UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
LUCIANA ELOÍSA DA SILVA CASTRO NÓBREGA
AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE EM LESÕES DE LÍQUEN PLANO ORAL E PÊNFIGO VULGAR.
Luciana Eloísa da Silva Castro Nóbrega
AVALIAÇÃO DA ANGIOGÊNESE EM LESÕES DE LÍQUEN PLANO ORAL E PÊNFIGO VULGAR ORAL
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Patologia Oral.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Antônio de Lisboa Lopes Costa
A DEUS, que sempre me conforta em oração nos momentos mais angustiantes e me abençoa todos os dias.
“Não cai uma lágrima de nossos olhos, não tem um suspiro em nossos corações sem uma resposta de DEUS”. (Bv. João XXIII)
Aos meus queridos pais, irmãos e sobrinha por todo amor, dedicação e por nunca deixarem de acreditar em mim até nos momentos que nem eu mesma acredito. Amo vocês!
Ao meu amor, agora meu marido, José Newton Filho, por me tornar uma mulher plena, realizada e sempre me apoiar em qualquer circunstância. Eu amo você para sempre!
Ao Professor Doutor, Antônio de Lisboa Lopes Costa, meu orientador, por sempre se mostrar interessado nas minhas dúvidas e incertezas, dando-me segurança e orientando-me no intuito de mostrar-me o melhor caminho nessa batalha. Exemplo de amor e dedicação não só para a Patologia Oral, mas para toda a Odontologia, abraçando toda causa em prol do pleno funcionamento da Faculdade de Odontologia da UFRN, tornando esta uma das melhores faculdades da área do Brasil. Esse, sim, sábio Mestre! Eu sou só orgulho e admiração!
A toda a minha família, que torce e vibra com cada conquista minha desde os meus primeiros passos.
Aos meus queridos amigos, que sentiram minha falta nos momentos que tive que me ausentar, porém sempre entenderam que isso era preciso, torcendo com afinco para a minha felicidade e realização.
À coordenadora, Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, por toda a sua dedicação, conhecimentos a mim transmitidos e por coordenar tão brilhantemente o Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN.
Ser mestre não é apenas lecionar, ensinar não é apenas transmitir o conteúdo programático. Ser mestre é ser orientador, guia e companheiro, é caminhar com o aluno passo a passo. É transmitir a este os segredos da caminhada. Ser mestre é ser exemplo de dedicação, de doação, de dignidade pessoal e de amor. Eu posso afirmar, com muito orgulho, que durante o Mestrado eu tive mestres assim, todos bastante preocupados em nos transmitir o máximo de conhecimento possível, com a melhor qualidade, sem demonstrar desânimo, entendendo os limites de cada um. E é por isso, meus mestres, Profa. Dra. Roseana de Almeida Freitas, Profa. Dra. Hébel Cavalcanti Galvão, Profa. Dra. Lélia Batista de Souza, Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz, Prof. Dr. Leão Pereira Pinto, Profa. Dra. Éricka Janine Dantas da Silveira, Profa. Dra. Márcia Cristina da Costa Miguel, Profa. Dra. Ana Miryam Costa de Medeiros, e Profa. Dra. Patrícia Teixeira, que devo todo o conhecimento adquirido no Mestrado da Patologia Oral para vocês. O meu muito obrigada, hoje e sempre!
a ajudar e ensinar tantas coisas que para mim eram tão desconhecidas. Agradeço em especial e com lágrimas nos olhos a minha querida turma de Mestrado: Alice Helena, que passou tão pouco tempo conosco, mas nos mostrou que tudo era possível; Tiago João, por ser sempre
tão “atrevido” e com tanto amor em fazer sempre o melhor; Maria Luiza, por sua dedicação inspiradora e contagiante; Luiz Eduardo, por ser sempre tão correto e perfeccionista; Andreia Do Carmo, por ser tão doce, emotiva e ao mesmo tempo muito sábia; Marcelo Nascimento, pela sua dignidade e hombridade; Thaís Maciel, por ser tão encantadora e batalhadora, Thâmara Manoela, por nos fazer chorar de rir, como todo bom cearense, mesmo nos piores momentos e Viviane Alves, que logo de cara me identifiquei, por ser sempre tão doce e corajosa. Eu não tenho palavras para dizer o quanto sou grata por tudo que passamos juntos, sempre apoiando um ao outro, nunca deixando que o outro desista... Foi lindo! Sem vocês não teria graça alguma!
Aos meus queridos amigos, que sentiram minha falta nos momentos que tive que me ausentar, porém sempre entenderam que isso era preciso, torcendo com afinco para a minha felicidade e realização.
Aos funcionários do Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral da UFRN, Gracinha, Lourdinha, Idelzuite, Sandrinha, Ricardo, Hévio e Patrícia da Clínica de Estomatologia, obrigada pela paciência e disponibilidade em ajudar.
RESUMO
O Líquen Plano Oral e o Pênfigo Vulgar são doenças imunológicas crônicas mucocutâneas de etiologias desconhecidas que podem acometer a mucosa oral. Tão importante quanto em neoplasias o papel da angiogênese na patogenia das doenças inflamatórias crônicas é de apreciável interesse, podendo ser considerado um marcador da atividade da doença. Ademais, com o estudo do processo angiogênico nessas lesões tem-se a possibilidade de aprimorar o entendimento do mecanismo patogênico nas mesmas. Este trabalho se propôs a avaliar a atividade angiogênica através da expressão imunoistoquímica do anticorpo anti-CD34, utilizando a técnica da MVC, em 26 casos de LPO reticulares, 14 casos de LPO erosivos, 18 casos de PV e em 15 casos de mucosa oral normal. Os resultados deste experimento foram submetidos a testes estatístico não-paramétricos com nível de significância de 5%. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre o número médio de vasos obtidos pela MVC nas lesões. Todavia, foi observado que a mediana dos casos de líquen plano oral foi maior que no grupo de pênfigo vulgar, que por sua vez revelou mediana maior que nos casos de mucosa oral normal (p=0,280). No tocante a
contagem microvascular de CD34 em relação à forma clínica dos líquens planos orais (reticular e erosivo), verificou-se uma mediana ligeiramente maior para a forma clínica erosiva. Apesar de os testes estatísticos utilizados não demonstrarem diferença significativa (p=0,720). Ainda que os resultados do presente estudo não permitam a afirmação contundente
da participação do processo angiogênico na patogênese e progressão das lesões de líquen plano oral e pênfigo vulgar, sugerimos que este processo está presente em ambas as lesões, porém outros estudos devem ser realizados a fim de que essa hipótese seja fundamentada.
ABSTRACT
Oral lichen planus and pemphigus vulgaris are chronic diseases mucous membrane immune of unknown aetiology that can be observed affecting to the oral mucous. A relevant as regards neoplasies the role angiogenesis in the inflammatory chronic disease pathogenesis as it provides a substancial interest can be considered as being an activity diseases marker; besides being through specialised research of this angiogenic process to improve of understanding pathogenic mechanism. This research proposes to assess angiogenic active through of antibody immunohistochemistry expression antiCD34 antibody in 26 OLP of reticular cases, 14 OLP erosives cases, 18 of PV cases and 15 specimens of normal oral mucosa. The result was submitted non-parametric tests of 5% significance level. It is not statistically significant correlacion was seen regarding between average vessels. However, only be effectively observed the median of OLP cases was larger than pemphigus vulgaris in fact proved average larger than oral normal mucosa (p=0,280). Regarding the microvascular count of CD34 concerning clinic form oral lichen planus (reticular and erosion) increased emphasis is more cross-border average for the form erosion clinic. Despite of the statistic tests could not be more effective (p=0,720). Even though, the results of the research is not sufficient to enable to consider of angiogenic process in the pathogenesis and lesions progression of oral lichen planus and pemphigus vulgaris, we suggest this process is present in both forms lesion, however, more studies must be made in the near future in order to prepare a well-founded proposal.
LISTA DE
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 - Especificação, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação do anticorpo primário utilizado... 37 Gráfico 1 - Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão analisada.
