Efeitos da glicina na mucosite oral
induzida por 5-fluorouracil em
hamster
.
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo – para obtenção do Título de
Mestre em ciências.
ODARA MARIA DE SOUSA SÁ
Efeitos da glicina na mucosite oral
induzida por 5-fluorouracil em
hamster
.
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo – para obtenção do Título de Mestre em
ciências.
Orientador: Prof
a. Dr
a. Eliana Maria Monteiro Caran
Co-orientadoras: Prof
a. Dr
a. Maria Luiza Vilela Oliva
Prof
a. Dr
a. Maria Teresa de Seixas Alves
Prof
a. Dr
a. Nilza Nelly Fontana Lopes
Odara Maria de Sousa Sá. -- São Paulo, 2010. xiv, 52f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Programa de Pós-graduação em Pediatria e ciências aplicada a Pediatria.
Título em inglês: Effects of the glycine in the oral mucositis induced by 5-fluorouracil in hamsters.
UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO PAULO
ESCOLA PAULISTA DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE PEDIATRIA
Chefe do Departamento:
Prof. Dr. Mauro Batista de Morais
Coordenadora do Programa de
Pós-graduação em Pediatria e
Ciências Aplicada à Pediatria:
Prof
a. Dr
a. Olga Maria Silverio Amancio
acontecem. Por isso existem momentos inesquecíveis, coisas inexplicáveis e pessoas incomparáveis".
Fernando Pessoa
A DEUS por estar sempre presente me concedendo força e dinamismo na busca dos meus objetivos, Aos meus PAIS por terem se dedicado em prol da minha formação, pelo amor, carinho e estímulo constantes dedico-lhes esse sonho conquistado.
À Profa. Dra. Eliana Maria Monteiro Caran agradeço profundamente por ter assumido orientação desta pesquisa em um tema novo e ter confiado no meu potencial, tendo-me brindado com importante colaboração na realização desta pesquisa, dosando as críticas com comentários de incentivo.
À Profa. Dra. Nilza Nelly Fontana Lopes na qualidade de amiga e co-orientadora, os tantos e inesquecíveis diálogos, a hospitalidade desde o acesso ao Laboratório até a intimidade de sua linda família. Sou inteiramente grata por essa orientação que ultrapassa esta pesquisa, bem como o imenso carinho nos momentos de dificuldade e de dor. Agradeço, sobretudo, o privilégio de haver trabalhado em um tema para o qual você tanto vem contribuindo para o esclarecimento.
À Profa. Dra. Maria Teresa de Seixas Alves pelo acompanhamento, críticas as quais me fizeram crescer, dinamismo e atenção especial para com esta pesquisa.
À Profa. Dra. Maria Luiza Vilela Oliva ajuda na realização experimental deste trabalho, com disponibilidade e paciência. Muito obrigada pela orientação no laboratório de bioquímica.
Ao Sr. Antonio Carlos Souza pela amizade e disponibilidade na confecção das lâminas. Sr. Emanuel Barreto pela ajuda na experimentação dos animais no biotério, durante tantos finais de semana.
À amigas Keite, Amene e Marina, pela indescritível solidariedade e afeto inestimável, que se traduziram sempre em entusiasmadas respostas, continuado estímulo e valiosa parceria, antes circunscrita aos questionamentos existenciais e teóricos nas longas e cúmplices conversas.
Há muito mais a quem agradecer. A todos aqueles que, embora não nomeados, me brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos e por sua presença afetiva em inesquecíveis momentos, o meu reconhecido e carinhoso, muito obrigado!
Sumário
Dedicatória …... v
Agradecimentos …... vi
Lista de figuras e gráficos... viii
Lista de quadros e tabelas …... ix
Lista de abreviaturas e símbolos …... x
1. FUNDAMENTAÇÃO CIENTÍFICA... 1
1.1 Mucosite Oral (MO)... 1
1.2 Fisiopatologia da MO... 4
1.3 Tratamento da MO... 6
1.4 Glicina... 8
1.5 Justificativa...10
1.6 Objetivo...11
1.7 Referências bibliográfica...12
2. ARTIGO...18
Resumo...19
Introdução... 20
Métodos...21
Resultados...25
Discussão...27
Referências bibliográfica...30
3. CONSIDERAÇÕES FINAIS... 33
4. ANEXO...34
Abstract
Figura 1 Manifestações da progressão da mucosite oral. Fonte: Sonis S, 2004.... 5 Figura 2 Estrutura do aminoácido glicina …... 8 Figura 3 Fotomicrografia da mucosa jugal de hamster – parâmetros HE... 22 Figura 4 Figura 4- Fotografia da mucosa jugal de hamster. A. Grupo suplementado
com glicina – Dia 3; B. Grupo suplementado com glicina – Dia 7; C- Grupo contole – Dia 3; D- Grupo contole – Dia 7... 25 Gráfico 1 Curva de calibração de proteína construída com o padrão de albumina
humana... 38
Gráfico 2 Curva de calibração do MDA traçada com 1,3,3 tetra-metoxipropano malondialdeído bis (acetildimetilo)... 38
Lista de quadros e tabelas
Quadro1 Representação esquemática do experimento... 21
Tabela 1 Escore clínico da mucosite oral... 22
Tabela 2 Parâmetros histológicos para avaliação da mucosite oral... 22
Tabela 3 Análise de concordância dos avaliadores na mucosite oral... 25
Tabela 4 Avaliação dos neutrófilos quanto aos grupos...…... 26
Tabela 5 Presença de úlcera quanto aos grupos de estudo... 26
Tabela 6 Valores de MDA tecidual na mucosa jugal (nmol/mg MDA/ mg de proteína).. 26
Tabela 7 Distribuição dos animais do GI conforme avaliação clínica dos avaliadores... 36
Tabela 8 Distribuição dos animais do GII conforme avaliação clínica dos avaliadores.... 36
Tabela 9 Caracterização dos animais do GI por meio análise histológica, D7... 37
Tabela 10 Caracterização dos animais do GII por meio análise histológica, D7... 37
Tabela 11 Caracterização dos animais do grupo experimental (GI) conforme dosagens de proteína e malondialdeído da mucosa jugal...
