AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO AQUOSO DE Cinnamomum zeylanicum L. NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m E NA
MORFOLOGIA DAS HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO AQUOSO DE Cinnamomum zeylanicum L. NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m E NA
MORFOLOGIA DAS HEMÁCIAS DE RATOS WISTAR.
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde, do Centro de Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde.
Orientador: Prof. Dr. Mário Bernardo Filho
B456a
Benarroz, Mônica de Oliveira.
Avaliação de efeitos de um extrato aquoso de
cinnamomum zeylanicum L. na marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia das hemácias de ratos wistar / Mônica de Oliveira Banarroz.___ Natal-RN, 2007.
51f.: il.
Orientador: Profº. Mario Bernardo Filho.
Dissertação (Mestrado em Ciências da Saúde) -Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde.
1.Cinnamomum zeylanicum - efeitos - Dissertação. 2. Tecnécio-99m – Dissertação. 3. Pertecnetato de sódio - Dissertação. 4. Ratos – Dissertação. I.Bernardo Filho, Mario. II. Título.
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
Prof.Dr. Aldo da Cunha Medeiros
Coordenador do Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde
AVALIAÇÃO DE EFEITOS DE UM EXTRATO AQUOSO DE Cinnamomum zeylanicum L. NA MARCAÇÃO DE CONSTITUINTES SANGUÍNEOS COM TECNÉCIO-99m E NA
MORFOLOGIA DAS HEMÁCIAS DE RATOSWISTAR.
BANCA EXAMINADORA
Prof. Dr. Mario Bernardo Filho – UERJ Prof. Dr. Aldo da Cunha Medeiros – UFRN
Prof. Dr. Christopher J. Palestro – Long Island Jewish Medical Center - USA
Aprovada em 05/12/2007
Aos meus amados pais: a minha conquista é a vossa. Aos meus preciosos filhos: fonte da minha inspiração. Aos meus queridos irmãos: vale a pena sonhar. A DEUS toda glória.
Ao Deus Trino pelo dom da vida, por sua manifestação de amor, força e consolo todos os dias.
Ao Professor Mario Bernardo Filho pela oportunidade que me proporcionou de ingressar na área da pesquisa e por todo seu esforço em conduzir seus alunos no caminho da busca do conhecimento e da excelência, forjando o caráter do cientista. Ao Professor Adenilson de Souza da Fonseca pela orientação, companheirismo e grande incentivo durante todo o processo de seleção, execução e conclusão do mestrado.
Aos amigos e companheiros de pesquisa: Gabrielle Rocha, Márcia Pereira, Camila Godinho, Rosane Neves, Bernardo Rebello, Angélica Garcia-Pinto, Jacques Frydman, Maria Regina Macedo e Sebastião Santo-Filho.
Aos meus filhos Felippe e Caroline pela digitação, correção de referências, aulas de francês e correção ortográfica e por toda vibração de cada conquista.
Ao Serviço de Medicina Nuclear e ao Laboratório de Endocrinologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto pelo suporte aos resultados obtidos.
À chefia do Instituto Nacional de Câncer HCIII e HCIV - Ilka Chaves e Rosângela Cordeiro, respectivamente, pelas inúmeras trocas de plantão e liberações para concluir os créditos exigidos.
À nutricionista e companheira solidária Samyra Kede, por sua compreensão e presteza em me substituir em vários plantões que precisei me ausentar.
A todos os colegas do Laboratório de Radiofarmácia Experimental que contribuíram para o êxito desta dissertação.
