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Efeitos da concentração dos compostos fenólicos no mosto da fermentação alcoólica

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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CÂMPUS DE BOTUCATU

EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO

MOSTO NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

MÍRIAM ROBERTA HENRIQUE

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Agronomia (Energia na Agricultura).

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UNIVERSIDADE

ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”

FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS

CÂMPUS DE BOTUCATU

EFEITOS DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO

MOSTO NA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA

MÍRIAM ROBERTA HENRIQUE

Orientador: prof. Dr. Waldemar Gastoni Venturini Filho

Dissertação apresentada à Faculdade de Ciências Agronômicas da UNESP Campus de Botucatu, para obtenção do título de Mestre em Agronomia (Energia na Agricultura).

(3)
(4)
(5)

Aos meus pais,

João e Maria Helena ...

...que me deram a vida e que nunca mediram esforço para

me dar tudo que estava ao seu alcance. Sempre estiveram

ao meu lado me apoiando, me incentivando em tudo e

corrigindo meus erros com sabedoria, dignidade e respeito.

Sempre com muito amor, amor esse que é meu alicerce.

Obrigada Deus por me dar a oportunidade de ser filha de

tão pessoas maravilhosas.

(6)

Aos meus irmãos,

Marcos e André...

... que sempre estão ao meu lado, são meus conselheiros e

companheiros.

A minhas cunhadas,

Edivirges e Andreia...

... pelo carinho e incentivo diário.

Aos meus sobrinhos,

Matheus, Emanuel e Heitor ....

... que são o sol do meu dia, que alegram a minha vida e

sempre estão me ensinando alguma coisa.

As minha avós,

Vó Cida (

in memória

) e

Vó Angelina (

in memória

) ....

... que fizeram toda a diferença na minha vida, me

ensinaram muitos valores e principalmente o amor a vida e

pra com o próximo. Saudades.

(7)

Ainda que eu falasse as línguas dos homens e dos anjos, e

não tivesse amor, seria como o metal que soa ou como o sino que

tine. E ainda que tivesse o dom de profecia, e conhecesse todos

os mistérios e toda a ciência, e ainda que tivesse toda a fé, de

maneira tal que transportasse os montes, e não tivesse amor,

nada seria.”

(8)

Agradecimentos

Primeiramente agradeço a Deus, pela minha vida e por mais essa oportunidade, juntamente com as pessoas que mais amo.

Agradeço meu orientador Waldemar GastoniVentiruni Filho, pelo apoio e compreensão de sempre, entendendo minhas dificuldades e limitações, mas sempre acreditando em mim. Obrigada pelo carinho, incentivo e paciência dedicados ao nosso trabalho.

Ao Prof. ToshioNojimotoe aProfaMarthaMariaMischanpelas orientações de estatística.

A ProfaDra Magali Leonel e ao Prof. Dr. Ricardo Figueira pelas sugestões apresentadas na qualificação e na defesa que muito acrescentaram no meu trabalho e no meu crescimento profissional.

A Luciana Brunelli que estava sempre pronta pra me ajudar.

Ao Roberto M. Fulan (in memoria) e ao Marcos A. Risseti que foram os

primeiros a acreditarem em mim como profissional, e a me dar várias oportunidades. Muito obrigada pelo carinho, paciência e dedicação.

A Usina São Manoel, por me liberar para as aulas e permitir que o trabalho fosse realizado na empresa.

Ao Cristiano Azeredo, que sempre me motivou em todos os momentos. Também contribuiu diretamente com o assunto abordado neste trabalho.

Aos colaboradores do laboratório industrial que direta ou indiretamente colaboraram para que tivéssemos os resultados das análises para a conclusão do trabalho. Em especial a Roberta Bronzatto, Elisangela Madaleno e ao Elton Rodrigues que muitas vezes participaram diretamente com muito companheirismo. Valeu pessoal!!

Ao Cleber Aguiar, que sempre esteve pronto para tirar dúvidas e ajudar.

Ao Bruno Innocenti, e aos colegas de trabalho que me estiveram presente no dia-a-dia auxiliando direta ou indiretamente para que esse trabalho fosse concluído.

(9)

A Andréia Innocenti, que muitas vezes foi um anjo em minha vida, sempre me alertando para as matrículas e datas acadêmicas, me socorrendo em muitos momentos.

(10)

SUMÁRIO

LISTA DE TABELAS ... XI LISTA DE FIGURAS ... XII

RESUMO ... 1

SUMMARY ... 3

CAPÍTULO I ... 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS ... 6

1.1INTRODUÇÃO ... 6

1.2REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ... 8

1.2.1Cana-de-açúcar ... 8

1.2.2Mel final ou melaço ... 9

1.2.3Levedura Alcoólica ... 10

1.2.4Fermentação alcoólica ... 15

1.2.4.1Processos ... 16

1.2.4.2Processo batelada ... 17

1.2.4.3Processo batelada alimentada ... 17

1.2.4.4Processo contínuo ... 18

1.2.5Fatores que interferem o processo fermentativo ... 19

1.2.5.1 pH ... 19

1.2.5.2Temperatura ... 20

1.2.6Contaminação microbiana ... 21

1.2.7Culturas puras de levedura ... 22

1.2.7.1Identificação da levedura no processo fermentativo ... 22

1.2.8Compostos fenólicos na cana-de-açúcar ... 23

1.2.9Compostos fenólicos e fermentação alcoólica ... 26

1.3REFERÊNCIAS ... 27

CAPÍTULO II ... 32

RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA ALCOÓLICA... 33

(11)

2.1INTRODUÇÃO ... 35

2.2MATERIAL E MÉTODOS ... 36

2.2.1Descrição do processo industrial de fermentação ... 36

2.2.2Planejamento experimental e análise estatística ... 38

2.3ANÁLISES QUÍMICAS E MIROBIOLÓGICAS ... 38

2.3.1Compostos fenólicos ... 38

2.3.2Identificação das leveduras ... 38

2.3.3Viabilidade, viabilidade de brotamento e brotamento celular ... 38

2.4RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 39

2.5CONCLUSÃO ... 45

2.6REFERÊNCIAS ... 45

CAPÍTULO III ... 47

RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO... 48

SUMMARY ... 49

3.1INTRODUÇÃO ... 50

3.2 MATERIAL E MÉTODOS ... 51

3.2.1Descrição do processo industrial de fermentação ... 51

3.2.2Planejamento experimental e análise estatística ... 52

3.3ANÁLISES QUÍMICAS E CALCULO DA EFICIÊCIA FERMENTATIVA POR SUBPRODUTOS ... 53

3.3.1Compostos fenólicos ... 53

3.3.2Calculo da eficiência da fermentação por subprodutos ... 53

3.3.3Análises dos subprodutos para cálculo da eficiência da fermentação ... 54

3.3.3.1Porcentagem de fermento vinho delevedurado e do creme de levedura ... 55

3.3.3.2 Teor alcoólico do vinho deleveduradoe do creme de levedura ... 55

3.3.3.3ARRT do vinho delevedurado... 55

3.3.3.4Glicerol do vinho delevedurado ... 55

3.3.3.5Acidez sulfúrica do mosto, do vinho levedurado e do fermento tratado 55 3.4RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 56

