RESSALVA
Atendendo solicitação d
o(a)
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL
DEFESA DE DISSERTAÇÃO
EFEITO DA COLHEITA FRACIONADA SOBRE A CINÉTICA E VIABILIDADE ESPERMÁTICAS DO SÊMEN REFRIGERADO E
CONGELADO DE GARANHÕES.
Sidnei Nunes de Oliveira
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIODE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA ANIMAL
EFEITO DA COLHEITA FRACIONADA SOBRE A CINÉTICA E VIABILIDADE ESPERMÁTICAS DO SÊMEN REFRIGERADO E
CONGELADO DE GARANHÕES.
Sidnei Nunes de Oliveira
Dissertação apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP, Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Biotecnologia Animal, Área de Reprodução Animal.
Orientador: Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa
Nome do autor: Sidnei Nunes de Oliveira
Título: EFEITO DA COLHEITA FRACIONADA SOBRE A CINÉTICA E
VIABILIDADE ESPERMÁTICAS DO SÊMEN REFRIGERADO E CONGELADO
DE GARANHÕES.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa
Presidente e orientador
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu /SP
Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga
Membro
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária FMVZ – UNESP – Botucatu/SP
Dr. Marcio Teoro do Carmo
Membro
Veterinário Autônomo, Botucatu/SP
SUMÁRIO
CAPÍTULO I
1. INTRODUÇÃO... 12
2. REVISÃO DE LITERATURA... 13
2.1. Anatomia e fisiologia do sistema genital do garanhão... 13
2.2. Espermatogênese... 16
2.3. Fisiologia da ejaculação... 16
2.4. Produção e composição do plasma seminal... 19
2.4.1. Enzimas... 20
2.4.2. Proteínas... 21
2.4.3. Eletrólitos... 22
2.4.4. Hormônios... 23
2.5. Efeito do plasma seminal na criopreservação do sêmen equino... 24
2.6. Principais métodos de colheita do sêmen equino... 29
2.7. Colheita fracionada do sêmen equino... 30
2.8. Benefício da colheita fracionada do sêmen equino... 32
REFERÊNCIAS... 35
HIPÓTESE... 46
OBJETIVOS ESPECÍFICOS... 46
CAPÍTULO II ARTIGO I - COLHEITA FRACIONADA E SEUS PRINCIPAIS BENEFÍCIOS NA CRIOPRESERVAÇÃO DO SÊMEN DE GARANHÕES... 48
ARTIGO II - INFLUÊNCIA DE DIFERENTES TÉCNICAS DE COLHEITA FRACIONADA DO SÊMEN EQUINO NA RECUPERAÇÃO ESPERMÁTICA: DESCRIÇÃO E MODIFICAÇÃO DE UM MÉTODO... 57
AGRADECIMENTO
Ao grande Deus pela força espiritual que me rege e por iluminar os meus caminhos.
A minha família, meu porto seguro, meu pai Sebastião, minha mãe Angelita, minha
irmã Alane Kelly, a minha avó Mariazinha, meus Tios Alex, Amarildo, Sônia, Norma e
Sonilde “in memoria”, mesmo estando distantes suportando as saudades, são eles meus
grandes incentivadores, sem eles todas as minhas conquistas não fariam sentido.
Ao grande mestre idealizador e incentivador deste projeto, o Prof. Papa que me acolheu
durante todo o mestrado e juntos desenvolvemos um trabalho em equipe.
Aos professores Nereu “Néris” pelos ensinamentos e pelos abraços de apoio durante esta etapa, Marco Alvarenga pelas oportunidades, considerações e conselhos, ao Zé
Dell’Aqua pelas horas de discussão e incentivo e a todos os outros professores do
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária.
Sou grato aos funcionários do departamento pelo apoio no dia a dia a Camila
Dell’Aqua, Edvaldo, D. Raquel, Edilson, Felipe, meu muito obrigado.
Aos velhos amigos de longas jornadas Luis, Endrigo, Bertiny e aos outros que aqui
ganhei durante a residência e no mestrado em especial ao Felipe Dalanezi, Luiz Roberto
Jr, Felipe Hartwig, João Alexandre, Rafaella Hayashi, Patricia Papa, Marcio Teoro.
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”– Botucatu-SP, pela oportunidade de cursar o Mestrado.
À Fundação de Apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pela bolsa de
estudo concedida para a realização do projeto (Processo FAPESP: 2014/00354-0).
Agradeço também aos Haras parceiro que contribuíram para a realização deste projeto:
Haras Itapuã, Haras Ogar, Equicenter Central de Reprodução e a Central Lub Breeding.