Natal/RN... 40 Gráfico 2 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com o tipo de
lesão avaliada. Natal/RN, 2014... 42 Gráfico 3 - Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com a forma
clínica de líquen plano oral. Natal/RN, 2014... 43 Figura 1 - Fotomicrografia do espécime de LPO exibindo hiperparaceratinização,
epitélio de revestimento atrófico, áreas de perda de nitidez da camada basal, projeções epiteliais e infiltrado inflamatório linfocítico subepitelial (H/E, 200X)... 44 Figura 2 - Fotomicrografia do espécime de PV exibindo separação intraepitelial,
acima da camada de células basais do epitélio, acantólise, células de Tzanck e um infiltrado leve de células inflamatórias crônicas no tecido conjuntivo (H/E, 200X)... 44 Figura 3 - LPO Reticular. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos
sanguíneos e células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X)... 45 Figura 4 - LPO Reticular. Marcação imunoistoquímica para o anticorpo
anti-CD34 em vasos sanguíneos e células endoteliais em meio ao infiltrado inflamatório linfocítico (LSAB, 100X)... 45 Figura 5 - LPO Erosivo. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação do
anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados (LSAB, 100X)... 46 Figura 6 - LPO Erosivo. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em
múltiplos vasos sanguíneos (LSAB, 100X)... 46 Figura 7 - Pênfigo Vulgar. Fotomicrografia evidenciando o padrão de marcação
do anticorpo anti-CD34 em vasos sanguíneos de calibres variados e em células endoteliais ocasionais (LSAB, 100X)... 47 Figura 8 - Pênfigo Vulgar. Imunoexpressão para o anticorpo anti-CD34 em vasos
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular do CD34 de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal/RN, 2014... 41 Tabela 2 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e
significância estatística para a contagem microvascular entre as lesões de LPO, PV e os espécimes de MON. Natal/RN, 2014... 42 Tabela 3 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos,
LISTA DE
LISTA DE ABREVIATURAS
APC Antigen-Presenting Cell– Célula Apresentadora de Antígeno CD Cluster of Diferentiation– Unidade de Diferenciação
CD62L L-Selectina
CD62E E-Selectina
CD62P P-Selectina
Dsg Desmogleína
ELAM-1 Molécula de Adesão doTipo 1
FvW Fator de Von Willebrand
GlyCAM-1 Molécula de Adesão do Tipo 1 que contém Glicano
H/E Hematoxilina e Eosina
HEV Vênula Especializada de Endotélio Alto
HIV Human Immunodeficiency Virus– Vírus da Imunodeficiência Humana
Ig Imunoglobulina
IL Interleucina
INF- Interferon gama
KDa Kilodalton
LP Líquen Plano
LPO Líquen Plano Oral
MDV Microvessel Density - Microdensidade Vascular
MHC Major Histocompatibility Complex– Complexo Principal de
Histocompatibilidade
MVC Microvessel Count –Contagmem Microvascular
MVV Microvessel Volume– Volume Microvascular OMS Organização Mundial da Saúde
P53 Proteína 53
PV Pênfigo Vulgar
RL Reação Liquenóide
Th T Helper– Células T Auxiliares
TGF- Transforming Growth Factor beta– Fator Transformador do
Crescimento beta
TGF -RI Receptor I para o Fator Transformador do Crescimento beta
TGF -RII Receptor II para o Fator Transformador do Crescimento beta
TNF-α Tumor Necrosis Factor alfa– Fator de Necrose Tumoral alfa
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO... 11 2 REVISÃO DE LITERATURA... 14 2.1 LÍQUEN PLANO ORAL... 14 2.1.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia... 14 2.2 PÊNFIGO VULGAR... 19 2.2.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia... 19 2.3 ANGIOGÊNESE... 23 2.3.1 Considerações Gerais... 23 2.3.2 Mensuração da Angiogênese... 24 2.3.3 O Processo Angiogênico nas Lesões Crônicas Inflamatórias (Líquen Plano
Oral e Pênfigo Vulgar)... 26 2.4 BIOMARCADOR ANGIOGÊNICO – CD34... 28 3 PROPOSIÇÃO... 31 4 MATERIAIS E MÉTODOS... 33 4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS... 33 4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO... 33 4.3 POPULAÇÃO... 33 4.4 AMOSTRA... 33 4.4.1 Critérios para seleção da amostra... 34 4.4.2 Caracterização da amostra... 34 4.5 ESTUDO CLÍNICO E MORFOLÓGICO... 35 4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO... 35 4.6.1 Método Imunoistoquímico... 35 4.6.2 Análise do Perfil Imunoistoquímico... 37 4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA... 38 5 RESULTADOS... 40 5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS... 40 5.2 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS... 41 5.2.1 Análise Quantitativa da Marcação Imunoistoquímica pelo anticorpo
anti-CD34...
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1 INTRODUÇÃO
O Líquen Plano Oral é uma doença imunológica crônica mucocutânea, de etiologia desconhecida e mediada por células T inflamatórias a qual apresenta uma vasta gama de manifestações clínicas, afetando comumente o epitélio escamoso estratificado. Trata-se da doença não infecciosa mais comum da mucosa oral e atinge 1 a 2% da população adulta acima de 40 anos de idade, embora adultos jovens e crianças possam desenvolver a doença (SOUSA; ROSA, 2008).
O pênfigo é uma doença autoimune individualizada pela formação de bolhas em pele ou em mucosas, que pode ser subclassificado em seis tipos: vulgar, vegetante, eritematoso, foliáceo, paraneoplásico e o IgA pênfigo. O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de pênfigo, tratando-se de uma doença crônica mucocutânea autoimune de etiologia desconhecida que inicialmente se manifesta na forma de lesões intraorais, as quais se dispersam para outras membranas mucosas e pele. Essa doença é caracterizada por uma formação de bolhas ou vesículas de diâmetros variáveis que uma vez rompidas originam erosões superficiais irregulares de sintomatologia dolorosa, as quais logo são recobertas por um tipo de pseudomembrana e circundadas por um eritema difuso (AMORMINO; BARBOSA, 2010). É uma doença rara, a qual acomete apenas de 1 a 5 pacientes por milhão/ano (NEVILLE et al., 2009); e dentre as pessoas afetadas a maioria são mulheres adultas com idade entre 40 a 60 anos. As lesões do PV podem incidir qualquer sítio da cavidade oral, sendo que os mais comumente afetados são palato, mucosa jugal e lábios. O diagnóstico é geralmente baseado nas manifestações orais, entretanto é raro o paciente relatar a presença de bolhas ou vesículas intraorais devido à rápida ruptura do teto fino e friável das bolhas. Por isso a confirmação é fornecida por achados histológicos que mostram a presença de bolhas intraepiteliais, acantólise e células de Tzanck (DAGISTAN et al., 2008; NEVILLE et al., 2009; TAMGADGE et al., 2011).
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efeitos anti-angiogênicos comprovados, apesar de se desconhecer por quais mecanismos a Talidomida inibe esse processo.
Um das técnicas mais utilizados para se observar a angiogênese é a contagem microvascular (MVC), uma importante ferramenta para quantificar esse processo a qual possui importante potencial para ser usado como um marcador de prognóstico, sendo avaliada quando se lança mão de marcadores de células pan-endoteliais, como o anti-CD34.
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2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 LÍQUEN PLANO ORAL
2.1.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia
O líquen plano oral é uma doença mucocutânea crônica autoimune, relativamente comum, com prevalências relatadas que variam de 0,5 a 4% (SURGERMAN et al., 2002; EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007). É mais comumente observada em pessoas de meia idade, com picos de prevalência entre a quinta e sexta décadas de vida. Além disso, ressalta-se uma forte predileção para o sexo feminino (CARBONE et al., 2009; CARROZZO, THORPE, 2009; FERNÁNDEZ-GONZÁLEZ et al., 2011; EBRAHIMI; NYLANDER; VAN DER WAAL, 2011). Também pode ser observado em crianças, embora seja raro (LAEIJENDECKER et al., 2005)
Além da mucosa oral, o líquen plano pode acometer pele, mucosa genital, unhas e couro cabeludo (SURGERMAN et al., 2002). Na maioria dos casos, o LP cutâneo é auto-limitado e causa prurido, sendo as lesões descritas como pápulas pruriginosas arroxeadas e poligonais, as quais são normalmente encontradas nas superfícies flexoras das extremidades (EISEN et al., 2005; AL-HASHIMI et al., 2007; ANURADHA et al., 2008; CARBONE et al., 2009). No couro cabeludo pode provocar áreas de alopecia e nas unhas podem produzir o adelgaçamento e separação das mesmas (SCULLY; CARROZZO, 2008). O envolvimento da mucosa oral pelo LP é muito comum, podendo ser tanto uma região de apresentação inicial dessa desordem bem como o único local de acometimento (JAAFARI-ASHKAVANDI et al., 2011; ANURADHA et al., 2011).