3.5CONCLUSÃO ... 61

(12)

CAPÍTULO IV ... 63

(13)

LISTA DE TABELAS

CAPÍTULO I ... 5 CONSIDERAÇÕES INICIAIS ... 6 Tabela 1.1 - Compostos fenólicos e flavonóides em cana-de-açúcar e seus

produtos, identificados por diversos autores... 25 CAPÍTULO II ... 32 RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA ALCOÓLICA... 33 Tabela 2.1 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:

compostos fenólicos x viabilidade celular... 42 Tabela 2.2 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:

compostos fenólicos x viabilidade de brotamento ... 43 Tabela 2.3 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:

compostos fenólicos x brotamento celular ... 44 CAPÍTULO III ... 47 RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS

DO MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR

SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO... 48 Tabela 3.1 - Resultados das análises de cariotipagem ... 57 Tabela 3.2 Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t::

compostos fenólicos x rendimento de fermentação por subprodutos ... 58 Tabela 3.3 – Coeficiente de correlação (r) e respectivos valores do teste t:

(14)

LISTA DE FIGURAS

CAPÍTULO I ... 5

CONSIDERAÇÕES INICIAIS ... 6

Figura 1.1 – Composição da cana-de-açúcar ... 9

Figura 1.2 – Via de Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP) ... 12

CAPÍTULO II ... 32

RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA ALCOÓLICA... 33

Figura 2.1 – Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São Manoel... 37

Figura 2.2 – Resultados das análises de cariotipagem... 39

Figura 2.3 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos do mosto e aviabilidade celular de levedura alcoólica... 42

Figura 2.4 – Correlação entre aconcentração de compostos fenólicos do mosto e a viabilidade de brotamento de levedura alcoólica... 43

Figura 2.5 – Correlação entre a concentração de compostos fenólicos no mosto e o brotamento de levedura alcoólica ... 44

CAPÍTULO III ... 47

RELAÇÃO ENTRE A CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS DO MOSTO E A EFICIÊNCIA DA FERMENTAÇÃO ALCOÓLICA POR SUBPRODUTOS EM PROCESSO CONTÍNUO ... 48

Figura 3.1 Fluxograma do processo de recirculação do fermento na Usina São Manoel ... 52

Figura 3.2 – Correlação entre a concentração dos compostos fenólicos do mosto e a eficiência de fermentação por subprodutos ... 58

(15)

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação da concentração dos compostos fenólicos do mosto com a viabilidade celular, viabilidade de brotamento, brotamento celular da levedura alcoólica e a eficiência da fermentação por subprodutos durante a safra 2011/2012 na Usina São Manoel, São Manuel (SP). Esta unidade iniciou a safra com a levedura selecionada CAT-1. Durante a safra, as cepas nativas adentraram o processo fermentativo e também foram avaliadas quanto à sensibilidade a concentração dos compostos fenólicos. A pesquisa foi desenvolvida como um estudo de caso na planta industrial de fermentação contínua. As análises de concentração dos compostos fenólicos do mosto foram realizadas através do método FolinCiocalteu, enquanto que as análises de viabilidade celular, viabilidade de brotamento e brotamento da levedura foram feitas através de contagem em câmara de Neubauer utilizando corante azul de metileno. A eficiência da fermentação foi determinada por subprodutos gerados durante o processo fermentativo. A análise estatística foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do teste t. Concluiu-se

(16)

brotamento celular da levedura e com a eficiência da fermentação em nenhumdos períodos estudados.

_________________________________________________________________________

Palavras-chave: compostos fenólicos, Saccharomycescerevisiae, viabilidade celular,

(17)

EFFECTS OF THE MUST PHENOLIC COMPOUNDS CONCENTRATIONINTHEALCOHOLIC FERMENTATION, Botucatu, 2013, 64p. Dissertação (Mestrado em Agronomia / Energia na Agricultura – Faculdade de Ciências Agronômicas, Universidade Paulista).

Author: MIRIAM ROBERTA HENRIQUE

Adviser: WALDEMAR GASTONI VENTURINI FILHO

SUMMARY

The aim of this project was to evaluate the relationship of the must phenolic compounds concentration with the cellular viability, budding viability, cellular budding of alcoholic yeast and the efficiency of the fermentation for by-products during the harvest 2011/2012 in São Manoel Sugar Mill, São Manuel (SP). This unit began the harvest with the selected yeast called CAT-1. During the harvest, the native stumps penetrated the fermentation process and they were also appraised as for the sensibility to the concentration of the phenolic compounds.The research was developed as a case study in the industrial plant of continuous fermentation. Analyses of concentration of the must phenolic compounds were accomplished through the FolinCiocalteu method, while the analyses of cellular viability, budding viability and budding yeast were made through counting in Neubauer chamber using a marker ( m-ethilen blue).The efficiency of the fermentation was determined using by-products generated during the fermentation process . Statistical analysis was evaluated by

Pearson’s correlation coefficient and its significance through the “t” test .It was

(18)

budding cellular yeast and with the efficiency of the fermentation in none of the studied periods.

_________________________________________________________________________

Key-words: phenolic compounds, Saccharomyces cerevisiae, cellular viability, budding

(19)
(20)

CONSIDERAÇÕES INICIAIS

1.1 INTRODUÇÃO

A cana-de-açúcar (Saccharumspp.), por apresentar potencial

genético favorável para acúmulo de sacarose, é a principal responsável pela produção de açúcar e etanol no Brasil, que se destaca como maior produtor mundial de etanol de cana-de-açúcar (UNICA, 2009).

A fermentação alcoólica é uma das principais etapas do processo para produção do etanol, na qual as leveduras (Saccharomycescerevisiae) transformam

açúcares presentes no mosto em etanol, gás carbônico e componente secundários. Este processo pode ser influenciado por vários fatores, entre eles, temperatura, pH, pressão osmótica, composição do meio, bactérias, leveduras contaminantes, etc.

A qualidade da matéria-prima afeta diretamente a eficiência fermentativa, levando à queda do rendimento alcoólico, quando o mosto contem ácidos orgânicos e inorgânicos que inibem o processo fermentativo (PAYNE, 1989).