Assim finalizo agradecendo a todos aqueles que de alguma forma contribuíram em mais
LISTA DE ABREVIAÇÕES
AST aspartato amino transferase PS plasma seminal
BG -glucuronidase RAP espermatozoides rápido
cm Centímetro SPTZ espermatozoides
Ca++ Cálcio VA vagina artificial
Cl- Cloretos VAP velocidade de trajeto
CRIP proteína rica em cisteína VCL velocidade curvilínea
Cu+ Cobre VSL velocidade linear
DNA ácido desoxirribonucleico UFC unidade formadora de colônias
ERO espécie reativa de oxigênio UI unidades internacionais
FA fosfatase alcalina Zn+ zinco
FAC fosfatase ácida [ ] concentração
Fe+ Ferro
Fn-2 fibronectína tipo II
GGT -glutamil transferase
G1 grupo 1
G2 grupo 2
HSP proteína do plasma seminal equino
IM integridade de membrana
K+ Potássio kDa kilo Dalton
LDH lactato desidrogenase
Mg+ Magnésio mL Mililitro
MP motilidade espermática progressiva
MT motilidade espermática total
Na+ Sódio
PGE2 prostaglandina E2
RESUMO
OLIVEIRA, S.N. EFEITO DA COLHEITA FRACIONADA SOBRE A CINÉTICA E
VIABILIDADE ESPERMÁTICAS DO SÊMEN REFRIGERADO E CONGELADO
DE GARANHÕES. Botucatu – SP. 2016, p.103. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”.
O pênis é o órgão copulador e no garanhão é classificado como sendo músculo
cavernoso, em que os espaços cavernosos são preenchidos de sangue durante a ereção.
Nos testículos que ocorre a produção espermática, que são transportados pela rete testis
até o epidídimo, onde sofrerão maturação, capacidade fertilizante e armazenados até a
ejaculação. As glândulas sexuais acessórias são responsáveis pelos fluidos expelidos
durante a ejaculação, denominado de plasma seminal, que se misturam às células
espermáticas e formam o ejaculado. Cada uma dessas glândulas são responsáveis por
uma determinada secreção que vai direcionar o ejaculado equino a ser dividido em três
distintas frações: fração pré-espermática, produzida pelas glândulas bulbouretrais e
próstata; fração rica em espermatozoides, produzida pelas secreções do epidídimo e por
líquidos das ampolas dos ductos deferentes; fração pós-espermática ou fração pobre,
formada por espermatozoides remanescentes no canal uretral e líquidos produzidos
pelas vesículas seminais, o gel. Durante o processo fisiológico de cópula, ocorrem
vários eventos denominados de ereção, em que o garanhão se excita por estímulos,
emissão que caracteriza-se pela liberação de espermatozoides dentro da uretra pélvica,
seguido da ejaculação com a expulsão do sêmen, o relaxamento e recolhimento do
pênis. Normalmente, as colheitas de sêmen equino são realizadas de forma
convencional, com vagina artificial fechada, em que todas as frações se misturam. Cada
garanhão possui características individuais com relação à manutenção das células
espermáticas durante a criopreservação, essas características podem estar relacionadas à
produção do plasma seminal, assim como os vários componentes que os compõem.
Sabe-se que existe um efeito deletério desempenhado pelos componentes do plasma
seminal produzido principalmente pelas vesículas seminais, aos espermatozoides
durante o processo de criopreservação, porém, esses fatores ainda são desconhecidos.
de proteínas e íons presentes em cada uma das frações do ejaculado. Sabendo disso, a
colheita fracionada pode trazer benefícios aos espermatozoides, de forma que as
primeiras frações não tenham contato com o plasma seminal produzido pelas vesículas
seminais. O presente trabalho objetiva revisar a colheita fracionada de sêmen em
garanhões, assim como, seus benefícios para as células espermáticas que serão
submetidas à criopreservação.
ABSTRACT
OLIVEIRA, S.N. EFFECT THE FRACTIONATED COLLECTION ABOUT
KINETIC AND SPERM VIABILITY THE SPERM COOLED AND FROZEN STALLION. Botucatu – SP. 2016 p.103. Dissertação (Mestrado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus Botucatu, Universidade Estadual Paulista
“Júlio de Mesquita Filho”.