Dedicatória...v
Agradecimentos...vi
Lista de abreviaturas e símbolos…...………...………..viii
Resumo………...………...ix
1 INTRODUÇÃO...1
2 REVISÃO DA LITERATURA...3
3 ARTIGO ANEXADO...7
4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES...33
5 ANEXOS...36
6 REFERÊNCIAS...37 Abstract
Apêndices
C célula sangüínea
CAPES Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Cl- íon cloreto
CNPq Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
FAPERJ Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro
FI-C fração insolúvel da célula FI-P fração insolúvel do plasma FS-C fração solúvel da célula FS-P fração solúvel do plasma HCO3- íon bicarbonato
MBq megabequerel
Pg micrograma
Pl microlitro
MN medicina nuclear
Mo molibdênio
NaCl cloreto de sódio
P plasma
PET positron Emission Tomography
% ATI porcentagem de radioatividade rpm rotações por minuto
SnCl2 cloreto estanoso
SPECT single photon emission computed tomography 99mTc tecnécio-99m
TcO4- íon pertecnetato
Na99mTcO4 pertecnetato de sódio
UERJ Universidade do Estado do Rio de Janeiro UFRN Universidade Federal do Rio Grande do Norte
Radiobiocomplexos são utilizados para obtenção de imagens em medicina nuclear e empregados na pesquisa básica. Constituintes sangüíneos marcados com tecnécio-99m têm sido empregados como radiobiocomplexos e utilizados como modelo experimental para avaliação de efeitos biológicos de drogas naturais ou sintéticas. A análise da forma e de parâmetros morfométricos (relação perímetro/área) pode ser usada para avaliar os efeitos de drogas sobre a estrutura da membrana de hemácias.
Cinnamomum zeylanicum (canela) é uma especiaria usada como planta medicinal para tratar doenças. O objetivo desse estudo foi avaliar efeitos de um extrato aquoso de
Cinnamomum zeylanicum na marcação de constituintes sanguíneos com tecnécio-99m e na morfologia de hemácias de ratos Wistar. No tratamento in vitro, amostras de sangue de animais foram isoladas e incubadas com um extrato de canela. No tratamento in vivo, animais foram tratados com um extrato de canela e amostras de sangue foram isoladas. Em ambas as situações foram realizadas a radiomarcação de constituintes sanguíneos e a análise morfológica. Como controle, o sangue ou os animais foram tratados com cloreto de sódio 0,9%. Os dados obtidos nos experimentos de marcação de constituintes sangüíneos com tecnécio-99m indicaram que o tratamento in vitro com extrato de canela foi capaz de diminuir significativamente (p<0,05) a porcentagem de radioatividade nos compartimentos celulares e na fixação das proteínas celulares e plasmáticas. Esses efeitos não foram observados no tratamento in vivo. Os resultados obtidos na morfologia de hemácias sugerem que os tratamentos in vitro e in vivo não alteram a forma nem a razão perímetro/área. O tratamento in vitro com o extrato aquoso de canela poderia afetar estruturas da membrana celular relacionadas ao transporte de Íons ou ao estado de oxidação do íon
com tecnécio-99m. Esse estudo é uma pesquisa experimental com caráter multidisciplinar. Foi desenvolvido em colaboração com diferentes Departamentos e Serviços da área biomédica do Hospital Universitário Pedro Ernesto, UERJ, atestando o caráter multidisciplinar da pesquisa .
Palavras chaves: Constituintes sangüíneos, Cinnamomum zeylanicum, Tecnécio-99m, Pertecnetato de sódio, Ratos.
As doenças crônicas são as principais causas de morte no mundo, às quais foram atribuídos 35 milhões de óbitos em 2005 (1). O avanço da tecnologia aplicada às ciências médicas tem garantido o aumento da expectativa de vida (2) e
dessa forma, a convivência com doenças que eram denominadas malignas ou fatais. Dentre os procedimentos que têm contribuído para auxiliar os diagnósticos, destacam-se as técnicas de imagens cintilográficas da medicina nuclear, a tomografia por emissão de fóton único (SPECT, single photon emission computed tomography) e a tomografia de emissão de pósitrons (PET, positron emission tomography)(3,4).
Durante os exames de medicina nuclear são administrados quantidades mínimas de estruturas de interesse biomédico marcadas com radionuclídeos denominadas de radiofármacos (radiobiocomplexos), para fins de diagnóstico e terapia (5). O tecnécio-99m (99mTc) é o radionuclídeo mais utilizado na para obtenção de imagens diagnósticas em virtude de suas características químicas e físicas(6), bem como em diversos estudos na pesquisa científica básica (7, 8).
