UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
DEPARTAMENTO DE MORFOLOGIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO
EM BIOLOGIA CELULAR
TESE DE DOUTORADO
PROLIFERAÇÃO E MORTE CELULAR DURANTE A FOLICULOGENESE DE Prochilodus argenteus DA BACIA DO RIO SÃO FRANCISCO.
RALPH GRUPPI THOMÉ
Ralph Gruppi Thomé
Proliferação e morte celular durante a foliculogênese de
Prochilodus argenteus da bacia do rio São Francisco.
Belo Horizonte
Instituto de Ciências Biológicas - UFMG 2012
Esta tese foi realizada no Laboratório de Ictiohistologia - Departamento de Morfologia e Centro de Microscopia Eletrônica (CEMEL) - Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais.
ORIENTADORA:
PROFA.DRA.ELIZETE RIZZO
CO-ORIENTADOR:
PROF.DR.NILO BAZZOLI
COLABORADOR:
DR.YOSHIMI SATO
APOIO FINANCEIRO E INSTITUCIONAL:
Aos meus pais:
“Não há nada como um sonho para se criar um futuro.”
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores, Profª. Dra. Elizete Rizzo e Prof. Dr. Nilo Bazzoli pela paciência, confiança e orientação na minha jornada científica, e principalmente pela amizade;
Ao Prof. Dr. Yoshimi Sato, pelos ensinamentos transmitidos e contribuição na obtenção do material biológico;
Ao meu amigo e grande parceiro de pesquisa Fabrício Flávio Theóphilo Domingos;
Aos amigos do Laboratório de Ictiohistologia, por tornarem os dias mais agradáveis e pela grande contribuição para o desenvolvimento deste trabalho, em especial a Mônica;
À coordenação do Curso de Pós-graduação em Biologia Celular, na pessoa da Profª. Dra. Denise Carmona;
Aos professores do Departamento de Morfologia, em especial a Profª. Dra. Gleydes Gambogi Parreira;
Aos professores do Curso de Graduação EAD - Ciências Biológicas;
Aos amigos da Biologia Celular;
Aos amigos do Programa de Pós-graduação em Zoologia de Vertebrados PUC-Minas;
Aos amigos da EAD-UFMG;
Aos amigos e companheiros da época da graduação na PUC e UFMG;
Aos amigos da Universidade Federal de São João Del Rei, Prof. Dr. Hélio Batista dos Santos, Profª. Dra. Rosy Iara M. Azambuja, Prof. Dr. Stenio Nunes Alves e Prof. Dr. Rodrigo Ribeiro Resende;
Aos amigos do glorioso time de veteranos do curso de Ciências Biológicas-UFMG;
À minha amada família pelo apoio incondicional;
À Ludmila, pelos momentos de ajuda, compreensão e principalmente pelo carinho;
“O passado é história, o futuro é mistério, e o hoje é uma dádiva. Por isso, é chamado de presente.”
SUMÁRIO
Resumo...i
Abstract...iii
Lista de abreviaturas...v
Lista de tabelas...vi
Lista de figuras...vii
1- INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA...1
1.1DESENVOLVIMENTO DOS FOLÍCULOS OVARIANOS...1
1.2REGRESSÃO OVARIANA APÓS DESOVA...6
1.3APOPTOSE E PROLIFERAÇÃO CELULAR...9
1.4ORIO SÃO FRANCISCO...12
1.5ESPÉCIE DE ESTUDO...13
2- OBJETIVOS...14
2.1OBJETIVO GERAL...14
2.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS...14
3- MATERIAIS E MÉTODOS...15
3.1AMOSTRAGEM...15
3.2HISTOLOGIA...16
3.3TUNEL...16
3.4IMUNOFLUORIMETRIA INDIRETA...16
3.5IMUNOHISTOQUÍMICA...17
3.6WESTERN-BLOT………..17
3.7TESTE COLORIMÉTRICO……….18
3.8MORFOMETRIA………...18
3.9ANÁLISES ESTATÍSTICAS……….....18
4- RESULTADOS...19
4.2ARTIGO PUBLICADO:APOPTOSIS, CELL PROLIFERATION AND VITELLOGENESIS
DURING THE FOLLICULOGENESIS AND FOLLICULAR GROWTH IN TELEOST
FISH...………....31
5- DISCUSSÃO...41
6- CONCLUSÕES...46
7- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...47
8- ANEXOS...58 8.1 ANEXO I: DUAL ROLES FOR AUTOPHAGY DURING FOLLICULAR ATRESIA IN
FISH OVARY.………..………...59
8.2 ANEXO II: AUTOPHAGY AND APOPTOSIS INTERPLAY DURING FOLLICULAR
ATRESIA IN FISH OVARIES: A MORPHOLOGICAL AND IMMUNOCYTOCHEMICAL
i
Resumo
ii
estruturas ovarianas mostrou apenas ovogônias e ovócitos perinucleolares em peixes de ambos os trechos. Por outro lado, no período chuvoso, a frequência relativa de ovogônias e ovócitos perinucleolares diminuiu e dos ovócitos vitelogênicos aumentou em S2. Folículos pós-ovulatórios foram observados apenas em S2, enquanto folículos atrésicos ocorreram em maior frequência em S1. Em conclusão, nossos resultados sugerem que a estrutura e composição da matriz extracelular, e os níveis plasmáticos de 17β estradiol estão relacionados à apoptose, e desempenham papel importante durante o desenvolvimento folicular e recuperação ovariana pós-desova. Além disso, mostraram que a apoptose, proliferação celular e catepsina-D podem ser utilizados como biomarcadores de impacto ambiental.
PALAVRAS-CHAVE: Prochilodus argenteus, foliculogenese, matriz extracelular,
iii
Abstract
Studies about of reproduction of teleosts provide informations about the understanding of the development of gametes and tenable better management of wild populations. The formation and growth of the ovarian follicles and the involution of postovulatory follicles are accompanied by changes in the extracellular matrix, proliferation and cell death. These changes may influence the follicular maturation and steroidogenesis. The major goal of this work was to analyze the extracellular matrix remodeling, proliferation and cell death during development and regression of ovarian follicles of Prochilodus
argenteus. The present work was performed in two steps. Initially, we evaluated the
iv
period, only oogonia and perinucleolar oocytes were found in fish ovaries from both sites. On the other hand, in the rainy period, the relative frequency of oogonia and perinucleolar oocytes decreased and the vitellogenic oocytes increased in S2. Postovulatory follicles were observed only in S2, whereas atretic follicles occurred at a higher frequency in S1. In conclusion, our results suggest that the structure and composition of the extracellular matrix, and plasma levels of 17β estradiol related to apoptosis, play an important role during the follicular development and post-spawning involution in teleost fishes. Besides, our results showed that evaluation of apoptosis, cell proliferation and cathepsina-D can be used as biomarkers of environmental impact.
KEYWORDS: Prochilodus argenteus, folliculogenesis, extracellular matrix, apoptosis,
v
Lista de abreviaturas
17β-20α DHP - 17β, 20α dihidroxi-4-pregnen-3-one BMP15 - fator morfogenético de ossos 15
Cat-D – catepsina-D DA – dopaminérgicos DAB – diaminobenzidina
DNA – ácido desoxirribonucleico E2 - 17β estradiol
FSH – hormônio folículo estimulante
GDF9 - fator de crescimento e diferenciação 9 GH - hormônio do crescimento
GnRH – hormônio liberador de gonadotrofinas GV – vesícula germinativa
GVBD – quebra da vesícula germinativa
IGF - fator de crescimento semelhante à insulina IGS – índice gonadossomatico
LH – hormônio luteinizante
MIS - esteroides indutores da maturação MMP - metaloproteinase da matriz MPF – fator promotor da maturação PAS – ácido periódico de Schiff
PCNA - antígeno nuclear de proliferação celular PGC – células germinativas primordiais
RNA – ácido ribonucleico
TGF-β - família do fator transformador de crescimento beta TIMP - inibidor tecidual de metaloproteinase
vi
Lista de tabelas
Tabela 1: Anticorpos primários utilizados para imunohistoquímica de ovários de P.