Existem seis formas de apresentação clínica do LPO descritas na literatura, as lesões brancas: reticular, em placa e papular; e as lesões vermelhas: atrófico, erosivo e bolhoso. Algumas variantes podem co-existir em um mesmo paciente. Sensação de queimação e usualmente dor podem acompanhar as lesões de LPO do tipo erosivo, atrófico e bolhoso, enquanto que a forma reticular é geralmente assintomática e os portadores podem nem perceber a presença das lesões (ANDREANSEN, 1968).
O tipo mais comum de LPO é a de padrão reticular, podendo se apresentar como pápulas, placas e com um rendilhado entrelaçado de linhas ceratóticas conhecidas como
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encontrado na mucosa jugal (EINSEN, 2002; INGAFOU et al., 2006; KALMAR, 2007). A forma erosiva ainda que não seja tão comum quanto a reticular, é mais incômoda para o paciente, pois as lesões são comumente sintomáticas. De forma geral, são difusas, avermelhadas que exibem estrias ceratóticas esbranquiçadas circundando-as. Essas estrias irradiam perifericamente e são usualmente evidentes nas margens das zonas atróficas da lesão (KALMAR, 2007; ANURADHA et al., 2008). Algumas vezes, a atrofia e a ulceração estão
confinadas à mucosa gengival, produzindo um padrão de reação chamado “gengivite
descamativa”. Todavia, em alguns casos, se o componente erosivo for muito intenso, poderá haver separação do epitélio, resultando em uma forma relativamente rara da doença, conhecida como líquen plano bolhoso (EDWARDS; KELSCH, 2002, NEVILLE et al., 2009). As lesões de LPO atrófico podem apresentar-se como uma mistura de subtipos clínicos de líquen plano. Alternativamente, uma área central de ulceração pode exibir sua superfície coberta por um exudato firinopurulento, circundado por uma área de eritema (SILVERMAN; GORSKY; LOZADA-NUR, 1985).
O LPO também pode ocorrer sob a forma de placas esbranquiçadas que se assemelham a leucoplasia oral, cujo aspecto pode variar de ligeiramente elevadas e suaves a levemente irregulares e multifocais. As lesões do tipo placa abrangem apenas 7% dos casos e são mais comuns em fumantes. Além disso, semelhante ao tipo reticular, geralmente é assintomático (ANURADHA et al., 2008). As lesões do tipo papular se apresentam como pequenas pápulas brancas (0,5mm a 1mm) com finas estriações na periferia da lesão e usualmente coexistem com outras lesões de líquen plano. É bastante raro e não é difícil de ser negligenciado no exame clínico devido ao pequeno tamanho da lesão (BRICKER, 1994).
Geralmente as lesões de líquen plano podem acometer qualquer região da cavidade oral, mas a mucosa jugal posterior é o local mais comum de acometimento, seguido pelas bordas laterais da língua, gengiva, mucosa labial e vermelhão do lábio inferior, apresentando-se como lesões bilaterais, simétricas ou múltiplas. São raras as lesões no palato, lábio superior e assoalho bucal (CARROZZO; THORPE, 2009; ROOPASHREE, et al., 2010; EBRAHIMI; NYLANDER; VAN DER WAAL, 2011).
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Os aspectos clínicos característicos do líquen plano oral são, na maioria das vezes, suficientes para o diagnóstico correto da doença. Em lesões clássicas é possível fazer o diagnóstico baseado apenas nas características clínicas (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007). Ainda assim, a biópsia associada ao exame histopatológico é recomendada para confirmar o diagnóstico clínico e, principalmente, para excluir a presença de atipias epiteliais ou mesmo indícios de malignidade (EISEN et al., 2005).
Dentre as desordens que podem se assemelhar tanto clínica quanto histologicamente às lesões de LPO se destacam as reações liquenóides (RL), porém estas reações possuem uma etiologia identificável. Usualmente, ocorrem em regiões da mucosa oral que se encontra em íntimo contato com restaurações de amálgama, restaurações de resina ou próteses dentárias. As RL provavelmente sejam o resultado da hipersensibilidade de contato da mucosa oral com esses materiais dentários (ISMAIL; KUMAR; ZAIN, 2007). Além disso, exposição sistêmica a algumas drogas também podem resultar em lesões de RL. Dentre as drogas mais comumente associadas com o surgimento de tais reações destacam-se hipertensivos, anti-inflamatórios não-esteroidais e anti-retrovirais utilizados na terapia do HIV. Certos tipos de alimentos como a canela também podem provocar lesões semelhantes às reações liquenóides, porém com aspectos histopatológicos que podem auxiliar a diferenciar do LPO, como a presença de um infiltrado inflamatório mais profundo e perivascular. Na maioria das vezes a causa das lesões de RL não pode ser identificada, desse modo o diagnóstico de exclusão
dessas lesões é considerado “líquen plano oral de causa idiopática” (SUGERMAN et al., 2002). Diferentemente do LPO, a maioria das reações liquenóides regridem após a remoção do agente causador (AL-HASHIMI et al., 2007; SCULLY; CARROZZO, 2008; SCHLOSSER, 2010; MÜLLER, 2011).
Atualmente a precisa etiologia do líquen plano oral ainda é incerta. Sabe-se que o estresse é amplamente conhecido por ser um importante fator etiológico para o LPO, porém outros estudos devem ainda ser feitos para comprovar essa hipótese. Ainda não foi determinado se alterações psicológicas observadas em paciente com LPO são fatores etiológicos diretos ou se representam apenas uma consequência do desconforto crônico causado pelas lesões do LPO nesses pacientes. Por si só, este desconforto pode ser o causador do estresse e, parcialmente explicar essa associação. Entretanto, observa-se notadamente que pacientes portadores de LPO apresentam tendência a depressão (CARROZZO; THORPE, 2009).
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celular do sistema imune. Além disso, sabe-se que ambos os mecanismos antígenos específicos e não específicos estão envolvidos no LPO. Estes mecanismos associados levariam então ao acúmulo de linfócitos T na lâmina própria subjacente ao epitélio, rompimento da membrana basal, migração de linfócitos T intra-epitelial e apoptose dos ceratinócitos, achados característicos do líquen plano (SUGERMAN et al., 2002).
A resposta imune específica para o antígeno desconhecido que desencadeia a resposta imune do LPO consiste em três passos: (1) a migração dos linfócitos citotóxicos TCD8+ para o epitélio; (2) a apresentação de antígenos pelos ceratinócitos basais e, (3) a ativação destes linfócitos, que uma vez ativados, destroem os ceratinócitos basais (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010).
As células basais são os principais alvos de destruição no LPO e o mecanismo do dano causado está relacionado ao processo imune mediado por células, que envolve as células de Langerhans, linfócitos T e macrófagos (ANURADHA et al., 2008). É bem evidente a presença de um infiltrado epitelial de células TCD8+ citotóxicas próximos aos ceratinócitos basais apoptóticos e um infiltrado de células TCD4+ na lâmina própria. Contudo, o fator desencadeante da apoptose e o mecanismo destas respostas imunes ainda permanecem desconhecidos. Sugere-se que os linfócitos TCD8+ presentes nas lesões de LPO podem ser ativados por um antígeno presente nos ceratinócitos basais associados ao MHC de classe I, consequentemente promovendo a apoptose dos ceratinócitos (FAHRI; DUPIN, 2010).
As células de Langerhans e os ceratinócitos basais podem apresentar um antígeno associado ao MHC de classe II para as células TCD4+ auxiliares, que secretam IL-2 e INF- , e
a produção local de INF- pode manter a expressão do MHC de classe II pelos ceratinócitos,
contribuindo assim para a cronicidade do LPO. Além disso, a expressão antigênica, a co-expressão de CD40 e CD80 e a secreção de IL-12 pelas células que apresentam antígeno
(APC’s) via MHC de classe II aos linfócitos TCD4+, podem produzir uma resposta TCD4 + do tipo Th1, com produção de IL-2 e INF- (LODI et al., 2005).
