UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
EVIDÊNCIAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS DE OVINOS
INTOXICADOS EXPERIMENTALMENTE COM SEMENTES
DE
Crotalaria spectabilis
(
Leg. Papilionoidea)
Diana Consuelo Cifuentes Sánchez
Médica Veterinária Zootecnista
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E VETERINÁRIAS
CÂMPUS DE JABOTICABAL
EVIDÊNCIAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS DE OVINOS
INTOXICADOS EXPERIMENTALMENTE COM SEMENTES
DE
Crotalaria spectabilis
(
Leg. Papilionoidea)
Diana Consuelo Cifuentes Sánchez
Orientador: Prof. Dr. Mário Roberto Hatayde
Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Unesp, Câmpus de Jaboticabal, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Medicina Veterinária (Clínica Médica Veterinária).
JABOTICABAL – SÃO PAULO - BRASIL
Ficha catalográfica elaborada pela Seção Técnica de Aquisição e Tratamento da Informação – Serviço Técnico de Biblioteca e Documentação - UNESP, Câmpus de Jaboticabal.
Cifuentes Sánchez, Diana Consuelo
C569e Evidências clínico-patológicas de ovinos intoxicados
experimentalmente com sementes de Crotalaria spectabilis
(leg.papilionoidea)/ Diana Consuelo Cifuentes Sánchez. --
Jaboticabal, 2010
xiii, 50 f. : il. ; 28 cm
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias, 2010
Orientador: Mario Roberto Hatayde
Banca examinadora: Julio Carlos Canola, Adriana Coelho de Souza.
Bibliografia
1. Plantas hepatotóxicas. 2. Intoxicação experimental. 3. Monocrotalina. 4. Ovinos. I. Título. II. Jaboticabal - Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias.
DADOS CURRICULARES DA AUTORA
DIANA CONSUELO CIFUENTES SÁNCHEZ – nascida em 10 de novembro de
1982 na cidade de Bogotá - Colômbia, filha de Isaias Cifuentes Vásquez e
Efigenia Sánchez Mancera. Ingressou em agosto de 2003 no curso de Medicina
Veterinária e Zootecnia na Universidad de los Llanos – UNILLANOS –
Villavicencio, concluindo-o em dezembro de 2008. Realizou estágio junto ao
Hospital Veterinário Governador Laudo Natel na área de Clínica Médica de
Grandes Animais no ano de 2008. Em março de 2009 iniciou o Curso de Mestrado
em Medicina Veterinária, área de concentração em Clínica Médica Veterinária, na
O SENHOR é o meu pastor, nada me falta, Ele me faz descansar em verdes prados,
a águas tranquilas me conduz. Restaura minhas forças, guia-me pelo caminho
certo, por amor do seu nome. Se eu tiver de andar por vale escuro, não
temerei mal nenhum, pois comigo estás. O teu bastão e teu cajado
me dão segurança. Diante de mim preparas uma mesa aos
olhos de meus inimigos; unges com óleo minha cabeça,
meu cálice transborda. Felicidade e graça vão
me acompanhar todos os dias da minha
vida e vou morar na casa do
Senhor por muitíssimos
anos.
DEDICO...
A ti meu amado Deus porque tudo o que sou e o que tenho é dádiva do teu infinito
amor.
Aos meus amados pais, Isaias Cifuentes e Efigenia Sánchez, e aos meus
irmãos, Paola Cifuentes, Andrea Cifuentes, Isaias Cifuentes e Jorge Luis
Cifuentes, por acreditarem em mim e sempre me lembrarem que tenho uma
família que me ama e espera sempre por mim.
A minha querida velinha Ligia Melo por seu amor e suas orações.
A Daniel Rodriguez, pelo apoio e amor incondicional.
A toda a comunidade da Paróquia de Santa Teresa por me acolher com tanto
carinho e me permitir fazer parte de suas vidas, tornando assim mais fácil este
tempo longe dos meus. Muito Obrigada !!
As minhas Amigas Natalia Castillo, Adriane Molardi Bainy, Juliana Baldín,
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Prof. Dr. Mario Roberto Hatayde, por acreditar em mim e
sempre me orientar de forma especial, ajudando no meu desenvolvimento pessoal
e cientifico.
A minha querida amiga Kalina Simplício, por sua autêntica amizade e palavra
certa em todo momento e pelo apoio incondicional na realização do experimento.
Ao Prof. Dr. Julio Carlos Canola, pela colaboração na realização das biópsias do
experimento.
Ao Prof. Dr. José Jurandir Fagliari, por suas curtas, mas importantes
orientações.
Ao Prof. Dr. Euclides Braga Malheiros, pelo auxílio nas análises estatísticas.
A Médica Veterinária Claudia Momo, pelo auxílio na leitura das lâminas
histológicas.
A Médica Veterinária Lucimara Borges, pela colaboração na realização do
experimento.
Aos funcionários do Setor de Grandes Animais do Hospital Veterinário
“Governador Laudo Natel”, pela ajuda quando necessária e pela amizade. Em
especial a Arildo Pereira dos Santos por sua grande e incondicional
colaboração.
Aos funcionários do Laboratório de Apoio à Pesquisa do Departamento de Clínica
Nogueira e Paulo César da Silva, pelo auxilio no processamento das amostras e
análises laboratoriais e por tantos momentos vividos.
A Francisca de Assis Ardisson, pela elaboração das lâminas histológicas.
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para que fosse possível
a realização e conclusão deste estudo.
A FCAV – UNESP – Câmpus de Jaboticabal, em particular ao curso de
pós-graduação em Medicina Veterinária, por ter me acolhido e proporcionado a
possibilidade de realizar este trabalho.
Ao CNPq, pela bolsa de estudos concedida.
