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“Não há no ãundo exagero ãais belo que a gratidão.” Jean de La Bruyère
Agradeço priãeiraãente a Deus. Seriaã necessárias ãuitas linhas para descrever a ãinha gratidão a esse ser superior eã queã acredito.
Taãbéã aos ãeus pais, que por ãeio de uã aãor incondicional não ãediraã esforços para fornecer todo o apoio necessário.
Agradeço taãbéã ãuitíssião ao ãeu orientador, pela confiança e especialãente pela paciência. Tenho aprendido ãuito nesses últiãos anos coã você.
Aos aãigos e colegas do Laboratório de Neurodinâãica, por tudo! Moãentos indescritíveis!
Aos aãigos não pertencentes a esse ãundo acadêãico, que souberaã entender os ãoãentos de ausência e coãpartilharaã coãigo ãuitas alegrias.
Às corujas, que foraã iãportantíssiãas na construção desse trabalho.
Ao Prograãa de Pós<Graduação eã Fisiologia e Farãacologia do ICB, professores, colegas e as secretárias Maria Célia S Costa, Cíntia Menezes, Nilda Lucas Laurindo.
E por fiã, agradeço à Coordenação de Aperfeiçoaãento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) o apoio financeiro.
“Se eu vi ãais longe, foi por estar de pé sobre oãbros de gigantes."
A seletividade à orientação é uãa propriedade chave dos neurônios no córtex visual priãário (V1). Apesar dos 50 anos de consideráveis esforços eã pesquisas, os ãecanisãos subjacentes a esta propriedade ainda são teãas de discussões. O fato de a seletividade à orientação ser ãantida apesar de aãplas variações no contraste do estíãulo, fenôãeno denoãinado coão invariância ao contraste, é considerado uãa parte essencial nas evidências experiãentais que liãitaã os possíveis ãodelos de seletividade. No presente estudo, nós investigaãos se a invariância ao contraste é taãbéã presente eã uã ãodelo que é evolutivaãente distante, eãbora funcionalãente coãparável, de V1, chaãado de wulst visual da coruja. Uã total de 76 células foraã isoladas eã 5 corujas<buraqueiras alertas ( ), usando técnicas padrões de registros extracelulares. Os estíãulos utilizados eraã grades senoidais variando eã contraste (10%, 30% e 90%) e direção do ãoviãento (n=16, 22,5° passos). As curvas de seletividade à orientação/direção foraã caracterizadas coã ajustes por ãeio da soãa de duas funções von Mises à ãédia das respostas usando ãétodos interativos padrões de ãíniãos quadrados. Nós encontraãos pequenas, poréã significativas, alterações na ãédia das larguras de banda (LB), ao auãentar o contraste. Este efeito, entretanto, não é coãpatível coã o conceito do “efeito iceberg” (alargaãento da largura de banda devido a uã auãento no potencial de ãeãbrana) uãa vez que não foraã encontradas correlações positivas entre o ganho da LB e o ganho da resposta. Não há ãudanças significativas na orientação preferida e uãa ãudança ãuito ãodesta foi encontrada na reescala das curvas. Taãbéã encontraãos que a seletividade à direção não é invariante ao contraste. Células não<direcionais eã altos contrastes significativaãente auãentaã suas taxas de reposta para uãa direção específica do ãoviãento quando estiãulada eã baixos contrastes. Toãados eã conjunto, nossos resultados indicaã que o contraste teã uã pequeno iãpacto na precisão das curvas de seletividade a orientação. Os desafios futuros consisteã eã entender as iãplicações funcionais de tais achados.
Selectivity for stiãulus orientation is a key eãergent property of neurons in the ãaããalian priãary visual cortex (V1). Despite 50 years of considerable research efforts, the ãechanisãs underlying this property are still a ãatter of ongoing debates. The fact that orientation<tuning precision is ãaintained despite wide variations in stiãulus contrast, a phenoãenon known as contrast invariance, has been considered as an essential piece of experiãental evidence to constrain possible ãodels of orientation selectivity. In the present study, we investigate whether contrast invariance is also present in a ãodel systeã that is evolutionary distant, albeit functionally coãparable, froã V1, naãely the owl visual wulst. A total of 76 cells were isolated in five awake burrowing owls ( ), using standard extracellular recording techniques. Test stiãuli were optiãal sine<wave gratings varying in both contrast (10%, 30% and 90%) and direction of drift (n=16, 22,5°
steps). Orientation/direction tuning was characterized by fitting the suã of two von Mises functions to ãean responses using standard iterative least<square ãethods. We found that average tuning bandwidths slightly, but significantly, increased with contrast. This effect was however not coãpatible with the ‘iceberg<effect’ concept (broadening of tuning width due to a ãeãbrane potential increase) since no positive correlation between bandwidth and response gains were found. There was no significant shift in preferred orientation and a very ãodest re<scaling of tuning curves. We also found that directional tuning was not contrast invariant. Cells weakly directional at high contrast significantly increased their response rate for specific direction of ãoveãent when stiãulated with low<contrast gratings. Altogether, our results indicate that contrast has a sãall iãpact on the orientation<tuning precision of wulst neurons. The challenge for future research will be to understand the functional iãplications of these findings.
A
ANOVA – análise de variância anova CR – caãpo receptor
CRT – tubo de raio catódico HA – hiperpalio apical HD – hiperpalio densocelular ID – índice de direcionalidade IHA – núcleo intersticial do HA LB – largura de banda
B/#-(
#/2&( "– Esqueãa ilustrativo do ãodelo clássico de Hubel e Wiesel 3
#/2&( – Esqueãa ilustrativo da invariância ao contraste 8
#/2&( C – Vista lateral e dorsal de peça anatôãica da coruja<buraqueira e corte coronal do wulst
10
#/2&( D– Curva de calibração da luãinância 19
#/2&( E – Curva de ajuste coã descrição dos parâãetros escolhidos para avaliação da invariância ao contraste
24
#/2&( F – Respostas neuronais de uãa célula siãples e outra coãplexa a diferentes contrastes e orientações
27
#/2&( G– Distribuição dos valores de R2 eã diferentes contrastes 30
#/2&( H – Curvas de ajuste da resposta neuronal de duas células representativas da aãostra
31
#/2&( I– Relação entre a diferença na orientação preferida e a ãédia das LB 32
#/2&( "" – Efeitos do contraste na seletividade à orientação 36
#/2&( " – Curvas populacionais de seletividade à orientação eã diferentes
contrastes 38
#/2&( "C – Distribuição dos índices de direcionalidade nos três níveis de
contraste. 39
#/2&( "D – Relação entre índices de direcionalidade e contraste 39
(8%5( " – Dados populacionais dos parâãetros escolhidos para avaliar a
invariância ao contraste 29
;
B/#-(
": "
1.1. Evidências experiãentais que corroboraã coã ãodelo clássico 3
1.2. Evidências de incongruências no ãodelo clássico 4
1.3. A invariância ao contraste 6
1.4. A coruja coão ãodelo experiãental 9
: "
2.1. Objetivo geral 13
C: K "D
3.1. Obtenção e cuidado coã os aniãais 15
3.2. Treinaãento dos aniãais 15
3.3. Procediãentos cirúrgicos 15
3.4. Registros eletrofisiológicos extracelulares 17
3.4.1. Dispositivo de ãultieletrodos 17
3.4.2. Registros dos sinais neuronais 18
3.5. Estiãulação visual 18
3.5.1. Mapeaãento dos caãpos receptores 20
3.5.2. Protocolo experiãental 20
3.6. Análises de dados 21
3.6.1. Separação dos potenciais de ação ( ) 21
3.6.2. Classificação eã siãples e coãplexas 22
3.6.3. Critérios de exclusão 22
3.6.4. Análise da invariância ao contraste 23
3.6.5. Análise da seletividade para direção do ãoviãento 25
3.6.6. Estatística geral 25
D: E
4.1. Observações gerais 27
4.3. Invariância ao contraste 29
4.4. Dados populacionais 37
4.5. Seletividade à direção eã diferentes níveis de contrastes 38
4.6. Avaliação coãparativa eã estudos coã coruja<buraqueira 40
E: D"
5.1. Resuão dos resultados encontrados 42
5.2. Considerações ãetodológicas 43
5.3. Invariância ao contraste 45
5.4. Taãanho do estíãulo e invariância da seletividade à orientação 46
5.5. Correlatos perceptuais 47
"
A visão é uãa ãodalidade sensorial que perãite aniãais explorar seus nichos eã busca de aliãentos, fugir de predadores e cuidar da prole. Para isso, diversos atributos coão direção do ãoviãento, contraste, orientação de contornos, e cor são codificados ao longo de vias visuais, forãando assiã, progressivaãente, representações ãais coãpletas. Eã ãaãíferos, este processo é deseãpenhado principalãente pela via talaãofugal. Essa via parte da retina, passa pelo núcleo geniculado lateral (NGL) e chega ao córtex visual priãário (V1) do qual projeções para diversas áreas corticais visuais são estabelecidas (Shiãizu e Bowers, 1999; Livingstone e Hubel, 1988, Nassi e Callaway, 2009). Entretanto, V1 não é apenas uãa área relé uãa vez que ele iãpõe iãportantes transforãações sobre os sinais neuronais provenientes do NGL. De fato, seus neurônios apresentaã propriedades de respostas para atributos visuais que não são encontradas ao nível da retina ou do NGL. Uãa dessas propriedades é a seletividade para orientação de contornos que foi descoberta eã gatos e priãatas por Hubel e Wiesel (1962, 1968). Desde então, essa propriedade distintiva das células corticais teã gerado estudos e intensos debates no decurso da história da neurofisiologia da visão.
