R e v ista d a S o c ie d a d e B ra sile ira d e M e d ic in a T ro p ica l 24 (1 ): 55 -5 8 , ja n - m a r , 1991
NOTA PRÉVIA
INSERÇÃO DE DNA DE
T R Y P A N O S O M A C R U Z I
NO GENOMA DE CÉLULA
HOSPEDEIRA DE MAMÍFERO POR MEIO DE INFECÇÃO
Antonio R.L. Teixeira, Zulmira Lacava, Jaime M. Santana
e Helena Luna
O b serva m o s a c ro m a tin a d e fo r m a s a m a stig o ta s d e T . cru zi a sso cia d a a cro m o sso m o s d e m a c ró fa g o s m e ta fá s ic o s o b tid o s em d iverso s p e río d o s d a infecção ag ud a. O estu d o im un o citog e-n ètico d e m o e-n stro u q u e o m a te ria l g ee-n ético ie-n serid o e-n a q u e le s cro m o sso m o s era p ro d u to do T . cruzi. P e lo teste d e h ib r id iza ç â o in situ com so n d a b io tin ila d a d e D N A d e T. cruzi, f o i c o n firm a d a a in serç ão d e D N A d o p ro to zo á rio n o s cro m o sso m o s m urin os. A inserção se letiva de JH -D N A do p r o to z o á r io em a lg u n s cro m o sso m o s su g ere q u e p o d e m o correr rearra njos tr a n sxen o g én ic o s em
in fecções d e m a m ífe r o s p e lo T . cruzi.
P a la v ra s-c h a v e s : T ry p a n o s o m a cruzi. M a cró fa g o . T ra nsxen o g en e.
E m tra b a lh o s re c e n te s9 10, m o stra m o s q u e a a d m in istra ç ã o de n itro a re n o s trip a n o c id a s em co elh o s in fecta d o s co m T. c r u z i n ã o d e s a tiv a as le sõ es d a
D o e n ç a d e C h a g a s crô n ic a. A p re se n ç a de m io card ite d e stru tiv a em co e lh o s tra ta d o s co m n itro a re n o s, e nos q u a is as p a ra site m ia s h av iam d e sa p a re c id o , re fo rç a o pa p el d a au to -im u n id ad e, e d e ix a d ú v id a q u a n to à im p o rtâ n c ia d a p e rs is tê n c ia do p a ra sito n a pro g re ssão d a s lesõ es. E m v is ta d e ssa s o b se rv a ç õ e s, p o stu la m o s q u e o T. c r u z iin tra c e lu la r p o d e ria in se rir se u D N A no g e n o m a d a c é lu la h o sp e d e ira in fectad a. N e s s e tra b a lho, d e sc re v e m o s a in se rç ã o seletiv a d e D N A do p ro to z o á rio e m cro m o sso m o s d a c é lu la h o sp ed eira .
M É T O D O S E R E S U L T A D O S
I m u n o c i t o g e n é t i c a : E s s e s e stu d o s fo ram reali zad o s em gru po s d e 25 cam u n d o n g o s B A L B /c , 2 a 15 d ia s a p ó s a in fecção , v ia ip, c o m 105 fo rm as tripo - m a stig o ta s d e T. c r u z i d o e sto q u e B eren ice. M a c ró
fagos p erito n e a is m e ta fá sic o s co lh id o s d a c av id ad e p e rito n e a l fo ram su b m etid o s a o estu d o im un ocito ge- n é tic o 3 5. U so u -se Ig G a n ti-r. c r u z id e cam u n d o n g o s
h ip erim u n es6 co n ju g a d a ao iso tio c ia n à to de
fluores-D e p a rta m e n to de P a to lo g ia , F a c u ld a d e d e C iê n c ia s d a S aú de e D e p a rta m e n to s de G e n é tic a e M o rfo lo g ia e de B iologia C e lu la r, In s titu to d e B io lo g ia d a U n iv e rs id a d e de B ra sília, B ra silia , D F .
E n d e re ç o p a ra c o rre sp o n d ê n c ia : D r. A n to n io R. L. T e ix e ira . L a b o ra tó rio d e Im u n o lo g ia /F C S /U n B . C a ix a P o s ta l 15- 3 1 2 1 , 7 0 9 1 0 B ra sília , D F .