SUMÁRIO
Página
LISTA DE ABREVIATURAS... viii
LISTA DE FIGURAS ... ix
LISTA DE TABELAS.. ... x
RESUMO ... xii
SUMMARY ... Xiii 1. INTRODUÇÃO ... 1
2. REVISÃO DE LITERATURA ... 2
3. OBJETIVOS ... 11
3.1 Objetivo geral ... 11
3.2 Objetivos específicos ... 11
4. MATERIAL E MÉTODOS ... 12
4.1 Animais e instalações ... 12
4.2 Delineamento experimental ... 12
4.2.1 Modelo de indução da intoxicação experimental ... 12
4.3 Procedimentos ... 13
4.3.1 Exame físico ... 13
4.3.2 Colheita de amostras de sangue ... 14
4.3.3 Hemograma ... 14
4.3.4 Bioquímica sérica ... 14
4.3.5 Avaliação ultrassonográfica e biópsia hepática ... 15
4.3.6 Exame histológico... 16
4.4 Análise estatística ... 17
5. RESULTADOS ... 18
5.1 Exame físico ... 19
5.2 Hematologia ... 20
5.2.1 Leucograma ... 20
5.3 Perfil Bioquímico ... 24
5.3.1 Enzimas ... 24
5.4 Proteinograma sérico ... 27
5.5 Exame ultrassonográfico ... 28
5.6 Exame Histológico ... 33
6. CONCLUSÕES ... 37
7. REFERÊNCIAS ... 38
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA Análise de variância APs Alcalóides pirrolizidínicos AST Aspartato aminotransferase
Cebea Comissão de ética e bem – estar animal
CHCM Concentração de hemoglobina corpuscular médio
CIDASC Companhia integrada de desenvolvimento agrícola de Santa Catarina CK Creatina fosfoquinase
EDTA Ácido dietilenodiamino teracético FA Fosfatase alcalina
fL Fentolitro
g/dL Gramas por decilitro GGT Gamaglutamiltransferase HE Hematoxilina- eosina MCT N-óxido Monocrotalina N-óxido MCT P Monocrotalina pirrol MCT Monocrotalina
mg/dL Miligramas por decilitro NRC National Research Council PFA Proteínas de fase aguda S.A.S Statistical Analysis System
SDS – PAGE Técnica de electroforese em gel de acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
U/L unidades internacionais por litro VCM Volume corpuscular médio Į – globulina Alfa – globulina
LISTA DE FIGURAS
Página Figura 1. Diferentes pontos de realização da biópsia hepática, em função
do tempo de administração de sementes de C. spectabillis na ração... 31 Figura 2. Ultrassonografia do parênquima hepático de ovino do G2 no
tempo controle (T0), ilustrando a região de interesse (RI), onde é verificado o grau de congestão hepática através da quantificação do número de pixels. Regiões dorsal (D) e ventral (V) do animal, região de pele e tecido subcutâneo (P/S), região diafragmática (DF)... 31 Figura 3. Ultrassonografia em plano transversal do parênquima hepático
de ovino do grupo G3 no 14° dia após inclusão das s ementes (T2), mostrando a dilatação da veia porta (VP), congestão hepática (C), hiperecogenicidade decorrente do efeito de reverberação do eco no momento do disparo... 32 Figura 4. Representação gráfica do número de pixels de ovinos em
função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração... 33
Figura 5. Fotomicrografia do fígado de ovino do G2 no 7° dia de intoxicação (T1), ilustrando a presença de infiltrado polimorfonuclear periportal acentuado (cabeça da seta negra), proliferação dos ductos biliares com fibrose (seta negra). Coloração HE aumento de 400X... 35 Figura 6. Fotomicrografia de ovino G2 no 14° dia de intoxica ção (T2),
ilustrando a presença de moderado infiltrado inflamatório mononuclear multifocal (cabeça da seta negra), degeneração gordurosa difusa discreta (cabeça da seta branca), uma grande área de necrose multifocal moderada (seta branca). Coloração HE, aumento de 400X... 35 Figura 7. Fotomicrografia de ovino do G3 no14° dia de intoxi cação (T2),
ilustrando a presença de infiltrado inflamatório mononuclear acentuado (cabeça da seta),e polimorfonuclear multifocal discreto (seta negra), área de necrose (seta branca). Coloração HE, aumento de 400X... 36 Figura 8. Fotomicrografia de ovino do G3 no14° dia de intoxi cação (T2),
LISTA DE TABELAS
Página Tabela 1. Médias e desvios - padrão dos parâmetros da frequência
cardíaca (FC), frequência respiratória (FR) e da temperatura corpórea (Temp.), de ovinos alimentados com diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na
ração, UNESP – Jaboticabal, 2010... 19 Tabela 2. Médias e desvios-padrão do peso corporal (kg) de ovinos em
função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP –
Jaboticabal, 2010... 20 Tabela 3. Médias e desvios-padrão da contagem total de leucócitos
(x103/ȝL) no sangue de ovinos em função do tempo de
inclusão de diferentes concentrações de sementes de
Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.... 20
Tabela 4. Médias e desvios - padrão da contagem total de linfócitos (x103/ȝL) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010... 21
Tabela 5. Médias e desvios - padrão da contagem total de neutrófilos segmentados (x103/ȝL) de ovinos em função do tempo de
inclusão de diferentes concentrações de sementes de
Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal,
2010... 21 Tabela 6. Médias e desvios - padrão do número de eritrócitos (x106/ȝL)
no sangue de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010... 22
Tabela 7. Médias e desvios - padrão do volume globular (%) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP –
Jaboticabal, 2010... 23 Tabela 8. Médias e desvios - padrão do teor de hemoglobina (g/dL) no
sangue de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010... 23
Tabela 9. Médias e desvios - padrão da atividade sérica da enzima gamaglutamiltransferase (U/L) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de
Tabela 10. Médias e desvios - padrão da atividade sérica da enzima aspartato aminotransferase (U/L) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal,
2010... 25 Tabela 11. Médias e desvios - padrão da atividade sérica da enzima
creatina fosfoquinase (U/L) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de
Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010... 26
Tabela 12. Médias e desvios - padrão da concentração sérica de proteína total (g/dL) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010... 26
Tabela 13. Médias e desvios - padrão da concentração sérica de albumina (g/dL) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010... 27
Tabela 14. Concentrações séricas de proteínas (médias ± desvios-padrão (mg/dL) obtidas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na
ração, UNESP – Jaboticabal, 2010... 29 Tabela 15. Médias e desvios–padrões do grau de número de pixels de
ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na
EVIDÊNCIAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS DE OVINOS INTOXICADOS
EXPERIMENTALMENTE COM SEMENTES DE Crotalaria spectabilis
(Leg.Papilionoidea)
RESUMO - Foram utilizadas 15 fêmeas ovinas, sem raça definida, alocadas em três grupos de cinco animais cada, com porcentagens de inclusão de 0,4% (G1), 0,6% (G2) e 1% (G3), de sementes de C. spectabilis trituradas e misturadas na ração, num
período experimental de 28 dias. As colheitas de amostras sanguíneas e biópsias hepáticas para exame histológico seguiram o esquema: T0 (dia anterior à inclusão de sementes), T1 (7 dias após inclusão das sementes), T2 (14 dias após inclusão das sementes), T3 (21 dias após inclusão das sementes) e T4 (28 dias após inclusão das sementes). As amostras de tecido hepático foram obtidas através da técnica de biópsia percutânea com agulha de tipo tru-cut guiada por ultrassom. Os resultados foram submetidos à análise de variância (ANOVA), com auxílio do programa estatístico Statistical Analysis System (SAS-Versão 9.1). Os contrastes de média pelo teste de Tukey com 95% de confiabilidade (p<0,05). Clinicamente apenas um animal do G3 no 21° dia após a inclusão de sementes (T3) apresentou sinais clínicos de intoxicação por
C. spectabillis. Os resultados dos parâmetros hematológicos mantiveram-se dentro da
faixa de normalidade para a espécie. As atividades séricas das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e creatina fosfoquinase (CK) não apresentaram diferenças significativas entre os grupos, enquanto gamaglutamiltransferase (GGT) apresentou diferença significativa entre o G1 (33,66±25,8 U/L) e o G2 (67,3±14,8 U/L) ambos no momento controle (T0). À avaliação ultrassonográfica evidenciou-se alterações hepáticas ao longo de todo o período experimental sendo confirmadas pelos achados histológicos. Concluiu-se que a análise do hemograma e das provas de função hepática isoladamente não têm valor diagnóstico para a intoxicação por C.spectabillis em ovinos,
fazendo-se necessário a realização de exames complementares, como a ultrassonografia e a biópsia hepática percutânea.
CLINICAL AND LABORATORIAL EVALUATION OF SHEEP EXPERIMENTALLY
INTOXICATED WITH Crotalaria spectabilis (Leg. Papilionoidea) SEEDS
SUMMARY - Fifteen (15) ovine females, with no defined breed were alloted in three groups. Each group had five animals and different inclusion percentage of the
Crotalaria spectabilis seeds, 0,4% (G1), 0,6% (G2) e 1% (G3). The seeds were grinded,
mixed in the ration and supplied once/day to the animals through 28 days. Blood sampling and hepatic biopsies were accomplished as follows: T0 (day prior to intoxication), T1 (7 days after seed inclusion), T2 (14 days after inclusion), T3 (21 days after inclusion) and T4 (28 days after inclusion). Hepatic tissue samples were obtained by the percutain biopse technique with tru-cut needles guided by ultrasound. Results were submitted to variance analysis (ANOVA) aided by the Statistical Analysis System (SAS-Versão 9.1). The means contrasts were accomplished by Tukey test, with 95% of reliability (p<0,05). Only one (1) animal from G3 on the 21st day after seed inclusion (T3) showed clinical signs of intoxication. Hematological parameters stayed within normality range for ovine species. Serum activity of the enzymes aspartate aminotransferase (AST) and creatine kinase (CK) did not show significant difference between groups, while gama-glutamyl tranferase (GGT) showed difference between G1 (33,66±25,8 U/L) and G2 (67,3±14,8 U/L), both in the control moment (T0). Ultrasound examination evidenced hepatic alterations during the whole experimental period which was confirmed by histological findings. It was concluded that both hemogram and hepatic function analysis isolated has no diagnostic value in C.spectabillis intoxication in sheep being
necessary to perform some complementary exams, like ultrasound examination and percutain hepatic biopse.