A matéria-prima não se restringe somente ao caldo da cana-de-açúcar. Nas unidades de produção de etanol acopladas a unidades de produção de açúcar, a matéria-prima utilizada para obtenção deste produto é o mel final diluído em caldo secundário (extraído a partir do segundo terno) ou filtrado após tratamento, ou somente em água. Nos últimos anos, a utilização de mel com maior nível de esgotamento como matéria-prima de fermentação vem se tornando uma pratica comum. Neste mel estão presentes açucares fermentescíveis e não fermentescíveis, cinzas, sais, compostos coloridos e outros (TOSETTO, 2008).

(21)

A contribuição dos fatores de inibição provenientes da cana-de-açúcar pode ser atribuída à própria variedade utilizada, assim como a deterioração dessa planta, ocorrida devido às operações envolvidas nos processo de colheita, como horas de queima, tempo de corte e transporte.

O mel final, oriundo do processo de fabricação de açúcar, faz parte da composição do mosto de fermentação, que por sua vez, agrega, além de todos esses fatores vindos com a cana-de-açúcar, também os inibidores provenientes das operações envolvidas na produção do açúcar, tais como os ácidos orgânicos (lático, fórmico e acético) e hidroximetil-furfural - HMF (CRUIKSHANK; PERKIN, 1964; FRIEND, 1979; GODSHALL; LEGENDRE, 1988).

Segundo Amorim et al. (1996), as destilarias brasileiras têm como prática frequente iniciar os processos fermentativos com uma determinada levedura, seja pela tradição de seu uso, como a Saccharomycescerevisiae, pela

facilidade de obtenção em grandes quantidades, como as leveduras de panificação, ou ainda, pelo fato da mesma ter sido obtida através de melhoramento genético para se melhor adequar às necessidades do processo industrial.

As destilarias brasileiras, por não possuírem unidades de esterilização de mosto, são consideradas abertas do ponto de vista microbiológico. Elas trabalham com populações mistas, ou seja, varias linhagens de levedura presentes. Estas linhagens podem ser classificadas como sendo selecionadas, nativas ou selvagens. As linhagens selecionadas são aquelas adquiridas de forma pura para serem utilizadas como inóculo nas partidas das plantas industriais. As nativas são aquelas encontradas no processo, que apresentam características fermentativas satisfatórias, mas são diferentes em relação às selecionadas. As linhagens selvagens são aquelas presentes nos processos que apresentam características fermentativas não adequadas aos processos industriais e normalmente não são Saccharomyces, sendo consideradas oportunistas, dominando o

processo somente em condições anormais, tais como: operação com baixa concentração de etanol, paradas prolongadas, paradas curtas ou longas sequenciais, etc. (ANDRIETTA, 2007).

(22)

redutores residuais totais (ARRT) e menor rendimento fermentativo e consequentemente perdas na produção do etanol (RAVANELI, 2010).

Inserido nesse contexto, o presente estudo teve como objetivo investigar os efeitos da concentração dos compostos fenólicos presentes no mosto sobre a viabilidade celular, a viabilidade de brotamento celular, taxa de brotamento celular e a eficiência fermentativa durante a safra 2011/2012 da Usina São Manoel, São Manuel, SP.

1.2REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

1.2.1 Cana-de-açúcar

A provável origem da cana-de-açúcar é o norte da Índia. Há referências sobre a produção de açúcar na Pérsia 500 D.C. Da Pérsia, foi levada para costa ocidental através do Mar Mediterrâneo e daí para a Espanha, por volta do século VIII. Nos séculos XI e XII, através das Cruzadas, espalhou-se por toda a Europa, África e China. Na América, foi introduzida por Colombo em São Domingos, em 1.494. No Brasil, o plantio iniciou-se em São Vicente, em 1.522, trazida por Martin Afonso de Souza (MARQUES, 2001).

A cana-de-açúcar pertence ao gênero Saccharum e possui várias

espécies. Sua reprodução pode ser por sementes (sexuada) ou por brotação de gemas (assexuada). A via sexuada é fortemente influenciada por fatores como localização geográfica e variáveis climáticas. Em condições de produção industrial, o processo baseia-se na brotação de gemas de plantas sadias de variedades selecionadas, por apresentar características de interesse industrial (MARQUES, 2001).

(23)

Fibra 8 a 18%

Celulose Lignina Pentosanas

Caldo 86 a 92%

Água 75 a 82%

Sólidos Solúveis 18 a 25%

Açúcares 15,5 a 27%

Sacarose (12 a 18%) Glicose (0,2 a 1%) Frutose (0 a 0,5%)

Não-açúcares (impurezas)

1 a 2,5%

Orgânicos 0,8 a 1,8%

Inorgânicos 0,2 a 0,7%

Aminoácidos Ácidos Ceras Corantes Gorduras SiO2 K2O P2O5 CaO MgO N2O Fe2O3 SO3

Figura 1.1 – Composição da cana-de-açúcar.

1.2.2 Mel final ou melaço

(24)

1.2.3 Levedura alcoólica

As leveduras são seres eucariontes e forma uma das classes mais importante dos fungos. A Saccharomycescerevisiae, que são as leveduras mais

utilizadas na produção de etanol, apresenta-se na forma unicelular com 2 a 8 micrômetros de diâmetro. São anaeróbicas facultativas (STECKELBERG, 2001). Encontram-se predominantemente na forma unicelular e facilmente se diferenciam das bactérias em virtude de suas dimensões maiores e de suas propriedades morfológicas. Uns dos aspectos que as caracterizam como fungos são a composição da parede celular, a perda de mobilidade e a ausência de fotossíntese (McKANE; KANDEL, 1996; MORTIMER, 2000, citados por WIESIOLEK, 2007).

Como resultado de seu modo reprodutivo, condições de cultivo, idade e cultura, a célula da levedura pode apresentar diferentes formas e tamanhos, sendo as mais comuns as esféricas, globosas, ovoides e alongadas. As leveduras podem multiplicar-se por gemulação (brotamento), esporulação ou por fissão. O método mais comum é o de gemulação (brotamento), sendo que durante sua vida uma célula madura (célula mãe) pode gerar até 24 brotos (células filhas). As principais microestruturas das leveduras são a parede celular, a membrana citoplasmática, o núcleo, os vacúolos e as mitocôndrias (AMORIM et al., 1996).

O crescimento pode ser definido como um aumento dos constituintes celulares, levando a um aumento no número de células, quando microrganismos crescem através de processos como brotamento ou fissão binária. Esse crescimento pode ser descrito como função logarítmica do número de células em determinado período de incubação, resultando numa curva de quatro fases diferentes (GLAZER, 1998).

1. Fase lag: quando os microrganismos entram num meio de cultura fresco,

usualmente não aumentam imediatamente o número de células ou massa. A divisão celular não ocorre imediatamente, pois a célula está sintetizando novos componentes. Esta fase varia seu comprimento consideravelmente com as condições do microrganismo e a natureza do meio (GLAZER, 1998).