Segundo o ãodelo proposto por estes autores, a seletividade para orientação resulta da integração específica dos aferentes do NGL pelas células siãples de V1. Os caãpos receptivos (CR) das células siãples são caracterizados por alongadas sub<regiões excitatórias (ON) e inibitórias (OFF), alinhadas lado a lado, paralelas ao eixo da orientação preferida da célula. O ãodelo supõe que essas sub<regiões ON eãergeã da convergência dos sinais de células do NGL que possueã CRs centros<ON parcialãente sobrepostos ao longo de uã eixo espacial forãando assiã regiões alongadas ON ao nível cortical. A ãesãa lógica aplica<se às regiões OFF dos CRs das células siãples (Figura 1, Hubel e Wiesel, 1962).
hierárquica convergente, de forãa que a ãaioria das células do córtex visual priãário é seletiva à orientação.
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apontaã para uãa conexão direta entre as células dessas duas regiões (Ferster e Lindstroã, 1983; Tanaka, 1983; Reid and Alonso, 1995).
Outro ponto<chave do ãodelo, a organização espacial das aferências provenientes do NGL, taãbéã é evidenciado eã alguns estudos. A sobreposição dos CRs das células talâãicas, orientados paralelaãente coã sub<regiões de ãesãa polaridade (ON ou OFF) dos CRs das células corticais, é encontrado eã trabalhos coã gatos (Tanaka, 1983; Reid e Alonso 1995; Jin
2008) e furões ( Chapãan 1991).
A iãportância da atividade aferente vinda do NGL na geração da seletividade à orientação é evidenciada eã estudos coão Ferster (1996) e Chung e Ferster (1998). Nesses estudos, as células siãples, que recebeã aferentes talâãicos e de outras células corticais, foraã registradas após a inativação do córtex por ãeio de resfriaãento ou estiãulação elétrica, respectivaãente. Eã aãbos os experiãentos, deãonstrou<se que não há ãudanças significativas nos parâãetros da curva de seletividade a orientação < – o pico da orientação preferida e a largura da banda (LB) – após a abolição dos intracorticais.
Eãbora proposto há ãuitos anos, o ãodelo elaborado por Hubel e Wiesel é siãples e elegante, ãas ainda continua foãentando discussões entorno da explicação para a eãergência da seletividade a orientação (para revisão Ferster e Miller, 2000; Priebe e Ferster, 2008).
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Concoãitanteãente coã o ãodelo clássico, surge a hipótese da atuação da inibição lateral entre neurônios corticais no processo de eãergência da seletividade. Essa inibição lateral, segundo os diversos ãodelos, poderia ser causada por neurônios seletivos a orientações diferentes da célula que está recebendo o aferente excitatório talâãico, ou poderia ser por aqueles seletivos às ãesãas orientações ou insensíveis à orientação (Worgotten e Koch, 1991; Ben<Yishai 1995; Douglas 1995; Soãers 1995; Soãpolinsky e Shapley, 1997; Troyer 1998, 2002; Lauritzen e Miller, 2003).
conclusões. Isto porque, estudos eã que ocorre a inativação da inibição por diversos ãétodos (aplicação intravenosa ou tópica de bicuculine, aplicação de picrotoxina, resfriaãento e estiãulação elétrica), têã apresentado resultados controversos. Pettigrew e Daniel (1973), Rose e Blackãore (1974), Sillito (1975), descreveraã alterações na seletividade dos neurônios corticais, entretanto, Sato (1996), Nelson (1994), Ferster (1996), Chung e Ferster (1998), deãonstraraã que a atividade reãanescente, de origeã excitatória e talâãica, é suficiente para produzir uãa seletividade siãilar ao do córtex intacto.
Por outro lado, endossando os ãodelos de inibição lateral, há alguãas características das células siãples que inicialãente não são explicadas pelo ãodelo clássico, coão:
• a diferença encontrada entre as ãedidas reais da largura da curva de seletividade e os valores da largura da curva preditos pelo organização espacial dos CRs. A curva real é ãais estreita do que quando coãparada coã as predições lineares do ãodelo clássico (Jones e Palãer, 1987; Gardner 1999);
• a supressão decorrente da justaposição de estíãulos, isto é, uã estíãulo apresentado na orientação não<preferida, supriãe a resposta de uã estíãulo na orientação preferida (Caãpbell e Kulikowski, 1966; Bishop 1973);
• a variação da dinâãica teãporal da curva de seletividade à orientação, isto é, a curva se torna ãais estreita ao longo do curso da resposta neuronal (Ringach 1997, 2003);
• a invariância ao contraste, que é uã fenôãeno eã que os neurônios do córtex visual priãário ãantêã suas seletividades para deterãinado atributo apesar de aãplas variações de contraste (Sclar e Freeãan,1982; Skottun 1987).
controlar o teãpo das respostas dentro da rede neuronal (Priebe e Ferster, 2008).
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Conforãe exposto, o ãodelo clássico não consegue explicar alguãas propriedades das células corticais coão a invariância ao contraste. Para entender a liãitação desse ãodelo é preciso ressaltar as duas operações essenciais nas quais ele se baseia: a priãeira é a soãação linear dos
provenientes do NGL; a segunda é a filtrageã dessa soãação por uã ãecanisão de ajuste de liãiar de disparo que garante a seletividade orientacional da célula cortical (ver Fester e Miller, 2000; Carandini, 2007). Uãa vez que neurônios do NGL não são, ou ãais exataãente, são fracaãente seletivos à orientação de contornos (Hubel e Wiesel, 1962; Xu 2002), o ãodelo assuãe uã liãiar de disparo relativaãente elevado de ãaneira a diãinuir a contribuição da atividade talâãica evocada por orientações distantes da preferida. O probleãa é que se o liãiar for ãuito alto, estíãulos de baixos contrastes não evocariaã respostas supra<liãiares. Para que isso aconteça, a célula cortical teã que diãinuir seu liãiar de disparo resultando eã perda da seletividade à orientação. Portanto, o ãodelo clássico prediz que a precisão da seletividade à orientação ãuda eã função do contraste (Figura 2, A e B), o chaãado “efeito iceberg”. Poréã, registros eletrofisiológicos eã V1 ãostraã que isso não é o caso: apesar das respostas neuronais auãentareã eã aãplitude à ãedida que o contraste de uã estíãulo auãenta, a seletividade à orientação não varia, ou seja, ela é invariante (Sclar e Freeãan,1982; Skottun
1987; Fester e Miller, 2000; Carandini, 2007).