1. INTRODUÇÃO
No Brasil há, pelo menos, 35 espécies de plantas hepatotóxicas distribuídas em 16 gêneros e que podem ser divididas em três grupos: plantas que causam necrose hepática aguda, plantas que causam fibrose hepática e plantas que causam fotossensibilização (SANTOS et al. 2008).
As perdas econômicas ocasionadas pelas intoxicações por plantas podem ser definidas como diretas ou indiretas. As perdas diretas são causadas pela morte de animais, diminuição dos índices reprodutivos, redução da produtividade nos animais sobreviventes, alterações decorrentes de doenças transitórias, enfermidades subclínicas com diminuição da produção, e aumento da susceptibilidade à outras doenças decorrente da depressão imunológica. As perdas indiretas incluem custos com o controle das plantas tóxicas nas pastagens, medidas de manejo para evitar intoxicações, como a utilização de cercas e o pastoreio alternativo, a redução do valor da forragem em razão ao atraso na sua utilização e os gastos associados ao diagnóstico das intoxicações e tratamento dos animais afetados. As perdas econômicas causadas pelas intoxicações por plantas são difíceis de estimar por não existirem dados confiáveis sobre todos os componentes envolvidos. No entanto, as perdas causadas por mortes são fáceis de determinar quando se dispõe de dados elaborados por laboratórios de diagnóstico, sobre a frequência das causas de mortes numa determinada região (RIET-CORREA et al. 1993).
2. REVISÃO DE LITERATURA
O gênero Crotalaria pertence à família Leguminosae, subfamília Papilionoideae,
que compreende cerca de 600 espécies, distribuídas especialmente em áreas tropicais e subtropicais do planeta (WILLIAMS & MOLYNEUX, 1987). As plantas do gênero Crotalaria são amplamente utilizadas como adubação verde, destinadas à recuperação de solos empobrecidos, em consórcio com culturas como o milho. Para tal finalidade, a crotalária é plantada e posteriormente incorporada ao solo, melhorando o conteúdo de compostos nitrogenados essenciais para outras culturas, além de evitar a erosão (JOLY, 1977; LORENZI, 1991).
Plantas do gênero Crotalaria são vulgarmente conhecidas por "xique-xique",
"guizo-de-cascavel" ou "chocalho-de-cascavel", pois os frutos, quando secos, produzem som semelhante ao de chocalho ao serem tocados. Também em função disso é que a planta recebeu o nome científico de Crotalaria, termo que, em latim, significa chocalho (TOKARNIA et al. 2000).
Atualmente algumas espécies de crotalaria são consideradas invasoras devido à sua vasta disseminação (LEITÃO FILHO et al. 1975). Segundo LORENZI (1991), a C. spectabilis é uma planta anual, subarbustiva, ereta, ramificada, glabra, medindo entre
70 e 100 cm, com reprodução por sementes. Suas folhas são simples, mucronadas no ápice, glabras na face superior e pubescentes na inferior, apresentando de 6 a 12 cm de comprimento e de 2 a 4 cm de largura, com estípulas de 5 a 7 cm de comprimento. Apresenta flores amarelas que crescem em racemos terminais e auxiliares de até 30 cm de comprimento, com 20 a 40 flores. As vagens com sementes imaturas são verdes e escurecem gradualmente, até tornarem-se pretas quando maduras. As sementes são firmes, pretas e lustrosas, medem 4 x 3 x 2mm e pesam 13,8 mg, em média.
milímetros) de diâmetro. Portanto, as sementes de crotalaria são consideradas
impurezas se presentes em ração animal por atravessarem a peneira.
Nos Estados Unidos da América, a C. spectabilis tem sido extensivamente usada
como adubação verde em solos leves, disseminando e tornando-se silvestre. Neste País, onde a espécie é considerada a mais tóxica do gênero, espaços naturais de intoxicação têm sido descritos em equinos, bovinos, ovinos, caprinos, suínos e aves (CLARKE & CLARKE, 1967).
Plantas do gênero Crotalária contêm alcalóides pirrolizidínicos (APs) constituintes
comuns de uma centena de espécies de plantas. Os APs são encontrados em mais de 20 grandes famílias de plantas, entretanto, apenas três famílias - Boraginaceae, Compositae (Asteraceae), e Leguminosae (Fabaceae) contêm os alcalóides considerados mais tóxicos. WILLIAMS & MOLYNEUX (1987), estudando a concentração de APs em sementes de 41 espécies de crotalaria, provenientes do
Brasil, verificaram que nas amostras de C. spectabilis havia maior quantidade de APs
quando comparadas às outras.
O principal alcalóide pirrolizidínico contido na C. spectabilis é a monocrotalina
(MCT), a qual foi isolada por NEAL et al. (1935), podendo ser encontrada em todas as partes da planta (PIERCY & RUSOFF, 1946). No entanto nas sementes foi constatada uma quantidade de até 3,98% do peso seco (JOHNSON et al. 1985; WILLIAMS & MOLYNEUX, 1987). A espectabilina, outro alcalóide pirrolizidínico, também pode ser encontrada em pequenas quantidades (BULL et al. 1968).
Quanto ao metabolismo da MCT, TAYLOR et al. (1997), mostraram que a mesma pode sofrer diferentes processos metabólicos no interior dos hepatócitos. FU et al. (2002) e WANG et al. (2005) consideraram que o metabolismo da MCT está diretamente relacionado a três processos principais:
1. Hidrólise do grupo funcional éster, para formação da base retronecina e ácido monocrotálico;
2. Processo de N-oxidação da base retronecina, promovendo a formação de monocrotalina N - óxido (MCT N – óxido);
3. Formação de derivados dehidrocrotalina ou monocrotalina pirrol (MCTP) através da hidroxilação das posições C-3 ou C-8 da base retronecina.
Esses compostos altamente reativos ligam-se de forma covalente ao DNA ou às enzimas hepáticas (MATTOCKS, 1968) causando danos hepáticos que vão desde edema e necrose centrolobular, megalocitose, cariomegalia, fibrose, proliferação de ductos biliares, veno-oclusão até perda total da função hepática (CHEEKE & SHULL, 1985; SCHULTZE et al. 1996; HANUMEGOWDA et al. 2003; WANG et al. 2005). Segundo COPPLE et al. (2002), a MCTP, também denominada dehidromonocrotalina, é o metabólito responsável pela toxicidade da MCT “in vivo” induzindo efeitos tóxicos sobre o fígado e o pulmão, desencadeando neste último a denominada hipertensão pulmonar.
cérebro. A insuficiência hepática ocorre quando 70% ou mais da capacidade funcional do fígado é perdida (TENNANT, 1997), o que acontece quando há perda de 80% a 90% do parênquima hepático, podendo ser visto, tanto em hepatopatias tóxicas agudas quanto crônicas (KELLY, 1993).
Neste contexto, a avaliação da função hepática torna-se importante. A patogenia de doenças hepáticas em animais domésticos é muito complexa, por tanto, o diagnóstico dessas enfermidades também envolve a dosagem de parâmetros bioquímicos séricos entre os quais estão as dosagens das enzimas aspartato aminotransferase (AST) e gamaglutamiltransferase (GGT), que revelam e confirmam a presença de lesão hepática aguda ou crônica. Entretanto, é válido ressaltar que aumento nos níveis de GGT indica a presença de lesões crônicas nos ductos biliares, servindo como marcador sérico primário para doenças do sistema hepatobiliar associadas à colestase. Já a AST é uma enzima citoplasmática e mitocondrial, presente em vários tecidos como fígado, músculos esquelético e cardíaco e em todas as espécies domésticas sua atividade hepática é alta, portanto, marcadamente elevada na lesão hepática aguda ou crônica (TENNANT, 1997).