R e c e b id o p a ra p u b lic a ç ã o e m 2 8 /0 3 /9 1 .
ceín a. A an álise d a s p re p a ra ç õ e s m o stro u g e n o m a do p a ra s ito en tre os cro m o sso m o s (F ig u ra 1). U m a c h a d o p e c u lia r co n sistiu n a a sso c ia ç ã o d e c ro m a tin a d e fo rm as a m a stig o ta s com cro m o sso m o s de m acró fag o s
F ig u ra 1 - M e tá fa s e d e m a cro fa g o p e rito n e a l d e c a m u n d o n g o in fe c ta d o co m T ry p a n o so m a cruzi. A se ta m o stra D N A d e n sa m e n te e m p a c o ta d o d e fo r m a a m a stig o ta d e T . c ru z i a sso c ia d o a regiões telo m éric a s d e d o is cro m o sso m o s. L â m in a co ra d a p e lo G iem sa . 1 00 0 X .
m eta fásic o s. O s te s te s d e im u n o flu o resc ên cia id e n ti fic a ra m c ro m a tin a d o T. c r u z iem cro m o sso m os. E s s e
a c h a d o foi d o c u m e n ta d o n a s m esm as m e tá fa se s co ra d a s, p o ste rio rm e n te , pe lo G ie m s a E n tre ta n to , e sse a c h a d o n ã o foi e n c o n tra d o em m acró fag o s co n tro le s, co lh id o s d e c a m u n d o n g o s n o rm ais.
N ota Prévia. Teixeira ARL, Lacava Z, Santana JM, Luna H. Inserção de DNA de Trypanosoma cruzi no genoma de célula hospedeira de mamífero por meio de infecção. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 24:55-58, jan-mar, 1991
A u to -r a d io g r a jia e ca rio tip a g em : E m v ista d e sse a ch a d o , m a rc a m o s o T. c r u z i em c u ltu ra de c é lu la s m u sc u la res d e fetos d e c a m u n d o n g o s co m 3H - tim id in a. O n u c le o tíd e o foi in c o rp o ra d o a o D N A d as fo rm as a m a stig o ta s in tra c e lu la re s, e as fo rm as tri- p o m a stig o tas em erg en te s ( 1 0 5 trip o m a stig o ta s = 3.5 x 104 cpm ) fo ram u sa d a s p a ra in fe c ta r ca m u n don go s. A seguir, fo ram feita s p re p a ra ç õ e s citogené- tic a s com as c é lu la s p erito n e a is d e sses cam u n d o n g o s in fectad o s. A s lâ m in a s c o n te n d o m acró fag o s m eta- fásico s fo ram su b m etid as a au to -rad io g rafias. A p ó s 9 a 21 d ia s de in c u b a ç ã o as lâ m in as re v e la d a s m o s tra ra m g râ n u lo s in d ic ativ o s de e m is são de p artíc u la rad io a tiv a, c o n tid a a p e n a s no 3H - D N A in se rid o em cro m á tid e s d e cro m o sso m o s d o s m acró fag o s (F ig u ra 2). E s s e a c h a d o foi o b se rv a d o a p e n a s n as auto- rad io g ra fias de p re p a ra ç õ e s c ito g e n éticas de an im ais in fectad o s, e n ão foi o b se rv a d o n a s p re p a ra ç õ e s con trole, o btid as de cam und on go s norm ais, não-infectados.
iÊ Ê .rWÂ* .ssum
n.-♦ %
+
• -
%
*s,
jg*
^ #
%
. # \
Ü
if
F ig u ra 2 - A u to -r a d io g ra jia d e m a cró fa g o m eta fá sico co lh id o d a c a v id a d e p e rito n e a l d e c a m u n d o n g o B A L B / c in fe c ta d o co m 1 0 5 tr ip o m a stig o ta s d o esto q u e B eren ic e d e T. cru z i, m a r c a d a s co m 3H -tim id in a . A s se ta s m o stra m g râ n u lo s re s u lta n te s d a red u çã o d o s a l d e p r a ta d a em u lsã o fo to g rá fic a , p e lo 3H -D N A d e T , c ru z i in serid o no cro
m o sso m o . P re p a ra çã o co ra d a p e lo G iem sa . 1 0 0 0 X .