Hemácias marcadas com 99mTc têm sido muito utilizadas na
medicina nuclear para várias aplicações importantes nos exames diagnósticos (9,10). A
radiomarcação de constituintes sanguíneos pode ser alterada por uma variedade de drogas derivadas de produtos naturais ou sintéticos (11-14).
A utilização de plantas medicinais por seres humanos data de milhares de anos devido às suas propriedades medicinais e nutricionais (15). Contudo, algumas plantas podem apresentar toxicidade e alguns de seus efeitos adversos têm sido descritos (16).
aldeído cinâmico, eugenol, cânfora (17) e compostos fenólicos (18,19). Amplamente utilizada em aromatizantes, bebidas e produtos de perfumaria (20), a canela também é utilizada na Medicina Tradicional devido a suas propriedades medicinais (18,21). Também vêm sendo demonstradas ações antioxidantes (18,19,22), antibacterianas (23) e hipoglicêmicas(20, 24, 25).
Essa pesquisa foi motivada por tentar identificar os efeitos dessa especiaria, mas também por gerar informações sobre possível interação radiobiocomplexo-produto nartural de interesse para a medicina nuclear. A utilização dessa especiaria do ponto de vista alimentar também atrai o interesse para o estudo desse produto vegetal. Além disso, não foram encontrados na literatura dados sobre a influência da canela na radiomarcação de constituintes sanguíneos.
Assim, objetivo deste estudo foi avaliar efeitos de um extrato aquoso deCinnamomum zeylanicum L.. na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc e na morfologia de hemácias de ratos Wistar.
2 REVISÃO DA LITERATURA
As inovações na área da saúde têm beneficiado os seres humanos. A redução da mortalidade, o aumento da expectativa de vida, a erradicação de doenças endêmicas e o desenvolvimento de novas drogas são conseqüências da inovação científica (26). Ainda assim, doenças crônicas são responsáveis por cerca de 35 milhões de mortes anuais em todo o mundo (1). Por isso faz-se necessário o desenvolvimento de tecnologias aplicadas às ciências médicas que permitam o aprimoramento dos procedimentos diagnósticos e terapêuticos (2).
A medicina nuclear é uma especialidade médica que utiliza técnicas não invasivas que permitem detectar alterações funcionais, metabólicas e bioquímicas antes das manifestações anatômicas, com o emprego de radiobiocomplexos para procedimentos de diagnóstico e de tratamento (5,27). Essa característica de natureza biológica possibilita o estudo detalhado de um órgão ou tecido e uma maior fidedignidade na aplicação (3).
Os Radiobiocomplexos são complexos formados por um radionuclídeo, emissor de radiação ionizante, ligado a estruturas moleculares ou celulares(8). Esses complexos constituem-se em uma ferramenta clínica de relevância devido ao seu crescente uso na área da saúde humana. Isso se deve à ausência de ação farmacológica, ao fato de serem administrados por via oral, venosa ou aérea, e ainda ao fato de serem utilizados para a obtenção de imagem metabólica (6). A
diversas doenças, tais como: doenças neurológicas e psiquiátricas (28), e perfusão miocárdica em pacientes obesos (29).
O 99mTc é um radionuclídeo amplamente utilizado na medicina nuclear para diagnósticos (SPECT) (5) e na marcação de estruturas biológicas em pesquisas científicas básicas (27). Esse radionuclídeo pode ser produzido em gerador
99Mo/99mTc, o que possibilita a sua disponibilidade em serviços de medicina nuclear. A
partir desse gerador, pode-se obter um eluído estéril e isento de pirógenos, com características que o fazem ideal para as imagens de câmara de cintilação (emissão de radiação gama de 140 keV); tendo meia-vida de 6 horas, baixo impacto ambiental e o custo reduzido (5).