Creatina fosfoquinase (CK) é uma enzima amplamente utilizada para determinar alterações musculares em animais domésticos, por ser considerada um indicador altamente sensível e específico de lesão muscular, já que a principal fonte dessa enzima são fibras musculares (CARDINET, 1997).
Ao analisar enzimas musculares e hepatobiliares, STOCKHAM (1995) cita que o aumento nos valores séricos de AST, com atividade normal de CK, ocorre em razão de doença hepatobiliar e não de dano muscular, entretanto, deve-se ter cautela nessa conclusão já que a meia-vida da CK circulante é menor que a da AST.
Mesmo que a GGT esteja presente em vários tecidos, elevações na sua atividade sérica são observadas primariamente em desordens hepáticas (TENNANT, 1997). Entretanto, a colestase provoca aumento na atividade sérica dessa enzima em todas as espécies (MEYER et al. 1995; KRAMER & HOFFMANN, 1997), com melhor utilidade diagnóstica que a fosfatase alcalina (FA), em equinos e ruminantes (MEYER et al. 1995), em razão do amplo intervalo de referência da FA nestas espécies (DUNCAN et al. 1994).
A resposta sistêmica a algumas enfermidades é acompanhada por aumento nos níveis de um grande número de proteínas séricas, dentre as quais as proteínas de fase aguda (PFA) (ECKERSALL, 2000). A concentração circulante dessas proteínas está relacionada à severidade da condição orgânica e, portanto, sua quantificação fornece, prontamente, um meio de avaliar a presença e a extensão do processo inflamatório (ECKERSALL, 2000; O´MAHONY et al. 2006).
Segundo KANEKO et al. (1997), o fracionamento eletroforético representa uma das mais confiáveis técnicas de identificação de proteínas sanguíneas, que podem ser classificadas em albumina, alfa-globulina (Į-globulina), beta-globulina (ȕ-globulina) e gama-globulina (Ȗ-globulina). O aumento das PFA também pode ser observado por meio de eletroforese das proteínas séricas e registro de elevação nas frações Į e/ou ȕ
(THOMAS, 2000). A albumina é a fração mais homogênea, solúvel, estável e é encontrada em maior quantidade no plasma. Possui a função de manter a pressão colóide osmótica plasmática, além de ser responsável pelo transporte de várias substâncias endógenas e exógenas. É sintetizada no fígado e constitui cerca de 35% a 40% do total de proteínas séricas (KANEKO et al. 1997).
C5), além de várias enzimas e fatores de coagulação. A fração Ȗ-globulina é composta por substâncias imunologicamente ativas e a formação de anticorpos depende exclusivamente da porcentagem dessa fração protéica no soro. A fração Ȗ-globulina é constituída por imunoglobulinas A, M, E, G e algumas enzimas. Em geral, a IgG representa 85% dessa fração, sendo responsável pelas modificações na curva de eletroforese (KANEKO et al. 1997).
As técnicas de eletroforese mais utilizadas em Medicina Veterinária têm como matrizes fitas de acetato de celulose ou filmes de agarose, as quais apresentam valor limitado porque permitem o fracionamento de apenas cinco a sete grupos de proteínas (FAGLIARI & SILVA, 2002). GORDON (1975) descreveu que a técnica de eletroforese em gel de acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) é relativamente simples e de baixo custo, possibilitando a visualização de concentrações protéicas extremamente baixas e a identificação de 20 a 30 proteínas, necessitando, apenas, micro-quantidade de amostra. O emprego da técnica SDS-PAGE pode ser útil na avaliação da cinética das proteínas de fase aguda da resposta inflamatória facilitando o estabelecimento do diagnóstico de doenças e do prognóstico de intercorrências no período pós-operatório (FAGLIARI & SILVA, 2002; FAGLIARI et al. 2006).
Os benefícios da biópsia hepática são muitos. A facilidade de realização, assim como as poucas complicações envolvidas e a importância diagnóstica, tem incrementado seu uso. Apesar dos avanços nos métodos de investigação das doenças hepáticas, incluindo-se os de imagem e biologia molecular, o exame histológico do tecido hepático é essencial para o diagnóstico, especialmente nas hepatopatias crônicas (SHERLOCK et al. 1984). A biópsia hepática em ruminantes tem aplicação clínica, pois fornece aos profissionais informações sobre a estrutura morfológica do fígado (AMORIM et al. 2003), auxiliando no diagnóstico clínico de deficiências minerais, e na comprovação de determinadas intoxicações (ORTOLANI, 2008).
Das técnicas de biópsia hepática desenvolvidas para animais, a biópsia percutânea com agulhas tipo Tru-Cut prevalece como uma das mais utilizadas, tanto pela sua praticidade como pela possibilidade de oferecer menor risco ao paciente (TOSTES & BANDARRA, 2002).
AMORIM et al. (2003), estudando a técnica de biópsia hepática percutânea em bovinos, concluíram que a técnica é segura e eficaz por não provocar dano hepático extenso e por obter rapidamente fragmentos adequados para análise histológica. As pequenas lesões teciduais causadas por essa técnica não provocaram alterações significativas nas variáveis do hemograma, concentração plasmática de fibrinogênio e nas atividades séricas enzimáticas da fosfatasa alcalina ALP e GGT.
al. 2004) Para tentar evitar possíveis erros de interpretação e minimizar a subjetividade do exame, podemos utilizar técnicas que quantificam a ecogenicidade e a ecotextura das regiões avaliadas. (LU et al. 1997; MAEDA et al. 1998). Uma destas técnicas é o método na escala de cinza que possibilita uma avaliação quantitativa da ecotextura e ecogenicidade de uma região previamente selecionada, demonstrando a distribuição de freqüência na intensidade do eco na região de interesse e mensurando a quantidade de níveis de cinza. O aparelho de ultrassonografia gera uns valores que demonstra a variação dos espectros de cinza que compõem a imagem da área selecionada. A imagem ultrassonográfica é gerada em tons de cinza. Assim é formada pelo preto absoluto, com valor zero, passando por muitas tonalidades de cinza até o branco absoluto, valor 255. A dos níveis de cinza quantifica todas as tonalidades presentes na região de interesse selecionada. Esta forma de análise está disponível em muitos aparelhos ultra-sonográficos comerciais,entretanto sua aplicação tem sido restrita ao meio acadêmico, merecendo padronização de valores para maior uso na prática clínica e em protocolos experimentais na medicina humana e veterinária (MAEDA et al. 1998).
A ecogenicidade é representada por um valor (LMEAN), que indica a luminosidade média da região selecionada. Médias baixas do LMEAN indicam imagens mais escuras, e médias altas, corresponde a imagens mais claras.
Vários são os estudos que verificam a toxicidade das espécies de crotalárias em aves e animais domésticos (CLARKE & CLARKE, 1967; TOKARNIA & DOBEREINER, 1982; BURGUERA et al. 1983; ALFONSO et al. 1993; HATAYDE et al. 1997a; HATAYDE et al. 1997b; SOUZA et al. 1997; HATAYDE et al. 1998; SOUZA et al. 1998, NOBRE et al. 2005; MELO et al. 2010).
quantidade de microorganismos no rúmen capazes de biotransformar esses alcalóides com maior eficiência que os bovinos (CRAIG et al. 1991). As diferentes respostas ou resistência individual dos animais aos APs podem ser reflexo da: 1) detoxificação bacteriana no trato gastrintestinal; 2) taxa de conversão, no fígado, dos APs a pirróis tóxicos e; 3) capacidade anti-oxidativa individual do animal. A quantidade de APs ingerida na alimentação também é importante (CRAIG et al. 1991).