2. Fase exponencial ou fase log: os microrganismos estão crescendo ou dividindo

(25)

intervalos regulares. A população é mais uniforme em termos químicos e fisiológicos nesta fase (GLAZER, 1998).

3. Fase estacionária: o crescimento populacional cessa e a curva se torna horizontal. O tamanho da população final depende da disponibilidade de nutrientes, dentre outros fatores. Nessa fase, o número total de organismos viáveis permanece constante. Este pode ser resultado de um balanço entre divisão e morte celular ou a população pode simplesmente cessar a divisão e permanecer em atividade metabólica. Sabe-se que os microrganismos entram em fase estacionária por muitas razões, sendo uma delas a limitação de nutrientes. Porém o crescimento também pode cessar devido ao acúmulo de produtos tóxicos, limitando principalmente culturas anaeróbias (GLAZER, 1998; PRESCOTT, 1999).

4. Fase de morte: restrições ambientais ocorrem com a privação de nutrientes e a produção de metabólitos tóxicos que levam ao declínio no número de células viáveis. A morte da população microbiana, como seu crescimento, é exponencial. Este padrão ocorre mesmo quando o número total de células permanece constante porque as células simplesmente não se dividem após morrerem (GLAZER, 1998; PRESCOTT, 1999).

Nas leveduras, encontra-se uma variedade de reações fisiológicas. O metabolismo de açúcar como a glicose, pode ocorrer anaeróbica (fermentação) ou aerobica (respiração). O processo mais característico é o metabolismo anaeróbico, também conhecido comumente como fermentação alcoólica, cujos produtos finais são etanol e gás carbônico (PELCZAR; REID; CHAN, 1980 citados por WIESIOLEK, 2007).

O metabolismo da levedura, como o de qualquer ser vivo, pode ser dividido didaticamente em anabolismo e catabolismo. O processo anabólico diz respeito a reações de síntese de material celular, tais como proteínas, gorduras, polissacarídeos, etc., à custa de energia celular armazenada na molécula de ATP. No catabolismo o processo se inverte, as moléculas são quebradas e oxidadas, sendo que a energia química produzida nessas reações é acumulada nas moléculas de ATP (VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001).

(26)

da célula que a fermentação alcoólica se processa. Essas enzimas, referidas como

“glicolíticas”, sofrem ações de diversos fatores (nutrientes, minerais, vitaminas,

inibidores, substâncias do próprio metabolismo, pH, temperatura e outros), alguns que estimulam e outros que reprimem a ação enzimática, afetando o desempenho do processo fermentativo conduzido pelas leveduras (LIMA et al., 2001).

Segundo Wiesiolen (2007), a glicólise é a soma total de reações bioquímicas pelas quais a glicose é convertida em piruvato. A via mais frequente é a de Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP) (Figura 1.2).

Figura 1.2 – Via de Embdem-Meyerhof-Parnas (EMP)

Glicose (1) Glicose 6-fosfato (2) Futose 6-fosfato (3) Frutose 1,3-difosfato (4) Gliceraldeído-3-fosfato (5) 1,3 difosfato-Glicerato (6) 3-Fosfoglicerato (7) 2-Fosfoglicetato (8) Fosfoenolpiruvato (9) Piruvato (10) Acetaldeído (11) Etanol Enzimas envolvidas

1- Hexoquinase (Mg++ATP convertido em

ADP)

2- Fosfohexoseisomerase

3- Fostofrutoquinase (Mg++ATP convertido em

ADP) 4- Aldolase

5- Gliceraldeído 3-P-desidrogenase (entra NAD sai NADH + H++ + Pi)

6- Fosdoglicerilquinase (entra ADP sai ATP) 7- Fosfoglicerilmutase

8- Enolase

9- Piruvatoquinase (entra ADP sai ATP) 10-Piruvato descarboxilase (Liberação de CO2)

(27)

Convém ressaltar que a levedura Saccharomycesé um anaeróbio

facultativo, ou seja, tem a habilidade de se ajustar metabolicamente, tanto em condições de aerobiose como de anaerobiose (ausência de oxigênio molecular). Os produtos finais da metabolização do açúcar irão depender das condições ambientais em que a levedura se encontra. Assim, enquanto uma porção do açúcar é transformada em biomassa, CO2 e H2O em aerobiose, a maior parte é convertida em etanol e CO2 em anaerobiose, processo denominado fermentação alcoólica (LIMA et al., 2001).

O balanço global dos dois ciclos pode ser resumido pelas equações:

Fermentação alcoólica

C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 57 Kcal (1)

Respiração

C6H12O6 + 6O2 6CO2 + 6H2O + 38ATP + 688 Kcal (2)

A reação global da glicólise demonstra que 1 mol de glicose (180g) produz 2 moles de etanol (92g), 2 moles de dióxido de carbono (88g), 2 moles de ATP e 57 Kcal de energia. Assim, o rendimento teórico para a produção de etanol é de 0,511 g/g. Na prática, segundo Oura (1974), este valor não é observado devido à utilização de parte da glicose para produção de glicerol e alcoóis superiores, substâncias necessárias para síntese de material celular e manutenção da levedura.

A via respiratória – energeticamente mais eficiente – é utilizada no início do processo de fermentação, com a finalidade de promover o crescimento e o reviramento do fermento. A via fermentativa tem a função de promover a transformação do açúcar em etanol e gás carbônico (VENTURINI FILHO; CEREDA, 2001). Os carboidratos considerados substratos para a fermentação, tanto podem ser endógenos (constituintes da levedura, como glicogênio e trealose) como exógenos (sacarose, glicose, frutose e outros provenientes da matéria-prima) (LIMA et al., 2001).

(28)

célula (ALMEIDA; SILVA, 2005; WALKER, 2000). As leveduras consomem primeiro a glicose e depois a frutose (RUSSEL, 1994).

Dos fatores ambientais que regulam a respiração e a fermentação em células de leveduras, a disponibilidade de glicose e oxigênio é o mais documentado (WALKER, 2000). No caso de algumas leveduras, entre elas a

Saccharomycescerevisiae, em presença de glicose mesmo em condições estritamente

aeróbias, o metabolismo é do tipo respiro-fermentativo. Esse comportamento metabólico é provocado por um efeito conhecido como efeito Crabtreeou repressão

catabólica. Esse efeito se pronuncia em condições onde a concentração de glicose

ultrapassa um valor limite. O mecanismo responsável pela repressão catabólica pode ser bastante complexo, mas estudos mostram que ocorre principalmente através do forte efeito repressivo da glicose sobre a atividade de enzimas respiratórias e também, possivelmente, pela inibição da expressão genética de enzimas constituintes da via respiratória, fazendo com que parte do piruvato que não pode ser oxidado pelo ciclo de Krebs seja reduzido a etanol pelo processo fermentativo (BAKKER et al., 2001). Em

contrapartida, outro efeito conhecido como efeito Pasteur relaciona o oxigênio com a

cinética do catabolismo de açúcar, estabelecendo que, sob condições anaeróbias, a glicólise aconteça mais rápido do que sobre condições aeróbias. Este fenômeno é observado somente quando as concentrações de glicose forem baixas (cerca de 5 mM) ou sob certas condições de nutrientes limitantes (WALKER, 2000). Segundo Nogueira e Venturini Filho (2005), a principal diferença entre o efeito Pasteur e o efeito Crabtreeé

que no primeiro, observa-se a tendência da levedura respirar em meios aeróbios, enquanto no segundo, constata-se que a levedura pode fermentar mesmo na presença de oxigênio.