As quimiocinas, a degranulação de mastócitos, a ativação das metaloproteinases de
matriz (MMP’s) e a perda da integridade da membrana basal epitelial são mecanismos não
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LPO. Esse mecanismo cíclico seria mais uma explicação para a cronicidade do LPO. Além disso, a quimase, que é uma protease dos mastócitos, é uma conhecida ativadora de MMP’s
(SUGERMAN et al., 2002; ZHAO et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010).
MMP’s atuam produzindo a degradação proteolítica dos componentes da matriz
extracelular do tecido conjuntivo e induzindo a perda da integridade da membrana basal, encontrada nas lesões de LPO. A perda desta integridade favorece a morte dos ceratinócitos, que em situação de normalidade, secretam colágeno IV e V, que são essenciais para a manutenção da integridade da membrana basal. Por sua vez, a membrana basal íntegra envia sinais de sobrevivência para os ceratinócitos. Portanto, a membrana basal íntegra é necessária para a sobrevivência dos ceratinócitos e os ceratinócitos são essenciais para a produção normal da membrana basal íntegra (SUGERMAN et al., 2002; ROOPASHREE et al., 2010).
Apesar de o líquen plano oral ter sido considerado pela Organização Mundial da Saúde (OMS) como uma condição cancerizável, esse assunto ainda suscita inúmeras discussões. O potencial maligno das lesões de líquen plano oral ainda permanece controverso e diferentes grupos têm apresentado distintas abordagens e interpretações (MITTAL; SHANKARI; PALASKAR et al., 2012). Sousa et al. (2005) concordam com Eisenberg e Krutchkoff (1992), os quais apontaram para o fato de que muitas das lesões diagnosticadas como LPO seriam na verdade displasias liquenóides, lesões essas de caráter eminentemente pré-maligno. Por outro lado, Tanda et al. (2000) observaram uma hiperexpressão da proteína p53 no LPO, fato confirmado por Valente et al. (2001), que relacionaram essa ocorrência a um risco maior de malignização, uma vez que esse aumento da expressão do p53, via de regra, significa alteração na sua atividade.
A transformação maligna em casos de LPO é relatada ocorrer em 0,3 a 3% dos casos sendo mais comum em casos de líquen plano erosivo. Assim o aumento da MDV nos casos de LPO erosivo quando comparado com os casos de LPO reticular pode ser sugerido como um dos fatores que contribuem para o alto potencial de malignidade nas lesões erosivas (MITTAL; SHANKARI; PALASKAR, 2012).
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sofrer transformação maligna são as do tipo erosivas. Isso é justificado pelo fato de que as formas erosivas deixam a mucosa com uma maior predisposição para sofrer danos por agentes carcinogênicos (VAN DER MEIJ; SHEPMAN; VAN DER WAAL, 2003).
2.2 PÊNFIGO VULGAR
2.2.1 Considerações Gerais, Aspectos Clínicos e Histopatologia
O pênfigo é a designação de um conjunto de entidades patológicas de etiologia autoimune, de incidência rara, caracterizada pela formação de bolhas intraepiteliais na pele e em mucosas (nariz, conjuntiva, genitálias, esôfago, faringe e laringe), sendo encontrada principalmente em pessoas de meia idade e idosos (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005).
O epitélio é uma estrutura complexa fazendo-se necessária a presença de uma grande quantidade de moléculas a fim de manter a sua integridade e saúde. O epitélio oral consiste essencialmente em ceratinócitos aderidos uns aos outros por desmossomos e, através de hemidesmossomos estes se aderem à membrana basal epitelial, que também está aderida à lâmina própria subjacente. Desmossomos são proteínas de adesão que funcionam tanto quanto um complexo adesivo como também um sítio de ligação à superfície celular para os filamentos intermediários de queratina do citoesqueleto (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005). No pênfigo, os desmossomos são danificados por anticorpos dirigidos contra os domínios extracelulares das moléculas de adesão celular epitelial do tipo caderina – as desmogleínas (Dsg) provocando depósitos imunes intraepiteliais e perda do contato célula-célula (acantólise), levando a formação de bolhas intraepiteliais (NISHIKAWA et al., 1996).
O epitélio oral é muito semelhante à pele, mas difere em alguns aspectos como na constituição dos componentes desmossomais. As moléculas de adesão do tipo caderina Dsg1 e Dsg3 são ambas expressas na pele, porém, no epitélio oral apenas a Dsg3 é expressa (SHIRAKATA et al., 1998). O dano à área intercelular leva à acantólise, que embora típica do pênfigo pode ser observada em outras condições como na doença de Darier, dermatose acantolítica transiente, disqueratoma warty, impetigo, em infecções virais e no carcinoma.
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desenvolve uma única variante do pênfigo, embora casos tenham sido descritos de transição para outra variante (ISHII et al., 2000), além de casos em que as manifestações clínicas de uma única variante poder mudar ao longo do tempo (BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005). Esta mudança pode estar relacionada às alterações nas proporções dos autoanticorpos contra as desmogleínas 1 e 3 (HARMAN et al., 2001).
O pênfigo vulgar é o mais comum dos tipos de pênfigo. Entretanto, sua ocorrência é rara, com incidência estimada na população geral de um a cinco casos por milhão de pessoas diagnosticadas a cada ano (ROBINSON; LOZADA-NUR; FRIEDEN, 1997). Este tipo ocorre raramente antes da terceira década de vida, sendo a média de idade no momento do diagnóstico de 50 anos, embora casos raros possam ser vistos na infância. Afeta ambos os sexos igualmente, ainda que alguns autores tenham reportado uma maior prevalência em mulheres. O PV é a forma de pênfigo que afeta com maior frequência a mucosa oral, e na maioria dos casos as lesões orais precedem as manifestações cutâneas. O curso é crônico e o envolvimento sistêmico pode ocorrer se o tratamento adequado não for fornecido (CAMACHO-ALONSO; L[OPEZ-JORNET; BERMEJO-FENOLL, 2005).
Embora a etiologia do pênfigo vulgar ainda não esteja esclarecida, sabe-se que um mecanismo autoimune com o envolvimento de autoanticorpos pode alterar as junções epiteliais intercelulares. Segundo Azulay e Azulay (1999), a sede primária da doença seria o cimento intercelular da camada espinhosa de Malpighi, embora não se saiba o motivo pelo qual esse cimento se torne antigênico e induza à produção de autoanticorpos, principalmente do tipo IgG. Esses autoanticorpos, mais especificamente o IgG1 e o IgG4, agem contra as glicoproteínas desmogleína 1 e desmogleína 3, pertencentes à família das cadeínas, as quais estão localizadas nos desmossomos do epitélio da pele, mucosas ou no soro dos paciente afetados. Tais anticorpos promovem a ruptura das pontes intercelulares e, consequentemente as células perdem a sua adesão, o que caracteriza o fenômeno de acantólise, provocando a formação de fendas intraepiteliais. A ligação antígeno-anticorpo induz a ativação de proteinases, dentre elas destaca-se o plasminogênio ativado, que após liberado pelos ceratinócitos transforma-se em plasmina, a qual promove a lise da substância intercelular (WILLIAMS, 1989; HASHIMOTO, 2003; JOLLY et al., 2010).
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para que o PV possa se desenvolver é necessária à presença de fatores endógenos como defeitos imunológicos, e exógenos como vírus e agentes físicos (CAMACHO-ALONSO; LÓPEZ-JORNET; BERMEJO-FENOLI, 2005; SCULLY; CHALLACOMBE, 2002; JOLLY et al., 2010).