39
Tabela 12 Caracterização dos animais do grupo controle (GII) conforme dosagens de proteína e malondialdeído da mucosa jugal...
39
DNA deoxyribonucleic acid ( Ácido desoxirribonucléico ) 5 - FU fluorouracil
MO mucosite oral
ROS reactive oxygen species (espécie de oxigênio reativo) NF-KB nuclear factor-KappaB (fator kappaB)
TNFa tumor necrosis factor-alpha (fator de necrose tumoral) IL-1B interleucina 1
IL-6B interleucina 6 COX-2 ciclooxigenase-2
MASSC multinational association for supportive care in cancer ISSO international society of oral oncology
QT quimioterapia
TMO transplante de medula óssea
KGF-1 recombinant human keratinocyte growth factor-1
CO2 dióxido de carbônico
NH4 amônia
1 – FUNDAMENTAÇÃO CIENTÍFICA
1.1 - Mucosite Oral
Mucosite é caracterizada por processo inflamatória que lesa a mucosa do trato gastrointestinal, podendo variar desde leve inflamação a ulceração, decorrente da ação de agentes anti-neoplásicos, especialmente quimioterapia e/ou radioterapia (Blijlevens et al., 2000).
Recentemente, Peterson et al. (2006) propuseram o termo “mucosite do trato alimentar”, em substituição ao termo mucosite oral. Isto porque as alterações orais constituem apenas parte de um grupo de alterações que ocorrem em todo o trato gastrointestinal. Desta forma, a terminologia proposta retrataria melhor as características dessa alteração.
Segundo Duncan et al. (2003) a mucosite oral é de origem multifatorial, podendo ser resultado da interação direta da droga sobre o epitélio, efeito tóxico da quimioterapia e/ou radioterapia, fatores locais como a saliva e microbiota oral ou podendo haver predisposição genética (Sonis, 2004).
Bensadoun et al. (2000) considera a mucosite como resultado da combinação de diversos fatores, como o tipo de terapia e a susceptibilidade do paciente. Os fatores de risco podem ser divididos em duas principais categorias: riscos relacionados ao próprio paciente e ao tratamento (D'hondt et al., 2006).
A idade tem se mostrado fator de risco para o desenvolvimento da mucosite, crianças possuem alta taxa de renovação celular; e pacientes com idade superior a 50 anos apresentam insuficiência no reparo do DNA (Balducci & Exterrman, 2000). Pacientes do sexo feminino são mais susceptíveis a desenvolver mucosite oral após tratamento com 5-fluorouracil (5-FU) ( Sonis, 1998). Estado nutricional, tipo de malignidade, protocolo de tratamento utilizado, ou seja tipo de quimioterapia e dose, região atingida pela radioterapia e a dosagem acumulada, dano pré-existente na boca e status periodontal também desempenham papel na formação de mucosite oral. Consumo de tabaco e álcool são considerados importantes fatores de risco (Dood et al.,
1999).
A quimioterapia consiste na aplicação de drogas anti-neoplásicas de forma sistêmica agindo sobre as células de alta taxa mitótica, afetando a síntese de DNA, consequentemente reduz a capacidade de renovação celular do tecido epitelial, comprometendo a reparação da área lesada (Sonis 1998, Sonis 2004 a, Sonis 2004 b), pois quimioterápicos são particularmente estomatotóxicos.
O 5-FU, um agente antimetabólico de peso molecular 130.1, se caracteriza por apresentar semelhanças estruturais com intermediários da síntese dos ácidos nucléicos, podendo substituí-los e causar alterações na duplicação celular . O 5-FU é clinicamente utilizado no tratamento de adenocarcinomas de diversas etiologias como cólon, reto,estômago, pâncreas, mama, e carcinomas epidermóides de cabeça e pescoço (Grem, 1996). A toxicidade dose limitante do 5-FU depende do esquema de administração. A administração em bolos produz maior toxicidade hematológica, enquanto que a infusão contínua se caracteriza por mucosite gastrointestinal. Em ambos esquemas observa-se anorexia, náuseas e vômitos (Haller,1988; Benson III,1998)
A administração de 5-FU está associada à mucosite oral em cerca de 40% dos pacientes (Popescu et al., 1999), e grau 3 a 4 mucosite oral são observados em 10 a 15% dos receptores 5-FU (MAC, 1998). Existe risco aumentado de mucosite com baixas doses de agentes quimioterápicos decorrente de aplicações prolongadas e repetitivas, infusão em bolus e contínua (Rao Naidu et al., 2004). Outros agentes citotóxicos são conhecidos por lesarem a mucosa, como os alquilantes, antraciclinas, taxanos e metotrexato ( Wright et al., 2005). Finalmente, alguns medicamentos são excretados na saliva, tais como metotrexato e etoposide (Rao Naidu et al.,
2004).