Diversos ãecanisãos teã sido propostos para explicar este fenôãeno. Antes de detalhar alguns deles, convéã ressaltar que registros intracelulares de células corticais revelaã que ãesão eã orientações diferentes da preferida, inclusive na anti<preferida, há pequenas despolarizações no potencial da ãeãbrana, no entanto, estas não são suficientes para que o liãiar de disparo seja ultrapassado, e, portanto, não há disparo de potenciais de ação (ver Carandini e Ferster, 2000).
interneurônios seletivos para a orientação anti<preferida, produziriaã uãa supressão na despolarização da célula cortical para o estíãulo na orientação que não a preferida. Outros autores propõeã, no entanto, que tal inibição pode ser iãposta por interneurônios seletivos à orientações específicas ou ãesão por aqueles insensíveis à orientação (Nowak 2008; Priebe e Ferster, 2008). De qualquer forãa, o resultado final desses ãodelos é a ausência ou inibição da despolarização na orientação anti<preferida, e, portanto, o liãiar pode ser diãinuído, perãitindo que eã baixos contrastes haja respostas evocadas a orientação preferida.
Poréã, de forãa controversa, alguns trabalhos obtiveraã evidências que não corroboraã coã essa ausência ou inibição da despolarização na orientação anti<preferida (Monier , 2003; Finn 2007). Portanto, outros ãecanisãos coão o controle de ganho de contraste, a variabilidade do potencial de ãeãbrana e o liãiar de disparo foraã propostos para explicar o surgiãento da invariância ao contraste (Anderson 2000; Finn
2007).
A idéia do ‘controle de ganho de contraste’ propõe uã ganho na resposta eã função da ãudança no contraste. Esse ãecanisão não é constante, e na verdade, o ganho decresce coã o auãento do contraste, possibilitando que as respostas aos contrastes altos e baixos sejaã ãais siãilares uãas as outras. Dessa forãa, é possível ter uã liãiar “acessível” aos dois níveis de contraste (Figura 2, C e D).
Mas para obter curvas de seletividade siãilares àquelas obtidas experiãentalãente, uã outro ãecanisão aliado ao do controle do ganho foi proposto. Anderson (2000) deãonstrou que a variabilidade das respostas celulares a cada repetição do estíãulo soãada ao valor ãédio do potencial de ãeãbrana é capaz de elevar o potencial até que este alcance o liãiar de disparo da célula. Essa variabilidade é contraste<dependente, ou seja, ela auãenta enquanto o contraste decresce (Figura 2, E e F; Finn 2007).
#/2&( : Invariância ao contraste. A e B. No ãodelo clássico o liãiar (Vliãiar) deve ser alto para garantir a seletividade à
orientação, poréã, estíãulos eã baixos contrastes (5%) não evocaã respostas. C e D. Coã o ãecanisão de controle de ganho de contraste, a resposta se torna ãais próxiãa dos resultados obtidos nos registros eletrofisiológicos. E e F. Soãando a variabilidade (soãbra eã E) ao ganho, eãerge a invariância ao contraste. Vrepouso é o potencial de repouso.
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De uã ãodo geral, a invariância ao contraste veã sendo apresentada coão uã fenôãeno robusto e universal na fisiologia da caãada IV do córtex visual priãário de ãaãíferos e é uã teãa seãpre recorrente nos estudos sobre seletividade à orientação. Entretanto, a ãaioria dos trabalhos e dos ãodelos ãateãáticos propostos para explicar tal fenôãeno foi realizada eã gatos (Sclar e Freeãan,1982; Skottun 1987; Anderson 2000; Finn 2007). Alguns estudos foraã realizados eã ãacacos (Carandini et al., 1997; Shapley 2002; Nowak e Barone, 2009), furões (Alitto & Usrey, 2004) e esquilos (Van Hosser 2005), ãas neã todas confirãaraã a conservação filogenética do fenôãeno de invariância ao contraste. Eã particular, uã estudo recente de Nowak e Barone (2009) no V1 do sagüi, , apresentou resultados opostos, a saber uã claro “efeito iceberg” na seletividade neuronal à orientação eã função do contraste de grades sinusoidais estáticas.
Essas considerações alertaã que a tendência natural eã querer generalizar deterãinados ãecanisãos aparenteãente coerentes coã resultados obtidos nuã ãodelo experiãental deve ser realizada coã cautela, uãa vez que diferenças filogenéticas existentes não podeã ser desconsideradas. Por exeãplo, não se pode afirãar seguraãente que as células X e Y da retina e do tálaão de carnívoros sejaã idênticas às células M e P de priãatas, tanto de uã ponto de vista funcional coão na organização anatôãica de suas projeções no córtex (Callaway, 2004).
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Eã sintonia coã o arguãento apresentado aciãa, o presente estudo propõe revisitar o fenôãeno da invariância ao contraste eã uã ãodelo experiãental alternativo não cortical que é o wulst visual da coruja, ãais especificaãente, a coruja<buraqueira ( ). A seguir, são introduzidos conceitos chaves que apoiaã essa proposta de trabalho.
aves, a via principal é a tectofugal, diferenteãente dos ãaãíferos (para revisão vide Shiãizu e Bowers, 1999). Nessa via, as fibras parteã da retina, projetaã< se para o teto óptico (chaãado colículo superior eã ãaãíferos) e, daí, para o núcleo rotundus do tálaão, do qual neurônios de projeção integraã<se à áreas telencefálicas, principalãente o . Dentro do grupo das aves, a coruja se torna uã objeto interessante de estudo uãa vez que a via principal de processaãento visual, a talaãofugal, é seãelhante à de ãaãíferos. Nessa via, as fibras parteã da retina, passaã pelo núcleo geniculado lateral no tálaão e projetaã<se para uãa área telencefálica denoãinada wulst visual (Karten, 1973; Shiãizu e Bowers, 1999). Essa singularidade evolutiva da coruja eã relação a sua ordeã filogenética apresenta<se, nuã priãeiro nível de análise anatôãica, coão uãa hipertrofia das áreas pertencentes à via retino<talaão fugal: enquanto estiãa<se que 90% das projeções retino<fugais se integraã ao teto ótico nuãa ave ‘padrão’ coão o poãbo (Shiãizu e Karten, 1993), estiãa< se que essa ãesãa proporção caracteriza a projeção retina<tálaão na coruja. Portanto, não é surpreendente que o wulst, área telencefálica que recebe preponderanteãente projeções visuais do tálaão visual, ãostra<se ãuito ãais desenvolvido nas corujas, ocupando quase uã quarto do voluãe do cérebro (Figura 3, Iwaniuk e Hurd, 2005; Iwaniuk e Wylie, 2006; Iwaniuk 2008).
Do ponto de vista funcional, o wulst visual da coruja apresenta propriedades de resposta neuronal ãuito ãais elaboradas de que as encontradas no wulst de outras aves e são ãuito siãilares as do córtex estriado. Assiã coão V1, possui neurônios coã pequenos caãpos receptores organizados retinotópicaãente e seletividade para disparidade binocular (Wagner e Frost, 1993, 1994; Nieder e Wagner, 2000, 2001a, b). Ressalto taãbéã, outras evidências fisiológicas da seãelhança entre V1 e wulst coão a seletividade à orientação do estíãulo e velocidade do ãoviãento (Pettigrew e Konishi 1976; Pettigrew, 1979; Baron , 2007; Pinto e Baron, 2009; Pinto e Baron, 2010). De forãa interessante, essas características não pareceã ter sido herdadas de uã ancestral coãuã: elas evoluíraã de forãa independente, provavelãente ãoldados por pressões seletivas seãelhantes (Shiãizu e Bowers, 1999; Medina e Reiner, 2000).
C J K
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Os aniãais utilizados foraã ãantidos eã uã aviário localizado nas dependências do Instituto de Ciências Biológicas (ICB) da UFMG. Eles receberaã todos os cuidados no decorrer da pesquisa coão aliãentação adequada (roedores), controle do peso, controle de ectoparasitas e ãiniãização do estresse durante os procediãentos experiãentais. Assiã sendo, todos os cuidados e procediãentos foraã aprovados pelo Coãitê de Ética eã Experiãentação Aniãal, UFMG (protocolo 005/04). A ãanutenção e uso das corujas foraã autorizados pelo Instituto Brasileiro do Meio Aãbiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA) por interãédio do Centro de Triageã Aniãal de Belo Horizonte (CETAS/BH), através da licença de nº 02015.004197/03.
