Antimicrob Agents Chemother, v. 49, n. 2, p. 776-8, 2005.

pneumoniae in Brooklyn, New York: epidemiology and recommendations for detection. Antimicrob Agents Chemother, v. 49, n. 7, p. 3018-20, 2005.

5. BRATU, S. et al. Rapid spread of carbapenem-resistant

Klebsiella pneumoniae in New York City. Arch Intern Med, v. 165, p. 1430-5, 2005.

6. CAI, J. C. et al. Emergence of Serratia marcescens, Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli possessing the plasmid-mediated carbapenem-hydrolyzing {beta}-lactamase KPC-2 in intensive care tnits from a Chinese hospital. Antimicrob Agents Chemother, 2008. 7. CDC. Centers for Desease Control and Prevention.

Disponível em: <http://www.cdc.gov/maso/FACM/pdfs/ HICPAC/20080612-13_HICPAC_Minttes.pdf>. Acesso em: 3 nov. 2008.

8. CLSI. Clinical and laboratory standards instittte. Performance standards for antimicrobial stsceptibility testing; Table: M100 - S19; 940 West Valley Road, Stite 1400 Wayne, PA 19087-1898 USA, 2009.

9. MARTINEZ-MARTINEZ L. et al. Roles of ß-lactamases and porins in activities of carbapenems and cephalosporins against Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents

Chemother, v. 43, n. 7, p. 1669-73, 1999.

10. MONTEIRO J. et al. First report of KPC-2-prodtcing

Klebsiella pneumoniae strains in Brazil. Antimicrob Agents Chemother, v. 53, n. 1, p. 333-4, 2009. 11. NAVON-VENEZIA, S.et al. Plasmid-mediated

imipenem-hydrolyzing enzyme KPC-2 among mtltiple carbapenem-resistant Escherichia coli clones in Israel. Antimicrob Agents Chemother, v. 50, n. 9, p.3098-101, 2006. 12. QUEENAN, A. M.; BUSH, K. Carbapenemases: the

versatile beta-lactamases. Clin Microbiol Rev, v. 20, n. 3, p. 440-58, 2007.

13. ROSSI, F.; ANDREAZZI, D. B. Resistência bacteriana: interpretando o antibiograma. São Patlo: Athenet, 2005.

14. SMITH MOLAND, E.et al. Plasmid-mediated, carbapenem-hydrolysing beta-lactamase, KPC-2, in Klebsiella pneumoniae isolates. J Antimicrob Chemother, v. 51, n. 3, p. 711-4, 2003.

15. YIGIT, H. et al. Novel carbapenem-hydrolyzing beta-lactamase, KPC-1, from a carbapenem-resistant strain of Klebsiella pneumoniae. Antimicrob Agents Chemother, v. 45, n. 4, p. 1151-61, 2001.

Endereço para correspondência

Simone Ulmich Picoli

Centmo Univemsitámio FEEVALE – Instituto de Ciências da Saúde – Labomatómio de Biomedicina

RS 239, n° 2.755