Além disso, o pênfigo também pode ser induzido por drogas. Na realidade, qualquer droga que apresentar uma substância contendo um grupamento –til ativo na sua estrutura
molecular é considerada capaz de induzir a doença (MUTASIM; PELC; ANHALT, 1993). Alguns agentes conhecidos como indutores do pênfigo vulgar são as sulfonamidas, as penicilinas e as drogas antiepilépticas. Porém, Camacho-Alonso, López-Jornet e Bermejo-Fenoli (2005) reportaram 14 casos de pênfigo vulgar, e afirmaram que nenhum dos pacientes relatou fazer uso de qualquer droga com possível efeito indutor do pênfigo. Tem sido sugerido que membros da família botânica Allium, incluindo cebola, alho e alho-poró podem induzir
tais lesões (BRENNER; WOLF, 1994).
Com relação às manifestações clínicas, aproximadamente 75% dos casos de PV revelam-se inicialmente na mucosa oral, cujas lesões precedem as cutâneas em um período de até um ano ou mais (ROBINSON; LOZADA-NUR; FRIEDEN, 1997; ENDO et al., 2005). Ao exame físico é observada a formação de bolhas e vesículas de diâmetros variáveis, de ocorrência superficial ou profunda, de conteúdo seroso claro, purulento ou sanguinolento, que uma vez rompidas originam erosões superficiais irregulares, com coloração avermelhada, sintomatologia dolorosa, sendo logo recobertas por um tipo de pseudomembrana e circundadas por um eritema difuso. Todavia, é raro o paciente relatar a presença de bolhas ou vesículas intraorais, e as lesões dificilmente podem ser detectadas pelo exame clínico devido à rápida ruptura do teto fino e friável das bolhas (SCULLY, CHALLACOMBE, 2002; NEVILLE et al., 2009). Tais lesões podem ser localizadas em qualquer região na da cavidade oral, porém são encontradas com maior frequência em áreas mais sujeitas ao trauma friccional, como mucosa jugal, língua, palato e lábio superior (LASKARIS; SKALAVOUNOU; STRATIGOS, 1982). O aumento da salivação e o incômodo ao mastigar, ao engolir e ao falar são as principais queixas dos pacientes com lesões de pênfigo vulgar oral, além de ardor intenso e odor fétido (SCIUBBA, 1996; SCULLY; CHALLACOMBE, 2002).
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do pênfigo vulgar, podendo ser observado na grande maioria das lesões vesículo-bolhosas (HEAPHY; ALBRECHT; WERTH, 2005; NEVILLE et al., 2009; JOLLY et al., 2010).
O diagnóstico geralmente é baseado nas manifestações orais, enquanto a confirmação é fornecida pelos achados histológicos. Os espécimes da biópsia do tecido perilesional caracterizam-se microscopicamente por uma separação intraepitelial (vesícula ou bolha intraepitelial) acima da camada basal das células do epitélio, sendo que esta permanece aderida à lâmina própria subjacente. No espaço vesicular são encontrados, com frequência, grupos de células que apresentam alterações degenerativas tais como tumefações dos núcleos, perda dos desmossomos, formato arredondado ou ovóide e hipercromatismo, sendo denominadas de células de Tzanck, as quais são resultantes da acantólise celular em decorrência do edema pré-vesicular. No tecido conjuntivo podem ser encontrados leucócitos polimorfonucleares e linfócitos em número variados. Ao contrário da maioria das doenças bolhosas, o pênfigo vulgar é caracterizado por escassez de infiltrado inflamatório no líquido da vesícula, exceto nos casos onde existe infecção secundária (WILLIAMS, 1989; WEINBERG; INSLER; CAMPEN, 1997; NEVILLE et al., 2009). A avaliação da imunofluorescência direta do espécime de biópsia de tecido perilesional fresco revela IgG ou IgM e fragmentos de complemento no espaço intercelular, sendo esse método de diagnóstico também considerado essencial, juntamente com o exame histopatológico, para a confirmação do diagnóstico (CALVANICO; ROBLEDO; DIAZ, 1991; BLACK; MIGNOGNA; SCULLY, 2005).
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2.3 ANGIOGÊNESE
2.3.1 Considerações Gerais
A formação de novos vasos sanguíneos pode ocorrer pelos processos de vasculogênese ou angiogênese. A vasculogênese consiste no surgimento de vasos sanguíneos de novo a partir
de precursores celulares, os quais se diferenciam em células endoteliais, formam lúmens e originam uma rede vascular primitiva. Por sua vez, a angiogênese representa a formação de novos vasos sanguíneos a partir da migração e proliferação de células endoteliais da vasculatura pré-existente (CLAPP et al., 2009; NIKITENKO, 2009; UCUZIAN et al., 2010).
O surgimento de novos vasos sanguíneos é um processo altamente complexo e coordenado, envolvendo a atuação de fatores pró e antiangiogênicos. Em adultos, sob condições fisiológicas, a angiogênese ocorre apenas durante processos relacionados ao ciclo, gestação e reparo tecidual. Dessa forma, normalmente, fatores antiangiogênicos mantêm o endotélio em um estado quiescente. Porém, em processos patológicos como artrite reumatoide, psoríase, retinopatia diabética, doença hepática policística, degeneração macular relacionada à idade, asma, aterosclerose e câncer, o delicado balanço entre fatores pró e antiagniogênicos é alterado em favor da formação de novos vasos sanguíneos (LALLA et al., 2003; KYZAS et al., 2005; FABRIS et al., 2006; CLAPP et al., 2009; NIKITENKO, 2009; GORDON; MENDELSON; KATO, 2010). Por sua vez, outras patologias, como isquemias cerebral e cardíaca e doenças neurodegenerativas, estão caracterizadas por angiogênese insuficiente e/ou regressão vascular anormal (CLAPP et al., 2009).
A angiogênese in vivo pode ocorrer por dois processos. Um dos processos é a
intussuscepção, que envolve a formação de pilares teciduais transluminais no interior dos capilares os quais se fusionam dando origem a novos vasos sanguíneos (MAKANYA; HLUSHCHUK; DJONOV, 2009; RIBATTI; NICO; CRIVELLATO, 2009; GORDON; MENDELSON; KATO, 2010). O outro processo envolve o brotamento de células endoteliais a partir de estruturas vasculares pré-existentes para tecidos circunvizinhos (ADAMS; ALITALO, 2007; UCUZIAN et al., 2010).
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na angiogênese. A descoberta destes precursores revolucionou o campo da biologia vascular e impulsionou a identificação de outros tipos celulares capazes de dar origem às células endoteliais. Dessa forma, verificou-se que células-tronco mesenquimais localizadas em diversos órgãos e tecidos como no tecido adiposo, parede de vasos sanguíneos, baço, fígado e intestino podem se diferenciar em células endoteliais, constituindo um verdadeiro pool de
precursores endoteliais (ZAMPETAKI; KIRTON; XU, 2008; TILKI et al., 2009)
2.3.2 Mensuração da Angiogênese
Diversos métodos podem ser empregados para se mensurar a angiogênese nos tecidos. Estudos in vivo relatam a utilização de métodos não invasivos como a ressonância magnética
com contraste aumentado, a tomografia computadorizada com emissão de pósitrons e a tomografia computadorizada com emissão de fóton único (PERINI et al., 2008). Em pesquisas ex vivo, como nos estudos realizados com materiais biológicos provenientes de
biópsias, a atividade angiogênica de um tecido pode ser mensurada pela determinação de um índice angiogênico obtido por meio da contagem dos microvasos presentes no espécime (EL-GAZZAR; MACLUSKEY; OGDEN, 2005; FREITAS et al., 2005). Neste caso, as técnicas existentes se baseiam na avaliação microscópica dos tecidos com o auxílio de anticorpos capazes de reconhecer epítopos expressos por células endoteliais como o FvW, o CD31, o CD34 e o CD105 (VERMEULEN et al., 2002; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007).
Em relação às técnicas de mensuração da angiogênese empregadas na avaliação dos tecidos submetidos ao processamento imunoistoquímico, a análise dos trabalhos existentes na literatura revela que as mais frequentemente utilizadas são a da densidade microvascular (MVD), do volume microvascular (MVV) e da contagem microvascular (MVC) (HANNEN; RIEDIGER, 2004; EL-GAZZAR; MACLUSKEY; OGDEN, 2005; FREITAS et al., 2005; SOUZA; FREITAS; MIRANDA, 2007; DAVEY et al., 2008).