A s b a n d a s G e C do s c ro m o sso m o s d e m a c ró fagos m eta fásic o s, su b m etid o s a au to -rad io g rafias, fo ram o b tid a s co n fo rm e d e sc riç ã o d a lite ra tu ra 12. A c a rio tip a g e m d os cro m o sso m o s de 5 2 m e tá fa se s m o s tro u , c o n sis te n te m e n te , in serçõ es p re fe re n cia is de D N A d e T. c r u z i n os c ro m o sso m o s 3, 6 e 11, p o sto q u e v isu alizad as, re sp e c tiv a m en te , e m 23 (4 4 ,2 % ), 14 (2 6 ,9 % ) e 2 2 (4 2 ,3 % ) d a s m etáfases an alisad as.
H ibrid ização in situ: U m p o o l de frag m e n to s de D N A to ta l de fo rm as d e cu ltiv o d o e sto q u e B eren ice de T. cruzi, a p ó s cliv ag em c o m en d o n u c le a se K la -I, foi u sa d o co m o so n d a. A m a rc a ç ã o d a so n d a com
b io tin a-1 1 d U T P foi fe ita p e la té c n ic a de “ nick- tra n s la tio n ” , d e a c o rd o com p ro to c o lo d a B o ehring- M a n n h e in . A p u rific a ç ã o d a so n d a foi o b tid a em c o lu n a de S ep h a d e x G - 5 0 11.
A s p re p a ra ç õ e s c ito g e n é tic a s fo ram tra ta d a s co m R N a s e (1 0 0 u g /m l) p o r 1 h, a 3 7 °C . A p ó s três rin sag en s em 2 x S S C , as p re p a ra ç õ e s fo ram d e s n a tu ra d a s em so lu ç ã o d e fo rm a m id a a 7 0 % , d u ra n te 2 m in, a 7 0 °C . A so n d a b io tin ila d a foi d ilu íd a p a ra co n c e n tra ç ã o de 10 ng/jiil em m eio de h ib rid iz a ç ã o 11 e d e s n a tu ra d a a 10 0 °C p o r 5 m in. A p ó s resfria m en to , 2 0 jal d a so n d a d e s n a tu ra d a foi d e p o s ita d a so b re lâ m in a , re c o b e rta c o m lam ín u la e in c u b a d a a 3 7 °C , d u ra n te a no ite , em c â m a ra úm ida.
A im u n o c o lo ra ç ã o foi fe ita ap ó s rin sa g em d a s lâ m in a s em b a n h o s de 5 0 % fo rm a m id a em 2 x S S C . O p rim e iro a n tic o rp o a n tib io tin a foi d e p o sita d o n a lâ m in a, re c o b e rta com la m ín u la e in c u b a d a p o r 45 m in, a 3 7 °C . A p ó s três rin sage n s, u so u -se o seg u nd o a n ti c o rp o (a n ti-Ig G c o n ju g ad o a flu o resc eín a). A c o n tra- c o lo ra ç ã o d os n ú cle o s in terfásico s e do s cro m o sso m o s foi fe ita c o m io d eto de pro p íd io . A o b se rv a ç ã o foi feita c o m au xílio de um m icro scó p io A x io p h o t d a Z e iss, c o m siste m a d e a m p lificaç ão de sin ais em ca m p o esc u ro , e fo n te de luz u ltra v io le ta H B O -5 0 .
A h ib rid iz a ç ã o in situ so b re cro m o sso m o s, com so n d a d e D N A b io tin ila d o d e T. cruzi, m o stro u a p re s e n ç a de D N A c o m p le m e n ta r à so nd a. O s po n to s flu o resc en te s, in d ic ativ o s do D N A fo rasteiro , fo ram o b se rv a d o s n o n ú c le o d e m acró fa g o s in te rfásico s e m e ta fá sic o s co lh id o s d e c a m u n d o n g o s in fec tado s (F ig u ra 3). P o r e s s a té c n ic a , 4 2 % d as m etá fase s tin h a m u m ou m ais p o n to s flu o re scen te s d o D N A d e fita ú n ic a, co m p le m en ta r. E s s e s a ch ad o s n ã o foram
F ig u ra 3 —L o c a liz a ç ã o d e D N A b io tin ila d o d e T ry p a n o so m a cru z i em cro m o sso m o de m a cró fa g o m u rin o , a o s 11 d ia s da infecção , p e la técn ica d e h ib r id iza ç ã o in situ. ( V id e m éto d o s p .). A s seta s m o stra m p o n to s flu o re sc e n te s in d ic a tiv o s do D N A c o m p le m e n ta r lo c a liz a d o p e la s o n d a m o lecu la r. C on -tra co lo ra çã o a la r a n ja d a d o s cro m o sso m o s p e lo io deto de p ro p íd io . 1 0 0 0 X .