(29)

Na sequência de reações enzimáticas de produção de ATP, é intrínseca à formação de etanol, rotas metabólicas alternativas aparecem para propiciar a formação de materiais necessários à constituição da biomassa (polissacarídeos, lipídeos, proteínas, ácidos nucleicos e outros), bem como para a formação de outros produtos de interesse metabólico, relacionados direta e indiretamente com a adaptação e sobrevivência. Assim, juntamente com o etanol e o CO2, o metabolismo anaeróbio permite a formação e excreção de glicerol, ácidos orgânicos (succínico, acético, pirúvico e outros), alcoóissuperiores, acetaldeído, acetoína, butilenoglicol, além de outros compostos de menor significado quantitativo (LIMA et al., 2001).

Simultaneamente ocorre o crescimento das leveduras (formação de biomassa). A formação do glicerol, o mais abundante dos compostos orgânicos secundários da fermentação, está acoplada à manutenção do equilíbrio redox celular, o qual é alterado quando da formação de ácidos orgânicos, biomassa e da presença de sulfito no mosto. A formação de glicerol também está relacionada a uma resposta ao estresse osmótico, quando de concentrações elevadas de açúcares ou de sais no mosto (WALKER, 2000; LIMA et al., 2001).

Segundo Amorim et al. (1996), a levedura como entidade viva independente, realiza a fermentação do açúcar com o objetivo de conseguir a energia química necessária para a sua sobrevivência, sendo o etanol apenas e tão somente um subproduto desse processo. Se o homem pretende beneficiar-se dessa habilidade metabólica, ele deve buscar os conhecimentos que lhe permitam propiciar às leveduras, condições ideais para que as mesmas trabalhem a seu favor, isto e, com maior eficiência na produção de etanol.

1.2.4 Fermentação alcoólica

Segundo Lima (1985), a primeira destilaria de etanol no Brasil foi montada em Piracicaba-SP, onde o processo de fermentação era batelada. O fermento utilizado era multiplicado para cada batelada e nessa época havia dois tipos de fermentação: a utilizada para produção de álcool nas usinas de açúcar e a desenvolvida para produção de aguardente.

(30)

economia de açúcar devido a menos reprodução celular, elevado rendimento de etanol, eliminação de contaminantes pela centrifugação do vinho fermentado, fermentação menos contaminada devido ao tratamento do leite de levedura (tratamento ácido), menor complexidade das operações (FERREIRA, 2005).

O processo mais difundido no Brasil sempre foi o de batelada-alimentada com recirculação da levedura, esse processo já era bastante conhecido e utilizado em outros países e também no Brasil, mas precisou de muito estudo e aprimoramento para atingir os níveis de produtividade e eficiência obtidos hoje (CORTEZ, 2010).

Até o início dos anos 60, poucos eram os investimentos feitos na produção de etanol no Brasil. As causas para este atraso estiveram provavelmente ligadas ao problema de falta de incentivo, dificuldade de obtenção de equipamentos e até mesmo ao pequeno interesse que a produção de etanol despertava devido ao mercado interno ser pequeno e o externo possuir forte concorrência (ANDRIETTA, 1994).

Então, na década de 60 iniciou-se a modernização desta indústria, onde Borzani e Fernandes (1994) citados por Andrietta (1994), estudaram a cinética da fermentação alcoólica contínua.

No início da década de 70, praticamente todas as destilarias de etanol já operavam com o processo Melle-Boint, com grandes ganhos no rendimento e na produtividade. Nesta década, este processo foi otimizado, chegando aos anos 80 no seu máximo de eficiência. Nesta mesma década também se intensificou estudos sobre o processo contínuo de fermentação alcoólica (ANDRIETTA, 1994).

Com o advento do PROALCOOL, houve um maior interesse na produção de etanol, e algumas indústrias partiram para a fermentação contínua, que no início apresentara alguns problemas, que segundo Finguerutet al. (1992) citados por Andrietta (1994), foram devidos às primeiras plantas contínuas serem fruto de adaptações de baixo custo de plantas de batelada-alimentada já existentes.

1.2.4.1Processos

(31)

1.2.4.2Processo batelada

O processo batelada é também conhecido como processo descontínuo. Este processo no passado foi muito utilizado na produção de etanol, mas segundo Maiorellaet al. (1981), ele é lento, pois se gasta muito tempo para o preparo do

reator.

Prepara-se um meio de cultura adequado à nutrição e ao desenvolvimento do microrganismo e também ao acúmulo do produto desejado; coloca-se este meio de cultura em um biorreator; adiciona-coloca-se o microrganismo responsável pelo processo biológico e se aguarda que o processo ocorra. Após um determinado tempo de fermentação, retira-se o caldo fermentado do reator e executam-se as operações unitárias necessárias para a recuperação do produto (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001, citados por PACHECO, 2010).

É considerado um processo seguro com relação a assepsia, pois ao final de cada batelada, o reator pode ser esterilizado juntamente com um novo meio de cultura, recebendo um novo inoculo (SCHIMIDELL; FACCIOTTI, 2001, citados por PACHECO, 2010). Além do menor risco de contaminação, este processo apresenta grande flexibilidade de operação pela possibilidade de utilização dos fermentadores para fabricação de diferentes produtos e por permitir melhor condição em relação a estabilidade genética do microrganismo (CARVALHO; SATO, 2001, citados por PACHECO, 2010).

A fermentação em batelada pode levar a baixos rendimentos e produtividade quando o substrato é adicionado de uma só vez, no início do processo, pois exerce efeitos de inibição, repressão ou desvia o metabolismo celular a produtos que não interessam (CARVALHO; SATO, 2001, citados por PACHECO, 2010).

A condução da fermentação alcoólica por processo em batelada, praticamente só ocorre em escala de laboratório e em pequenas destilarias de aguardente (PACHECO, 2010).