A técnica da MVD foi descrita por Weidner et al. (1991) em um estudo com carcinoma de mama. Sob microscopia de luz, com aumentos de 40x e 100x, são identificadas cinco áreas de maior vascularização no espécime. Em sequência, sob aumento de 200x, são quantificados os microvasos presentes em cada uma dessas áreas. O resultado, designado de MVD alta, consiste no maior número de microvasos em uma dessas áreas. Dessa forma não é estabelecido um valor médio, sendo o resultado apresentado sob a forma de microvasos/mm2.
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autores, deveriam ser considerados como um único microvaso as células endoteliais isoladas ou grupos de células endoteliais claramente separadas de microvasos adjacentes ou de outros tipos celulares do tecido conjuntivo. Além disso, grupos de células endoteliais isoladas que poderiam constituir secções distintas de um mesmo microvaso deveriam ser consideradas como microvasos distintos. Lúmens vasculares, embora geralmente identificáveis, não seriam necessários para definir uma estrutura como um microvaso.
Posteriormente, com base na metodologia descrita por Weidner et al., (1991), foi proposta uma avaliação da MVD alta, designada de MVD média (SCHOR et al., 1998a; SCHOR et al., 1998b). Nesta técnica, sob aumento de 200x, são quantificados os microvasos em 10 – 15 campos microscópicos aleatórios. Com os valores obtidos em cada um destes campos é estabelecido o número médio de microvasos do espécime. Na análise MVD média, os resultados são apresentados sob forma de média de microvasos ± desvio padrão.
O MVV consiste em uma técnica estereológica para a determinação do volume dos microvasos. Neste processo, sob microscopia de luz (aumento de 200x), com o auxílio de uma ocular contendo um retículo com 100 pontos marcados, são avaliados 15 campos microscópicos aleatórios, perfazendo um total de 1.500 pontos. Em cada um destes campos são quantificados os vasos que coincidem com os pontos do retículo. Ao final, o resultado é expresso em porcentagem de volume (PAZOUKI et al., 1997; SCHOR et al., 1998a).
A técnica da MVC foi descrita por Maeda et al., (1995) em um estudo com carcinomas gástricos. Sob microscopia de luz, com aumento de 40x, são identificadas cinco áreas de maior vascularização no espécime. Em sequência, sob aumento de 200x, são quantificados os microvasos presentes em cada uma dessas áreas. Nesta análise, o resultado obtido é apresentado como um número médio de microvasos em cada secção histológica. Além de constituir uma técnica de fácil execução (FREITAS et al., 2005), a MVC se destaca por apresentar relevância prognóstica em diversos tumores (NANASHIMA et al., 2008; NANASHIMA et al., 2009).
A MVD em tumores tem sido avaliada pela imunomarcação dos tecidos por anticorpos pan-endoteliais contra antígenos como o CD34, CD31 e fator de Willebrand. Entretanto, sabendo-se que as células endoteliais são altamente heterogêneas, surge um questionamento sobre se um marcador pan-endotelial é um reagente ideal para avaliar a MVD de um tumor. Tomando isso como base, muitos autores relatam que os anticorpos anti-CD105, ao contrário dos marcadores pan-endoteliais, ligam-se preferencialmente às células endoteliais ativadas in
vitro e em tecidos participando da angiogênese (WANG et al., 1993; WESTPHAL et al.,
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tipos histológicos de tumores humanos, o CD105 foi que esteve mais fortemente expresso nas células endoteliais dos vasos sanguíneos tumorais, todavia foi indetectável ou esteve fracamente presente em vasos sanguíneos de tecidos normais (WANG et al., 1993; WANG et al., 1995; DERBYSHIRE; THORPE, 1997). Por outro lado, evidências sugerem que a expressão do CD105 pode refletir a atividade metabólica dos tecidos, não estando necessariamente relacionado à formação de novos vasos sanguíneos (DAVEY et al., 2008).
O grau de vascularização (medido quantitativamente pela MDV) tem potencial para ser usado como fator de prognóstico (FIDLER; ELLIS, 1994; FOX; GATTER; HARRIS, 1996). A extensa neovascularização em carcinomas de mama invasivos é um fator preditor de metástase independente tanto para linfonodos axilares quanto para sítios distantes ou ambos (WEIDNER, 1993; GASPARINI; POZZA; HARRIS, 1996; FOX; GATTER; HARRIS, 1996). Subsequentemente, muitos pesquisadores têm demonstrado que a alta microdensidade vascular (MDV) é um fator de prognóstico independente em muitos outros tipos histológicos de tumores humanos, enquanto outros autores têm falhado em encontrar tal relação (KUMAR et al., 1999).
2.3.3 O Processo Angiogênico nas Lesões Crônicas Inflamatórias (Líquen Plano Oral e Pênfigo Vulgar)
O processo angiogênico é considerado fundamental em muitos processos fisiológicos e patológicos e, em ambos os tipos o início da resposta angiogênica ocorre com uma ativação das células endoteliais devido à liberação de citocinas como resposta à hipóxia ou à isquemia (SCARDINA et al., 2009). A angiogênese está diretamente relacionada a uma alteração na microcirculação local, que consiste basicamente em um aumento no número de vasos em uma determinada área e uma alteração morfológica dos mesmos, culminando na expressão in vivo
da neoformação de vasos sanguíneos (SCARDINA et al., 2007).
Além de a angiogênese ter sido atualmente relacionada com a patogenia e atividade de uma série de condições crônicas inflamatórias, incluindo artrite reumatoide, psoríase e osteoartrite; outros dados sugerem que a angiogênese pode desempenhar um papel importante na persistência e cronicidade de algumas lesões do líquen plano oral, podendo, desse modo, ser utilizado como um marcador de atividade da doença (TAO et al., 2007).
Uma relação de feedback positivo, em que um estado inflamatório promove a
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elucidar o papel da angiogênese na patogênese da LPO a fim de se melhor compreender o seu mecanismo para que sejam desenvolvidas novas estratégias de tratamento (TAO et al., 2007).
O LPO caracteriza-se por uma ciclicidade, com fases de remissão e recrudescência, desse modo, modificações na microcirculação local podem ser associadas a uma maior ou menor intensidade do fenômeno flogógero, e, por conseguinte, a uma maior ou menor atividade da doença (SCARDINA et al., 2007). Dados da literatura indicam que na presença da LPO, os vasos sanguíneos encontram-se dilatados, portanto eles ocupam um espaço relativamente maior, todavia isso não corresponde a um aumento do número dos mesmos (SCARDINA et al., 2007). Entretanto, SCARDINA et al., 2009, afirmam que, no momento, na literatura ainda não há estudo algum satisfatório que compare o fenômeno da angiogênese nas lesões de líquen plano oral.
Tal como uma doença autoimune de origem inflamatória e progressão crônica, o líquen plano oral satisfaz todos os pré-requisitos de hipóxia que são essenciais na angiogênese. Macrófagos e outras células do sistema imune produzem o fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), que estimula a degradação, proliferação e migração das células endoteliais e regula a permeabilidade vascular, importante na iniciação da angiogênese (MITTAL; SHANKARI; PALASKAR, 2012). O VEGF é considerado um dos mediadores mais potentes da angiogênese, uma vez que se trata do fator de maior estimulação específica da célula endotelial. Tem sido demonstrado que as lesões de LPO apresentam um aumento significativo de VEGF quando comparado à mucosa oral normal (TAO et al., 2007).
Alguns estudos em pacientes afetados pelo líquen plano oral sugerem que o aumento da densidade de mastócitos na lâmina própria próximo à camada basal do epitélio e o aumento de número de fatores proangiogênicos e angiogênicos, tais como histamina, heparina, VEGF e TGF- produzidos por essas mesmas células podem influenciar o endotélio vascular de um modo crítico, além de possuir um papel importante na formação da lesão (MICHAILIDOU; MARKOPOULOUS; ANTONIADES, 2008; SCARDINA et al., 2009). Ao mesmo tempo, pesquisas revelaram uma série de citocinas proangiogênicas, incluindo fator de necrose tumoral (TNF), interleuninas 1, 6 e 8 presentes em quantidades significantes nos tecidos da lesão, no sangue periférico e em diferentes fluidos orais de pacientes com LPO (RHODUS et al., 2005). Esses resultados, portanto, indicam que existe angiogênese no microambiente de lesões de LPO, embora alguns estudos ainda considerem necessário o fornecimento de mais evidências para que isso seja estabelecido de fato (MIGNOGNA et al., 2004).