Nota Prévia. Teixeira ARL, Lacava Z, Santana JM , Luna H. Inserção de DNA de Trypanosoma cruzi no genoma de célula hospedeira de mamífero por meio de infecção. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 24:55-58, jan-mar, 1991
e n co n trad o s em m acró fa g o s c o n tro le s, c o lh id o s de c am u n do ng os n o rm ais.
D I S C U S S Ã O
N e s te e stu d o , o b se rv a m o s a p re s e n ç a de cro - m a tin a de fo rm as am astig o ta s d e T. c r u z i e n tre os c ro m o sso m o s d e m a cró fag o s de cam u n d o n g o s com in fecção ag ud a. T e s te s d e im u n o flu o re sc ê n c ia d ire ta m o stra ra m q u e o s m a te ria is asso c ia d o s ao s cro m o sso m o s do s m acró fag o s e ra m p ro d u to s d o T. cruzi.
A co n firm a ç ão d e sse a c h a d o foi o b tid a c o m estu d o s au to -rad io g ráfic o s, no s q u a is os m acró fag o s eram colh id os d e cam u n d o n g o s in fe c ta d o s c o m T. c r u z i
m a rc a d o c o m 3H -tim id in a . E m ad ição , a in se rç ã o de D N A de T. c r u z i n o g e n o m a d a c é lu la h o sp e d e ira foi d e m o n stra d a p e lo te ste d e h ib rid iz a ç ã o in situ com so n d a b io tin ila d a d e D N A co m p le m e n ta r. E s te te ste m o stro u a lta sen sib ilid ad e p a r a d e te c ç ã o d o D N A h o m ólo g o in serid o , p o is 4 2 % d a s 8 4 m e tá fa se s an ali sa d a s a p re s e n ta v a m u m a o u m ais in se rç õ e s.E sse a c h a d o d ev e se r c o n sid e ra d o em re la ç ã o a u m p ossív el sig nificado bioló gico d e sse fe nôm en o.
A c a rio tip a g e m d e c ro m o sso m o s m e tá fa sic o s m o stro u in se rç õ e s se le tiv a s d o D N A d e T. c r u z i no s cro m o sso m o s 3 ,6 e 11. U m d o s po ssív eis m ec an is m o s p a ra a sele tiv id ad e a p re c ia d a se ria a p re se n ç a d e sítios frágeis id en tific ad o s n as reg iõ es B d o s cro m o sso m o s 3 e 6 4. A c o rre la ç ã o p o te n c ia l en tre sítio s frág eis e re a rra n jo s d e g en es te m re c e b id o e x tra o rd in á ria aten ção . C o n sid e ra m o s, a in da , q u e a a te n ç ã o de v e ser v o lta d a p a ra se q ü ê n c ia s id ên tic a s d e o lig o n uc leo tí- d eo s ( T T A G G G ) e x iste n te s n a s reg iões te lo m é ric a s d e T r y p a n o so m a sp, as q u ais h ib rid iz am cru z a d a - m en te, c o m te lô m e ro s d e cro m o sso m o s h u m a n o e m u rin o 1 1. E x is te a p o ssib ilid a d e d e q u e ta is se q ü ê n cias ho m ó lo g as fa v o re ç am re a rra n jo s g ên ico s (tra n s- x eno ge ne , d o gr. x e n o s = fo rasteiro ) em esp écies filo g en eticam en te d is ta n te s.