Na intoxicação pelos APs em ovinos pode se observar três quadros clínicos: intoxicação crônica com fotossensibilização e/ou encefalopatia hepática, intoxicação crônica por cobre secundária, e intoxicação aguda. Na intoxicação crônica os animais apresentam sinais clínicos variáveis, que incluem emagrecimento progressivo, apatia, fraqueza, perturbações neurológicas como depressão, andar desequilibrado, pressão da cabeça contra objetos, icterícia e fotossensibilização. Histologicamente, observa-se fibrose periportal, proliferação de células epiteliais de ductos biliares, hepatomegalocitose e bilestase (ILHA et al. 2001, DANTAS et al. 2004). Achados ultra-estruturais no fígado incluem graus variáveis de degeneração hepatocelular caracterizada por acúmulo de numerosas gotas lipídicas no citoplasma de presença de lisossomos carregados de material eletrodenso que, na maioria dos casos, correspondem à lipofuscina-ceróide. Adicionalmente, há discreta dilatação do retículo endoplasmático rugoso e moderada hiperplasia do retículo endoplasmático liso em algumas regiões do citoplasma dos hepatócitos (ILHA et al. 2001).
NOBRE et al. (2005) descreveram a intoxicação aguda pela ingestão de C. retusa em ovinos. Os sinais clínicos observados incluíram anorexia, depressão
acentuada, icterícia moderada, incoordenação e decúbito. Os ovinos morreram cerca de 12 horas após os primeiros sinais clínicos. Na necropsia, o fígado apresentou aspecto de acentuação do padrão lobular com deposição de fibrina na superfície capsular. A vesícula biliar mostrou-se distendida e havia presença de hemorragias subepicárdicas e subendocárdicas, hidropericárdio, hidrotórax e ascite. Os autores relataram, ainda, que as sementes e vagens da planta podiam ser encontradas em grandes quantidades no
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo Geral
Avaliar os efeitos tóxicos das sementes de Crotalaria spectabilis quando trituradas
e adicionadas à ração de ovinos.
3.2. Objetivos Específicos
• Avaliar as alterações clínicas e laboratoriais de ovinos intoxicados experimentalmente com sementes de Crotalaria spectabilis;
4. MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi aprovado pela comissão de Ética e Bem-Estar Animal (CEBEA) da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias /UNESP/ Câmpus de Jaboticabal (protocolo n° 012325-08).
4.1. Animais e instalações
Foram utilizadas 15 fêmeas ovinas, clinicamente sadias, sem raça definida, com aproximadamente três anos de idade e peso médio de 40 kg. Os animais foram alojados em gaiolas individuais equipadas com comedouros e bebedouros, situadas sob área coberta junto ao Setor de Pesquisa do Departamento de Clínica e Cirurgia da FCAV-UNESP- Jaboticabal, SP e submetidas a sete dias de adaptação antes do início do experimento.
Durante o período experimental, foi fornecida dieta composta de feno de capim “coast cross”, água à vontade e ração farelada de milho e soja fornecida em duas refeições diárias segundo recomendações do NATIONAL RESEARCH COUNCIL – NRC (2007). Uma vez observados sinais de intoxicação, confirmados pelos exames clínico e laboratorial, os animais receberam tratamento a base de protetores hepáticos1 e soro glicofisiológico a 5%2, suspendendo-se a administração de sementes de
Crotalaria spectabilis na ração durante o tratamento.
4.2. Delineamento experimental
4.2.1 Modelo de indução da intoxicação experimental
Os animais foram alocados aleatoriamente em três grupos. Para cada grupo foi determinado um nível de inclusão de sementes de C. spectabilis trituradas e
1 Mercepton injetável – Bravet Laboratórios
previamente misturadas na ração, seguindo-se as proporções de 0,4%; 0,6% e 1,0%, como mostra o esquema abaixo.
G1 (n=5) – Ração de manutenção + 0,4% de sementes.
G2 (n=5) – Ração de manutenção + 0,6% de sementes.
G3 (n=5) – Ração de manutenção+ 1,0% de sementes.
O período experimental totalizou 28 dias, sendo as amostras sanguíneas e biópsias hepáticas colhidas da seguinte forma:
T0 – dia anterior ao início da inclusão de sementes de C. Spectabillis na ração
(tempo controle).
T1 – sete dias após do início da inclusão de sementes de C. Spectabillis na ração.
T2 – 14 dias após do início da inclusão de sementes de C. Spectabillis na ração.
T3 – 21 dias após do início da inclusão de sementes de C. Spectabillis na ração.
T4 – 28 dias após do início da inclusão de sementes de C. Spectabillis na ração.
4.3. Procedimentos
4.3.1 Exame físico
4.3.2 Colheita de amostras de sangue
Semanalmente foram colhidas amostras de sangue, antes da realização da biópsia hepática, mediante venopunção jugular, em tubos esterilizados e siliconizados a vácuo3 com e sem anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), para obtenção de sangue total e soro, respectivamente.
As amostras sem anticoagulante foram mantidas em refrigeração até retração do coágulo. Posteriormente foram centrifugadas durante 15 minutos a 500G, acondicionadas em tubos de polipropileno4 e armazenadas à -20°C para futura análise. As amostras contendo EDTA foram utilizadas para realização do hemograma e esfregaço sanguíneo, logo após a colheita.
4.3.3 Hemograma
A contagem de leucócitos, hemácias e os índices hematimétricos foram realizadas em contador semi-automático5. As contagens diferenciais de glóbulos brancos foram feitas com auxílio de microscópio óptico comum, após coloração pelo corante de Rosenfeld (0,97 g de Giemsa em pó azul esosina-azul-de-metileno, Ecibra nº 0390;
0,53 g de May Grüwald eosina-azul de metileno, Ecibra nº 0747; 1000ml Metanol PA,
Cinética cod. 109070).
4.3.4 Bioquímica Sérica
A avaliação da função hepática foi realizada por meio da determinação das atividades séricas de AST, (método de Reitman-Frankel), GGT, (método de Szas modificado), e CK, (método de Szas) e as leituras realizadas em espectrofotômetro
3Vacutainer®,%''LDJQRVWLFV3UHDQDO\WLFDO6\VWHPV
4 Eppendorfes®
semi-automático (Labquest, Belo Horizonte), com comprimento de onda específico para cada constituinte.
A proteína total sérica foi determinada pelo método do biureto empregando-se kit
comercial6. A separação das frações protéicas foi realizada por meio de eletroforese em gel de acrilamida contendo dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), conforme técnica descrita por LAEMMLI (1970). Após fracionamento o gel foi corado durante 10 minutos em solução de azul de coomassie, constituída de metanol (50%), água (40%), ácido acético glacial (9,75%) e azul de coomassie (0,25%). Em seguida o gel foi colocado em solução de ácido acético a 7% para retirar o excesso de corante, até que as frações protéicas se apresentassem nítidas (ver apêndice). As concentrações dessas proteínas foram determinadas em densitômetro computadorizado7. Como referência foi utilizada
uma solução marcadora8 com pesos moleculares 29.000, 45.000, 66.000, 97.400, 116.000 e 205.000 daltons (D), além das proteínas purificadas3 transferrina, haptoglobina, ceruloplasmina, Į1-antitripsina e IgG.