A marcação de estruturas celulares e moleculares com o 99mTc necessita, em geral, da utilização de um agente redutor. O 99mTc é eluído do gerador sob a forma de pertecnetato de sódio (Na99mTcO4) que não se liga facilmente a outras
espécies químicas, sendo necessária a redução do estado de oxidação +7 para valências menores (5). A redução do Na99mTcO4 pode ser obtida através de diferentes
agentes químicos, sendo realizada freqüentemente com o cloreto estanoso (SnCl2)(5).
As hemácias, estruturas celulares sangüíneas anucleadas, circulam no sangue durante 120 dias em média e exercem funções vitais no organismo (30). A
relacionada à troca do íon bicarbonato (HCO3-) pelo íon cloreto (Cl-) (31,32), e tem
importante participação no metabolismo e na forma das hemácias (33).
Tem-se descrito que doenças (34) e drogas (7,11) poderiam alterar a forma das hemácias. Assim, a análise da forma e de alguns parâmetros morfométricos, tais como o perímetro e a área das hemácias, vem sendo utilizada para avaliar propriedades relacionadas com a membrana eritrocitária (11, 35).
As hemácias são marcadas com o 99mTc através de métodos in vitro, in vivo ou através da combinação de ambos (5). Na aplicação clínica, são muito utilizadas para avaliar o pool sangüíneo, imagem esplênica (5) e detecção de hemorragias gastrintestinais (5,10). Utiliza-se a técnica de marcação in vitro de constituintes sanguíneos com 99mTc também como modelo experimental para avaliação de efeitos biológicos de drogas naturais e sintéticas (7,36, 37).
O consumo de plantas medicinais vem alcançando relevante importância econômica nas últimas décadas em virtude da sua ampla utilização na cultura popular (38). Os benefícios dessas plantas estão associados aos seus princípios ativos (39, 40), que estão presentes em todas as suas partes: folhas, flores, galhos, raízes, sementes e grãos (16). Entretanto, os relatos sobre os efeitos adversos e as
possíveis interações farmacológicas entre os compostos químicos das plantas medicinais e as drogas alopáticas ainda são escassos, devido ao pouco conhecimento sobre os mecanismos de ação dessas plantas (16, 41). Além disso, diversas plantas ainda não foram padronizadas quanto à posologia, indicação e efeitos adversos, levando as autoridades em saúde à preocupação de criar estratégias que viabilizem a sua segurança, eficácia e qualidade (38).
conhecidas são: a canela-do-Ceilão (Cinnamomum zeylanicum.) e a canela da China (Cinnamomum cassia Blume), que se diferenciam por peculiaridades, como por exemplo, a ausência de súber na Cinnamomum zeylanicum e as concentrações de constituintes químicos, como o eugenol (42). Seu consumo como especiaria está relacionado às suas propriedades organolépticas (sabor e aroma) que são conferidas pela presença de compostos químicos como o aldeído, o eugenol, a cânfora e uma variedade de polifenóis (43-45). É muito difundida na culinária ocidental (46, 47), nas
indústrias de flavorizante, de perfumaria, de bebidas e de alimentos (20).
A canela também é utilizada como planta medicinal no Sistema de Saúde Oficial Asiático (18,21,47). Na cultura popular, tem uma variedade de aplicações empíricas, como por exemplo: tratamento de transtornos digestivos, resfriados (48), hipertensão (49,50), tratamento de disfunção erétil, frigidez, inflamação dos olhos, vaginite, reumatismo, ferimentos e cefaléia (42).
Alguns autores têm descrito para essa especiaria, propriedades antioxidantes (17-20,44,51), antimicrobianas (23,52-54), antifúngicas (46,53) e anti-hipertensiva
(50). Além disso, muitos pesquisadores passaram a enfatizar o possível efeito
hipoglicemiante dos compostos fenólicos da canela (21, 24, 25, 47, 48).