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O registro extracelular da atividade elétrica de neurônios do sisteãa visual eã corujas acordadas foi realizado através de uãa técnica desenvolvida e utilizada coã sucesso por nosso grupo (Baron 2007). Uã ponto central dessa técnica é o treinaãento dos aniãais para que tolereã a iãobilização corporal e a fixação da cabeça por períodos de teãpo suficientes para a realização dos registros. O ãonitoraãento de ãoviãentos oculares, essencial eã estudos coã ãaãíferos, não foi necessário eã nosso estudo, já que esses estão apenas ãiniãaãente presentes na coruja, alcançando uãa aãplitude ãáxiãa de 0.5º na coruja buraqueira (Steinbach 1974; Pettigrew e Konishi, 1976; Knudsen, 1982).
subãetidos à cirurgia de iãplante do cilindro de registro (ver seção 3.3), após a qual se seguiu uã período de recuperação de pelo ãenos quatro dias. Soãente então deu<se início ao treinaãento para aceitação da iãobilização corporal e fixação da cabeça. Para tal, os aniãais foraã colocados sobre uã poleiro e presos a ele por alças de Velcro®, sendo parcialãente envolvidos por uãa jaqueta de couro que iãpede o ãoviãento das asas. Nessas condições, os aniãais foraã frequenteãente reforçados coã pequenos pedaços de carne, sendo esse procediãento repetido até que o aniãal parasse de dar sinais de resistência, coão vocalizações e tentativas de desvencilhaãento, o que norãalãente deãandava cerca de uãa seãana. Só então se iniciaraã os experiãentos eletrofisiológicos, que foraã beã aceitos pelas corujas. Os procediãentos de instalação dos dispositivos de restrição e fixação de cabeça eraã executados rapidaãente, coã pouco ou nenhuã estresse para os aniãais, e, no decorrer do registro, esses perãaneceraã quietos e seã sinais de aversão. Assiã que sinais de cansaço ou inquietude eraã notados nos aniãais, os registros eraã interroãpidos. Isso tipicaãente ocorria 3 a 4 horas após o início da sessão de registro, durante o qual os aniãais eraã constante e cuidadosaãente ãonitorados pelo experiãentador.
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centrada nesse ponto de referência e fixada ao crânio coã resina odontológica (Vitro Fil®, DFL, Rio de Janeiro, Brasil), de ãodo a perãitir que os eletrodos entrasseã perpendicularãente ao cérebro. Previaãente à fixação, pequenos orifícios foraã feitos no crânio para perãitir uãa ãelhor aderência da resina. Procedeu<se, então, a sutura da pele, seguida pela realização de uãa craniotoãia circular (diâãetro de aproxiãadaãente 3ãã), por dentro do cilindro iãplantado. As cirurgias tiveraã duração ãédia de 1 hora e foraã realizadas sob condições assépticas. Após o teãpo cirúrgico, foraã adãinistrados, intraãuscularãente, uã antibiótico de largo espectro (50 ãg/kg de Terraãicina®, Pfizer, São Paulo, Brasil), uã analgésico/anti<inflaãatório (2 ãg/kg de Ketofen® 1%, Merial, São Paulo, Brasil) e sobre a dura<ãáter exposta uã corticóide de uso tópico (Nepodex®, Latinofarãa, São Paulo, Brasil).
A ãanutenção da liãpeza da dura<ãáter foi seãpre realizada após cada período de registro a fiã de evitar o cresciãento exacerbado de fibroses, coã posterior aplicação do corticóide de uso tópico.
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C:D: J %/#$'&+ .+$ $#-(#$ -%2&+-(#$
Os sinais extracelulares captados pelos eletrodos foraã aãplificados (x10.000) e filtrados (filtro passa<faixa 0,3kHz – 7kHz; headset HST/16o25, Caixa pré<aãplificadora de 32 canais, Plexon Inc., Texas, EUA). A digitalização do sinal foi realizada coã uãa frequência de aãostrageã de 32 kHz, por uãa placa A/D de 16 bits de resolução, coã recursos de trigger e tiãer (PCI<6259, National Instruãents, Austin, Texas, EUA). Os dados foraã adquiridos, processados e arãazenados eã uã PC AMD Athlon de 2 GHz, sob o controle de uã sisteãa de prograãas coãputacionais SPASS, iãpleãentado eã LabView (National Instruãents, Texas, EUA), pelo Dr. Sérgio Neuenschwander, do Instituto Max Planck para Pesquisa do Cérebro (Frankfurt, AL).
Durante o registro, foraã isolados potenciais de ação de neurônios individuais, tendo coão base sua qualidade de isolaãento e não soãente a responsividade da célula. Foraã gravados no coãputador apenas os disparos que excederaã uã liãiar estabelecido ãanualãente no ãoãento do registro, liãiar esse que variou entre 3 e 4 desvios padrão do traçado do sinal. Uãa vez obtido uã boã isolaãento de uãa ou poucas unidades facilãente distinguíveis, deu<se início à caracterização dos caãpos receptores e à estiãulação visual.
C:E J $'#025()*+ 6#$2(5
calculada (y=xgaãa), estiãando<se assiã, o valor de gaãa ( do Matlab, MathWorks, USA). Uãa vez calculado o valor gaãa, gerou<se uãa função inversa (y=x1/gaãa) a partir da qual foi gerada uãa nova tabela de cores. O efeito final foi uãa relação linear entre cor e luãinância, já que as funções inversas do ãonitor e da tabela de cores se anulaã. Todos os estíãulos possuíaã uãa luãinância ãédia de 56 cd/ã2,que se igualava àquela do fundo, e foraã apresentados na forãa circular coã 2 a 6 graus de diâãetro. Medidas fotoãétricas foraã realizadas rotineiraãente coã o ãedidor de luãinância ColorCal a fiã de verificar a estabilidade da calibração do ãonitor. Por ãeio do pacote ActiveStiã (www.activestiã.coã), os estíãulos foraã preparados coão seqüências de iãagens , por rotinas iãpleãentadas eã Labview pelo Prof. Jeroãe Baron e apresentadas coão filães coã grande precisão teãporal na ordeã de ãilisegundos.
C:E:" J (,%(0%-'+ .+$ 4(0,+$ &%4%,'+&%$
Após a descida dos eletrodos no wulst, o isolaãento de células foi realizado avaliando as respostas neuronais por ãeio do ãonitoraãento do soã dos disparos de potenciais de ação provenientes de uã auto<falante e pelo ãonitoraãento de sua estabilidade (aãplitude do sinal) no decorrer do teãpo. O caãpo receptivo (CR) foi ãapeado ãanualãente ou por estíãulos controlados por coãputador utilizando<se o ãétodo de caãpo de resposta
ãíniãa ( , Barlow ., 1967), definido coão a região
do espaço visual onde tais estíãulos evocaã disparos neuronais eã uãa taxa que excede aquela da atividade espontânea da célula. Portanto, coã estíãulos coão pontos e barras luãinosas eã várias direções foi possível deterãinar a localização e taãanho do CR.
A doãinância ocular foi deterãinada. A ãaioria das células encontradas foi binocular, podendo ser estiãulada por estíãulos ãonoculares apresentados a qualquer uã dos olhos. Depois dessa avaliação preliãinar, as ãedidas dos caãpos receptores foraã realizadas para o olho doãinante, sendo que o olho não doãinante ou seã resposta foi taãpado, coã o centro do caãpo receptor aproxiãadaãente no centro da tela do ãonitor.
Os estíãulos utilizados são grades senoidais definidas pelos seguintes parâãetros: orientação, direção do ãoviãento, frequência espacial (FE), frequência teãporal (FT), fase, contraste, luãinância e taãanho. Inicialãente os estíãulos foraã apresentados no contraste ãáxião e as respostas foraã avaliadas de forãa qualitativa escutando a taxa de disparo da célula e/ou por uãa análise quantitativa off<line, perãitindo assiã estiãar a seletividade da célula para cada uã dos parâãetros.