argenteus...17
Tabela 2: Primary antibodies, supliers, and dilutions (Thomé et al., 2010 Artigo 1-Table
1)…………...………..………23
Tabela 3: Biometric, gonadosomatic index and morphometric analysis of P. argenteus females captured in two sites of the São Francisco River: S1 immediately following the Três Marias Dam and S2 in the confluence with Abaeté River (Thomé et al.,
2012 Artigo 2-Table 1)…………...………34
vii
Lista de figuras
Figura 1: Esquema comparativo de desenvolvimento folicular entre vertebrados...2 Figura 2: Resumo do controle hormonal da foliculogenese em peixes...3 Figura 3: Hipótese para o destino das células foliculares em peixes teleósteos ovíparos após desova...7 Figura 4: Modelo proposto para relação entre autofagia e apoptose na atresia folicular..8 Figura 5: Prochilodus argenteus Spix & Agassiz, 1829...13 Figura 6: Mapa de localização da área de estudo no rio São Francisco...16 Figura 7: Histological sections of P. argenteus ovaries stained with toluidine blue (a, b,
d), Gomory trichrome (c), hematoxylin-eosin (e) and periodic acid-Schiff (PAS)-hematoxylin (f, g) (Thomé et al 2010 Artigo 1-Fig 1)...…………..23 Figura 8: Immunohistochemical for laminin β2 (a–d), collagen type IV (e) and MMP-9
(f–i) in ovarian follicles of P. argenteus. (Thomé et al., 2010 Artigo 1-Fig
2)………...….…..23
Figura 9: Immunohistochemical reaction for actin (b, f) and histological sections of spawned ovary in P. argenteus stained with Gomory trichrome (a, e), hematoxylin-eosin (c) and periodic acid-Schiff (PAS)-hematoxylin (d, g, h) (Thomé et al., 2010
Artigo 1-Fig 3)………....25
Figura 10: Immunohistochemical reaction for laminin β2 (a, b, e), collagen type IV (c, d), fibronectin (h, i) and MMP-9 (f, g) in postovulatory follicles of P. argenteus (Thomé et al., 2010 Artigo 1-Fig 4)...25 Figura 11: Immunostained area of laminin β2, collagen type IV and MMP-9 of the postovulatory follicles in P. argenteus (Thomé et al., 2010 Artigo 1-Fig 5)……...26 Figura 12: TUNEL-positive reaction during follicular development and postovulatory
viii
Figura 14: Plasma 17β estradiol level concentrations in ovaries in resting, ripe and post-spawning = PS (0, 48 and 96 h) in P. argenteus (Thomé et al., 2010 Artigo 1-Fig
8)………...………..26
Figura 15: Histological sections of P. argenteus ovaries stained with hematoxylin and eosin (A and D) and Gomori trichrome (B, detail in B and C) (Thomé et al., 2012
Artigo 2-Fig 1)………....35
Figura 16: Relative frequency of oogonia (Oo), perinucleolar (PNF), previtellogenic (PVF), vitellogenic (VF), atretic (AF) and postovulatory follicles (POF) of P.
argenteus captured in two sites of the São Francisco River: S1 immediately
following the Três Marias Dam and S2 in the confluence with Abaeté River (Thomé et al., 2012 Artigo 2-Fig 2)………..………...…35 Figura 17: Immunohistochemistry for PCNA in ovarian sections of the P. argenteus
from São Francisco River: S1 immediately following the Três Marias Dam and S2 in the confluence with Abaeté River (Thomé et al., 2012 Artigo 2-Fig 3) ………36 Figura 18: TUNEL-positive reaction in ovaries of P. argenteus captured in two sites from the São Francisco River: S1 immediately following the Três Marias Dam and S2 in the confluence with Abaeté River (Thomé et al., 2012 Artigo 2-Fig 4)……....37 Figura 19: Immunohistochemistry for cathepsin-D in ovarian sections of the P.
argenteus from São Francisco River: S1 immediately following the Três Marias Dam
(A) and S2 in the confluence with Abaeté River (B) (Thomé et al., 2012 Artigo 2-Fig
5)……….38
Figura 20: Schematic summary for possible formation and development of the ovarian follicles in teleosts under environmental influence (Thomé et al., 2012 Artigo 2-Fig
1- INTRODUÇÃO E JUSTIFICATIVA
O Brasil ocupa o primeiro lugar do mundo no número de espécies de peixes de água doce (McAllister et al., 1997), com quase 2600 já descritas (Buckup et al., 2007). Os Characiformes e Siluriformes, respondem por cerca de 70% de todas as espécies de peixes neotropicais, seguidos pelos grupos Gymnotiformes, Perciformes e Cyprinodontiformes, compondo a ictiofauna brasileira de água doce (Vari e Malabarba, 1998). Além desses cinco grupos, há outros que individualmente não são representativos, mas quando combinados compõem um grande número de espécies (Godinho et al., 2010). Além da grande diversidade da nossa ictiofauna, os peixes de água doce possuem papel de destaque na pesca comercial e esportiva representando uma rica fonte de proteínas (Sato e Godinho, 2003). Por isso, o entendimento do comportamento reprodutivo dos peixes, através da análise da maturação gonadal, é importante para a melhoria da gestão dos recursos da pesca e conservação das espécies nativas. De fato, estudos sobre a biologia reprodutiva e da cascata de eventos moleculares na gametogênese e fecundação são considerados parâmetros importantes na conservação da biodiversidade (Wildt e Wemmer, 1999).
1.1DESENVOLVIMENTO DOS FOLÍCULOS OVARIANOS
Nos ovários de mamíferos, a divisão mitótica das células germinativas ocorre por completo antes do nascimento, com isso o número de ovócitos a ser liberado é limitado ao número de folículos primordiais que serão gerados durante a embriogênese. Ao contrário, em muitos vertebrados com alta fecundidade como os peixes teleósteos, o número de ovócitos pode ser infinito (Figura 1). Nos ovários de peixes e de anfíbios adultos, células germinativas mitóticas com características citológicas de ovogônias são observadas e, assim, a manutenção do estoque destas células permite a formação de ovócitos maduros continuamente ao longo da vida (Nakamura et al., 2010; 2011).
Figura 1: Esquema comparativo de desenvolvimento folicular em vertebrados (Adaptado de Nakamura et al., 2011).
Figura 2: Resumo do controle hormonal da foliculogênese em peixes (Adaptado de Yaron e Levavi-Sivan, 2011).
Na ovogênese de mamíferos os ovócitos não aumentam de tamanho, diferente do observado em teleósteos, onde os ovócitos crescem enquanto o ciclo celular está bloqueado em diplóteno na prófase meiótica (Nagahama, 1994). Nesta fase, os ovócitos dos teleósteos se desenvolvem dentro de folículos ovarianos, estabelecidos quando células foliculares associadas a uma membrana basal e células tecais envolvem completamente o ovócito (Patiño e Sullivan, 2002; Grier et al., 2009). O FSH estimula as células especiais da teca a sintetizar testosterona, que será convertida em E2 pelas células foliculares através da ação da enzima P450 aromatase. No fígado, o E2 estimula os hepatócitos a produzirem vitelogenina e coreogenina, que são levadas pela corrente sanguínea até o ovário, onde participam da formação do vitelo e da zona pelúcida durante a maturação ovocitária (Senthilkumaran et al., 2004). O vitelo acumula no citoplasma do ovócito que aumenta de diâmetro. Assim o FSH regula a secreção de E2 e a incorporação de vitelogenina dentro dos ovócitos (Yaron e Levavi-Sivan, 2011) (Figura 2a).
quantidade de LH na circulação sanguínea. Após a ligação do LH aos seus receptores nas células foliculares, o folículo ovariano inicia o processo de maturação final, começando com a produção dos esteroides indutores da maturação (MIS), por exemplo, a 17β-20α DHP. A ligação de MIS aos seus receptores na membrana plasmática do ovócito é seguida pela ativação do fator promotor de maturação (MPF) (Figura 2b). O processo de maturação do ovócito é reconhecido morfologicamente pela migração da vesícula germinativa (GV) em direção ao pólo animal e a quebra da vesícula germinativa (GVBD), o envelope nuclear rompe-se e a cromatina compactada na metáfase irá permitir a fertilização (Yaron e Levavi-Sivan, 2011).