A radioterapia consiste na aplicação de feixes de elétrons direcionados à região do tumor, estes feixes de elétrons lesam os tecidos, danificando o DNA celular e levando à morte celular. O risco varia de acordo com a dose, fracionamento e local da radioterapia. Devido a alta taxa de renovação celular e baixa radioresistência, as células da mucosa oral, faringe e laringe respondem precocemente aos efeitos tóxicos da radiação com o surgimento da mucosite oral. Em pacientes com tumores de cabeça e pescoço, a incidência de mucosite é superior a 50% (Rubenstein et al., 2004). Dependendo do comprometimento das regiões envolvidas, a mucosite oral pode permanecer por 1 a 4 semanas após o término do tratamento (Scully et al., 2006).
A mucosite oral se desenvolve com maior frequência nos epitélios não queratinizados como mucosa jugal, ventrolateral da língua, labial, palato mole e assoalho bucal (Peterson et al.,
3 A mucosite deve ser entendida como efeito adverso, evidenciada clinicamente por sintomatologia complexa, incluindo em sua evolução outras complicações como xerostomia, disgeusia, disfagia, odinofagia e infecções oportunistas (Salvajoli et al., 2000).
A primeira manifestação clínica é a descoloração da mucosa que se torna edematosa, eritematosa e friável. Subsequentemente, áreas de ulceração recobertas por crosta fibrino amarelada. O quadro sintomatológico varia da queixa de ardência oral, dor intensa, sangramento espontâneo, sialorréia, edema, eritema, ulceração, facilitando a presença de infecção secundária que podem impedir a alimentação e que, eventualmente, conduzem o paciente a caquexia e a nutrição através de sondas nasogástricas ou parenteral, comprometendo também a expressão verbal, deglutição e higienização da cavidade oral (Neville et al., 1995; Spijkervet et al., 1989; Elting et al., 2007).
A mucosite oral desencadeia reflexos negativos na qualidade de vida do paciente e consequentemente pode resultar em complicações como interrupção do tratamento, desidratação, uso de medicamentos, perda de peso, aumento o tempo de hospitalização e custo com o tratamento, elevando significativamente a morbidade e mortalidade dos pacientes ( Bensadoun
et al., 1999; Epstein & Schubert, 1999; Bensadoun et al., 2001; Stiff et al.,2001; Stokman et al.,
1.2 - Fisiopatologia da Mucosite Oral
De acordo com Sonis (2004 b), a fisiopatologia da mucosite oral - MO compreende dinâmico processo de injúria ao epitélio da mucosa oral normal , incluindo alterações da imunidade associada a atividades de citocinas e da própria microflora. Para melhor entendimento, a MO pode ser descrita em cinco estágios biológicos: iniciação, resposta ao dano primário, amplificação do sinal, ulcerações e cicatrização (figura 1).
5
1.3 – Tratamento da Mucosite Oral.
Existem muitas estratégias para prevenir e tratar a mucosite oral, geralmente a maioria destas não são aceitas e frequentemente estão baseadas em relatos de casos ou experiências pessoais. A falta de estudos clínicos randomizados bem projetados aumenta a dificuldade de estabelecer o tratamento ideal. Recentemente, o grupo de estudos de mucosite do Multinational Association of Supportive Care Cancer (MASCC) por meio da International Society of Oral Oncology (ISOO) revisou a literatura sobre mucosite oral e resumiu as conclusões nas orientações clínicas (Rubenstein et al., 2004; Sonis et al., 2004). Interessantes estudos clínicos foram relatados e novas drogas têm sido desenvolvidas e testadas.
De acordo com Saadeh (2005) o manejo da mucosite oral pode ser dividido em três componentes básicos: cuidados na higiene oral , prevenção e cuidados paliativos .
Os cuidados na higiene oral são fatores importantes para minimizar o efeito da mucosite oral e têm papel crucial na prevenção da sua ocorrência. O objetivo é reduzir fatores de risco, incluindo a redução do impacto da flora microbiana oral. Rubenstein et al. (2004) sugerem que o uso de um protocolo sistemático melhora o resultado do paciente. Alguns cuidados simples devem ser sugeridos, por exemplo: escovar os dentes após a ingestão de alimentos e usar nova escova de dentes a cada ciclo de quimioterapia e fio dental diariamente. Além disso, alimentos picantes, bebidas alcoólicas e bochechos a base de álcool devem ser evitados (Larson et al.,
1998). Tratamentos tópicos com antimicrobianos frequentemente, têm se mostrado eficaz em modificar a mucosite (Sonis, 2004). Por exemplo, uso de anfotericina B, tobramicina e polimixina B demonstram eficácia na prevenção da mucosite oral induzida por radioterapia, mas não pela quimioterapia (Donnelly et al., 2003).
A prevenção é o segundo fator mais importante no tratamento da mucosite oral. A
7 pacientes submetidos ao TMO autólogo ( Sonis et al., 1995; Sonis et al., 2000; Huang et al.,
2000; Scully et al., 2001; Kostler et al., 2001, Barash et al., 2005, Bensadoun, 2006).