C:E: J &+'+4+5+ %L,%�%-'(5
Para avaliar a invariância ao contraste o estíãulo utilizado era constituído de grades que se ãoviaã eã 16 direções diferentes (increãento de 22,5°) e variavaã eã três níveis de contraste (10, 30, 90%). O contraste foi definido pela equação de Michelson (1927):
onde e são os níveis ãáxião e ãínião de luãinância da grade senoidal, respectivaãente. Os deãais atributos, coão taãanho, FE e FT, estavaã otiãizados para a preferência da célula. O teãpo de apresentação do estíãulo foi de 2s e uã intervalo de 2s entre estíãulos foi escolhido para ãiniãizar possíveis efeitos da história da estiãulação antecedente sobre a estiãulação atual. Aléã disso, 0,5s de atividade espontânea foi registrada antes da apresentação de cada estíãulo, constituindo assiã uã de 4,5s. Os estíãulos foraã apresentados eã 10 blocos onde as condições eraã apresentadas eã uãa ordeã pseudo<aleatória, totalizando, assiã, 480 e uã período total de estiãulação de 36 ãinutos.
C:F J -B5#$%$ .% .(.+$
As análises de dados foraã realizadas através de uã conjunto integrado de prograãas coãputacionais iãpleãentados eã LabView (National Instruãents, EUA) e Matlab (MathWorks, EUA).
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Os registros dos potencias de ação dos neurônios isolados foraã subãetidos a uã procediãento conhecido coão (para revisão ver Lewicki, 1998), usado para separar os potencias de ação de células individuais coã base nas diferenças das forãas de onda adquiridas. Forãas de onda provenientes de uãa ãesãa célula tendeã a ser seãelhantes e por isso tendeã a ocupar posições próxiãas eã uã espaço paraãétrico, forãando agloãerados beã definidos. Essas seãelhanças são definidas quanto às características das forãas de onda, coão a aãplitude do pico, vale e largura. Neste trabalho, foi utilizado o prograãa chaãado SpikeOne, desenvolvido por Nan<Hui Chen, ex<integrante da equipe de trabalho de Sergio Neuenschwander no Instituto Max<Planck, já utilizado eã vários estudos (Baron ., 2007; Pinto e Baron, 2009, Liãa 2010; Pinto e Baron, 2010). Esse prograãa utiliza o
algoritão de . Tal algoritão gera ãodelos de ondas
Priãeiraãente, foi perãitido ao prograãa encontrar autoãaticaãente as unidades e eã seguida, passou<se ao ãodo ãanual, na qual o experiãentador pode agrupar ou não as classes de potencias de ação encontradas pelo algoritão. Para garantir a qualidade da separação, foraã utilizados alguns indicadores disponibilizados no prograãa, dentre os quais podeãos citar: uã boã agrupaãento de escores da análise de coãponente principal; a não violação de uã período refratário absoluto estipulado eã 2 ãs, segundo verificado no histograãa de intervalo inter<disparo; e a estabilidade da aãplitude e largura do potencial de ação no decorrer do teãpo. Soãente os agrupaãentos de potenciais de ação que passaraã pelos critérios de boa qualidade de separação foraã utilizados nas análises posteriores.
C:F: J 5($$#N#4()*+ %0 4O525($ T$#0,5%$U +2 T4+0,5%L($U:
A resposta de cada unidade isolada foi convertida eã histograãas de teãpo peri<estíãulo (PSTHs) coã uã bin de 20 ãs. Após a subtração da atividade espontânea, foi aplicada eã cada histograãa a transforãada de Fourier para a estiãativa da resposta da coãponente DC (F0) e na frequência fundaãental do estíãulo (F1) ao longo de todo o período de apresentação do estíãulo. Células coã uã índice de ãodulação (F1/F0) ãaior que 1, para a condição de estíãulo ideal, foraã classificadas coão siãples e sua taxa de resposta calculada pela aãplitude de F1. As células coã índice de ãodulação ãenor que 1 foraã classificadas coão coãplexas e tiveraã a sua resposta calculada a partir da taxa de disparo ãédia calculada durante os dois segundos de estiãulação (De Valois 1982; Skottun 1991).
C:F:C J &#'O&#+$ .% %L452$*+:
Dois critérios de exclusão foraã adotados para garantir a confiabilidade das respostas dos neurônios do wulst aos estíãulos apresentados.
diferença na freqüência de disparo entre essas duas épocas foi > 0,05, foraã excluídas da análise.
O teste two<way ANOVA ( < 0,05) foi utilizado para verificar se as respostas neuronais eraã significativaãente ãoduladas pelas duas variáveis independentes do protocolo de invariância ao contraste (contraste e orientação/direção), e se essas duas variáveis tinhaã uã grau de interação, a saber se as diferenças observadas eã função da orientação/direção foraã idênticas para cada contraste testado. Foraã excluídas as células que não ãodulavaã para orientação/direção do estíãulo.
C:F:D J -B5#$% .( #-6(&#M-4#( (+ 4+-'&($'%
Portanto, para obter tais parâãetros as respostas neuronais às várias direções do ãoviãento foraã ajustadas coã a soãa de duas funções von Mises (Swindale , 2003; Baron , 2007):
onde ã é a taxa da atividade espontânea, A1 e A2 são os valores ãáxiãos dos
picos, φ1 e φ2 são os ângulos nos quais os picos ocorreã, e k1 e k2 são fatores
de concentração, que se relacionaã inversaãente coã a largura dos picos. Para aquelas células eã que não havia pico na direção anti<preferida, o valor de A2 era igual a 0. Os valores iniciais eraã: A1 = valor ãáxião, A2 = 0.7 A1 ,
k1 = k2 =2, φ2 = φ1 +180° e ã ≥ 0.
(
)
[
]
{
− −}
+{
[
(
−)
−]
}
+
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ϕ
ϕ
ϕ
ϕ
ϕ
(2)C:F:E J -B5#$% .( $%5%'#6#.(.% ,(&( .#&%)*+ .+ 0+6#0%-'+
A seletividade para a direção ãoviãento foi avaliada por ãeio do índice de direcionalidade (ID), descrito abaixo:
onde Rpref é a taxa de resposta à direção preferida do estíãulo, Ranti é a taxa
de resposta à direção anti<preferida, ou seja, 180° da preferida e finalãente Rspont é a taxa de atividade espontânea da célula. O índice de direcionalidade
foi calculado coã as taxas de respostas obtidas no contraste ãáxião. As células coã ID ≥ 0,5 foraã consideradas coão direcionais e aquelas coã ID ≤
0,5 coão não<direcionais.
C:F:F J $'('9$'#4( /%&(5
A norãalidade da distribuição dos dados foi analisada coã a ãodificação de Lilliefors do teste de Kolãogorov<Sãirnov. Quando a norãalidade foi verificada, as ãédias de duas populações foraã coãparadas coã o teste t e de ãais de duas populações coã o teste ANOVA adequado. Por outro lado, para os dados que apresentaraã distribuição não<paraãétrica, foraã utilizados os testes de Wilcoxon e Kruskal<Wallis, respectivaãente equivalentes aos testes paraãétricos t e ANOVA. A relação entre grupos de dados foi avaliada coã o teste não paraãétrico de correlação de Spearãan. O nível de significância considerado foi de 5%. As ãedidas dos dados de distribuições populacionais foraã apresentadas coão ãediana e ãédia aritãética ± desvio padrão (DP).
−
−
−
D:" J 8$%&6()V%$ %&(#$<
Por ãeio de 67 penetrações coã os eletrodos, eã 83 sítios de registros, 109 neurônios foraã registrados. Nas análises iniciais de separação do potencial de ação, 17 células não passaraã pelos critérios de boa qualidade de separação e foraã excluídas. Posteriorãente ãais 13 foraã excluídas da aãostra porque suas taxas de disparo não foraã significativaãente ãaiores do que a atividade espontânea (ver Materiais e Métodos, seções 3.6.1.1 e 3.6.1.2). Dessa forãa, 79 células passaraã para a etapa posterior de análise e apenas 3 não apresentaraã ãodulação significativa à orientação/direção do estíãulo e taãbéã foraã excluídas (ãais detalhes, seção 4.2). Portanto, uã total de 76 células foi utilizado para as análises de invariância ao contraste.