Dentre todas as células da linhagem germinativa as ovogônias tem a maior proporção núcleo/citoplasma. Os núcleos das ovogônias variam de ovais a esféricos, com fina cromatina e nucléolo único. O citoplasma destas células apresenta mitocôndrias, ribossomos e escasso retículo endoplasmático e complexo de Golgi (MacMillan, 2007). Nos ovários de peixes em início de desenvolvimento, são observadas histologicamente três fases distintas de células germinativas: ovogônias isoladas envolvidas por células somáticas que expressam Sox9b, ovogônias ligadas por pontes citoplasmáticas formando aglomerados de células, ninhos de ovogônias, e ovócitos em estágio inicial de desenvolvimento. O gene Sox9 foi descrito inicialmente em mamíferos estando envolvido com desenvolvimento gonadal de machos, particularmente na diferenciação da célula de Sertoli. O Sox9b é um ortólogo funcional em teleósteos, sendo expresso durante o desenvolvimento gonadal nas células de suporte como as células foliculares (Nakamura et al., 2011). O núcleo das ovogônias está circundado por várias mitocôndrias esféricas e nuage, a qual é uma estrutura granular e eletrondensa sem limite de membrana formada por proteínas associadas a ácido ribonucleico (RNA) (Santos et al., 2006).
múltipla ou parcelada está associada a ambientes lênticos, onde o desenvolvimento de ovócitos é assíncrônico e eles são liberados em lotes durante um prolongado período reprodutivo (Bazzoli, 2003; Lubzens et al., 2010).
O desenvolvimento folicular pode ser dividido em três fases: crescimento primário, crescimento secundário e maturação final (Lubzens et al., 2010). O crescimento primário é caracterizado por uma intensa proliferação de organelas, acúmulo de RNA materno no citoplasma e diferenciação das células foliculares e tecais. Nesta fase, ocorre também o início da formação da zona pelúcida. No ooplasma justanuclear, a proliferação de organelas membranosas ocorre em área conhecida como corpo de Balbiani ou núcleo vitelínico. Durante este período, os ovócitos aumentam em tamanho e a basofilia citoplasmática torna-se mais intensa (Quagio-Grassioto et al., 2011). Grandes quantidades de glicoproteínas são sintetizadas na fase final do crescimento primário e são incorporados em vesículas formadas na periferia do ooplasma, chamadas de alvéolos corticais (Patiño e Sullivan, 2002). Os alvéolos corticais liberam seu conteúdo durante a reação cortical no espaço perivitelínico, sendo responsáveis pelo endurecimento da zona pelúcida dificultando a polispermia durante a fertilização (Tyler e Sumpter, 1996).
reprodução através do estímulo a proliferação celular e inibição da apoptose e o IGF2 na foliculogênese durante a maturação final ovocitária (Kagawa et al., 1995; Perrot et al., 2000; Radaelli et al., 2010). Recentemente, além do IGF1 e IGF2 foi descrita a existência de uma terceira forma de IGF denominada IGF3, exclusiva de peixes e associada à reprodução de machos (Berishvili et al., 2010).
O crescimento secundário ou fase vitelogênica é caracterizado pela captação de vitelogenina. A vitelogenina é uma glicofosfolipoproteína sintetizada no fígado e carreada para o ovário, chegando ao folículo ovariano pela vascularização da teca, passando pelos espaços intercelulares das células foliculares, pelos canais da zona pelúcida até alcançar a membrana plasmática ovocitária. A vitelogenina se liga ao seu receptor, é internalizada por endocitose seletiva e entra em contato com as enzimas lisossomais, como a catepsina-D (Cat-D), que degradam a vitelogenina em moléculas menores, lipovitelina e a fosfovitina, que darão origem ao vitelo (Patiño e Sullivan, 2002; Carnevali et al., 2006). A expressão gênica da cat-D ocorre em ovócitos de tamanhos diferentes durante o crescimento secundário, especialmente na fase inicial da vitelogenese (Carnevali et al., 2008) e tem sido sugerida como biomarcador de desregulação endócrina por estar envolvida no processo de formação do vitelo durante a maturação do ovócito, desempenhando um papel fundamental para o sucesso da reprodução de peixes (Carnevali e Maradona, 2003). O processo de maturação final é caracterizado pela redução ou interrupção da endocitose de vitelogenina, retomada da meiose e quebra da vesícula germinativa culminando com a ovulação e desova (Lubzens et al., 2010).
1.2 REGRESSÃO OVARIANA
Após a desova, os ovários apresentam folículos pós-ovulatórios e atrésicos que involuem progressivamente até sua recuperação total do ovário, para retornar a fase de repouso e iniciar novo ciclo reprodutivo (Bazzoli, 2003). Os folículos pós-ovulatórios são remanescentes dos folículos ovarianos constituídos de células foliculares, membrana basal e teca conjuntiva (Grier et al., 2007). Diferentemente do corpo lúteo de mamíferos os folículos pós-ovulatórios de peixes ovíparos não apresentam atividade hormonal, sendo estruturas transitórias após desova (Selman e Wallace, 1989; Drummond et al., 2000; Santos et al., 2005).
no processo conhecido como atresia folicular (Saidapur, 1978). Nos teleósteos, os ovócitos vitelogênicos que não foram ovulados durante o período reprodutivo tornam-se atrésicos e são lentamente reabsorvidos durante a regressão ovariana pós-desova (Rizzo e Bazzoli, 1995; Miranda et al., 1999; Santos et al., 2005). Fatores intrínsecos e extrínsecos, incluindo a hipofisectomia, irradiação, substâncias anti-gonadotróficas, estresse térmico, confinamento, jejum prolongado e outros podem induzir atresia folicular em ovários de peixes e diminuir o potencial reprodutivo das espécies (Saidapur, 1978; Nahum et al., 1996). Alguns estudos indicam que a apoptose é o principal mecanismo envolvido na eliminação de células somáticas e germinativas em folículos atrésicos de aves e mamíferos (Andreu-Vieyra e Habibi, 2000; Hussein, 2005). Em teleósteos, a morte celular programada parece desempenhar um papel secundário durante a atresia folicular (Santos et al., 2008a).
Estudo recente indicou que a apoptose e autofagia podem agir cooperativamente, nos ovários de peixes, e uma dupla função, na sobrevivência e na morte celular, foi atribuída à autofagia para garantir uma regressão ovariana mais eficiente após a desova (Thomé et al., 2009 Anexo I) (Figura 3). Nos folículos pós-ovulatórios a taxa de apoptose das células foliculares aumenta rapidamente após desova, enquanto que no folículo atrésico inicialmente a autofagia é predominante e a taxa de apoptose só aumenta na fase final do processo (Santos et al., 2005; Thomé et al., 2006; Santos et al., 2008a).
Durante a atresia folicular, células foliculares hipertrofiadas fagocitam o vitelo em degeneração durante a reabsorção do folículo (Santos et al., 2008a). Estudos realizados em ovários de Oncorhyncus mykiss sugerem que a atresia folicular envolve a degradação de proteínas vitelínicas mediada por enzimas lisossomais (Wood e Van Der Kraak, 2003). Dentre as hidrolases ácidas presentes no compartimento lissosomal, destaca-se a cat-D que é uma protease aspártica da superfamília das pepsinas e está envolvida em muitos processos fisiológicos, tais como degradação, apoptose e autofagia (Zaidi et al., 2008).
Entre as proteínas envolvidas na autofagia, beclin-1 induz a nucleação de uma vesícula com dupla membrana chamada vacúolo autofágico (Maiuri et al., 2007, 2010). Em células autofágicas, o conhecimento sobre a organização do citoesqueleto de actina e seu papel na biogênese do vacúolo autofágico ainda é escasso (Reggiori et al., 2005). A interação de beclin-1 com a proteína anti-apoptótica bcl-2 é essencial na determinação do destino das células e no “crosstalk” entre autofagia e apoptose (Klionsky, 2007). Em teleósteos, proteínas autofágicas (beclin-1, Atg, LC3, Lamp) e apoptóticas (bcl-2, bcl-xl, bax e bid) podem ser ativadas de maneira coordenada dependendo do estágio da atresia folicular, estabelecendo uma relação entre autofagia e apoptose (Figura 4) (Morais, 2009; Morais et al., 2012 Anexo II).