1.2.4.3Processo batelada alimentada

(32)

Esse processo possibilita uma vazão de alimentação constante ou variável com o tempo e a adição de mosto de forma contínua ou intermitente. Devido à flexibilidade de utilização de diferentes vazões de enchimento dos reatores, no processo batelada alimentada é possível controlar a concentração de substrato no fermentador, de modo que o metabolismo microbiano seja deslocado para uma determinada via metabólica, levando ao acúmulo de um produto específico (CARVALHO; SATO, 2001).

Almeida (1960) citado por Ferreira (2005) descreveu as seguintes vantagens do processo Melle-Boinot:

- Economia de açúcar devido à menor reprodução celular elevando o rendimento em etanol;

- Eliminação de contaminantes pela centrifugação do vinho (separação de células de levedura);

- Fermentação mais pura devido ao tratamento de leite de levedura (tratamento ácido); - Eliminação da necessidade de cultura pura no preparo do pé-de-cuba, prática exigida

no processo clássico, diminuindo, portanto, a complexidade das operações da planta.

1.2.4.4Processo contínuo

Este processo não sofre interrupções, há a retirada continua do produto a uma vazão igual a da alimentação, permitindo um fluxo contínuo, diminuindo assim, o efeito inibitório do etanol e do substrato. Este tipo de processo atinge, quando bem operado, maior produtividade e rendimento.

Segundo Rodrigues et al. (1992), este processo tem apresentado uma maior produtividade, com um aumento que pode atingir 100% em relação à batelada alimentada. Os novos projetos que estão sendo desenvolvidos consideram a cinética do processo e utilizam ferramentas matemáticas e computacionais. Com isto obtêm-se processos que:

- Reduzem gastos em mão-de-obra; - Aumentam a produtividade;

- Reduzem o tempo não produtivo (carga, descarga, limpeza);

(33)

1.2.5 Fatores que interferem no processo fermentativo

Segundo Luceri et al. (2005), as leveduras são capazes de sobreviver em flutuações ambientais intensas por adaptarem rapidamente sua máquina bioquímica interna às novas condiçoes. Um aspecto desta adaptação é a marcada capacidade de ajuste da expressão gênica às necessidades ambientais requeridas para seu crescimento.

Organismos unicelulares requerem condições internas específicas para crescimento. Estratégias múltiplas existem para manter essas condições internas, face a vários e frequentes ambientes externos instáveis. Considerando que organismos multicelulares podem usar órgãos e tecidos especialidados para prover um ambiente interno relativamente estável e homogêneo, organismos unicelulares como a levedura S. cerevisiae tem desenvolvido mecanismos autônomos para adaptação de

mudanças ambientais drásticas. As leveduras regularmente resistem a flutuações nos tipos e quantidades de nutrientes disponíveis, temperatura, osmolaridade e acidez de seu ambiente, a variável presença de agentes nocivos, como radiação e agentes tóxicos. De fato, quando condições ambientais mudam abruptamente, a célula deve rapidamente ajustar seu programa de expressão genômica para adaptarem-se as novas condições (GASH et al., 2000).

1.2.5.1pH

Segundo Amorim et al. (1996), o pH é fator significativo para as fermentações industriais devido à sua importância tanto no controle da contaminação bacteriana quanto ao seu efeito sobre o crescimento da levedura, taxa de fermentação e formação de subprodutos.

Os valores de pH dos mostos industriais geralmente encontram-se na faixa de 4,5 a 5,5 com uma boa capacidade tampão, mas as leveduras mantêm uma homeostase de forma independente dos valores de pH do meio, por isso toleram o tratamento ácido. O tratamento ácido também provoca lixiviação de nutrientes tais como N, P e K da levedura que acaba por elevar o pH. Embora o tratamento ácido se mostre estressante à levedura, ele apresenta efeito benéfico de controlar a contaminação bacteriana, pois ocorre uma redução significativa no número de bactérias durante esse tratamento (AMORIM et al., 1996).

O pH ótimo para a produção de etanol por leveduras

(34)

pHaté 7, observa-se via de regra, uma diminuição do rendimento em etanol, com aumento da produção de ácido acético (MAIA, 1989).

Segundo Blanchet e Ballerini, citados por Maia (1989), o pH interno da célula se mantêm na faixa de 5,8 a 6,8, entretanto, baixos valores de pH tornam o meio mais agressivo, uma vez que exigem das leveduras um maior dispêndio de energia na manutenção do pH interno, além, de afetar as proteínas de transporte da membrana citoplasmática que ficam expostas ao meio externo. O pH do meio externo também, afeta a velocidade de crescimento das leveduras, a qual atinge um máximo quando o pH está compreendido entre 5 e 6. Na fermentação alcoólica, o estabelecimento e controle do pH do meio em valores inferiores a 5 é também considerado importante como meio para prevenir contaminação por bactérias láticas e acéticas.

1.2.5.2Temperatura

Na indústria, a temperatura do mosto é um fator crítico no processo fermentativo. Segundo Steckelberg (2001) a temperatura ótima de fermentação é uma função que depende do teor do etanol no meio, tendendo a diminuir com o aumento do teor alcoólico. Portanto, teoricamente, a otimização de um processo de fermentação com relação à temperatura requer uma redução da temperatura do processo, à medida que o etanol é produzido. A temperatura de fermentação também influencia a fluidez na membrana citoplasmática e a atividade das enzimas, alterando a permeabilidade na membrana e o metabolismo das células.

O efeito inibitório do etanol está intimamente relacionado à temperatura da fermentação. Segundo Sá-Correia e Van Uden (1983), a faixa de melhor resistência ao etanol para cepas usuais de Saccharomycescerevisiae é de 13 a 27ºC a

11% (v/v) de etanol. A tolerância ao etanol diminui para temperaturas mais baixas que 13ºC ou mais altas que 27ºC, de forma que a inibição do crescimento do microrganismo ocorre tanto em processos à baixa temperatura (cervejas, espumantes), como em processos à alta temperatura (etanol combustível, vinhos tintos).

(35)

provoca uma diminuição das 3 temperaturas. Quando Tmaxf se iguala a temperatura do processo, o crescimento celular torna-se nulo.

Segundo Maia (1989), a temperatura ótima de crescimento das leveduras é geralmente, inferior à temperatura ótima para produção de etanol. A fermentação alcoólica geralmente é conduzida em torno de 30 a 32ºC, quando se pretende maximizar a produtividade em etanol.