4.3.5 Avaliação ultrassonográfica e biópsia hepática percutânea
A avaliação ultrassonográfia e posterior biópsia hepática foram realizadas entre o 8° e 11° espaços intercostais do antímero direito. Em todos os animais foi realizada uma varredura nos sentidos caudo-craneal e dorso-ventral, onde foi avaliado a ecogenicidade do parênquima hepático padrão ultrassonográfico hepático foi considerado normal quando o fígado apresentava-se no interior do gradil costal, com contornos lisos e margens de ângulos agudos, com ecotextura homogênea, levemente mais grosseira que aquela do parênquima esplênico e, com ecogenicidade igual ou discretamente maior que a do córtex renal e menor que a do baço e a do ligamento falciforme (MAMPRIM, 2004). Com as imagens bidimensionais (2D) armazenadas na memória de um computador e com auxílio de "software específico" foi estabelecida a
6 Kit comercial, Labtest, Belo Horizonte - MG 7 Shimadzu, Tóquio- Japão
região de interesse (RI), com o objetivo de quantificar o número médio de pixels local na escala-cinza e assim determinar grau de ecogenicidade do fígado. Cada (RI) foi delimitada por um retângulo de 10,00 mm de altura por 5,0 mm de espessura de lados, localizado na região central no eixo central do feixe sonoro a uma profundidade de 1 a 2 cm.
Foram colhidos fragmentos hepáticos através da técnica de biópsia percutânea com agulha cortante tipo tru-cut9, para acompanhamento do processo de intoxicação induzida experimentalmente mediante avaliação ultrassonográfica e histológica. Com os animais em posição quadrupedal, uma área de 10 cm de largura por 15 cm de comprimento foi tricotomizada na região do gradil costal direito (MEDEIROS et al. 2002). Para a realização de anestesia local infiltrativa foram usados 2 ml de cloridrato de lidocaína 2,0% sem vasoconstrictor (NAVARRE & PUGH, 2005). Para este procedimento utilizou-se agulha calibre 40 x 16 para perfurar a pele e tecido subcutâneo. Em seguida foi introduzida a agulha cortante tipo tru-cut 14G que perfurou os músculos intercostais até alcançar o fígado. A agulha foi direcionada em sentido à articulação do cotovelo oposto, formando um ângulo de 90° com a pele, e com o auxílio do ultrassom foi determinada a profundidade necessária de penetração da agulha no parênquima hepático para a colheita da amostra hepática, a qual mediu aproximadamente 2,0 cm de comprimento por 3 mm de largura (NAVARRE & PUGH, 2005; MEDEIROS et al. 2002; FERREIRA et al. 1996). Os fragmentos hepáticos foram acondicionados em frascos contendo como fixador formalina a 10% neutro e tamponada, em pH 7,0 para realização dos exames histológicos.
4.4. Exame histológico
Os exames histológicos foram realizados no Departamento de Patologia Veterinária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias – Câmpus de Jaboticabal
As amostras hepáticas foram fixadas por mais de 18 horas numa relação liquido material 10:1, permitindo a completa fixação, logo após foi processado conforme a rotina convencional de processamento histológico com desidratação em diluições crescentes de alcoóis e diafanização em xilol, para inclusão em blocos de parafina histológica.
Os cortes foram realizados em micrótomo, com espessura de 3 μm e corados pelo método histoquímico de rotina, hematoxilina e eosina (HE) segundo técnica descrita por LUNA (1968) posterior analise em microscopia de luz.
4.5. Análise estatística
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Durante o período experimental não houve morte natural dos animais. Um animal do grupo com 1,0% de inclusão de sementes (G3) no 21° dia após a inclusão (T3) começou a apresentar sinais de intoxicação como depressão, diminuição de apetite e hipomotilidade rumenal. Este animal no dia seguinte (22° dia) apresentou-se em decúbito esternal, deprimido, inapetente com hipomotilidade e timpania rumenal, fezes pastosas e pêlos eriçados. Foi suspensa a administração de sementes de Crotalaria spectabilis na ração e realizado tratamento com soro glicofisiológico a 5% e protetor
hepático por três dias, obtendo-se rápida resposta do animal, que reassumiu posição quadrupedal e voltou a se alimentar normalmente. As diferentes respostas ou resistência individual dos animais aos APs podem ser reflexo da: 1) detoxificação bacteriana no trato gastrintestinal; 2) taxa de conversão, no fígado, dos APs a pirróis tóxicos e; 3) capacidade anti-oxidativa individual do animal. Este animal permaneceu dentro do experimento participando da ultima colheita no T4.
Os restantes dos animais não apresentaram sinais clínicos de intoxicação e o consumo da ração nas diferentes proporções de semente de Crotalaria spectabilis foi
total ao longo de todo o período experimental. Estes resultados concordam com relato de ANJOS et al. (2010) em estudo com Crotalaria retusa onde os ovinos reberam a
5.1 Exame físico - clínico
Os animais submetidos a experimentação não apresentaram alterações marcantes no exame físico (Tabela 1). Quanto à temperatura retal, apresentou aumento significativo do valor médio verificado nos animais do grupo com 1,0% de inclusão de sementes (G3) quando comparado com os animais dos grupos com 0,4% (G1) e 0,6% (G2). Apesar da variação encontrada, em todos os grupos estudados a temperatura se manteve dentro do intervalo de normalidade para a espécie ovina (PUGH, 2005).
Os valores maiores das frequências cardíaca e respiratória foram observados nos animais do grupo G3 enquanto os valores menores foram constatados nos animais pertencentes ao grupo G2, porém as frequências cardíaca e respiratória apresentavam-se mais elevadas que o relatado por PUGH (2005), talvez em decorrência das diferentes condições climáticas sob as quais foi realizado este experimento.
Tabela 1. Médias e desvios - padrão dos parâmetros da frequência cardíaca (FC), frequência respiratória (FR) e da temperatura corpórea (Temp.), de ovinos alimentados com diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Quanto à variação do peso corporal dos animais ao longo dos 28 dias de experimento (Tabela 2), foi observado aumento significativo (p<0,05) nos animais do grupo G2 em todos os tempos avaliados quando comparado com o tempo controle (T0). Da mesma forma houve ganho de peso (p<0,05) nos animais do grupo G3 a partir dos 21° e 28° dias (T3 e T4), discordando com o descrit o por NOBRE et al.(2004), em intoxicação de equinos por C. retusa e com Souza et al. (1997), em intoxicacao
experimental de suinos com sementes de C. spectabillis.
Grupo FC (min) FR (min) Temp.(°C)
G1 91,26±5,96a 27,43±4,52a 38,1±0,4b
G2 89,31±5,73a 25,64±2,24a 38,2±0,4b
Tabela 2. Médias e desvios-padrão do peso corporal (kg) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
5.2. Hematologia
5.2.1 Leucograma
O número de leucócitos não variou (p<0.05) entre os grupos de animais e também em função dos tempos, durante todo o período experimental, estando dentro da faixa de normalidade citada por PUGH (2005) para a espécie ovina (Tabela 3).
Tabela 3. Médias e desvios-padrão da contagem total de leucócitos (x103/ȝL) no sangue de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP –
Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
O número total de linfócitos (Tabela 4) aumento a (p<0,05) G3 em relação aos grupos G1 e G2 no tempo controle (T0) e entre os tempos. No entanto estes valores permaneceram dentro da normalidade preconizada por PUGH (2002).
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
G1 49,66±5,72aA 50,14±6,45 aA 50,02±6,39 aA 50,84±6,44 aA 50,92±6,43 aA G2 42,46±7,11 abA 45,92±5,76 aB 46,28±6,20 abB 47,14±6,26 abB 47,20±6,41 abB G3 34,88±6,22 bA 35,40±4,99 bA 36,50±4,42 bAB 37,28±5,24 bB 38,14±5,02 bB
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
Tabela 4. Médias e desvios - padrão da contagem total de linfócitos (x103/ȝL) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
As contagens do número total de neutrófilos segmentados (Tabela 5) apresentaram aumento significativo no G2, quando comparado ao grupo com a maior porcentagem de inclusão de sementes na ração, G3, ambos no tempo controle (T0), Da mesma forma, foi constatada diferença (p<0,05) entre o grupo com 0,4% de inclusão de sementes, G1, e o grupo com 1,0% de inclusão, G3, aos 7 dias após inclusão de sementes na ração, T1. Ainda, foi verificada diferença significativa entre todos os tempos avaliados no G1. No entanto, apesar das variações significativas observadas, todos os valores mantiveram-se dentro da normalidade, segundo PUGH (2005).