1.3 APOPTOSE E PROLIFERAÇÃO CELULAR
Em condições normais, o funcionamento do ovário é dependente de remodelações cíclicas com formação, desenvolvimento e involução dos folículos, tornando o ovário um excelente modelo para estudo dos eventos de desenvolvimento e regressão tecidual (Bagavandoss, 1998). O crescimento folicular e a ovulação são acompanhados por alterações na matriz extracelular, como também ocorre na involução dos folículos pós-ovulatórios. Essas alterações podem influenciar na maturação folicular, na sobrevivência das células foliculares e na esteroidogênese.
Células de organismos multicelulares são influenciadas pelo microambiente onde estão inseridas através de interações com células vizinhas e com a matriz extracelular (Pinkse et al., 2004). Os componentes da matriz extracelular dos ovários têm sido caracterizados em várias espécies de mamíferos, tais como bovinos, ovinos, eqüinos, murinos e primatas, sendo mais comumente estudados: colágeno tipo I, colágeno tipo IV, laminina e fibronectina (Berkholtz et al., 2006a). O colágeno tipo IV interage por meio de seus domínios terminais para formar uma rede extracelular flexível e plana. A laminina é uma glicoproteína que participa na adesão das células à lâmina basal, enquanto que a fibronectina é importante nos processos de adesão, migração, crescimento e diferenciação celular (Rodgers et al., 2003).
As interações célula-matriz exercem grandes efeitos na regulação gênica, estrutura do citoesqueleto, diferenciação e crescimento celular (Frisch e Francis, 1994). Em mamíferos, a membrana basal é importante para a sobrevivência celular atuando como fator anti-apoptótico em células epiteliais (Pullan et al., 1996). A sobrevivência das células tronco-epidermais é garantida pela interação célula-matriz, uma vez que os queratinócitos que expressam integrina e aderem ao colágeno tipo IV não entram em apoptose (Tibério et al., 2002). O desprendimento da célula de sua matriz extracelular promove a desfosforilação da quinase de adesão focal resultando na ativação do efeito cascata das caspases induzindo a apoptose (Frisch e Francis, 1994; Pinkse et al., 2004).
controle das MMPs: secreção da forma inativa (pro-enzima), confinamento por receptores de superfície celular e inibidores teciduais de metaloproteinases (TIMPs). O aumento de TIMPs atua coordenando as ações de MMPs, regulando a localização e extensão da remodelação da matriz extracelular durante o processo ovulatório em mamíferos (Curry e Osteen, 2003). As MMPs desempenham um importante papel no processo ovulatório de diferentes grupos de vertebrados, atuando na ruptura folicular, fragmentação da membrana basal e fibras conjuntivas associadas ao folículo ovariano (Curry e Osteen, 2003; Ogiwara et al., 2005). Em teleósteos, a distribuição e a ação proteolítica das MMPs foram descritas em fígado, músculos, brânquias e gônadas (Matsui et al., 2000; Lodemel et al., 2004; Ogiwara et al., 2005).
Durante a foliculogênese e crescimento folicular, o balanço entre os sinais proliferação e morte celular determinam o destino do folículo ovariano para ovulação ou para atresia folicular (Krysko et al., 2008). O antígeno nuclear de proliferação celular (PCNA), é uma proteína nuclear não histônica que apresenta 36 kDa em mamíferos (Bravo e Graf, 1985; Bravo e MacDonald-Bravo, 1987). O PCNA é um importante regulador do ciclo celular, muito conservado entre as espécies, atua como co-fator da DNA-polimerase delta e está envolvido nos processos de reparo de DNA (Bravo et al., 1987). O PCNA é encontrado na matriz nuclear, começando a ser sintetizado na fase G1, atingindo os mais altos níveis durante a fase S e diminuindo na fase G2 e mitose (Kurki et al., 1988).
Os primeiros estudos sobre proliferação celular utilizaram basicamente dois métodos de avaliação da proliferação celular: a contagem de figuras de mitose em cortes histológicos utilizando a morfologia como parâmetro de identificação (Beaumont e Mandl, 1962) e a contagem após a incorporação dos marcadores timidina triciada ou BrdU (Dolbeare, 1995). Atualmente, além dos métodos citados, a expressão de PCNA tem sido utilizada como ferramenta útil para a identificação da proliferação celular durante a gametogênese e embriogênese de mamíferos e peixes (Leung et al., 2005; Hutt et al., 2006; Loppion et al., 2008). O PCNA foi detectado nas células foliculares de zebrafish durante o crescimento dos folículos ovarianos (Korfsmeir, 2002) e em células da teca de folículos atrésicos de Prochilodus argenteus e de Leporinus taeniatus (Santos et al., 2008a).
caspases (Kerr et al., 1972). As caspases ativam endonucleases dependentes de íons Ca2+/Mg2+, que clivam o DNA em regiões internucleossômicas, gerando fragmentos múltiplos de 180-200 pares de bases nucleotídicas (Huettenbrenner et al., 2003). Células em apoptose apresentam perda de junções de adesão célula-célula e célula-matriz extracelular, retração celular, condensação da cromatina na periferia do envoltório nuclear e fragmentação celular em corpos apoptóticos que são fagocitados por células vizinhas ou fagócitos sem desencadear reação inflamatória (Hsueh et al., 1994). Alterações do citoesqueleto têm sido amplamente relatadas em células apoptóticas nas quais a forma da célula e sua ancoragem são dependentes da reorganização dos filamentos de actina (Korsnes et al., 2007).
A apoptose pode ser induzida por diferentes estímulos extrínsecos, reunidos em dois grupos de acordo com seus mecanismos de ação. No primeiro grupo, estão os membros da família do fator de necrose tumoral (TNF) e o Fas/Fas-Ligante. No segundo grupo encontram-se indutores de injúrias no DNA, alterações hormonais, substâncias tóxicas e perda de ancoragem celular (McConkey, 1998). Fatores intrínsecos, relacionados com alterações nas mitocôndrias também podem desencadear apoptose. Dentre eles, a família Bcl-2 é composta por proteínas intracelulares que ajudam a regular a ativação das pro-caspases. Alguns membros dessa família, como a própria bcl-2 e bcl-x, inibem a apoptose, enquanto outros como bad e bax promovem a ativação da apoptose. A inibição do fator anti-apoptótico da via bcl-2 induz apoptose em células foliculares de folículos atrésicos de mamíferos, aves e peixes (Hsueh et al., 1994; Johnson et al., 1996; Johnson, 2003; Morais et al., 2012 Anexo II).
Em teleósteos, o aumento significativo de apoptose foi utilizado como bioindicador de ambientes aquáticos impactados expostos a diferentes tipos de xenobióticos, i.e., substâncias químicas estranhas a um organismo ou sistema biológico prejudicando desde a função hepática até a taxa reprodutiva do peixe (Janz et al., 1997; Piechotta et al., 1999; Janz et al., 2001; Weber et al., 2001; Weber et al., 2002). A importância da apoptose na dinâmica reprodutiva de peixes teleósteos foi investigada na seleção e recrutamento de folículos para a vitelogênese em O. mykiss (Janz e Van Der Kraak, 1997), no desenvolvimento dos folículos ovarianos de Carassius auratus e O.
mykiss (Wood e Van Der Kraak, 2001) e durante a involução de ovários após desova de
Astyanax bimaculatus (Drummond et al., 2000), L. taeniatus (Santos et al., 2005) e
1.4 O RIO SÃO FRANCISCO
O rio São Francisco, considerado como o rio da integração nacional, descoberto em 1502, tem esse título por ser o caminho de ligação do Sudeste e do Centro-Oeste com o Nordeste. Suas águas são utilizadas principalmente para geração de energia, irrigação, abastecimento urbano e industrial. Desde as suas nascentes, na Serra da Canastra, em Minas Gerais, até sua foz, na divisa de Sergipe e Alagoas, ele percorre 2.700 km, atravessando regiões diversificadas, tanto em relação às condições climáticas e topográficas, quanto à diversidade social (fonte: http://www.integracao.gov.br/saofrancisco). Desta forma, a bacia é tradicionalmente dividida em quatro segmentos: alto, médio, submédio e baixo São Francisco. O alto compreende da nascente até Pirapora, numa extensão de 630 km; o médio com 1.190 km estende-se até Remanso, o submédio até Cachoeira de Paulo Afonso com 686 km e o baixo até a foz no Oceano Atlântico (Paiva, 1982). As maiores usinas hidrelétricas (UHE), em área alagada ou em potência, encontram-se na calha principal do rio. Apenas a UHE de Três Marias, foi construída no alto São Francisco, enquanto as demais: Sobradinho, Itaparica, Moxotó, o complexo Paulo Afonso e Xingó ocupam o terço inferior do rio. Em conjunto, elas têm capacidade de geração de 7.902 MW, mas que inundaram cerca de 6.250 Km2 de áreas férteis (Godinho e Godinho, 2003).