1.2.6 Contaminação microbiana

A característica microbiológica da cana-de-açúcar que entra no processo de extração das unidades sucroenergéticas no Brasil normalmente apresenta altos níveis de microrganismos contaminantes, sejam eles bactérias, leveduras ou fungos. Isso porque, segundo Dorta (2006), a decomposição da sacarose por microrganismos inicia-se quando a cana-de-açúcar está ainda no campo. Quanto mais rápido a cana for levada à usina para ser convertida em sacarose ou etanol, mais eficiente será o processo de obtenção de tais produtos. Oliva-Neto (1995), citado por Dorta (2006), durante o processamento da cana até a etapa de fermentação alcoólica nas dornas das destilarias, a microbiota contaminante passa por uma grande seleção em função do pH, temperatura, condições atmosféricas e produtos inibidores (presentes no substrato) a que são submetidas. Assim, durante o processo fermentativo, a microflora restringe-se a poucos gêneros, uma vez que o pH torna-se mais baixo e existe o aumento do teor alcoólico, ficando difícil a adaptação para a maior parte dos microrganismos. Entretanto, o processo de batelada alimentada ou contínuo com o reciclo de célula, utilizado nas usinas sucroenergéticas favorece a proliferação de alguns gêneros contaminantes nas dornas fermentativas (OLIVA-NETO E YOKOYA, 1994).

O aumento das contaminações na cana-de-açúcar pode ser favorecido por geadas como mostram os trabalhos de Irvine eFriloux (1965) e Coll et al. (1978), e também por doenças e parasitas como as galerias formadas pela

Diatraeasaccharalis, que facilitam a entrada de bactérias, fungos e leveduras nos

colmos da cana, facilitando sua deterioração (TILBURY, 1969). Mayeux e Colmer (1975); Duncan e Colmer (1964), relatam o aumento das contaminações no caldo de cana-de-açúcar como consequência da terra que se adere às raízes, colmos e folhas quando são carregadas até a indústria.

(36)

Leuconostoc, sendo este último menos comum devido a menor resistência ao teor

alcoólico (OLIVA-NETO, 1995). Oliva-Neto (1990) isolou como principal contaminante da fermentação alcoólica o gênero Lactobacillus, a partir de amostras de

leite de levedura, em usinas do estado de São Paulo. A análise taxonômica demonstrou

que L. fermentumfoi a bactéria predominante (62%), seguida por L. murinus(9%), L.

vaccinostercus(9%), L. plantarum(2%) e Leuconostocsp (2%). Do total da referida

microflora, 64% resistiu a 10% (v/v) de etanol em cultivo isolado.

Segundo Narendranathet al. (1997), a contaminação por bactérias láticas é o maior problema da fermentação industrial de etanol. O crescimento das referidas bactérias reduz o rendimento alcoólico devido o consumo de glicose que seria destinada à síntese etanólica, além da competição dos nutrientes do meio, e do efeito tóxico do ácido lático (YOKOYA, 1991, NARENDRANATHet al. 1997). Além disso, tais bactérias podem induzir a floculação do fermento causando o assentamento de células de leveduras no fundo das dornas e perda de células nas centrífugas contribuindo ainda mais para a diminuição do rendimento, produtividade e viabilidade celular (OLIVA-NETO; YOKOYA, 1994).

1.2.7 Culturas puras de levedura

No final dos anos 1920, começou-se a falar no Brasil da substituição da fermentação espontânea pela cultura de levedo puro, já empregado nos países desenvolvidos, desde o final do século anterior.

1.2.7.1Identificação da levedura no processo fermentativo

(37)

selecionadas para o processo fermentativo (CABRINI; GALLO, 1999) citados por Steckelberg, 2001.

Os métodos moleculares têm sido bastante empregados na identificação de leveduras, uma vez que são mais precisos quando comparados aos testes tradicionais (morfológicos, bioquímicos e fisiológicos).

Atualmente, vários métodos moleculares são utilizados para caracterizar linhagens de leveduras no processo fermentativo, tais como o Polimerase

Chain Reaction (PCR), RandomAmplifiedPolymorphic DNA

(RAPD),RestrictionFragmentLengthPolymorfism (RFLP),

AmplifiedFragmentLenghtPolymorphism (AFLP) (RAVANELI, 2010). Entretanto, quando se pretende verificar a permanência de uma linhagem durante todo o processo de fermentação, a técnica mais empregada é a PFGE (Pulsed Field Gel Eletrophoresis), ou eletroforese em campo pulsado. Essa técnica consiste em separar o DNA cromossômico intacto, de acordo com o tamanho dos cromossomos, e tem-se mostrado uma importante ferramenta na identificação de gêneros, espécies ou estirpes de leveduras (BASSO et al.,1993). A técnica de eletroforese em campo pulsado tem sido amplamente empregada por diversos autores, segundo Ravaneli, 2010. Basso et al.

(1993), citados por Ravaneli (2010), investigando o emprego da técnica de PFGE no acompanhamento de linhagens industriais de Saccharomycescerevisiae, verificaram que

as leveduras de panificação não permanecem no processo fermentativo industrial após 40 dias, sendo substituídas por leveduras dominantes típicas de cada destilaria. Outro método também utilizado é Método PCR Microssatélite (ANTONANGELO et al. 2009).

Basso et al. (2008) citados por Ravaneli (2010), relatam que a principal razão pela qual essas leveduras são incapazes de permanecer no processo pode ser a condição de estresse imposta pelas fermentações, tais como alta concentração de etanol, estresse osmótico, elevadas temperaturas, presença de sulfito e bactérias contaminantes.

1.2.8 Compostos fenólicos na cana-de-açúcar

(38)

A concentração destes compostos na planta está relacionada ao ataque de fungos, bactérias e insetos (CRUIKSHANK; PERKIN, 1964; FRIEND, 1979). Em adição, injuria mecânica e química e doenças virais e bacterianas induzem a produção de cor vermelha no tecido possivelmente como resposta ao estresse na cana-de-açúcar (GODSHALL; LEGENDRE, 1988).

Os componentes fenólicos sofrem reações não enzimáticas, incluindo oxidação e autopolimerização com pigmentos marrom escuro, reações com proteínas e aminoácidos, para produzirem melaninas, pigmentos de coloração marrom e reações com aldeídos para produzir produtos de condensação vermelhos na presença de ácidos (BOVI, 1997). Os compostos fenólicos também sofrem reações de escurecimento por via enzimática. A reação de cor catalisada por enzima resulta da ação de difenol-O2oxiredutase sobre os fenólicos, particularmente ácido clorogênico. A o-diquinona resultante dessa oxidação é quimicamente reduzida a um o-difenol secundário e a quinina secundária assim formada, polimeriza para formar cor. Compostos poliméricos coloridos podem também ser formados a partir da quinonaclorogênica após reação com aminoácidos (GROSS; COOMBS, 1976, citados por TOSETTO, 2008).

Paton (1978) utilizou cromatografia em camada delgada em placas de celulose para a identificação de ácidos fenólicos presentes em folhas de cana-de-açúcar, caldo de cana, e outros produtos oriundos da cana-cana-de-açúcar, identificando treze ácidos fenólicos (Tabela 1.1).