Tabela 5. Médias e desvios - padrão da contagem total de neutrófilos segmentados (x103/ȝL) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP –
Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
5.2.2 Eritrograma
De forma geral, foi observada em todos os animais uma discreta queda na média do número de eritrócitos ao longo do período experimental, sem evidenciar no entanto,
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
G1 3,91±0,99bA 3,65±1,60aA 4,05±1,72aA 4,62±1,56aA 3,84±0,36aA G2 3,34±0,31bA 4,08±1,24aA 3,44±0,95aA 3,91±1,23aA 3,75±0,47aA G3 6,85±0,90aA 5,25±0,92aAB 4,36±1,64aB 4,21±1,02aB 3,28±1,43aB
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
diferença significativa entre eles. Os valores permaneceram dentro do intervalo considerado fisiológico para a espécie ovina (Tabela 6). Somente no grupo com maior proporção de sementes incluídas na ração, G3, no último dia experimental (T4) foi observado uma média abaixo da normalidade. Este resultado provavelmente é decorrente do fato de uma das ovelhas, neste período, ter apresentado contagem de hemácias inferior ao normal (7,36, x106/ȝL), quadro este compatível com anemia.
Tabela 6. Médias e desvios - padrão do número de eritrócitos (x106/ȝL) no sangue de
ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Com relação aos valores médios de volume globular (Tabela 7) ao longo do período experimental nenhum dos animais apresentou alteração ou diferença significativa entre eles, mantendo-se dentro da normalidade, resultados estes compatíveis com os descritos por PUGH (2005).
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
Tabela 7. Médias e desvios - padrão do volume globular (%) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Quanto ao teor de hemoglobina (Tabela 8) não se constatou diferença significativa entre os grupos ou entre os tempos estudados, mantendo-se dentro dos valores preconizados por PUGH (2005). Somente no grupo G3 no 28º dia (T4) foi verificado valor abaixo da normalidade, possivelmente ao fato de uma das ovelhas apresentar um quadro compatível com anemia a partir da segunda semana do experimento.
Tabela 8. Médias e desvios - padrão do teor de hemoglobina (g/dL) no sangue de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
G1 27,84±3,28aA 28,56±3,89aA 32,46±4,25aA 31,06±4,34aA 29,18±3,64aA G2 30,38±5,55aA 29,08±4,31aA 27,88±2,87aA 28,78±4,66aA 27,50±3,80aA G3 28,78±4,85aA 29,08±4,90aA 29,38±4,16aA 26,68±4,36aA 25,20±3,13aA
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
G1 8,82±0,49aA 9,07±0,76aA 10,18±0,84aA 9,77±0,79aA 9,28±0,59aA G2 9,34±1,02aA 9,00±0,81aA 8,55±0,69aA 8,89±1,23aA 8,46±0,98abA G3 8,53±1,13aA 8,72±1,22aA 8,92±1,13aA 8,02±1,06aA 7,68±0,70bA
5.3. Perfil bioquímico
5.3.1. Enzimas
Quanto à atividade sérica de gamaglutamiltransferase (GGT) (Tabela 9), foi verificado aumento significativo no grupo G2 quando comparado com o grupo G1 no tempo controle (T0) e um pico nas concentrações séricas desta enzima aos 7 dias de consumo da semente (T1) no grupo com a menor proporção de sementes incluída na ração, G1. No entanto, os valores permaneceram dentro da normalidade durante todo o período experimental, provavelmente em decorrência do fato de as lesões hepáticas observadas não terem sido suficientes para induzir aumento da atividade sérica de GGT, situação que indica lesão hepática e disfunção biliar segundo TENNANT (1997).
Tabela 9. Médias e desvios - padrão da atividade sérica da enzima
gamaglutamiltransferase (U/L) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na
ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Quanto à atividade sérica de aspartato aminotransferase (AST) não foram observadas diferenças significativas entre os grupos experimentais, estando as médias dentro da normalidade citada por KRAMER et al. (1997). Entretanto, foi verificado no grupo G1 que no 21º e 28º dias do estudo, T3 e T4 respectivamente, houve diminuição na atividade sérica desta enzima. É provável que a função hepática dos ovinos intoxicados por C. spectabillis não tenha sido afetada em grau de severidade suficiente
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
para aumentar a atividade sérica de AST, apesar da constatação de degeneração hidrópica de hepatócitos.
Tabela 10. Médias e desvios - padrão da atividade sérica da enzima aspartato aminotransferase (U/L) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração,
UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
A atividade sérica de creatina fosfoquinase (CK) (Tabela 11) não variou (p<0,05) entre os grupos ou entre os tempos experimentais, à exceção de um animal do grupo G1 e outro do grupo G3 que apresentaram marcante elevação na atividade sérica desta enzima. THRALL et al. (2007) consideram que a CK é uma enzima de extravasamento e que sua elevação no soro sanguíneo é considerada indicador de lesão muscular. Outros pesquisadores indicaram diversos fatores que induzem a elevação desta enzima no soro sanguíneo de animais, dentre os quais se destacam esforço físico prolongado durante o transporte ou o parto, injeção intramuscular e decúbito (SOUZA et al. 1998; BIRGEL JUNIOR et al. 2003). Já que nos animais avaliados neste estudo não houve nenhuma situação parecida com a supracitada que pudesse justificar a elevação verificada na atividade sérica de CK, supõe-se que essa elevação seja decórrente de artefato de leitura, em função da termosensibilidade desta enzima, uma vez que as amostras sanguíneas colhidas durante todo o experimento foram submetidas a descanso por cerca de 40 minutos para retração do coágulo antes de centrifugação e para separação da alícota de amostra sérica.
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
Tabela 11. Médias e desvios - padrão da atividade sérica da enzima creatina fosfoquinase (U/L) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração,
UNESP – Jaboticabal, 2010.
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
G1 77,7±54,0aA 106,8±36,3aA 92,2±35,7aA 68,0±23,7aA 68,0±41,7aA G2 111,7±24,7aA 106,8±24,7aA 111,7±19,4aA 126,2±18,1aA 189,0±174,2aA G3 131,1±32,9aA 121,4±21,7aA 121,4±21,7aA 131,1±64,4aA 126,2±60,2aA
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Quanto à concentração sérica de proteína total (Tabela 12), não se constatou diferença (p<0,05) entre grupos ou entre os tempos durante todo o período experimental.
Tabela 12. Médias e desvios - padrão da concentração sérica de proteína total (g/dL) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
G1 7,51±3,12aA 7,33±3,64 aA 7,77±1,17 aA 7,80±3,15 aA 8,06±0,68 aA G2 6,67±0,60 aA 7,65±0,73 aA 7,97±0,85 aA 7,62±0,76 aA 7,11±0,40 aA G3 7,44±1,18 aA 7,14±0,49 aA 7,28±0,44 aA 7,56±0,57 aA 7,68±0,88 aA
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Tabela 13. Médias e desvios - padrão da concentração sérica de albumina (g/dL) de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
5.3.2 Proteinograma sérico
O proteinograma em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) possibilitou a detecção de 31 proteínas, cujos pesos moleculares variaram de 17,188 a 263,025 para o grupo G1; de 17,170 a 268,688 para o G2; de 17,023 a 273,992 para o G3. Destas, sete proteínas são de importância diagnóstica: imunoglobulina A, ceruloplasmina, transferrina, albumina, imunoglobulina G (IgG), haptoglobina, e Į1-glicoproteína ácida (Tabela 14 e Figuras 13 a 19). Os pesos moleculares foram: IgA, 82,44 ± 41,30; ceruloplasmina, 37,21 ± 8,05; transferrina, 484,66 ± 16,45; albumina, 3471,37 ± 154,84; Ig G 2573,16 ± 188; haptoglobina 18,69 ± 8,24;Į1- glicoproteína ácida, 23,09 ± 0,89.