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também em lesões de LPO erosivo quando comparados com lesões de LPO reticular; o que sugere que a angiogênese é um dos principais fatores que contribuem na progressão do LPO.
Cunha et al. (2004) e Lee (2011) observaram em seus respectivos casos clínicos relatados uma significativa remissão das lesões de pênfigo vulgar após o uso oral da talidomida; sendo notado também o retorno das mesmas quando o uso desse medicamento era interrompido. Porém, os mecanismos pelos quais a talidomida age no pênfigo ainda não estão esclarecidos. Especula-se que esse medicamento exerce seus benefícios clínicos no PV através dos efeitos citocinas-moduladores e que agentes imunossupressores podem interferir nesses efeitos da talidomida.
Tem sido observado em modelos animais que a talidomida apresenta propriedades
antiangiogênicas, porém o mecanismo pelo qual isso acontece é desconhecido (D’AMATO et
al., 1994). Uma vez que se observou que essa inibição ocorre apenas após a administração oral da talidomida, surgiu a hipótese de que um metabólito ativo é formado in vivo
(MATHEWS; MCCOY, 2003). A talidomida suprime, nos macrófagos, a produção de TNF-α,
que é fracamente angiogênico in vivo; e age secundariamente induzindo uma inflamação.
Hipotetizou-se, então, que a talidomida inibe diretamente um componente essencial da angiogênese, e não opera através do efeito da produção de TNF-α. (D’AMATO et al., 2004). Somando-se a isso, Kruse et al. (1998), relataram que a talidomida inibiu a angiogênese induzida pelo fator de crescimento endotelial vascular (VEGF),o qual é um potente mediador da angiogênese (TAO et al., 2007).
2.4 BIOMARCADOR ANGIOGÊNICO – CD34
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O CD34 é um marcador de células endotelias, caracterizado como uma glicoproteína transmembrana de 105-120 kDa que possui alta especificidade, principalmente para células endoteliais de vasos sanguíneos e precursores de células hematopoiéticas (YOSHIDA et al., 1999; ABBAS; LICHTMAN, 2005).
Este imunomarcador atua na adesão célula a célula ao se ligar com domínios existentes nas selectinas, chamadas de CD62L. A adesão e a transmigração leucocitária são reguladas principalmente pela ligação de moléculas de adesão pertencentes aos leucócitos e na superfície endotelial e pelos mediadores químicos (quimiotaxinas e citocinas) que afetam esses processos modulando a expressão na superfície ou a avidez dessas moléculas de adesão. Os receptores de adesão envolvidos pertencem a quatro famílias moleculares como as selectinas, as quais possuem um domínio N-terminal extracelular, compreendendo a E-selectina (CD62E) ou molécula endotelial de adesão de leucócitos tipo 1 (ELAM-1), confinada ao endotélio; a P-selectina (CD62P), presente no endotélio e plaquetas; e por último, a L-selectina (CD62L) ou molécula de adesão de leucócitos tipo 1 (LAM-1), a qual é expressa na maioria dos tipos de leucócitos (ABBAS; LICHTMAN, 2005; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
A L-selectina serve de receptor de endereçamento para os linfócitos entrarem nos linfonodos ligando-se às vênulas especializadas de endotélio alto (HEV’s). Ela liga, ainda, os
neutrófilos às células endoteliais ativadas pelas citocinas nos locais de inflamação. Pelo menos três ligantes das células endoteliais podem ligar-se à L-selectina: a molécula de adesão do tipo 1, que contém glicano (GlyCAM-1), uma proteoglicana encontrada nas HEV’s dos
linfonodos; a molécula de adesão celular adressina da mucosa do tipo 1 (MadCAM-1), expressa pelas células endoteliais no tecido linfoide associado às mucosas; e a glicoproteína CD34 (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2005).
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3 PROPOSIÇÃO
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4 MATERIAIS E MÉTODOS
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
A presente pesquisa foi registrada na Plataforma Brasil e submetida a análise do seu conteúdo pelo Comité de Ética em Pesquisa da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (CEP/UFRN).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO
O presente estudo caracterizou-se como uma pesquisa descritiva, comparativa e retrospectiva constituída pela observação, análise e registro dos índices angiogênicos obtidos a partir da apreciação quantitativa dos vasos sanguíneos imunomarcados pelo anticorpo anti-CD34 em uma série de casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar previamente selecionados.
4.3 POPULAÇÃO
Todos os casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar diagnosticados e arquivados no Setor de Anatomia Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).
4.4 AMOSTRA
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4.4.1 Critérios para seleção da amostra
4.4.1.1Critérios de inclusão
Foram incluídos na amostra:
Lâminas coradas em hematoxilina-eosina (HE), que tiveram diagnóstico histopatológico de líquen plano oral reticular e erosivo e, pênfigo vulgar;
Casos cujos blocos em parafina apresentaram quantidade suficiente de material para realização do estudo imunoistoquímico;
Casos cujas fichas apresentaram todos os dados necessários para a realização do estudo clínico.
4.4.1.2 Critérios de exclusão
Foram excluídos da amostra aqueles casos que não satisfizeram os critérios de inclusão acima.
4.4.2 Caracterização da amostra
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4.5 ESTUDO CLÍNICO E MORFOLÓGICO
A partir de fichas clínicas de requisições de biópsias arquivadas no Laboratório de Anatomia Patológica do Departamento de Odontologia da UFRN, foram obtidas as características clínicas das lesões, para que assim as lesões de LPO fossem classificadas como LPO Reticular ou LPO Erosivo. As lesões de LPO foram consideradas reticulares quando foram descritas nas fichas clínicas dos pacientes como: assintomáticas, com linhas brancas entrelaçadas ou como pápulas e as erosivas como lesões eritematosas, ulceradas e com sintomatologia associada (apresentando dor e/ou ardor), conforme Neville et al. (2009) e Carrozzo e Thorpe (2009).
Os espécimes foram analisados sob microscopia de luz, através da análise de cortes
histológicos de 5μm de espessura, corados pela técnica da Hematoxilina/Eosina. Em seguida foi efetuada uma análise descritiva das características anátomo-patológicas inerentes a cada lesão, onde foram selecionados apenas os casos que apresentaram aspectos morfológicos padrões de líquen plano oral e pênfigo vulgar.
4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO
4.6.1 Método Imunoistoquímico
Os espécimes fixados em formol a 10% e emblocados em parafina foram submetidos a cortes histológicos de 3µm de espessura, que foram estendidos em lâminas de vidro, previamente limpas e desengorduradas, preparadas com adesivo à base de Organosilano (3-aminopropyltrietoxy-silano, Sigma Chemical CO, St Louis, MO, USA). Na técnica imunoistoquímica foi empregado o complexo Avidina Biotina (Kit LSAB + HRP, DAKO CYTOMATION, Carpinteria, CA, USA), utilizando o imunomarcador anti- CD34, seguindo os seguintes passos laboratoriais descritos abaixo:
o Xilol I (30 minutos), estufa 59°C – Desparafinização;
o Xilol II (20 minutos), temperatura ambiente (TA) – Desparafinização; o Etanol absoluto, I, II e III (05 minutos cada) – TA;
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o Remoção de pigmento formólico com hidróxido de amônia a 10% em etanol a 95% (10 minutos) – TA;
o Lavagem das lâminas em água corrente (10 minutos); o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada); o Recuperação antigênica (Quadro 1);
o Lavagem em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Bloqueio da peroxidase endógena com peróxido de hidrogênio 10 volumes (duas trocas 15 minutos cada);
o Lavagem em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Passagem em TRIS HCl (Tris (hydroxymethyl) aminomethane Hydrochlride) pH 7,4 (duas trocas de 5 minutos cada);
o Incubação sem solução de BSA (albumina sérica bovina) a 1% e soro fetal bovino (SFB) a 5% em TRIS HCl pH 7,4 por 60 minutos, para bloquear a reação do anticorpo primário com proteínas inespecíficas teciduais;
o Retirar o excesso da solução dos cortes;
o Incubação dos anticorpos conforme a determinação do fabricante (Quadro 1); o Passagem solução de Tween 20 a 1% em TRIS HCl pH 7,4 (duas trocas de 5
minutos cada);
o Incubação por 30 min nos reagentes do Kit LSAB (Dako Cytomation + and LSAB® + Systems) para o anticorpo anti-CD34;
o Passagem em TRIS HCl pH 7,4 (duas trocas de 5 minutos cada);
o Incubação por 3 minutos em solução de di-aminobenzida (DAB) na concentração de 30 mg em 10 ml de TRIS HCl pH 7,4 ativada por peróxido de hidrogênio 10 volumes para revelação;
o Lavagem em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA; o Lavagem em água corrente (10 minutos);
o Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);
o Desidratação em etanol em cadeia crescente em 80° ao etanol absoluto (3 minutos cada);
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o Montagem da lâmina em resina Permount® (Ficher Scientific, Fair Lawn, NJ, USA) para observação em microscópio de luz.