As terapias podem incluir sais de alumínio (sucralfato e Maalox®), citocinas (interleucina-1), glutamina, citoprotetores, antioxidantes e sintomáticos como o uso da camomila, betametasona, ácido acetilsalicílico, lidocaína, polimixina E, lozenges e tobramicina ( Cowen et al., 1997; Adamietz et al., 1997; Biron et al., 2000; Sonis et al., 2000; Huang et al.,
1.4- GLICINA
A glicina (do grego glykos, "doce", nome devido ao seu sabor adocicado) é aminoácido simples, não essencial, formado por uma molécula de carbono ligada a um grupo amina e um grupo carboxil e apolar (figura 2) . Devido à sua simplicidade estrutural, este aminoácido tende a ser conservado evolucionariamente em proteínas como o citocromo c, mioglobina e hemoglobina. A maioria das proteínas possui pequenas quantidades de glicina; o colagéno é uma importante excepção , sendo um terço da sua estrutura primária constituída por glicina (Nelson, 2004).
Figura 2. Estrutura do aminoácido glicina .
A glicina constitui a glutationa, tripeptídeo essencial na manutenção do equilíbrio intracelular e serve de precursor a diversas espécies químicas: ácido aminolevulínico, precursor chave das porfirinas, o bloco C2N central a todas as purinas (IUPAC-IUBMB). É
neurotransmissor inibitório do sistema nervoso central, especialmente a nível da medula espinal, tronco cerebral e retina. Quando receptores de glicina são ativados, o anion cloreto penetra no neurónio através de receptores ionotrópicos, causando potencial pós-sináptico inibitório (Wagner et al., 2004).
A glicina tem efeito antiinflamatório, imunomodulador e citoprotetor; atuando como protetora em vários modelos experimentais, prevenindo lesões por isquemia-reperfusão em uma variedade de órgãos e tecidos , choques causados tanto por hemorragias como por endotoxinas e transplantes e diminui lesão renal e hepática causada por drogas (Rose et al., 1999; Jacob et al.,
2003).
9 inflamatório, provavelmente bloqueando a ativação do NF-kB e TFN-α (Zhong et al., 2003), diminuindo a formação de radicais livres e outros mediadores tóxicos (Mauriz et al., 2001).
A glicina é facilmente administrada por infusão intravenosa de manutenção basal do metabolismo ou como componente de solução de nutrição parenteral total. Pode ser utilizada por via oral, tendo sido observada excelente resposta nos diferentes estudos realizados . A dose já descrita de glicina utilizada para prevenção de alguns tipos de lesões é 0,5 a 3 mg por quilograma de peso corporal (mg/kg) (Zhong et al., 1998; Yin et al., 2002).
Estudos realizados por Mauriz et al. (2001) com objetivo de avaliar o efeito da suplementação de glicina na inibição do NF-kB em modelos animais de choque hemorrágico, comprovaram os potentes efeitos protetores na prevenção do estresse oxidativo, com inibição da produção de enzimas antioxidantes , como o TFN-α e redução na formação oxigênio reativo.
Lee et al. (2001), induziram oclusão da artéria mesentérica em modelo animal, demonstrando que a infusão mesentérica local de glicina aumentou o conteúdo protéico e de DNA da mucosa, diminuindo a atividade da mieloperoxidase intestinal e mantendo a atividade da glutaminase na mucosa (Jacob et al., 2003).
A degradação da glicina segue três vias principais: pode ser degradada a piruvato, especialmente em animais, pode ser oxidada a CO2, NH4+ e um grupo metileno pela enzima
glicina sintase e pode ser oxidada e desaminada a glioxilato pela enzima D-aminoácido oxidase, sendo o glioxilato posteriormente reduzido a oxalato.
1.5 – Justificativa
11
1.6- Objetivo
1.7- Referências Bibliográficas
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Efeitos da glicina na mucosite oral induzida por 5-fluorouracil em
hamster.
Effects of the glycine in the oral mucositis induced by 5-fluorouracil in
hamster.
Odara M S Sá 1; Nilza F Lopes 2; Maria T S Alves 3; Maria L V Oliva 4; Eliana M.M Caran 5.
Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP.
1. Pós Graduanda em Pediatria e ciências aplicada à pediatria, Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil
2. Dentista do Instituto de oncologia pediátrica (IOP), Universidade Federal de São Paulo – UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
3. Professoralivre docente do Departamento de Patologia, Universidade Federal de São Paulo –
UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
4. Professoraadjunta do Departamento de Bioquímica, Universidade Federal de São Paulo –
UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
5. Professora aassociada do Departamento de Pediatria, Universidade Federal de São Paulo –
UNIFESP, São Paulo (SP), Brasil.
Correspondência:
Odara Maria de Sousa Sá
Rua Acre, APT.S/N – Apt 201 , Bairro – Ilhotas
Teresina – PI , Brasil – CEP:64000-000
Telefone: 086- 99325493
E-mail: odarasousa@yahoo.com.br
19
Resumo
Mucosite oral é complicação comum no tratamento do câncer. A glicina demonstra efeito antiinflamatório, imunomodulador e citoprotetor. Este estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da suplementação de glicina na reparação da mucosite oral induzida por 5-fluorouracil em
hamster. Os animais foram divididos em dois grupos: grupo experimental (GI; n=20) e grupo controle (GII; n=20) ambos receberam injeção intraperitoneal de 5-fluorouracil no 1° e 3° dia. Os animais tiveram a sua bolsa jugal direita evertida e arranhada superficialmente no dia 3. O Grupo I, foi submetido ao tratamento com glicina a 5% por infusão intraperitoneal durante 7 dias e o Grupo II, recebeu placebo. A mucosa do GI e GII foi avaliada clinicamente, por meio de escore, no D3 e D7. Ao final do experimento a bolsa jugal dos animais de ambos os grupos foi retirada e avaliada segundo parâmetros histopatológicos e bioquímicos. Os grupos I e II apresentaram acentuado processo inflamatório durante o período inicial, segundo a avaliação clínica. No GI houve redução da severidade da mucosite, diminuição do processo inflamatório, cicatrização acelerada e redução da peroxidação lipídica quando comparado ao GII no final do experimento (p < 0,001). A suplementação com glicina demonstrou ser promissor instrumento para tratamento da mucosite, devido aos seus efeitos no processo inflamatório.