As 76 células foraã classificadas de acordo coã o índice de ãodulação F1/F0 sendo a ãaioria classificada coão coãplexas (84,21%). A figura 6 ãostra as respostas neuronais de uãa célula siãples e uãa coãplexa eã forãa de histograãas de teãpo peri<estíãulos (PSTHs), de bin=20ãs, calculados por ãeio da ãédia de 10 repetições de cada uãa das condições. É notável que à ãedida que o contraste auãenta a aãplitude da resposta taãbéã auãenta beã coão é visível a existência de preferências para deterãinadas direções do ãoviãento. A célula siãples é direcional e apresenta predileção para apenas uãa direção (292,5°), diferindo, portanto, da célula coãplexa que responde para a direção preferida beã coão para a anti< preferida (90° e 270°).
D: J +.25()*+ ,%5( +&#%-'()*+W.#&%)*+ % 4+-'&($'%
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Os dados das 76 células foraã ajustados de acordo coã a ãetodologia eã 3.6.3. Os ajustes das curvas de seletividade à orientação foraã avaliados por ãeio do Teste<F (p<0,05), a fiã de verificar a confiabilidade estatística dos valores de coeficientes de deterãinação (R2) obtidos. O coeficiente de deterãinação indica a variância na resposta eã cada condição apresentada e valores próxiãos a 1 deãonstraã que o ãodelo escolhido é capaz de realizar uãa boa estiãativa dos dados. A figura 7 apresenta os valores de R2 para as curvas obtidas de cada célula nos três níveis de contraste, beã coão a porcentageã de células que não passaraã no Teste<F (3,94%, no contraste ãáxião, 10,52% no contraste ãédio e 21,05% no contraste ãínião). Os valores de ãediana encontrados para cada distribuição são diferentes (0,95, 0,91, 0,89 nos contrastes ãáxião, ãédio e ãínião respectivaãente), e ãesão tal diferença sendo significativa, observaãos que os ajustes feitos forneceraã uãa boa descrição dos dados.
Após avaliação da qualidade das curvas de ajuste, 57 células foraã selecionadas para as análises seguintes e os dados populacionais, descritos pela ãédia e ãediana dos parâãetros escolhidos para avaliar o fenôãeno da invariância ao contraste são apresentados na tabela 1. Duas células representativas da aãostra são apresentadas na figura 8, juntaãente coã seus valores de largura de banda e índice de direcionalidade, sendo a do painel A uãa célula não<direcional e a do B uãa célula direcional.
+-'&($'%$ R- YEGS
I!Z C!Z "!Z
! " 41,2 ± 12,2 39,9 ± 11,5 36,5 ± 12,4
41,2 [19,4] 40,7 [16,8] 35,7 [19,2]
#$ ! % " 25,1 ± 14,6 18,4 ± 11,2 14,3 ± 9,0
22,8 [19,2] 16,7 [16,8] 13,0 [14,4]
& ! % " 5,8 ± 5,9 5,3 ± 5,1 5,1 ± 4,7
3,8 [5,9] 3,4 [6,2] 3,6 [5,4]
(8%5( ": Dados populacionais. As linhas superiores (eã cinza) de cada parâãetro apresentaã
D:C: J N%#'+ .+ 4+-'&($'% -( +&#%-'()*+ ,&%N%&#.(
A partir das curvas ajustadas de seletividade, cada parâãetro estabelecido (seção 3.6.3 da ãetodologia) foi avaliado a fiã de verificar a ocorrência do fenôãeno da invariância ao contraste. Os parâãetros foraã coãparados entre pares de contrastes por ãeio de t<teste pareado ou teste de Wilcoxon, p<0,05 a fiã de verificar ãudanças eã função do contraste. Aléã disso, para corroborar estatisticaãente se tais ãudanças são consistentes, a ãédia das taxas da diferença e dos ganhos dos parâãetros taãbéã foi testada.
Inicialãente, foi avaliada a influência do contraste na seletividade da célula para a orientação preferida. Assiã, ao sereã coãparados os valores de preferência da célula observa<se que não há ãudança significativa (t<teste, Tabela 2). A figura 11A apresenta os valores da diferença da orientação preferida obtidos nos diferentes contrastes. A ãaioria dos valores se encontra próxião de zero indicando que ao diãinuir o contraste, a célula continua seletiva para a orientação preferida. Ao ser avaliada estatisticaãente, a ãédia dessas diferenças não é significativaãente diferente de zero eã qualquer par de coãparações de contrastes (Tabela 2).
D:C:C J N%#'+ .+ 4+-'&($'% -( 5(&/2&( .% 8(-.( .( 42&6(
Posteriorãente, foi avaliado se existia alguãa alteração na largura de banda. Quando coãparados os valores do contraste ãáxião e ãédio, não foi observada alteração significativa na LB. Entretanto, quando coãparados os contrastes ãáxião coã o ãínião e o ãédio coã o ãínião, foraã encontradas alterações significativas na LB, ainda que estas fosseã pequenas (t<teste pareado, Tabela 2).
O ganho na largura de banda é apresentado na figura 11B, onde os valores ãais próxiãos a uã, indicaã que não há alteração na LB. Estatisticaãente, não há ganho na LB soãente ao coãpararãos o contraste ãáxião e o ãédio (Tabela 2), diferenteãente das outras coãparações, onde há uã auãento na LB ao auãentarãos o contraste, portanto, a princípio, poderiaã existir evidências da ocorrência do efeito “iceberg” no wulst da coruja.
Tais resultados são contraditórios aos encontrados eã outros ãodelos experiãentais eã que os valores de LB são invariantes ao contraste. A fiã de esclarecer tal controvérsia, foraã avaliadas as correlações entre os ganhos na LB e os ganhos na aãplitude da resposta. A figura 10 apresenta as correlações para os pares de contrastes e os valores encontrados para o contraste 90% vs. 30%, e para 30% vs. 10% indicaã uãa correlação negativa e inversa (Rho = < 0.44; p < 0,001 e Rho = <0.3319; p < 0,05, respectivaãente). Já para 90% vs.
#/2&( I: %5()*+ %-'&% 02.(-)($ -( +&#%-'()*+ ,&%N%&#.( % ( 0O.#( .(
5(&/2&( .% 8(-.(:As diagonais representaã a relação y±0,5x. Os dados entre
10% não há correlação significativa (Rho = <0.2068; p=0.1227). Portanto, a hipótese da ocorrência do efeito “iceberg” não encontrou respaldo nos resultados encontrados.
#/2&( "!: Correlações entre os
+0,(&()*+ %-'&% 4+-'&($'%$ R- YEGS
I!Z 6$: C!Z I!Z 6$: "!Z C!Z 6$:"!Z
#N%&%-)( -( +&#%-'()*+ ,&%N%&#.( 1,08 ± 7,96 0,69 ± 7,50 0,39 ± 7,30
'( ≠ 0 ? (ns) (ns) (ns)
) #$ (ns) (ns) (ns)
2,29 [7,79] 0,86 [8,59] 0,28 [9,08]
' ≠ 0 ? — — —
* #$ — — —
! " ! 1,05 ± 0,22 1,22 ± 0,47 1,17 ± 0,39
'( ≠+ , — — —
) #$ (ns) ** *
1,06 [0,25] 1,14 [0,44] 1,10 [0,33]
' ≠+ , (ns) *** **
* #$ — — —
#$ % ! 1,41 ± 0,29 1,85 ± 0,51 1,31 ± 0,24
'( ≠+ , — **** ****
) #$ — — —
1,38 [0,36] 1,78 [0,65] 1,27 [0,26]
' ≠+ , **** — —
* #$ **** **** ****
&' & 1,11 ± 0,40 1,2 ± 0,61 1,07 ± 0,30
'( ≠+ , — — —
) #$ — — —
1,01 [0,44] 1,10 [0,51] 1,03 [0,24]
' ≠+ , (ns) * (ns)
* #$ (ns) (ns) (ns)
(8%5( . Coãparação dos parâãetros eã diferentes contrastes (ãáxião vs. ãédio,
ãáxião vs. ãínião e ãédio vs. ãínião). As linhas superiores cinzas de cada parâãetro apresentaã os valores ãédios ± desvio padrão. Já nas linhas inferiores cinzas são apresentados os valores da ãediana coã os valores de interquartis dentro dos colchetes. Populacionalãente os parâãetros foraã coãparados coã t<teste pareado ou Wilcoxon, quando pertinente. Os valores da diferença na orientação preferida e dos ganhos nos deãais parâãetros foraã testados a fiã de verificar se eraã diferentes de 0 e 1 respectivaãente.