Larrahondoet al. (1996) promoveram identificação dos compostos fenólicos em açúcar bruto empregando cromatografia gasosa (CG) acoplada a espectrometria de massa (MS). Esta analise indicou a presença de diversos ácidos fenólicos no açúcar bruto, os quais estavam presentes na cana-de-açúcar como ácido fenólico, siríngico e derivados do ácido cinâmico, além de derivados de ácido benzoico.

(39)

Tabela 1.1 - Compostos fenólicos e flavonóides em cana-de-açúcar e seus produtos, identificados por diversos autores.

Compostos fenólicos e flavonóides

Derivados do ácido benzóico

ácidogentístico ácido p-hidroxibenzóico ácido m-hidroxibenzóico ácido 3,4-dihidroxibenzóico

ácidovanílico ácidosiríngico ácido salicílico 3,4-dihidroxibenzaldeído

p-hidroxibenzaldeído ácido 2,3-dihidroxibenzóico

vanilina

Derivados do ácido cinâmico

ácido o-cumárico ácido p-cumárico

ácidocafeico ácidoferúlico ácidosinápico ácidoclorogênico éster de ácido ferúlico

Derivados de cumarina

cumarina umbeliferona

esculina

Flavonas

apigenina luteolina

tricina

Flavonóis

quercetina rutina kaempferol

Outros derivados

ácido quiníco-3'-cafeiol ácido quiníco-3'p-cumaroil ácido quínico-4-p-cumaroil

coniferina sinapoil glicose p-cumaroil glicose

(40)

1.2.9 Compostos fenólicos e fermentação alcoólica

Vários são os trabalhos realizados que visam determinar a forma de ação dos compostos fenólicos sobre os microrganismos, principalmente em produtos

desinfetantes. Klarmann e Shternov (1936) citados por O’Connor e Rubino (1991),

realizaram testes para comprovar a ação germicida de compostos fenólicos e concluíram que a potência germicida contra os microrganismos testados aumenta com o aumento do peso molecular dos compostos fenólicos.

O’Connor e Rubino, (1991) relatou que o fenol e seus derivados

apresentam diversos tipos de ação bactericida. Em altas concentrações estes compostos atuam como um violento veneno protoplasmático, penetrando e rompendo a parede celular e precipitando as proteínas celulares. Entretanto, em baixas concentrações, os fenóis e seus derivados inativam o sistema de enzimas essenciais.

Segundo Borzani e Falcone (1960), o fenol se dissolve no protoplasma. Sua ação depende de seu coeficiente de distribuição entre o meio e os lipídeos do protoplasma. Quando a concentração de fenol na célula ultrapassa um valor máximo, as proteínas precipitam irreversivelmente e a célula morre.

Martin e Jonsson (2003) compararam a resistência de onze cepas (industrial e laboratório) de Saccharomyces e Zigosaccharomycesa inibidores da

fermentação de derivados lignocelulósicos. Eles prepararam um coquetel inibidor, em diferentes concentrações, contendo dois ácidos alifático, dois furaldeídos e dois compostos fenólicos. Concluíram que dentro de uma mesma espécie existe uma cepa que é mais resistente ao coquetel inibidor tendo uma redução no rendimento em etanol de 10% em presença do coquetel inibidor na concentração de 100%, enquanto que a cepa mais sensível não produziu etanol na presença de 25% do coquetel inibidor.

Conforme Narendranathet al. (2001), os ácidos orgânicos também são potenciais inibidores das leveduras. Estes compostos estão presentes nas plantas da cana-de-açúcar e são carreados pelo caldo e acabam se acumulando nos méis que posteriormente serão fermentados. Este acúmulo acontece quando o caldo passa pelos evaporadores e cozedores para a retirada da água e cristalização do açúcar, mas a temperatura que o caldo é submetido não é suficiente para evaporar ou decompor estes compostos que possuem elevados ponto de ebulição e boa estabilidade térmica.

(41)

1.3REFERÊNCIAS

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RELAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DOS COMPOSTOS FENÓLICOS NO MOSTO COM A VIABILIDADE CELULAR, VIABILIDADE DE BROTAMENTO E A TAXA DE BROTAMENTO CELULAR DA LEVEDURA ALCOÓLICA.

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a relação da concentração dos compostos fenólicos do mosto com a viabilidade celular, viabilidade de brotamento e a taxa brotamento celular de levedura alcoólica, durante a safra 2011/2012 na Usina São Manoel, em São Manuel-SP. A pesquisa foi desenvolvida como um estudo de caso na planta industrial de fermentação contínua. Esta usina iniciou a safra com a levedura selecionada CAT-1, sendo que durante a safra as cepas nativas adentraram o processo fermentativo. As análises de concentração de compostos fenólicos do mosto foram realizadas através do método FolinCiocalteu, enquanto que as análises de viabilidade celular, viabilidade de brotamento e brotamento da levedura foram feitas através de contagem em câmara de Neubauer com corante azul de metileno. A análise estatística foi avaliada pelo coeficiente de correlação de Pearson e sua significância através do teste t. Concluiu-se que, os compostos fenólicos contidos no mosto tiveram relação

negativa sobre a viabilidade celularnos períodos com leveduras 100% das nativas e no período geral da safra; sobre a viabilidade de brotamento somente o período com leveduras 100% nativas tiveram relação negativa. Os compostos fenólicosnão apresentaram relação com o brotamento celular da levedura em nenhumdos períodos estudados.

Palavras-chave: compostos fenólicos, Saccharomycescerevisiae, viabilidade celular,

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RELATIONSHIP OF THE MUST PHENOLIC COMPOUNDS CONCENTRATION WITH THE CELLULAR VIABILITY, BUDDING VIABILITY AND THE CELLULAR BUDDING TAX OF THE ALCOHOLIC YEAST.

SUMMARY

The aim of this project was to evaluate the relationship of the must phenolic compounds concentration with the cellular viability, budding viability, alcoholic yeast cellular budding tax during the harvest 2011/2012 in São Manoel Sugar Mill, São Manuel (SP).The research was developed as a case study in the industrial plant of continuous fermentation. This unit began the harvest with the selected yeast called CAT-1. During the harvest, the native stumps penetrated the fermentation process Analyses of concentration of the must phenolic compounds were accomplished through the FolinCiocalteu method, while the analyses of cellular viability, budding viability and budding yeast were made through counting in Neubauer chamber using a marker(m-ethilen blue).Statistical analysis was evaluated by Pearson’s correlation

coefficient and its significance through the “t” test.It was concluded that the must phenolic compounds had negative relationship about the cellular viability in the periods with 100% of native yeasts along the general period of the harvest; about the budding viability only the period with 100% native yeasts had negative relationship. The phenolic compounds didn't present relationship with the budding cellular yeast and with the efficiency of the fermentation in none of the studied periods.

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