Introdução
A mucosite oral é complicação frequente e muitas vezes pode limitar a dose da quimioterapia ou radioterapia 1,2,3,4. A mucosa oral e o restante da mucosa do trato
gastrointestinal, frequentemente são afetadas pela toxidade direta não especifica dos agentes antineoplásicos. Clinicamente a mucosite resulta em dor intensa, prejuízo na alimentação e comunicação, causando impacto na sobrevida, além de afetar negativamente a qualidade de vida dos pacientes, prolongando o período e os custos de hospitalização 5,6,7. Infecções associadas com
lesões na mucosa oral podem causar sepse durante períodos de profunda imunossupressão 8.
Na mucosite observa-se dano à mucosa, resposta inflamatória, ulceração e cicatrização 9.
A fisiopatologia da mucosite é complexa e multifatorial. O tratamento atual da mucosite é paliativo, direcionado a diminuição da dor e prevenção das suas complicações. Estudos recentes têm demonstrado que o uso do laser de baixa intensidade minimiza o grau de mucosite e da dor
10,11,12. Pesquisas prévias em animais demostraram que a utilização de mediadores biológicos na
mucosa oral pode modificar o curso da mucosite. Fator de crescimento do queratinócito, como estimulante da proliferação epitelial e antiinflamatórios aceleram essa condição 13 .
A glicina é aminoácido simples tendo efeito antiinflamatório, imunomodulador e citoprotetor. Estudos experimentais demonstram seu efeito protetor na prevenção de lesões causadas por isquemia-reperfusão, choques hemorágicos e endotoxicos e diminuição da lesão renal e hepática causada por drogas. A glicina inibe a produção de mediadores inflamatórios, provavelmente diminuindo a ativação de NF-kB e TNFα, reduzindo a formação de radicais livres e outros mediadores tóxicos, atenuando a peroxidação lipídica e depleção da glutationa
14,15,16,17. O presente estudo tem como objetivo avaliar os efeitos da suplementação de glicina no
21
Métodos
Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP), São Paulo, Brasil, número CEP 1916/08. Foram utilizados quarenta hamsters Golden Syrian (Mesocricetus Auratus), fêmea, idade entre 8 a 12 semanas e peso entre 90 a120g, com alimentação e água ad libitum. Os animais foram divididos em 02 grupos: Grupo I(GI) – experimental, suplementados com glicina e Grupo II(GII) – controle, utilizando placebo.
Na indução da mucosite oral, os animais receberam injeção intraperitoneal de 5-Fluorouracil (5-FU) (5-Fluorouracil 25mg/ml; Eurofarma Laborátorio Ltda., São Paulo, SP, Brasil) no 1° e 3° dia do experimento, nas doses de 80 and 60mg/kg, respectivamente. Para eversão da bolsa jugal direita dos hamsters foram utilizados os anestésicos quetamina (Doppalen®; 10ml,
Sespo Ind. Com. Ltda., Jacareí, SP, Brasil), xilazina (Xilazin®; 10ml, Rhobifarma Ind. Com.
Ltda., Jacareí, SP, Brasil) e sendo surpeficialmente irritada, no dia 3. Os animais do GI foram tratados com suplementação de glicina através de injeção intraperitonial, dosagem de 0,2 ml (2,0 mg/g de peso corporal) de solução à 5% de glicina diluída em hepes 14-15 durante 7 dias do
estudo (Tabela 1).
Quadro 1. Representação esquemática do modelo experimental.
Período do experimento Dia 1 (D1) Dia 2 (D2) Dia 3 (D3) Dia 4 (D4) Dia 5 (D5) Dia 6 (D6) Dia 7 (D7)
Injeção de 5-FU ■ ● ■ ●
Arranhadura da mucosa
■ ●
Suplementação da glicina
■ ■ ■ ■ ■ ■ ■
Sacrifício ■ ●
(GI) Grupo I ■ Mucosite suplementação com glicina. (GII) Grupo II ● Mucosite + placebo.
A avaliação clinica foi realizada em ambos os grupos no 3° e 7° dia. Os animais foram anestesiados e sua bolsa jugal direita foi evertida para avaliação e fotografada, com câmera digital (Nikon Colpix® Finepix S4300 6.0 mega pixel, Tokyo, Japan). Para classificar
clinicamente a gravidade da mucosite, utilizou-se o escore definido por Sonis 18 (Tabela 2)
mediante o método duplo cego, realizadas por duas observadoras independentes.
Score Caracteristica clínica
1 Mucosa completamente saudável 2 Eritema, vasodilatação e erosão superficial
3 Eritema, vasodilatação e formação de úlcera < 50% da superfíce da bolsa julgal 4 Eritema, vasodilatação e formação de úlcera > 50% da superfíce da bolsa julgal 5 Úlcera em toda bolsa julgal. Perda da flexibilidade
No sétimo dia os animais foram sacrificados com “overdose” de anestésicos e tiveram sua bolsa jugal direita removida e analisada. Os espécimes foram fixados em formalina a 10% e corados pelo método histoquímico de Hematoxilina-eosina (HE) para análise histológica. A análise foi realizada por patologista experiente, sem prévio conhecimento da distribuição dos grupos, utilizado o princípio´´hot spot``, considerando os sequintes parâmetros:
Tabela 2. Parâmetros histológico para avaliação da mucosite oral.