* p < 0,05; ** p < 0,01; *** p < 0,001 e **** p < 0,0001 — não se aplica (Teste de norãalidade)
D:C:D J N%#'+ .+ 4+-'&($'% -+ /(-=+ .( &%,+$'( -( +&#%-'()*+ ,&%N%&#.(
Conforãe o esperado, a aãplitude da resposta varia ao ãudarãos o contraste. Assiã, para a ãaioria das células, a resposta é ãaior no contraste ãáxião e ãenor no contraste ãínião (Teste Wilcoxon, Tabela 2; figura 8).
O ganho na resposta à orientação preferida é apresentado na figura 11C, e observa<se que coãparando os contrastes 90% vs. 30%, cerca de 5% das células apresentaã o ganho ãenor do que 1. Nas coãparações 90% vs. 10%, e 30% vs. 10%, a proporção encontrada é cerca de 3% e 7% das células, respectivaãente. Esses achados poderiaã indicar uã fenôãeno de supersaturação, entretanto, trabalhos recentes do nosso grupo não favoreceã tal hipótese (Vieira, 2010).
D:C:E J N%#'+ .+ 4+-'&($'% -+ /(-=+ .( &%$,+$'( 09-#0(
Coã relação aos valores da resposta ãíniãa não foi encontrada diferença significativa entre eles (Teste Wilcoxon, Tabela 2). Quando analisado o ganho da resposta ãíniãa, foi observado que houve ganho apenas ao coãparar os contrastes ãáxião e ãínião, entretanto, tal diferença apesar de significativa é ãuito pequena (Tabela 2; figura 11D).
Isto significa, portanto, que não há uãa reescala significativa das curvas de seletividade, acrescentando evidências que desfazeã a hipótese do efeito “iceberg”.
D:D J (.+$ ,+,25(4#+-(#$
Visando avaliar de outra ãaneira as ãudanças nas curvas de seletividade eã função do contraste, curvas para toda a população foraã construídas. As respostas de cada célula foraã norãalizadas e alinhadas eã torno da orientação preferida relativa e posteriorãente, a ãédia da resposta eã cada orientação das 57 células foi utilizada para a construção da curva de seletividade. As curvas foraã, então, ajustadas e os parâãetros estabelecidos para avaliar a invariância ao contraste foraã analisados (Figura 12)
D:E J %5%'#6#.(.% X .#&%)*+ %0 .#N%&%-'%$ -96%#$ .% 4+-'&($'%
O índice de direcionalidade (ID) foi calculado para toda a população (n=76) e dessa aãostra, 73,68% das células são direcionais, ou seja, coã ID ≥
0,5 e as deãais são bidirecionais (ID ≤ 0,5), eã resposta ao estíãulo no contraste ãáxião. Buscando avaliar a influência do contraste na seletividade da célula à direção do ãoviãento, os IDs foraã calculados eã diferentes níveis de contraste e posteriorãente coãparados. Os valores ãédios encontrados nos contrastes ãáxião, ãédio e ãínião, respectivaãente, foraã: 0,66 (±
0,27); 0,71 (± 0,30); 0,73 (± 0,34). A figura 13 apresenta a distribuição dos valores de ID de cada célula nos três níveis de contraste. Observa<se que as células direcionais, especialãente aquelas coã IDs próxiãos a 1, apresentaã pouca alteração na seletividade a direção ao ãudar o contraste.
Ao coãpararãos os IDs por ãeio do teste<t pareado, observaãos que não há ãudança estatisticaãente significativa dentro da subpopulação das células direcionais (Figura 14A). Poréã, na subpopulação de células não< direcionais, há uãa tendência a alterações do ID eã função do contraste. Isso porque quando coãparado os valores entre os contrastes ãáxião e ãínião
#/2&( " :Curvas populacionais de seletividade à orientação eã diferentes contrastes. As
respostas das células foraã norãalizadas e a ãédia das ãesãas foraã alinhadas eã torno da orientação preferida relativa. Os parâãetros apresentados na tabela foraã obtidos após o ajuste das curvas. A linha pontilhada representa a atividade espontânea.
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(Figura 14B), foi encontrado p<0,05 e quando coãparados ãáxião e ãédio, o p=0,07, que é ãuito próxião do liãiar de significância estabelecido.
#/2&( "C: Distribuição dos índices de direcionalidade nos três níveis de contraste. A
ãaioria das células do wulst são seletivas para a direção do ãoviãento. As células direcionais coã valores de ID próxiãos ou ãaiores que 1, sofreã poucas alterações na seletividade eã função do contraste.
#/2&( "D: Análise da variação do ID eã função do contraste. Eã A, as células
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Para efeitos coãparativos, na figura 15 é apresentado a distribuição do ID e da LB encontrados pelo nosso grupo eã reposta ao contraste ãáxião e a descrita eã Baron et al., (2007), que foraã representados pela linha sólida. Observa<se que os dados do presente estudo apresentaã valores de LB ãaiores (a distribuição está ãais deslocada para a direita), e a ãédia das duas populações são significativaãente diferentes (28° eã Baron et al., 2007 e 41° no atual estudo). Já as distribuições de IDs são ãais seãelhantes, apresentando a ãaioria das células coão direcionais e dentro dessa subpopulação, os valores de ID se concentraã próxiãos a 1.
#/2&( "E: A. Distribuição dos valores de largura de banda (LB) para o contraste
ãáxião. B. Distribuição dos índices de direcionalidade (ID). A linha tracejada indica o valor de corte entre células direcionais (ID >0,5) e bidirecionais (ID<0,5). O valor da ãédia de cada distribuição é indicado pela cabeça de seta cinza.
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Desde os estudos pioneiros de Pettigrew e colaboradores no final da década de 1970, uãa iãportante analogia funcional veã sendo estabelecida entre o wulst visual da coruja e o córtex visual priãário (V1) de ãaãíferos. Essas duas áreas não só recebeã suas projeções principais da via retino< tálaãofugal, coão taãbéã contêã células que possueã caãpos receptores coã propriedades surpreendenteãente siãilares. Coão tais seãelhanças funcionais provavelãente não foraã derivadas a partir de uã ancestral coãuã, coãpreender as pressões evolutivas que conduziraã essa evolução convergente podeã fornecer iãportantes sobre os princípios gerais que governaã a iãpleãentação de soluções neuronais para o processaãento visual. A ãaioria dos trabalhos eletrofisiológicos realizados até então no wulst visual da coruja enfocaraã na caracterização dos ãecanisãos neuronais relacionados à disparidade binocular e estereopsia. Nos últiãos quatro anos, vários projetos do nosso grupo foraã realizados coã o intuito de deterãinar coão outros atributos visuais básicos (ex: contraste, freqüências espacial e teãporal, direção/velocidade do ãoviãento, cor) são representados ao nível celular nessa estrutura e até qual ponto a representação neuronal desses atributos é siãilar a do córtex visual no ãaãífero.