Quadro 1 - Especificação, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação do anticorpo primário utilizado.
Anticorpo Clone
Especificidade Diluição Recuperação
Antigênica
Incubação
CD34 (QBEnd 101)
Dako Corporation Células endoteliais, precursores das células hematopoiéticas.
1:100 Citrato Ph 6.0 Pascal, 30 min
Overnight 4°C
PPGO, 2014
4.6.2 Análise do Perfil Imunoistoquímico
As lâminas coradas pela técnica da imunoistoquímica com anticorpo anti-CD34 foram analisadas sob microscopia de luz (OLYMPUS BX41) quantitativamente através do índice angiogênico, por um examinador previamente treinado. O índice angiogênico foi delimitado empregando-se a técnica da contagem microvascular (MVC), de acordo com a metodologia de Maeda et al. (1995) modificada, em que foram selecionadas, de forma criteriosa e subjetiva, cinco áreas bem significativas da lesão e com maior número de vasos (densidade microvascular) sob aumento de 40x (x4 objetiva, x10 ocular). Em seguida, através do aumento de 100x (x10 objetiva, x10 ocular) foram quantificados manualmente, com o auxílio do programa ImageJ (Image Processing and Analysis in Java), objetivando evitar a
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4.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Com o intuito de testar as hipóteses propostas no presente estudo, os resultados obtidos foram submetidos a testes apropriados. Os dados obtidos foram digitados em planilha eletrônica no programa Excel (Microsoft Office 2013® for Windows) e posteriormente
exportados para o programa Statistical Package for the Social Sciences (SPSS versão 20.0;
Inc., Chicago, IL, USA), no qual foi inicialmente realizada a análise descritiva e em seguida os testes estatísticos descritos abaixo.
Para comparar o índice angiogênico determinado pela contagem microvascular (MVC) entre os diferentes tipos de lesões, categorizadas nos grupos líquen plano oral, pênfigo vulgar e mucosa oral normal, fez-se uso do teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis. Enquanto para comparação da MVC entre a forma erosiva e reticular dos casos de líquen plano oral, realizou-se o teste não-paramétrico de Mann-Whitney.
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5 RESULTADOS
5.1 RESULTADOS MORFOLÓGICOS
No presente estudo, foram utilizados 40 casos de líquen plano oral, destes, 14 eram do tipo erosivo e 26 do tipo reticular, 18 casos de pênfigo vulgar e 15 casos de mucosa oral normal (Gráfico 1).
Gráfico 1 -Distribuição da amostra quanto ao tipo de lesão analisada. Natal, RN-2014.
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Ao exame histopatológico, os casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar, sob microscopia de luz, em cortes de 5µm de espessura, corados pela técnica da Hematoxilina e Eosina, revelaram para os diagnósticos histológicos as características inerentes às referidas lesões.
Nas lesões de líquen plano analisadas constatou-se a presença de perda de nitidez da camada basal acompanhada pelo intenso infiltrado inflamatório predominantemente linfocítico, disposto em faixa, imediatamente subjacente ao epitélio, além da presença de corpos colóides eosinofílicos na interface epitélio/tecido conjuntivo (Corpos de Civatte),
cristas epiteliais ausentes, hiperplásicas ou em forma de “dentes de serra”, variações da
espessura da camada espinhosa e graus variáveis de orto ou paraceratose.
Líquen Plano Oral Pênfigo Vulgar Mucosa Oral Normal 54,8%
24,7%
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No que concerne aos espécimes de pênfigo vulgar, pôde-se observar a existência de separação intraepitelial, acima da camada de células basais do epitélio evidenciando-se a presença de acantólise (separação das células da camada espinhosa do epitélio) e a presença de células soltas, de forma arredondada, na camada espinhosa, chamadas de células de Tzanck, além de um infiltrado leve a moderado de células inflamatórias crônicas no tecido conjuntivo.
5.2 RESULTADOS IMUNOISTOQUÍMICOS
A reatividade celular observada nos casos de líquen plano oral e pênfigo vulgar foi restrita ao citoplasma das células endoteliais de revestimento e aos grupamentos de células endoteliais proliferantes sem lúmen, sendo representada pela coloração acastanhada independente da intensidade da imunomarcação.
Foi ainda observado que o anticorpo anti-CD34 reagiu imunopositivamente em 100% da amostra analisada.
5.2.1 Análise Quantitativa da Marcação Imunoistoquímica pelo anticorpo anti-CD34.
O número médio dos vasos sanguíneos determinados pela contagem microvascular (MVC) nos espécimes de líquen plano oral, pênfigo vulgar e mucosa oral normal imunomarcados para CD34 encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1 -Índices angiogênicos determinados pela contagem microvascular do CD34 de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal, RN-2014.
LESÃO Índices Angiogênicos
LPO
Erosivo 72,80 54,40 106,00 96,80 83,50 72,60 57,40 75,80 55,00 110,80 138,75 60,80 45,00 91,40
Reticular 94,00 75,60 128,20 75,20 66,00 73,40 87,40 72,40 66,80 41,00 60,80 157,20 65,00 97,00
65,60 94,20 40,00 73,80 46,20 58,40 58,00 78,60 88,00 82,20 62,00 57,60
PV 63,00 118,60 71,00 96,60 47,20 39,60 66,60 99,60 65,00 34,50 109,80 61,20 56,20 63,00 64,80 41,00 118,00 83,20
MON 68,60 43,80 80,60 88,40 128,00 51,60 37,00 37,60 101,40 50,60 55,20 76,80 83,60 31,50 44,75
Legenda: LPO, líquen plano oral; PV, pênfigo vulgar; MON, mucosa oral normal.
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5.2.2 Análise Estatística da Contagem de Microvasos Marcados pelo Anticorpo Anti-CD34
Ao comparar a MVC entre diferentes lesões, observou-se que a mediana dos casos de líquen plano oral foi maior que no grupo de pênfigo vulgar, que por sua vez revelou mediana maior que nos casos de mucosa oral normal. O teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis demonstrou que essas diferenças não foram estatisticamente significativas (p=0,280) (Tabela
2) (Gráfico 2).
Tabela 2 -Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos e significância estatística para a contagem microvascular entre as lesões de LPO, PV e os espécimes de MON. Natal, RN-2014.
Lesão n Mediana Q25-Q75 Média dos postos p(1)
LPO 40 73,10 59,00-90,55 40,15 0,280
PV 18 64,90 53,95-97,35 35,78
MON 15 55,20 43,80-83,60 30,07
Legenda: LPO, líquen plano oral; PV, pênfigo vulgar; MON, mucosa oral normal. (1): Teste Kruskal-Wallis.
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Gráfico 2 -Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com o tipo de lesão avaliada. Natal, RN-2014.
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Tabela 3 - Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, estatística U e significância estatística para a contagem microvascular entre os tipos de líquen plano oral. Natal, RN-2014.
LPO n Mediana Q25-Q75 Média dos postos
Soma dos postos
U p(1)
Erosivo 14 74,30 56,80-99,10 21,46 300,50 168,50 0,720 Reticular 26 72,90 60,20-87,55 19,98 519,50
Legenda: LPO, líquen plano oral.
(1): Teste Mann-Whitney. Fonte: ?????
Gráfico 3 -Box-plot relativo à contagem microvascular de acordo com a forma clínica de líquen plano oral. Natal, RN-2014.