Os barramentos apesar de importantes para o desenvolvimento econômico provocam alterações graves e irreversíveis no regime hidrológico natural dos rios, alterando também a qualidade dos hábitats e a dinâmica de toda a biota. As espécies mais afetadas são aquelas que realizam longas migrações e que necessitam de diferentes hábitats para completar seu ciclo de vida (Agostinho et al., 2008).
que não restabelecem o perfil físico-químico natural da água. No entanto, alguns desses pequenos tributários (Barreiro grande, Consciência, Espírito Santo) recebem efluentes industriais sem tratamento (Ribeiro, 2010). O rio Abaeté é o primeiro tributário de médio porte caracterizado pelo fundo rochoso e várias corredeiras e cachoeiras, desaguando cerca de 34 km após a barragem de Três Marias. O rio Abaeté minimiza o impacto da barragem apresentando condições favoráveis à reprodução de várias espécies de peixes migradores de importância econômica (Sato et al., 2005).
1.5 ESPÉCIE DE ESTUDO
A curimatã-pacu Prochilodus argenteus Spix & Agassiz, 1829 (Figura 5), endêmico da bacia do rio São Francisco, é uma das espécies predominantes na pesca da região de Três Marias, podendo alcançar mais de 10 kg de peso corporal (Reis et al., 2003; Sato e Godinho, 2003). De hábito alimentar iliófago, a curimatã-pacu alimenta-se de lodo com finos materiais particulados depositados no fundo do rio, podendo ser um bom modelo biológico para análise da contaminação com metais e outros resíduos químicos depositados no sedimento dos rios. A espécie não desova em ambientes lênticos (Arantes et al., 2011) e é usualmente submetida à reprodução induzida na Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias, visando o repovoamento do reservatório (Sato et al., 1996). Apresenta desova total, ovos livres, desenvolvimento embrionário rápido e não possui comportamento de cuidado parental (Sato et al., 2003). Realiza migrações reprodutivas na estação chuvosa, geralmente de novembro a janeiro, no rio São Francisco e em seus afluentes, principalmente no rio Abaeté (Sato e Godinho, 2003).
2- OBJETIVOS
2.1OBJETIVO GERAL
Analisar o desenvolvimento e a regressão dos folículos ovarianos da curimatã-pacu Prochilodus argenteus, em condições naturais e de confinamento, com ênfase nos processos de remodelação da matriz extracelular, proliferação e morte celular.
2.2OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Avaliar a foliculogênese em condições de confinamento;
- Analisar a distribuição espacial e temporal de MMP-9, laminina, fibronectina e colágeno tipo IV em ovários pré e pós-desova;
- Relacionar alterações da membrana basal e níveis de E2 com a apoptose em ovários pré e pós desova;
- Analisar a distribuição espacial e temporal do citoesqueleto de actina em folículos pós-ovulatórios;
- Analisar e comparar a distribuição dos folículos ovarianos em diferentes fases de desenvolvimento em dois trechos do rio São Francisco, a jusante da UHE de Três Marias;
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1AMOSTRAGEM
Os animais utilizados no presente trabalho foram obtidos em duas etapas. Na primeira etapa, utilizaram-se 20 exemplares de P. argenteus nos seguintes estádios: repouso, maturação e desovado. Os peixes foram capturados no rio São Francisco e mantidos em confinamento na Estação de Hidrobiologia e Piscicultura de Três Marias. Para obtenção dos ovários desovados os peixes foram submetidos à desova induzida por hipofisação. Na segunda etapa, fragmentos de ovários de P. argenteus que foram capturados em dois trechos do rio São Francisco (Figura 6): 25 exemplares logo a jusante da barragem de Três Marias (S1) e 20 exemplares na confluência com rio Abaeté (S2). Os fatores físico-químicos da água (pH, temperatura da água, oxgênio dissolvido e condutividade) foram determinados com sonda Horiba modelo W-22XD durante a coleta sempre pela manhã, com amostragem da margem esquerda, centro e margem direita do rio.
O projeto seguiu os princípios éticos de experimentação com animais de acordo com o Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (COBEA) e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da UFMG (CETEA protocolo nº: 073/08).
Figura 6: Mapa do rio São Francisco a jusante da UHE de Três Marias (Adaptado de Sato et al., 2005).
Trecho 1
Trecho 2
Trecho 2
3.2HISTOLOGIA
Amostras de ovários fixadas em líquido de Bouin por 6 horas a temperatura ambiente foram incluídas em parafina ou em glicol metacrilato (JB-4 Polysciences). Secções histológicas foram coradas com hematoxilina-eosina, tricrômico de Gomori ou azul de toluidina-borato de sódio. Algumas amostras foram submetidas à técnica histoquímica do PAS e contra-coradas com hematoxilina.
3.3TUNEL
Amostras de ovários fixadas em paraformoldeído 4% em tampão fosfato 0,1M pH 7,3 por 24 horas a 4°C foram incluídas em parafina, seccionados e submetidos à técnica de TUNEL in situ utilizando o Kit TdT FragEL Calbiochem ou Kit Apoptag Millipore para a identificação da fragmentação do DNA das células em apoptose. Para isso, incubaram-se as secções histológicas com mistura da enzima terminal deoxynucleotides transferase (TdT) e deoxinucleotídeos conjugados com biotina em câmara úmida a 37°C por 3 h. Em seguida, aplicou-se solução de estreptavidina conjugada com peroxidase em câmara úmida a temperatura ambiente por 45 min. A reação da peroxidase foi revelada com diaminobenzidina (DAB) durante 2 min à temperatura ambiente. As lâminas foram contra-coradas com hematoxilina. Para controle-negativo, uma das lâminas não recebeu a mistura contendo a enzima TdT e deoxinucleotídeos. Para a permeabilização e inativação de peroxidase endógena foram utilizadas proteinase K e água oxigenada 3% respectivamente. Foram consideradas como células apoptóticas aquelas que apresentaram reação TUNEL-positiva e alterações celulares como retração citoplasmática e/ou fragmentação semelhante a corpo apoptótico.
3.4IMUNOFLUORIMETRIA INDIRETA
3.5IMUNOHISTOQUÍMICA
Amostras de ovários fixadas em DMSO/metanol ou paraformaldeído foram incluídas em paraplast (Sigma) e seccionadas e submetidas a imunohistoquímica. Foram utilizados os anticorpos primários descritos na tabela 1.
Utilizou-se pré-tratamento para recuperação antigênica com proteinase K a temperatura ambiente ou pré-tratamento com tampão citrato pH 6,0 a 95°C por 30 min. Após lavagem com PBS, utilizou-se tampão (BSA 2%) para bloqueio de reações inespecíficas e H2O2 3% para bloqueio da peroxidase endógena. As secções foram incubadas com o anticorpo primário “overnight” a 4°C. Após lavagem com PBS, os cortes foram incubados com anticorpo secundário conjugado com biotina (Kit LSAB-DAKO) e a reação foi revelada com DAB. Para as análises em microscopia confocal (Carl Zeiss LSM 510) os cortes de tecido foram incubados com anticorpo secundário ALEXA 488 anti-coelho (1:200) e ALEXA 568 anti-camundongo (1:200) e para marcação do núcleo das células utilizou-se DAPI (1:500). Para controle negativo, uma das lâminas não recebeu anticorpo primário.
Tabela 1. Anticorpos primários da Santa Cruz Biotechnology utilizados para imunohistoquímica de ovários de P. argenteus.