A c re d ita m o s q ue re a rra n jo s tra n sx e n o g ê n ic o s p o d e ria m le v a r à e x p re ssã o d e an tíg eno s d o p a ra s ito co d ificad o s p e lo D N A c o m p artilh ad o . S e ria de se esp e ra r, p o rta n to , q u e a e x p re ssã o d e p ro te ín a s co d i ficad as p elo s gen es d o s c ro m o sso m o s 3 ,6 e 11 p o d e ria se r m o d ificad a. S a b e -se q u e o gene qu e co d ifica a e x p re ssã o d a c a d e ia ft do re c e p to r do linfóc ito T e stá p re se n te n o lo cus B d o cro m o sso m o 6; os gen es d a c a d e ia p e s a d a d a m io sin a e d a a - a c tin a d e m ú sc u lo esq u elé tico e s tã o p re se n te s n o s cro m o sso m o s 11 e 3, re sp ectiv am en te^ . C u rio sa m e n te , algu m as lesõ es auto- im unes d a D o e n ç a d e C h a g a s p a re c e m e s ta r re la c io n a d a s à cito to x ic id a d e d o lin fó cito T c o n tra m io sin a de m ú sc u lo e sq u e lé tic o è d e c o ra ç ã o .
P o r o u tro lad o , e x iste ta m b ém a p o ssib ilid a d e de q ue os genes d a c é lu la h o sp e d e ira sejam in c o rp o rad o s
n o g e n o m a d o T. cru zi. A e s te re sp e ito , d e sc re v e u -se a p re s e n ç a de a n tíg en o s d a c é lu la h o sp e d e ira q u e a p a re c e m n a m e m b ra n a d o T. c r u z i e sã o lib era d o s no m e io ex terio r^ . A s p ró x im a s in v e stig açõ es o rie n ta d a s p a ra o c o n h e c im e n to d a co m p le x id a d e d a s re a ç õ e s a u to -im u n e s d e v e m a b o rd a r esse s a sp e c to s d a g en é tic a m o le c u la r do s g en es tra n sfe c ta d o s. E s te tra b a lh o d escrev e, p e la p rim e ira vez, a in se rç ã o d e m ate ria l g en é tico d e u m p ro to z o á rio p ato g ên ic o n o g en o m a de u m a c é lu la de m am ífero .
S U M M A R Y
T ry p a n o s o m a cru z i c h ro m a tin w a s o b served in m a cro p h a g e c h ro m o so m e sp rea d s o b ta in e d a t d iffe ren t p e rio d s o f in fectio n s in B A L B / c m ice. Im m u n o flu o r e s c e n t stu d ie s sh o w e d th a t g e n e tic m a te ria ls a ss o c ia te d w ith th e ch ro m o so m e s were T . cru z i p ro d u cts. In situ h y b rid iza tio n s h o w e d th e p ro to zo o n D N A in sertio n in th e h o s t cell geno m e. I n a d d itio n , selective 3H -D N A in sertio n in ch ro m o so m e s 3, 6 a n d 11 w as observed, w hich su g g ested th a t tr a n sxen o g en e rea rra n g em en t m a y ta k e p la c e in T . c ru z i in fectio n s o f m a m m a ls.
K e y w o r d s : T ry p a n o s o m a cruzi. M a cro p h a g e. T ran sxeno g en e.
A G R A D E C I M E N T O S
N ó s agradecem os a D ra . E v an i V iegas-Pequignot, L a b o ra to ire d e M u ta g e n è se e t S tru c tu re C h ro m o so - m iq u e d e l’ln s titu t C u rie, P a ris , p e la o rie n ta ç ã o téc- n ico -cie n tífic a n a re a liz a ç ã o d a h ib rid iz a ç ã o in situ.
A g ra d e c e m o s a S p a rta c o A sto lfi F ilh o e C e s a r M . S á, d o L a b o ra tó rio de B io lo gia M o lec u la r, In s titu to de B io lo g ia d a U n iv e rsid a d e d e B rasília , p e la s d is cu ssõ es e a p o io no p re p a ro d e so n d as d e D N A .
R E F E R Ê N C I A S B IB L IO G R Á F IC A S
1. A llsh ire R C , D e m p s te r M , H a s tie N D . H u m a n te lo m e rs c o n ta in a t le a s t th re e ty p e s o f G -ric h re p e a t d is trib u tte d n o n -ra n d o m ly . N u c le ic A c id s R e se a rc h 17: 4 6 1 1 -4 6 2 7 , 19 89.