1 2 Escore Característica histológica
Polimorfonucleas neutrófilo
Úlcera 1
2
Ausente Presente
Figura 3. Fotomicrografia HE da mucosa jugal de hamster: Úlcera: A (100x), B ( 100x) e C (200x); neutrófilos: D (200x) , E ( 400x) e F(400x).
A C
D E F
23 Para determinar os níveis de Malondialdeído tecidual (MDA) foi utilizado o método do ácido tiobarbitúrico (TBA) proposto por Kohn e Liversedge 19 e os valores foram expressos em
nanomoles de MDA por miligrama de proteína (nmol MDA/mg proteína). O conteúdo protéico homogeneizado foi determinado mediante o uso do ´´coomassie brilliant blue``(CBB).
As amostras teciduais, referente à bolsa jugal foram descongeladas, anotando-se o peso de cada amostra e adicionando o volume correspondente a 5 vezes o peso em gramas, de solução tampão de TRIS-HCL 0,01 M/pH 7,4. Foram homogeneizadas em banho de gelo, 4 vezes em 30 segundos, e posteriormente centrifugadas por 5 minutos a 10.000 rpm a 4°C.
− Dosagem da proteína - utilizamos o reagente CBB que interage com a proteína, permitindo sua quantificação. Utilizou-se uma curva padrão de albumina com concentração conhecida.
− Preparação do reagente CBB- agitou-se bem até dissolver 100 mg de CBB em 50 ml de etanol 95%, em seguida adicionou 100 ml de ácido fosfórico 85%, com agitação constante, acrescentou água destilada para um volume final de 1 litro. O reagente ficou em repouso por 24 horas e, em seguida, filtrado e mantido no escuro. Foram colhido 25 µl e 50 µl do homogenato, posteriormente diluídos em 5 vezes em tampão de TRIS-HCL 0,01M/pH 7,4, e acrescentou 2,5 ml do CBB. As leituras foram realizadas em 595 nm após 10 minutos da adição do reagente de CBB.
− Dosagem do malondialdeído- Foram coletados 400 µl do sobrenadante do homogenato centrifugado e adicionados 1 ml de ácido tricloroacético 20% e 400 µl de ácido tiobarbitúrico a 1,6%. A mistura foi incubada por 30 minutos, a 95°C. Os lipídeos foram extraídos pela adição de n-butanol (1,6 ml) e vigorosa agitação. Assim a mistura foi centrifugada novamente à 10 minutos a 3000rpm, e a camada superior foi cuidadosamente separada. A absorbância da camada orgânica foi determinada em 510, 532 e 560 nm. Para cálculo dos valores finais utilizou-se a equação abaixo, postada para minimizar a interferência dos pigmentos heme e da hemoglobina na dosagem de MDA 20:
MDA532 = 1,22[(A532 )- (0,56)(A510 )+(0,44)(A560 )]
As variáveis quantitativas foram expressas por média, desvio padrão (dp) e as descritivas por frequência absoluta. O teste Kolmogorov-Smirnov foi aplicado para avaliar a distribuição normal dos parâmetros avaliados. Na análise clínica o teste estatístico Alfa de Cronbach avaliou o grau de concordância entre os avaliadores e o o Teste de Wilcoxon para comparação entre os grupos. Oteste Qui-quadrado ajustado pela Estatística de Fisher na avaliação da injúria tecidual.
25
Resultados
Os estágios clínicos da mucosite oral no modelo animal foi bem estabelecido. O desenvolvimento da mucosite ulcerativa foi consistente e padronizado em ambos os grupos. A mucosite grave , definida com escore igual ou superior a 3, apresentou elevada incidência no período inicial. No D3 todos animais de ambos os grupos apresentavam mucosite grave instalada (100%).
A análise clínica de concordância dos avaliadores demonstrou confiabilidade elevada (tabela 3). No 7° dia, os animais do GI, suplementados com glicina, apresentaram redução da gravidade da mucosite oral quando comparados ao GII (p < 0,001) (Figura 4) .
Tabela 3. Análise de concordância dos avaliadores na mucosite oral.
Grupo Coeficiente Alfa de Cronbach
Significância (p)
GI 0,82 < 0,001
GII 1 < 0,001
Figura 4- Fotografia da mucosa jugal de hamster . A. Grupo suplementado com glicina – Dia 3; B. Grupo suplementado com glicina – Dia 7; C. Grupo contole – Dia 3; D.Grupo controle– Dia 7.
No D7, os animais do GII (100%) apresentaram infiltrado inflamatório agudo, caracterizado pela presença de neutrófilos. 75% dos animais do grupo I não apresentavam infiltrado neutrofílico (tabela 4), diferença estatisticamente significante foi observada, quando
A B
comparada ao grupo II (p < 0,001) . Ao compararmos os grupos, nota-se que o GI evidenciou gradativa diminuição de lesão ulcerada (p < 0,001) (tabela 5).
Tabela 4. Avaliação dos grupos quanto a presença de neutrófilos.
Dia Polimorfonucleares Neutrófilo
Grupo P-Valor
GI GII
7 1
2
15 5 20
p < 0,001
Tabela 5. Análise dos grupos em relação à presença de úlcera.