The penis is the copulatory organ and in the stallion it is classified as cavernous muscle and the cavernous spaces are filled with blood during erection. In the testicles occurs sperm production, that are transported through the rete testis to the epididymis, where they will suffer maturation, fertilizer capacity and will be stored until ejaculation. The accessory sex glands are responsible for the expelled fluids during ejaculation, named seminal plasma that are mixed with sperm cells and form the ejaculate. Each of these glands are responsible for a certain secretion that will divide equine semen into three distinct fractions: pre-sperm fraction, produced by the prostate and bulbourethral glands; rich fraction in sperm, produced by epididymal secretions and liquids from ampoules of the vas deferens; post-sperm fraction or poor fraction, consisting of sperm remaining in the urethral canal and liquids produced by the seminal vesicles, the gel. During the physiological process of mating, several events occur named erection, in which the stud is excited by stimuli emission which is characterized by the release of sperm into the pelvic urethra followed by ejaculation with the expulsion of semen, relaxation and gathering the penis. Typically, horse semen collections are performed in the conventional way, with a closed artificial vagina, where all the fractions are mixed. Each stud has individual characteristics related to the maintenance of sperm cells during the cryopreservation, these characteristics may be related to production of seminal plasma and to the components that form it as well. What is known is that there is a negative effect played by the seminal plasma components mainly produced by the seminal vesicles, to the sperm during cryopreservation process, however, these factors are still unknown. Several hypotheses are suggested such as the production’s reduction of lipids and proteins and the types of ions present in each fraction of the ejaculate. Knowing this, the fractional collection may be beneficial to sperm, considering that the first fractions do not have contact with seminal plasma produced by the seminal vesicles. This work aims to review the semen fraction harvest in stallions, as well as its benefits for the sperm cells to be submitted to cryopreservation.
12
1. INTRODUÇÃO
A equinocultura brasileira possui o quarto maior rebanho mundial, com 5,8
milhões de cabeças, ficando atrás dos Estados Unidos, China e México, seu faturamento
anual fica em torno de R$ 7,5 bilhões, gerando 642,5 mil empregos diretos e US$ 27,4
milhões em exportação (GUERRA, 2010). Tendo em vista este crescente mercado,
faz-se necessário o uso das biotecnologias reprodutivas relacionadas a fêmeas e também aos
machos: inseminação artificial, transferência de embrião, transferência intrafalopiana de
gametas, injeção intracitoplasmática de espermatozoides e refrigeração de sêmen e
congelação de sêmen. Dentre as biotécnicas citadas, a inseminação artificial vem se
tornando um pilar de sustentação e evolução na criação de equinos, tendo em vista que
seu uso traz grandes benefícios na difusão do material genético de animais classificados
como superiores, dentre eles, campeões em diversas modalidades de competição
equestre.
Apesar do avanço no uso das biotécnicas reprodutivas, ainda há grandes desafios
para melhorar os índices reprodutivos na equinocultura, principalmente quando estão
relacionadas à criopreservação das células espermáticas em garanhões.
Estudos realizados indicam que em alguns garanhões, o plasma seminal (PS)
acarreta danos aos espermatozoides, culminando em prejuízos na qualidade espermática
durante a refrigeração e a congelação (KARESKOSKI; KATILA, 2008), podendo
diminuir os índices de fertilidade. Embora o plasma seminal possua um efeito negativo
durante a criopreservação, existem também evidências do seu papel protetor às células
espermáticas (KARESKOSKI et al., 2006), dentre elas a prevenção da capacitação
prematura que pode ser induzida durante o processo de congelação e descongelação
(SCHEMBRI et al., 2002), afirmando que, a presença de pequenas quantidades de PS
parece ser necessária. Segundo Alghamdi et al. (2002), a motilidade espermática é
maior quando a proporção de PS é ≤ 5% antes da refrigeração e congelação, quando comparada a amostras com proporções entre 10-30% no volume do ejaculado. Por outro
lado, Jasko et al. (1992) demonstram que a proporção ideal de PS no ejaculado seja em
torno de 5 a 20%, sem que haja um efeito prejudicial durante a criopreservação.
13
aqueles garanhões cujos ejaculados possuem baixa tolerância à criopreservação
(KARESKOSKI; KATILA, 2008).
Assim, pressupõe-se que exista uma variação individual do efeito do PS entre
garanhões (AKCAY et al., 2006) e da sua produção, existindo variações na composição
do PS nas diferentes frações do ejaculado (KATILA et al., 2004). Contudo, em estudos
realizados, demonstrou-se que a fração rica em espermatozoides do ejaculado possui
uma tolerância maior a criopreservação quando comparada às demais frações (SIEME
et al., 2004; KARESKOSKI et al., 2006).
Durante a colheita de sêmen de forma convencional, utilizando-se as vaginas
artificiais modelo Missouri, Nishikawa, Hannover, Colorado ou Botucatu, todas as
frações do ejaculado se misturam e não há possibilidade de separação destas. Diante
disto, Varner et al. (1987) sugerem que a colheita fracionada poderá reduzir o efeito
deletério do PS ao colher apenas a fração rica em espermatozoides do ejaculado,
correspondente a 75% do total de espermatozoides.
Desta forma, uma alternativa para minimizar as injúrias provocadas pelo PS em
garanhões que produzem sêmen com tolerância limitada à criopreservação, seria a
colheita de sêmen fracionada, possibilitando, com isso, identificar as diferentes frações
e separar a fração espermática com maior percentual de espermatozoides em menor
contato com o PS. O presente trabalho tem por objetivo revisar a colheita fracionada de
sêmen em garanhões, assim como, seus benefícios para as células espermáticas que
35
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