Antígeno Natureza Diluição
MMP-9 Monoclonal- camundongo 1:10
Colágeno IV Policlonal- coelho 1:100
Laminina β2 Policlonal- coelho 1:50
Fibronectina Policlonal- coelho 1:25
Actina Monoclonal- camundongo 1:100
PCNA Policlonal- camundongo 1:80
Cat-D Policlonal- coelho 1:25
3.6WESTERN-BLOT
reações inespecíficas foram bloqueadas com BSA 1%. A membrana foi incubada por 20 min com os anticorpos primários. Depois de três lavagens com tampão PBST, a membrana foi incubada por mais 10 min com anticorpo secundário conjugado com peroxidase. A reação foi revelada pela adição de 3’3 diaminobenzidina em PBS contendo cloronaftol, metanol e água oxigenada. Todos os testes foram feitos em triplicatas e a densidade das bandas obtidas foi estimada utilizando-se do ImageJ Software.
3.7TESTE COLORIMÉTRICO
Para identificar a atividade enzimática da caspase-3 em ovários foi utilizado o kit de teste colorimétrico para Caspase-3 da R&D Systems. As amostras do tecido foram pesadas e lisadas com 0.5 ml do tampão de lise celular. O homogenizado foi centrifugado por 1 min a 10.000 g. O sobrenadante foi mantido e incubado com substrato colorimétrico da caspase-3 (DEVD-pNA) a 37°C por 2 h. O nível da atividade da caspase-3 foi diretamente proporcional a reação de cor.
3.8 MORFOMETRIA
Foi realizada contagem de células apoptóticas (TUNEL-positivas), área imunomarcada (Software ImagePro-Plus), medida do diâmetro ovocitário e frequência de estruturas ovarianas.
3.9ANÁLISE ESTATÍSTICA
4- RESULTADOS
Os resultados obtidos no presente trabalho foram publicados nos seguintes artigos:
THOMÉ R.G., SANTOS H.B., SATO Y., RIZZO E., BAZZOLI N., 2010. DISTRIBUTION OF LAMININ Β2, COLLAGEN TYPE IV, FIBRONECTIN AND MMP-9 IN OVARIES OF THE TELEOST FISH. JOURNAL OF MOLECULAR HISTOLOGY. 41, 215-224.
O R I G I N A L P A P E R
Distribution of laminin
b2, collagen type IV, fibronectin
and MMP-9 in ovaries of the teleost fish
Ralph Thome´• He´lio Batista dos Santos•
Yoshimi Sato•Elizete Rizzo• Nilo Bazzoli
Received: 28 April 2010 / Accepted: 15 July 2010 / Published online: 4 August 2010 ÓSpringer Science+Business Media B.V. 2010
Abstract Extracellular matrix in the ovarian follicle has
been characterised for several mammalian species but there are no reports that describe the immunolocalisation of the extracellular matrix elements, matrix metalloproteinases, and its relation to plasma 17bestradiol levels and follicular apoptosis during the teleost’s reproductive cycle. The present study used immunohistochemistry to characterise the distribution of lamininb2, collagen type IV, fibronectin and matrix metalloproteinases-9 (MMP-9). The TUNEL in situ technique was used to quantify apoptosis and indirect immunofluorimetric to determine plasma 17b estradiol levels. The TUNEL-positive reaction associated with mor-phological features exhibited follicular apoptosis. During postovulatory follicle involution, the drop in plasma 17b estradiol levels after spawning contributed to the intense apoptosis observed. By immunohistochemical analysis, laminin b2 and collagen type IV were identified as the major constituents of the basement membrane. The loss of integrity of the basement membrane occurred due to lyses of the major constituents, and coincides with increased follicular apoptosis. The integrity of the basement mem-brane is important for the survival of follicular cells. Fur-thermore, the MMP-9 results suggest that this enzyme is
involved in final oocyte maturation and regression of pos-tovulatory follicles. Fibronectin was observed on the sur-face of follicular cells of the postovulatory follicle in P. argenteus, this being important for maintaining normal cell adhesion to extracellular matrix. In conclusion, our results suggest that the structure and composition of the extracel-lular matrix, and plasma 17b estradiol levels related to apoptosis, play an important role during the follicular development and post-spawning involution in teleost fishes.
Keywords Apoptosis17bestradiolExtracellular
matrix Matrix metalloproteinasesOvarian follicle
Introduction
Teleost reproduction presents many original features, such as spawning types and parental behaviour, sensitivity to environmental factors, and specific features of the game-togenesis, such as the duration of the vitellogenesis, and egg morphology (Jalabert 2005). Their ovaries are sur-rounded by a connective tunica that issues numerous septa projecting into the ovarian lumen, called ovigerous lamellae, where nests of oogonia can be found, as well as follicles at different stages of development. Post-spawning, postovulatory and atretic follicles are gradually reabsorbed until the ovaries are fully recovered, which return to the resting stage to start a new reproductive cycle (Drummond et al.2000; Santos et al.2005, Thome´ et al.2009). During the reproductive cycle, the ovarian tissue is constantly remodelling, with extensive cell proliferation and differ-entiation, besides changes of extracellular matrix from the onset of the follicular development until involution of tis-sues after ovulation (Curry and Osteen 2003). Among the processes and factors involved in tissue remodelling stand
R. Thome´H. B. dos SantosE. Rizzo
Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, Brazil
Y. Sato
Estac¸a˜o de Hidrobiologia e Piscicultura de Treˆs Marias (CODEVASF), Treˆs Marias, Brazil
N. Bazzoli (&)
Programa de Po´s graduac¸a˜o em Zoologia de Vertebrados (PUC-minas), Belo Horizonte, Brazil
e-mail: bazzoli@pucminas.br
123
out apoptosis, changes in hormone levels and degradation of extracellular matrix in contact with the cells.
Apoptosis is a physiological, genetically programmed process that is important for tissue homeostasis in multicel-lular organisms and requires specialised machinery involv-ing proteases known as caspases (Kerr et al.1972; Takle and Andersen2007). The activation of endonucleases, and sub-sequent cleavage of DNA, is a definitive step toward apop-tosis, but there are many factors that can play a role in earlier stages to inhibit the entire apoptotic process, such as varia-tion in hormones levels, modificavaria-tions of the cytoskeleton or loss of cell anchorage (Frisch and Francis1994; Janz et al. 1997; Kulms et al. 2002). In mammalian ovaries, many studies indicate that 17bestradiol can act as an anti-apoptotic factor for granulosa cells (Guthrie et al.1995; Chun et al.
1996; Narkar et al.2006). The relationship between follic-ular apoptosis and plasma 17bestradiol levels in the repro-ductive dynamics of teleosts has been investigated in a few species, for exampleOncorhyncus mykiss(Janz et al. 1997) and Chalcalburnus tarichi (Kaptaner and Ural 2006). Cytoskeletal changes have been extensively reported in apoptotic cells in which alterations of cell shape and anchorage are dependent on reorganisation of actin filaments and focal adhesion contacts (Korsnes et al.2007). In relation to cell anchorage, the detachment of the cell of its extracel-lular matrix promotes the dephosphorylation of focal adhe-sion kinase resulting in activation of caspase cascade leading to apoptosis (Frisch and Francis,1994).
The extracellular matrix–cell interactions influence gene regulation, cytoskeleton structure, differentiation and many aspects of cell growth (Irving-Rodgers and Rodgers2005). The balance between degradation and regeneration of the extracellular matrix is maintained, in part, by the action of extracellular proteolytic enzymes that are secreted by local cells. Most of these enzymes are matrix metalloproteinases (MMPs), which depend on the binding of Ca2?or Zn2?for their activity (Sternilicht and Werb2001). During oogenesis, the extensive changes in the ovarian extracellular environ-ment have been largely attributed to the action of MMPs (Curry and Osteen2003). The MMPs play an important role in the ovulatory process in different vertebrate groups, acting in the follicular rupture, fragmentation of the basement membrane and connective fibres of the follicle (Curry and Osteen2003; Ogiwara et al.2005). The role of MMPs in the dynamics of the reproductive cycle for teleosts has been few investigated. The expressions of gelatinase A (MMP-2) and B (MMP-9) were detected in the ovaries ofOryzias latipes
(Matsui et al.2000; Ogiwara et al.2005).