Dia Úlcera Grupo P-Valor
GI GII
7 1
2
13 7 20
p < 0,001
Os valores de MDA dos grupos em estudo podem ser observados na tabela 6. Encontrou-se diferença estatisticamente significante entre os grupos de estudo, quando Encontrou-se comparou a média da dosagem de MDA nos animais ( p< 0,001)
Tabela 6. Valores de MDA tecidual na mucosa jugal (nmol/mg MDA/ mg de proteína).
Grupo nmolMDA/mg proteína Média Desvio Padrão N
I 0,185 0,118 20 II 1,085 0,225 20
27
Discussão
A mucosite oral é importante efeito colateral, decorrente do tratamento antineoplásico, seja por radioterapia ou quimioterapia ou as duas modalidades combinadas. Geralmente as manifestações da mucosite induzida por quimioterapia são observadas 3 dias após a exposição inicial ao 5-FU 21, coincidindo com o período de renovação do epitélio da mucosa devido a ação
direta dos agentes quimioterápicos, interferindo na síntese de DNA, especialmente nas células que têm alta taxa de mitose, como as células epiteliais da mucosa oral , ocasionando redução na renovação epitelial, o que resulta em formação de úlcera .
A presença da mucosite, além de interferir no tratamento do câncer, predispõe o paciente a outros tipos de complicações, como dores intensas, infecções oportunistas, desnutrição devido à baixa ingestão oral, dificuldade com a expressão verbal, hospitalização prolongada, que culminam na redução da qualidade de vida.
A indução de mucosite oral em hamster foi realizada com sucesso nesta pesquisa, estabelecendo a sequência cronológica do processo inflamatório. O protocolo de indução de mucosite oral decorrente da quimioterapia em hamster tem sido amplamente utilizado em diversos estudos. O hamster foi utilizado neste modelo experimental , devido a presença da bolsa jugal que funciona como reserva de alimentos, além de sua similaridade no desenvolvimento na mucosite induzida pela quimioterapia, flora bacteriana e células sanguíneas 8.
Vários mecanismos estão envolvidos na lesão da mucosa oral, tais como aumento na síntese de mediadores inflamatórios, como citocinas, elevado número de neutrófilos e intensa peroxidação lipídica.
A suplementação de glicina na prevenção e reparação de mucosite oral não apresenta parâmetros definidos para seu uso. Nos parâmetros utilizados neste estudo, a glicina foi diluída à 5 %, estando de acordo com a literatura para o tratamento de lesões como enterocolite necrotizante neonatal 22.
Clinicamente, observa-se que na fase inicial os grupos I e II apresentavam semelhante grau de mucosite, igual ou superior ao grau 3 caracterizando mucosite grave, observando a formação de eritema, edema, formação de pseudomembrana e úlcera. No entanto, notamos que no D7, os animais do grupo I, suplementados com a glicina, apresentavam clinicamente redução do grau de mucosite oral. A glicina mostra efeito citoprotetor com resposta positiva no tratamento da mucosite oral .
dano epitelial, seguido por aceleração do processo de cicatrização, a glicina demonstrou seu efeito anti-inflamatório na mucosite oral. A inflamação aguda é caracterizada por resposta inflamatória imediata e inespecífica do organismo diante da agressão, caracterizada pela presença de neutrófilo seguidos por linfócitos e histiócitos. A resolução da inflamação ocorre a partir do momento em que os granulócitos são eliminados e a população de células mononucleares teciduais (macrófagos e linfócitos) retornam-se ao número e fenótipo normais 23.
A comparação bioquímica do GI e GII mostra que os animais do grupo I apresentaram diminuição da peroxidação lipídica indicando o efeito da ação glicina . A peroxidação lipídica é processo complexo que pode acontecer em membranas biológicas constituídas por ácidos graxos poliinsaturados reagentes ao oxigênio molecular, levando à produção de hidroperóxidos lipídicos e seus metabólitos. Na maioria dos casos em que há peroxidação de lipídios começa uma reação em cadeia que se propaga, mediada pela presença de radicais livres. Os hidroperóxidos lipídicos acumulam-se na membrana, inativando-se os seus receptores e enzimas, afetando suas funções, levando a sua desestabilização e tornando-a permeável a íons. Um método simples e de alta sensibilidade para demonstrar esta peroxidação lipídica é a reação de substâncias que se combinam com ácido tiobarbitúrico, como o malondialdeído (MDA). Conseqüentemente, o MDA é indicador adequado para medir a peroxidação lipídica provocada por radicais livres 24.
Os resultados acima demonstram que a suplementação de glicina apresenta efeitos anti-inflamatórios e citoprotetores na mucosite oral. Estudos demonstram o efeito protetor da glicina, usada em infusão intravenosa sistêmica, ao diminuir a apoptose e preservar a integridade e a contratilidade da parede intestinal 25,26. A comprovada diminuição da peroxidação lipídica e
processo inflamatório nos animais tratados com glicina decorreu, provavelmente, de seu mecanismo de ação na membrana plasmática onde ativa o canal de cloro que estabiliza ou hiperpolariza o potencial da membrana.
A glicina bloqueia o acréscimo intracelular de cálcio que estimularia a cascata de formação das citocinas; inibindo as células que ativam o processo inflamatório, provavelmente bloqueando ativação do NF-kB e TFN-α 25, diminuindo a formação de radicais livres e outros
mediadores tóxicos 27,28 .Outro mecanismo a ser abordado é o fato da glicina participar da
formação de um terço da estrutura de colágeno, essas fibras mais fortalecidas podem aumentar a resistência do tecido à ação inflamatória.