2. C h e ss A , A c o s ta A M , S e th i J K , S a n to s-B u c h G A . R e v e rsib le ac q u is itio n o f a h o st ce ll su rface an tig en by T ry p a n o so m a cruzi. In fe c tio n a n d Im m u n ity 40: 2 9 9 - 3 02 , 1983.
3. C o m m itte e o n S ta n d a rd iz e d G e n e tic N o m e n c la tu re for M ic e . J o u rn a l o f H e re d ity 63: 6 9 -7 2 , 19 72.
4. D ja la li M , A d o lp h S, S te in b a c h P , W in k in g H , H a - m e iste r H . A c o m p a ra tiv e m ap p in g stu d y o f fragile site s in the h u m a n a n d m urine geno m es. H u m a n G e n e tic s 77: 1 5 7 -1 6 2 , 19 87.
5. H a rp e r M E , S a n d e rs G F . L o c a liz a tio n o f single co p y D N A se q u e n c e s o n G -b a n d e d c h ro m o so m e s b y in situ h yb rid iz a tio n . C h ro m o s o m a 83: 4 3 1 -4 3 9 , 198 1. 6. R iz z o L V , C u n h a -N e to E , T e ix e ira A R L . A u to im m u n ity
in C h a g a s’ dise ase: specific in h ib itio n o f re a c tiv ity o f C D 4 + T cells a g a in st m y os in in m ice c h ro n ic a lly
N ota Prévia. Teixeira ARL, Lacava Z, Santana JM , L una H. Inserção de D NA de Trypanosoma cruzi no genoma de célula hospedeira de mamífero por meio de infecção. Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical 24:55-58, jan-mar, 1991
infected w ith T ryp a n o so m a cruzi. Infection an d Im m u n ity 57: 2 6 4 0 -2 6 4 4 , 19 89 .
7. R u d e n k o G , V an d e r P lo e g H T . T ra n sc rip tio n o f telo m ere re p e a ts in p ro to zo a. E M B O Jo u rn a l 8 :2 6 3 3 - 2 6 3 8 ,
1989.
8. S earle A G . M o u s e c h ro m o so m e m app in g. G e n o m ic s 1: 3 -1 8 , 1 9 87 .
9. T e ix e ira A R L , C ó rd o b a J C , S o u to M a io r IC , S o lo rz a n o E A C . C h a g a s ’ disease: ly m p h o m a g row th in ra b b its tre a te d w ith b e n z o n id a z o le . T h e A m e ric a n J o u rn a l o f T ro p ic a l M e d ic in e a n d H y g ie n e 43 : 1 4 6 -1 5 8 , 1 99 0. 10. T e ix e ira A R L , S ilv a R , C u n h a -N e to E , S a n ta n a J M ,
R iz z o L V . M a lig n a n t, n o n -H o d g k in ’s ly m p h o m a in T ry p a n o so m a c ru zi-in fe c te d ra b b its tr e a te d w ith
nitro-a ren es . J o u rn nitro-a l o f C o m p nitro-a rnitro-a tiv e P nitro-a th o lo g y 103: 3 7 -4 8 , 1990.
11. V ie g a s-P e sq u ig n o t E , D u trilla u x B, M a g d e le n a t H , C o p p e y -M o isa n M . M a p p in g o f sin gle-co py D N A se q u e n c e s on h u m a n c h ro m o so m e s by in situ h y b rid iz a tio n w ith b y o tin ila te d probes: e n h a n c e m e n t o f d e te c tio n sen sitiv ity b y in te n sifie d -flu o re sc e n c e dig ital-im ag in g m i c ro sco p y . P ro c e e d in g s o f the N a tio n a l A c a d e m y of S cien ce s o f th e U n ite d S ta te s o f A m e ric a 86: 5 8 2 -5 8 6 , 1986.
12. V ie g a s-P e q u ig n o t E , L in L Z , D u trilla u x B, A p io u F , P a n lin D . A ssig n m e n t o f h u m a n d e sm in g ene to b a n d 2g35 by n o n -ra d io a c ttiv e in situ h y b rid iz a tio n . H u m a n G e n e tic s 83: 3 3 -3 6 , 1 98 9.