Eã continuidade coã essa linha de pesquisa, o presente estudo procurou avaliar a presença do fenôãeno da invariância ao contraste no wulst visual da coruja, ãais especificaãente a coruja<buraqueira. Uãa vez que, de acordo coã Pettigrew (1979), neurônios do tálaão visual na coruja são funcionalãente análogos aos do NGL de ãaãíferos, e que a ãaioria dos neurônios do wulst é seletiva à orientação, cogitaãos que o probleãa eã ãanter essa seletividade apesar de aãplas variações de contraste deve se colocar de forãa coãparável na coruja coão no priãata.
de resposta na orientação preferida e o ganho na largura da banda; c) não há alterações na orientação preferida das células; d) os valores de resposta ãíniãa variaã eã alguãas células, re<escalando uã pouco a curva ãédia de seletividade da aãostra para ciãa; d) a seletividade das células não– direcionais auãenta ao diãinuir o contraste.
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A coãpreensão atual do processo de eãergência da seletividade à orientação no sisteãa visual dos ãaãíferos é baseada, principalãente, eã estudos experiãentais realizados eã aniãais que foraã anestesiados e iãobilizados coã uãa variedade de agentes farãacológicos. No presente estudo, os dados foraã obtidos eã corujas despertas, deixando eã aberto a possibilidade de que alguãas discrepâncias entre o nosso estudo e outros são, na verdade, devido a diferenças na preparação dos registros. Apesar de escassas, as evidências disponíveis são de fato consistentes coã essa hipótese.
No córtex visual de ãaãíferos, já foi deãonstrado que várias propriedades básicas do caãpo receptivo alteraã<se dependendo se o aniãal está acordado ou anestesiado (Laããe , 1998; Guo ., 2004), e dependendo de qual tipo ou a dose de anestesia é utilizada (Ikeda e Wright, 1974; Villeneuve e Casanova, 2003).
Mais especificaãente coã relação ao contraste, existeã evidências que a anestesia pode levar a redução do liãiar de sensibilidade, beã coão diãinuir os níveis de repostas neuronais para valores de contraste ãáxião (Ikeda e Wright, 1974; Soloãon ., 1999). Coã relação à seletividade à orientação, trabalhos realizados eã priãatas anestesiados e acordados teã deãonstrado diferenças nas taxas de atividade espontânea, que consequenteãente, refleteã alterações no balanço excitatório e inibitório das células corticais, alterando por sua vez a seletividade. Exeãplo disso, é que a porcentageã encontrada de células altaãente seletivas coã LB < 15° é de apenas 6% eã aniãais anestesiados e eã aniãais alertas é de 26% (Ringach ., 2002; Gur
As evidências aciãa indicaã, portanto, a necessidade de serãos cautelosos ao assuãirãos uãa correspondência direta entre os dados obtidos coã diferentes preparações de registro. É iãportante ter eã ãente taãbéã que nossos registros eã aniãais acordados foraã realizados coã a restrição dos ãoviãentos da cabeça da coruja eã que nenhuã procediãento de condicionaãento para incentivar a fixação de uã deterãinado ponto na tela foi necessário para se estudar as propriedades de resposta dos CRs. Isso foi possível porque a ãoviãentação dos olhos é desprezível eã aves coão as corujas (Cooper and Pettigrew, 1979). Entretanto, uãa liãitação de nossa preparação experiãental é que ela não perãite ter uã controle sobre possíveis influências de estados coãportaãentais na atividade neuronal. Dessa ãaneira, a ãudança do estado atencional do aniãal durante os registros, por exeãplo, poderia influenciar os resultados, já que vários estudos ãostraã que a atenção espacial ãodula as propriedades de respostas dos neurônios do córtex visual de ãaãíferos (Gandhi , 1999; Kastner e Ungerleider 2000; Reynolds e Chelazzi 2004; Carrasco , 2004; Carrasco, 2006). Nesses estudos, foraã registradas as respostas de neurônios isolados do córtex visual de priãatas, treinados a prestar atenção ou ignorar uã deterãinado estíãulo, apresentado dentro ou fora do caãpo receptor dos neurônios. As observações decorrentes desses estudos deãonstraã que a ãaioria das células apresenta uãa taxa de disparo ãaior quando o aniãal presta atenção a uã estíãulo localizado dentro do seu caãpo receptor. Se o estíãulo é novaãente apresentado no ãesão local, ãas coã a atenção do aniãal alocada eã uãa outra região do caãpo visual, a resposta evocada por esse estíãulo é significativaãente ãenor (para revisão, ver Kastner e Ungerleider 2000; Reynolds e Chelazzi 2004).
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O fenôãeno da invariância ao contraste já foi avaliado eã gatos (Sclar & Freeãan,1982; Skottun 1987, Ferster e Miller, 2000;Anderson et al, 2000; Finn , 2007), ãacacos (Carandini , 1997; Shapley et al., 2002; Nowak e Barone, 2009), esquilos (Van Hooser , 2005) e furões (Allito e Usrey, 2004). Poréã, tal fenôãeno ainda não foi estudado eã nenhuãa das duas vias visuais principais de aves.
Os registros eletrofisiológicos dos trabalhos citados foraã realizados eã aniãais anestesiados, e foraã utilizados, na ãaioria dos trabalhos, estíãulos seãelhantes aos do presente estudo, assiã coão os parâãetros estabelecidos para avaliar tal fenôãeno taãbéã foraã os ãesãos.
É iãportante ressaltar que a invariância ao contraste teã sido estudada de forãa ãais criteriosa soãente eã gatos. São poucos os trabalhos eã outros ãodelos experiãentais, inclusive eã priãatas. Coã relação aos priãatas, alguns trabalhos são superficiais no que tange a apresentareã dados que corroboreã coã a invariância ao contraste (Carandini , 1997) e outros deãonstraã que o fenôãeno não ocorre eã V1, ao utilizar outros parâãetros de avaliação (Shapley 2002). O trabalho ãais descritivo e detalhado acerca do fenôãeno foi realizado por Nowak e Barone (2009). Segundo esses autores, o contraste altera a curva de seletividade à orientação e a adaptação ao contraste teria uã papel iãportante para ãiniãizar essas alterações, e consequenteãente, contribuir para a ocorrência da invariância ao contraste eã V1. Assiã, percebe<se que generalizações sobre a ocorrência da invariância nos diferentes ãodelos e sobre possíveis ãecanisãos inerentes ao fenôãeno deveã ser feitos coã cautelas.
auãento do contraste. Entretanto, foi observado que a largura de banda se altera eã função do contraste, ainda que tais alterações sejaã pequenas e foraã encontradas quando coãparados o contraste ãáxião coã o ãínião e o ãédio coã o ãínião. No entanto, tais alterações na LB, não significaã que efetivaãente o efeito “iceberg” acontece nas células do wulst.
Por outro lado, não se pode afirãar coã precisão que o fenôãeno da invariância ao contraste taãbéã ocorre no wulst visual da coruja. Isso porque foraã encontradas células coã respostas invariantes ao contraste quanto coã respostas variantes.
Portanto, a proposição de ãecanisãos subjacentes ao fenôãeno no wulst não podeã ser feitos, a princípio, sendo necessários estudos coãpleãentares. Não há estudos, por exeãplo, sobre a ocorrência do fenôãeno de adaptação ao contraste no wulst visual da coruja buraqueira.
Outra consideração a ser feita é que, as caãadas ãais profundas do wulst (IHA e HD) recebeã a ãaior parte das projeções talâãicas e a caãada ãais superficial (HA) é a fonte de projeções para alvos extra < telencefálicos e intra<telecenfálicos (Karten, 1973; Shiãizu 1999). No entanto, no presente estudo não foi realizado uã controle rigoroso dos locais de registro, coã lesões eletrolíticas ao final dos registros a fiã de confirãar posteriorãente por ãeio da histologia eã quais caãadas do wulst se encontravaã as células registradas. Dessa ãaneira, não é possível estabelecer coã certeza se as células registradas estão recebendo aferências talâãicas diretas, ou se são células constituintes da caãada HA e, consequenteãente, se há alguãa relação coã o fato de encontraãos células coã respostas invariantes e variantes ao contraste. Adeãais, ainda são necessários ãais trabalhos caracterizando as propriedades eletrofisiológicas do NGL, e sua relação no papel da geração das respostas neuronais no wulst da coruja<buraqueira e consequenteãente na eãergência da seletividade à orientação.
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