The follicular growth and ovulation as well as the involution of postovulatory follicles of ovarian follicles are accompanied by changes in the extracellular matrix. These changes can influence the follicular maturation, the cell survival, and steroidogenesis. However, there are no
studies that identify the cells responsible by the MMPs synthesis and distribution of elements of the extracellular matrix in teleosts. In this context, this study used immu-nohistochemistry to characterise the distribution of laminin b2, collagen type IV, fibronectin and MMP-9 in follicular development until involution post-spawning. Follicular apoptosis was assessed by TUNEL in situ, and the plasma 17bestradiol levels by immunofluorometry.
Materials and methods
Animals
A total of 20 females of the Prochilodus argenteus, a commercial fish from the Sa˜o Francisco river basin, were utilised. The followed reproductive stages were assessed: resting (n =3), ripe (n=4), recently post-spawning (n =5), 48 h post-spawning (n=4) and 96 h post-spawning (n=4). Since P. argenteus does not naturally spawn in captivity, ripe females (36.8±0.3 cm total length; 0.6±0.05 kg body weight) were induced to spawn in order to obtain spawned ovaries. The fish received two doses of crude carp pituitary extract (CCPE) with a 12 h interval between doses according to methodology previous established for the species (Sato et al. 1996). Following spawning, females were kept in concrete tanks with a continuous water flow at 24°C until 96 h post-spawning.
Fishes were anaesthetised with tricaine methanosulfonate (Sigma 0.17 g/L) for data collection.
Histology
Ovarian samples were fixed in Bouin’s fluid for 6 h at room temperature. The samples were subsequently embedded in paraffin or glycol methacrylate, sectioned with 5lm thick-ness, and stained with hematoxylin-eosin (HE), Gomori tri-chrome or toluidine blue-sodium borate (BT). Some sections were also processed for the periodic acid-Schiff (PAS) reaction and counterstained with hematoxylin.
TUNEL in situ reaction
Ovarian samples were fixed in 4% paraformaldehyde solution in 0.1 M phosphate buffer (PBS) at pH 7.3 for 24 h, embedded in paraffin, sectioned with 6lm thickness and submitted to TUNEL assay by using the TdT FragEL DNA fragmentation detection kit (Calbiochem). The sec-tions were briefly incubated with terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) and biotin-conjugated deoxinucleotides for 3 h at 37°C, followed by streptavidin conjugated with
peroxidase for 45 min in a humidified chamber at room temperature. Finally, the reaction was developed with
216 J Mol Hist (2010) 41:215–224
diaminobenzidine (DAB) for 2 min and followed by counterstaining with hematoxylin. For the negative control, the treatment with TdT labelled-deoxinucleotides was omitted. For inactivation of endogenous peroxidase and permeabilisation of cell membranes, hydrogen peroxide 3% and proteinase K were used, respectively.
Immunohistochemistry
For the detection of MMP-9, collagen type IV, lamininb2, fibronectin and actin (Table1), ovarian samples were fixed in DMSO/methanol (2:8), embedded in paraplast (Sigma) and sectioned with 6lm thickness. For antigen recovery, two methods were used: enzymatic with proteinase K for 10 min at room temperature for lamininb2 and fibronectin and heat-induced epitope retrieval with sodium citrate buffer (10 mM Sodium Citrate, 0.05% TWEEN 20, pH 6.0) for 30 min at 95°C for MMP-9 for collagen type IV
and actin. After washing in phosphate-buffered saline (PBS), the sections were incubated with 3% hydrogen peroxide in methanol to inactivate endogenous peroxidase and subsequently with blocking buffer (BSA 2%? TRI-TON X-100?TWEEN 20) for 30 min to allow perme-abilisation and block unspecific staining. Primary antibodies were applied to the sections overnight at 4°C.
For immunohistochemical staining, two methods were used: immunoperoxidase detection with horseradish per-oxidase (HRP) kit LSAB 2 System HRP (DakoCytomation, Carpinteria, CA., USA) visualised by diaminobenzidine (DAB) counterstained with hematoxylin and immunofluo-rescent detection with secondary antibodies ALEXA 488 anti-rabbit (1:200) and ALEXA 568 anti-mouse (1:200) and DAPI (1:500) were used for DNA labelling. A negative control was performed by omitting treatment with the primary antibody.
Morphometric analyses
The follicular apoptosis index (apoptotic cells/total cells in the follicle) was established in histological sections sub-jected to the TUNEL technique. The means of the follicular apoptosis index (AI) values were calculated by using 30
follicles at each stage of follicular development: resting, ripe, recently post-spawning, 48 and 96 h post-spawning. The TUNEL-positive cells that also presented morpho-logical alterations were identified as apoptotic cells (Santos et al. 2005). The immunostained area of laminin b2, col-lagen type IV and MMP-9 was calculated by digital image analysis using ImagePro-Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, MD). Images were captured through an Axiostar Carl Zeiss microscope fitted with a Sony Cyber-shot DSC-W1 camera. A series of 15 random images of postovulatory follicles from different specimens were taken for each immunostained parameter to obtain a mean value for sta-tistical comparison. The brown stain was selected, a colour mask was made, and then applied, equally, to all images and measurements were taken. Only the percentage of the postovulatory follicle correspondent to immunostained area was computed.
Plasma 17bestradiol levels
Samples of blood (1.0–5.0 mL) from females at resting, ripe and recently post-spawning, 48 and 96 h post-spawn-ing were collected through caudal vein puncture. Aliquots of the serum were kept at -20°C and the 17b estradiol
levels were determined by indirect immunofluorimetric assay using the Estradiol AutoDELFIAÒtest (PerkinElmer Waltham, Massachusetts, USA) with sensitivity of 13.6 pg/ ml.
Statistics
Statistical analysis was performed using GraphPad InStat software, version 3.05 (San Diego, CA., USA). Values were expressed as means±SEM, and results were con-sidered significant at the 95% confidence interval. The Kruskal–Wallis test followed by the Dun’s test was used to compare the means of the follicular apoptosis index. The ANOVA followed by the Tukey’s test were used to com-pare to 17bestradiol levels, and also to the immunostaining reactions. Graphics were produced using GraphPad Prism software, version 4.00.
Table 1 Primary antibodies,
suplliers, and dilutions Antibodies Clone Dilution Supplier Antigen recovery
Anti-MMP-9 (2C3) monoclonal-mouse 1:10 sc-21733 Heat-induced epitope retrieval
Anti-collagen type IV (H-234) polyclonal-rabbit 1:100 sc-11360 Heat-induced epitope retrieval
Anti-lamininb2 (H-300) polyclonal-rabbit 1:50 sc-20777 Enzymatic
Anti-fibronectin (H-300) polyclonal-rabbit 1:25 sc-9068 Enzymatic
Anti-actin (C-2) monoclonal-mouse 1:100 sc-8432 Heat-induced epitope retrieval
J Mol Hist (2010) 41:215–224 217
Results
Follicular development
In the resting ovaries of P. argenteus, the ovigerous lamellae showed oogonia nests and perinucleolar follicles, with oocytes presenting basophilic cytoplasm, a central vesiculous nucleus and several peripheral nucleoli (Fig.1a, b). These oocytes were surrounded by squamous follicular cells and thin connective theca (Fig.1c). During advanced maturation the ovaries showed vitellogenic follicles in the ovigerous lamellae, characterised by oocytes filled with acidophilic yolk globules, a central nucleus and also sur-rounded by squamous follicular cells (Fig.1d, e). The ovaries reached full maturation characterised by displace-ment of the nucleus of vitellogenic oocytes towards the micropyle (Fig.1e). The PAS-positive reaction (Fig.1f, g) was detected in zona radiata, granulations between the yolk globules, basement membrane, and eosinophilic granulo-cytes. The development of the zona radiata was initiated in
the advanced perinucleolar stage, becoming a thick layer in the vitellogenic oocyte. During follicular development, the follicular cells were supported by a thin and continuous basement membrane.
Immunolabelling for extracellular matrix proteins, lamininb2 (Fig.2a–d) and collagen type IV (Fig.2e) were detected in the basement membrane of the oogonia nests, ovigerous lamellae and ovarian follicles during the differ-ent developmdiffer-ent stages. In resting ovaries, the MMP-9 was detected in the muscle cells of arteries, although in the oogonia nests and perinucleolar follicles, the MMP-9 showed no immunoreactivity (Fig.2f). In the vitellogenic follicles, the MMP-9 labelling was observed in zona radiata inner, micropyle cell, and some follicular cells (Fig.2g–i).