Quanto à concentração sérica de ceruloplasmina constatou-se um pico nas concentrações séricas aos 14 dias após início do consumo de semente (T2) nos grupos G1 e G2 com diminuição significativa aos 21 dias e mostrando posterior tendência à elevação. Por outro lado, a concentração sérica de haptoglobina oscilou durante todo o período experimental. A concentração sérica de Į-glicoproteína ácida evidenciou um decréscimo inicial aos 7 dias após início do consumo de semente (T1). Segundo GRUYS et al. (1994), a ceruloplasmina, a haptoglobina e a Į-glicoproteína ácida são consideradas proteínas de fase aguda, sintetizadas pelo fígado em resposta à citocinas inflamatórias.
Quanto às concentrações séricas de transferrina e albumina, notadamente proteínas de fase aguda negativa que diminuem suas concentrações frente à um
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
estímulo inflamatório (KANEKO et al. 1997; THOMAS, 2010), à exceção do grupo G3, não foi observada diminuição de suas concentrações séricas em nenhum dos grupos. É provável que a maior porcentagem de inclusão de sementes neste grupo (G3) tenha causado estímulo inflamatório suficiente no parênquima hepático para desencadear a liberação de citocinas pró-inflamatórias, provocando o declínio nas concentrações séricas dessas duas proteínas de fase aguda negativas.
Quanto à concentração sérica de IgG constatou-se inicialmente elevação sérica no grupo G3 em relação aos grupos G2 e G1, embora não tenha sido significativo, observando-se concentrações séricas estatisticamente semelhantes entre os grupos e entre os momentos avaliados durante todo o período experimental. Da mesma forma, a IgA mostrou comportamento oscilante nos três grupos, durante todo o período experimental. (Tabela 14).
5.4. Exame Ultrassonográfico
Tabela 14. Concentrações séricas de proteínas (médias ± desvios-padrão (mg/dL) obtidas em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE), de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Proteína e
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
IgA
G1 157,88±60,6aA 82,29±54,9aA 56,08±40,5abA 74,94±45,5abA 82,12 ±47,1aA
G2 62,67±26,3aA 36,7±51,2aAB 88,94±54,9aB 77,36±27,0aAB 83,20±31,0aAB
G3 144,05±47,8aA 81,97±28,2aA 35,84±13,3bA 27,31±9,8bA 54,12±21,5aA Ceruloplasmina
G1 56,63±18,0aA 42,82±16,6aA 75,64±18,6aA 32,48±12,9aA 40,70 ±9,5aA G2 33,83±12,2aA 21,2±24,7aA 39,36±21,2aA 33,57±17,4aA 32,95±11,2aA G3 41,22±9,5aA 35,29±4,6aA 18,13±10,0bA 23,06±6,0aA 28,94±7,5bA
Transferrina
G1 546,13±74,7aA 527,21±91,6aA 568,01±109aA 540,92±80,7aA 496,79 ±95,8aA G2 429,05±161,4aA 446,3±94,8aA 477,435±136aA 451,23±99,3aA 450,80±76,7aA
G3 543,98±149,9aA 462,39±79,3aA 437,44±104,1aA 448,25±61,1aA 508,15±118,4aA Albumina
G1 3761,6±289,0aA 3591,3±301,9aA 4199,3±1422aA 4102,9±699aA 3820,4 ±538aA
G2 2669,8±443,4aA 2997,9±684,9aA 3578,2±938aA 3566,4±583aA 3434,3±375aA G3 3445,1±320,1aA 2659,4±375,6aA 3271,0±398aA 3513,2±465aA 3900,0±414aA
Ig G
G1 1848,0±516,5aA 1735,4±599,0aA 1760,8±481,9aA 1836,5±408aA 1855,4 ±242aA G2 1551,9±542,6aA 1614,6±152,4aA 1665,4±358,8aA 1745,4±199aA 1634,6±114aA
G3 2052,5±291,7aA 1662,7±290,8aA 1553,4±117,6aA 1630,6±244aA 1523,7±277aA Haptoglobina
G1 20,3 ±6,4aA 22,5±7,4aA 24,5±6,0aA 21,9±2,4aA 20,4 ±13,2aA
G2 11,9±2,3aA 24,0±8,9aA 18,6±8,0aA 20,8±11,8aA 12,9±8,1aA G3 19,6±8,7aA 17,4±4,5aA 27,2±7,6aA 21,7±10,3aA 28,8±15,1aA Į1- glicoproteína
ácida
Da mesma forma foi observada uma alteração na estrutura do parênquima hepático em todos os animais a partir dos 7 dias após o início da inclusão de sementes na ração (T1), tornando-se mais severos com o avançar do experimento, sendo mais marcantes no grupo com maior porcentagem de sementes, grupo G3. Fato esse explicado por CULLEN & MacLACHLAN (2001) onde relatam que o fígado recebe produtos e toxinas do trato gastrintestinal pelo fluxo sanguíneo portal, doenças intestinais primárias que lesam a mucosa podem causar aumento da absorção dessas substâncias pela circulação portal. Estas substâncias podem causar lesão hepática (hepatopatia tóxica) ou incitar reações imunológicas que levam ao desenvolvimento de um processo inflamatório. Foi possível visualizar estas alteração por meio da alteração na ecogenicidade das imagens, que mostraram-se cada vez mais hipoecogênicas em conseqüência do grau de congestão hepática. O fígado hipoecogênico está associado às afecções que levam ao acúmulo de líquido em hepatócitos, tais como hepatite aguda, colangiohepatite, congestão passiva, além de necrose hepática (BILLER et al. 1992; BOROFFKA, 1998). Ainda, foi possível acompanhar a dilatação da veia porta (Figura 3).
Figura 1. Diferentes pontos de realização da biópsia hepática, em função do tempo de administração de sementes de C. spectabillis na ração.
Figura 2. Ultrassonograma do parênquima hepático de ovino do G2 no tempo controle (T0), ilustrando a região de interesse (RI), onde é verificado o grau de congestão hepática através da quantificação do número de pixels. Regiões dorsal (D) e ventral (V) do animal, região de pele e tecido subcutâneo (P/S), região diafragmática (DF).
RI
D
V
T1 T0 T2 T4
T3
Figura 3. Ultrassonograma em plano transversal do parênquima hepático de ovino do grupo G3 no 14° dia após inclu são das sementes (T2), mostrando a dilatação da veia porta (VP), congestão hepática (C), hiperecogenicidade decorrente do efeito de reverberação do eco no momento do disparo.
Quanto ao número de pixels (Tabela 15 e Figura 4), constatou-se diminuição progressiva significativa nos três grupos estudados, durante tudo o período experimental, sendo menor no grupo com menor porcentagem de sementes na ração (G1). Demonstrando assim um aumento na congestão hepática. Segundo a literatura (BILLER et al. 1992; ZWEIBEL, 1995), uma diminuição difusa da ecogenicidade pode estar correlacionado a processos inflamatórios ou congestivos.sendo compatível com os achado neste estudo.
X
Tabela 15. Médias e desvios–padrões do grau de número de pixels de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração, UNESP – Jaboticabal, 2010.
Valores seguidos de letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúsculas na mesma linha não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
Figura 4. Representação gráfica do número de pixels de ovinos em função do tempo de inclusão de diferentes concentrações de sementes de Crotalaria spectabilis na ração.
5.5. Exame Histológico
Os achados histológicos são mostrados nas figuras 5 a 8. Os achados mais frequentes nos cortes histológicos do fígado dos ovinos do grupo G1 não evidenciaram alterações no tempo controle, aos 7 e 14 dias do consumo de sementes, T1 e T2 respectivamente. Já aos 21 e 28 dias (T3 e T4) após a inclusão de sementes, os animais apresentaram discretas alterações no fígado, como degeneração hidrópica
Grupo T0 T1 T2 T3 T4