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3. CONSIDERAÇÕES FINAIS
A glicina é promissora opção terapêutica nutricional para minimizar o processo inflamatório, porém o seu mecanismo de ação não é totalmente esclarecido, sendo necessário novos estudos para sua total compreensão.
Animal Grau de mucosite- D3 1 avaliador
Grau de mucosite- D3 2 avaliador
Grau de mucosite -D7 1 avaliador
Grau de mucosite- D7 2 avaliador
1 III III II I
2 III III II II
3 III III I I
4 III III I I
5 IV III III II
6 III III II I
7 III III I II
8 III III II II
9 III III I I
10 IV IV III II
11 III III I II
12 III III II I
13 III III I II
14 III III II II
15 III III I II
16 III IV II III
17 III III I II
18 III III II I
19 III III II I
20 III III I I
Tabela 8. Distribuição dos animais do GII conforme avaliação clínica dos avaliadores.
Animal Grau de mucosite- D3 1 avaliador
Grau de mucosite- D3 2 avaliador
Grau de mucosite -D7 1 avaliador
Grau de mucosite- D7 2 avaliador
1 IV IV III III
2 III IV II III
3 III III III III
4 III III III II
5 IV III III III
6 IV III III III
7 III III II III
8 IV IV III IV
9 III III III III
10 IV IV III IV
11 III III II III
12 III III III II
13 II III I III
14 IV III III II
15 IV III IV III
16 III IV II III
17 III III II II
18 III III II II
19 III III II II
37
Tabela 9. Caracterização histológica dos animais do GI no D7.
Lâmina Descrição
1 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 2 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 3 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 4 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 5 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 6 Lesão úlcerada com raros neutrófilo em início de reparação.
7 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 8 Lesão úlcerada com raros neutrófilo em início de reparação.
9 Lesão úlcerada com raros neutrófilo em início de reparação. 10 Lesão úlcerada com raros neutrófilo em início de reparação. 11 Lesão úlcerada com raros neutrófilo em início de reparação.
12 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 13 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 14 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparados. 15 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 16 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 17 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 18 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 19 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado 20 Ausência de úlcera e polimorfonucleares neutrófilos. Processo reparado Tabela 10. Caracterização histológica dos animais do GI I no D7.
Lâmina Descrição
1 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 2 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 3 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 4 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 5 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 6 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 7 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 8 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 9 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 10 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 11 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 12 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 13 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 14 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 15 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 16 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 17 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 18 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 19 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo. 20 Lesão úlcera necrotizante com colônias de bactérias e presença de neutrófilo.
Gráfico 2. Curva de calibração do MDA traçada com 1,3,3 tetra-metoxipropano malondialdeído bis (acetildimetilo).
39
Tabela 11. Caracterização dos animais do grupo experimental (GI) com as dosagens de proteína e malondialdeído da mucosa jugal.
Animal Peso do órgão MDA Proteína nmol MDA/mg proteína
0 5 10 15 20 25 30 35
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 0,5
f(x) = 0,01x + 0,01 R² = 0,99
Curva padrão de dosagem de proteína
ug BSA/100ml
A
9
5
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9
f(x) = 0,05x - 0,02 R² = 0,98
Curva de MDA
nmol MDA
A
5
3
(g) nmol/ml mg/ml
1 0,35 7,7 60,4 0,1
2 0,31 9,4 38,7 0,2
3 0,27 16 32,8 0,4
4 0,25 7,2 44,6 0,1
5 0,34 7,7 62,2 0,1
6 0,22 8,7 59,8 0,1
7 0,29 14 35,8 0,3
8 0,23 9 36,7 0,2
9 0,31 9,4 37,9 0,2
10 0,29 16 29,6 0,5
11 0,28 7,3 48 0,1
12 0,33 15,3 52,3 0,2
13 0,33 11,3 57,8 0,1
14 0,31 9,2 53,8 0,1
15 0,24 11,5 61,5 0,1
16 0,32 11,5 38,2 0,3
17 0,16 8,7 86,9 0,1
18 0,43 10,5 62,5 0,1
19 0,28 11,4 34 0,3
20 0,25 7,5 40,3 0,1
Tabela 12. Caracterização dos animais do grupo controle (GII) com as dosagens de proteína e malondialdeído da mucosa jugal.
Animal Peso do órgão (g)
MDA nmol/ml
Proteína mg/ml
nmol MDA/mg proteína
1 0,19 22 31,1 0,7
2 0,27 25,5 20,25 1,2
3 0,17 27,8 21,3 1,3
4 0,28 28 22,5 1,2
5 0,37 23,9 28,9 0,8
6 0,31 14,3 13 1,1
7 0,29 22 23,5 0,9
8 0,37 25,5 27 0,9
9 0,33 21,2 23,5 0,9
10 0,34 24,5 21,1 1,1
11 0,19 25,7 21,1 1,2
12 0,3 25,5 21,7 1,1
13 0,29 24,3 20,8 1,1
14 0,52 25,5 20,7 1,2
15 0,2 25,3 31,6 0,8
16 0,25 25,5 15,6 1,6
17 0,28 24,3 24,7 0,9
18 0,25 25,2 17,25 1,4
19 0,21 25,5 18,7 1,3
20 0,26 14,3 13,1 1
40