Fig. 1 Histological sections of P. argenteus ovaries stained with toluidine blue (a, b, d), Gomory trichrome (c), hematoxylin-eosin (e) and periodic acid-Schiff (PAS)-hematoxylin (f,g).a,bOvary in resting stage with perinucleolar follicles (O1 and O2) and oogonia (Oo) with pre-follicular cells (PF). c Perinucleolar follicle surrounded by squamous follicular cells (arrows) and thin connective theca (CT). dOvary in advanced stage of maturation with a predominance of vitellogenic follicles (O4). e Nucleus (N) displaced towards the micropyle (M) during final oocyte maturation.fHistochemical PAS-positive reaction in perinucleolar follicle with a thin zona radiata (ZR) and basement membrane (BM). g Histochemical PAS-positive reaction in vitellogenic follicle with a zona radiata (ZR) thickened and thin basement membrane (BM), eosinophilic granulocytes (arrowhead).Bars20lm (a–c,e,fandg), 100lm (d)
Fig. 2 Immunohistochemical for lamininb2 (a–d), collagen type IV (e) and MMP-9 (f–i) in ovarian follicles ofP. argenteus. Lamininb2 was detected through immunofluorescent-green (a) and immunoper-oxidase (b–d) and collagen type IV immunofluorescent-green (e) in the basement membrane of the oogonia nests (c, e), ovigerous lamellae (d) and ovarian follicles (a,b). The MMP-9 was detected in the muscle cells(MC) of arteries in resting ovary, and in zona radiata inner (ZRI), micropyle cell (M), and some follicular cells (arrows) in the vitellogenic follicles (O4). BM=basement membrane;
Oo=oogonia nests;LO=ovigerous lamellae;O1 and O2= per-inucleolar follicles;ZR=zona radiata.Bars20lm
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Postovulatory follicular regression
In recently spawned ovaries, postovulatory follicles had a large, irregular lumen covered by a layer of hypertrophied follicular cells (Fig.3a) with an exuberant peripheral ring of actin (Fig.3b) and a poorly developed connective theca with eosinophilic granulocytes (Fig.3c). The follicular cells of postovulatory follicles, recently spawned, were supported in thin and continuous basement membrane (Fig.3d).
During the regression of postovulatory follicles, the follicular cells returned to the squamous shape with a dense nucleus (Fig.3e) and disorganised actin cytoskeleton
(Fig.3f). Gradually, the connective theca became thicker and the follicular lumen was occluded (Fig.3e). During the postovulatory regression (48 and 96 h), the basement membrane became diffuse, discontinuous and with a deg-radation aspect (Fig. 3g, h). Other basement membranes were also very evident in the theca of the postovulatory follicles and supporting endothelium of blood vessels.
Continuous labelling to laminin b2 (Fig.4a, b) and collagen type IV (Fig.4c) was detected in the basement membrane of the recently spawned postovulatory follicles. Both proteins showed discontinuous labelling in the pos-tovulatory follicles with 48 h and 96 h post-spawning (Fig.4d, e). In the postovulatory follicles, the MMP-9 was detected in the follicular cells, increasing in intensity in 48 h. In the theca, cells looking like smooth muscle cells of
Fig. 3 Immunohistochemical reaction for actin (b,f) and histological sections of spawned ovary in P. argenteus stained with Gomory trichrome (a, e), hematoxylin-eosin (c) and periodic acid-Schiff (PAS)-hematoxylin (d, g, h). a Postovulatory follicle recently spawned, showing a wide convoluted lumen and hypertrophied follicular cells.bPostovulatory follicle recently spawned, showing with an exuberant peripheral ring of actin (red) in follicular cells and nucleus (blue). cEosinophilic granulocytes (arrowhead) in postov-ulatory follicles.dHistochemical PAS-positive reaction in recently spawned postovulatory follicle with a thin basement membrane (BM) and eosinophilic granulocites (arrowhead). ePostovulatory follicle, 96 h after spawning, showing a partially occluded follicular lumen, squamous follicular cells and thick connective theca.fPostovulatory follicle 96 h after spawning with disorganised actin cytoskeleton (red). Histochemical PAS-positive reaction in postovulatory follicle 48 h (g) and 96 h (h) after spawning evidenced by the fragmentation of the basement membrane (BM). L=lumen; arrows=follicular cells.Bars20lm
Fig. 4 Immunohistochemical reaction for laminin b2 (a, b, e), collagen type IV (c, d), fibronectin (h, i) and MMP-9 (f, g) in postovulatory follicles of P. argenteus. Laminin b2 was detected through enzymatic methods (a,b,e) and collagen type IV fluorescent-green methods (c, d) in the basement membrane (BM) of the postovulatory follicles (POF). Fibronectin was detected through fluorescent-green methods, (h,i) in the basement membrane (BM) and surface of follicular cells (arrows). The MMP-9 was detected in follicular cells (arrows), theca cells looking like smooth muscle cells (TC) and eosinophilic granulocytes (arrowhead) of the postovulatory follicles (f) and 48 h after spawning (g). BV=blood vessel.Bars
20lm (b–i), 100lm (a)
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postovulatory follicles and eosinophilic granulocytes also showed immunoreactivity for MMP-9 (Fig.4f, g). Fibro-nectin in connective tissue and basement membrane of endothelium was immunolocalised. In the postovulatory follicles the fibronectin was detected on the basement membrane, surface of follicular cells, and connective tissue (Fig.4h, i).
Morphometric analyses of the immunostained lamininb2 and collagen type IV in the postovulatory follicles showed that both proteins decreased gradually from zero to 96 h and MMP-9 presented a statistical peak at 48 h (Fig.5).
Apoptosis and plasma 17b estradiol levels
Reaction TUNEL-positive that allowed to evidence of the DNA fragmentation (Fig.6a–e) associated with morpho-logical characteristics, such as condensation of the
chromatin, cell shrinkage and fragmentation similar to apoptotic bodies, allowed the apoptosis identification in the follicular and theca cells.
The apoptosis follicular index (Fig.7) increased from perinucleolar follicles to postovulatory follicles with 48 h post-spawning, decreasing with 96 h post-spawning but did not show a significant statistical difference between 48 and 96 h (P\0.05).
The plasma 17b estradiol levels (Fig.8) increased sta-tistically from resting to ripe, and decreased abruptly soon after post-spawning. Moreover, the plasma 17b estradiol levels in the females with 48 and 96 h post-spawning do not show a statistical difference when compared to females in the resting stage (P\0.05).
Discussion
This study reported for the first time the immunolocalisa-tion of lamininb2, collagen type IV, fibronectin and
MMP-Fig. 5 Immunostained area of laminin b2, collagen type IV and MMP-9 of the postovulatory follicles in P. argenteus. Note the decrease of immunostained area for lamininb2, collagen type IV until 96 h after spawning, while the MMP-9 immunostained area showed a peak at 48 h post-spawning. Values represent means±SEM. Aster-isks indicate that means differ significantly (P[0.05)
Fig. 6 TUNEL-positive reaction during follicular development and postovulatory regression in P. argenteus. a Perinucleolar follicle (O2).bVitellogenic follicle (O4).cRecently spawned postovulatory follicle.dPostovulatory follicle 48 h post-spawning.ePostovulatory follicle 96 h post-spawning. L=lumen; arrows=follicular cells;
arrowheads=theca cells.Bars20lm
Fig. 7 Follicular apoptosis index in resting (O1), ripe (O4) and postovulatory follicles=POF(0, 48 and 96 h) inP. argenteus. Note the peak of the apoptotic index at 48 h post-spawning. Values represent means±SEM (n=30 follicles at each time point). Different letters indicate that means differ significantly (P[0.05)
Fig. 8 Plasma 17bestradiol level concentrations in ovaries in resting, ripe and post-spawning=PS(0, 48 and 96 h) inP. argenteus. Note a peak of the plasma 17bestradiol levels in ripe followed by abrupt drop soon after spawning (0 h). Values represent means±SEM. Different letters indicate that means differ significantly (P[0.05)
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