O processo de marcação de hemácias com 99mTc pode ser alterado
por drogas terapêuticas, modificando a natureza da ligação ou a quantidade de 99mTc
3 ARTIGO ANEXADO
Aceito para publicação no periódico “Applied Radiation and Isotopes” (2008 Feb;66(2):139-146. Epub 2007 Aug 15), Qualis Internacional A.
Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabeling of blood constituents and
the morphometry of red blood cells: in vitro assay.
M. O. Benarroz1, 2; A.S. Fonseca1* ; G. S. Rocha1; J.N.G. Frydman1, 2; V.C. Rocha1;
M.O. Pereira1and M. Bernardo-Filho1, 2, 3.
1 - Universidade do Estado do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Departamento de Biofísica e Biometria, Avenida 28 de Setembro, 87, 4o
Andar, Vila Isabel, 20551-030, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
2 – Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, Avenida General Gustavo Cordeiro de Farias, s/n, 59010-180,
Natal, RN, Brasil.
3 - Instituto Nacional do Câncer, Coordenadoria de Pesquisa Básica, Praça Cruz Vermelha, 23, 20230-130, Rio de Janeiro, RJ, Brasil.
Corresponding Author:
Adenilson de Souza da Fonseca
Universidade do Rio de Janeiro, Instituto de Biologia Roberto Alcantara Gomes, Departamento de Biofísica e Biometria, Av. 28 de setembro, 87, 4o Andar, 20551-030,
Abstract
Effects of Cinnamomum zeylanicum(cinnamon) on the labeling of blood constituents with technetium-99m(99mTc) and on the morphology of red blood cells were studied.
Blood samples from Wistarrats were incubated with cinnamon extract for 1hour or with 0.9% NaCl, as control. Labeling of blood constituents with 99mTc was performed.
Plasma(P) and blood cells(BC), soluble(SF-P and SF-BC) and insoluble(P and IF-BC) fractions were separated. The radioactivity in each fraction was counted and the percentage of radioactivity incorporated(%ATI) was calculated. Blood smears were prepared, fixed, stained and the qualitative and quantitative morphological analysis of the red blood cells was evaluated. The data showed that the cinnamon extract decreased significantly(p<0.05) the %ATI on BC, IF-P and IF-BC. No modifications were verified on shape of red blood cells. Cinnamon extracts could alter the labeling of blood constituents with 99mTc, and although our results were obtained with animals, precaution is suggested in interpretations of nuclear medicine examinations involving the labeling of blood constituents in patients who are using cinnamon.
Keywords:blood constituents; Cinnamomum zeylanicum; morphology; technetium-99m
1. Introduction
“cinnamon quills” (Wijesekera, 1978). It is widely used in Western cooking in various kinds of desserts as well as in preparing flavoring teas (Mau et al., 2001; Jham, et al., 2005).
Cinnamon is an ancient herbal medicine (Cheng et al., 2000) used as health tea to treat gastrointestinal disturbance and loss of appetite (WHO, 1999), vasodilatation (Qin et al., 2003), common cold, as well as, having antimicrobial action (Murcia et al., 2004). It has the capability of inhibiting various cancer cell lines (Schoene et al., 2005). Other data demonstrated that cinnamon could reduce glucose, triglyceride, total cholesterol and LDL cholesterol plasma levels in people with type 2 diabetes (Khan et al., 2003). In addition, it has been shown that cinnamon extracts could also present a potent antioxidant effect (Mancini-Filho et al., 1998; Murcia et al., 2004).
Chemical analysis of cinnamon extracts have revealed the presence of essential oils, tannins (Lee and Ahn, 1998; Mau et al., 2001), phenolic acids (Anderson et al., 2004; Schoene et al., 2005; Shan et al., 2005), cinnamaldehyde (WHO, 1999; Cheng et al., 2000; Prasad et al., 2003; Shan et al., 2005), eugenol (Friedman et al., 2000; Chericoni et al., 2005), cinnamophilin (Su et al., 1999), hydroxychalcone (Jarvill-Taylor et al., 2001) and coumarin (Choi et al., 2001). However, the composition of the essential oil and, therefore, its value and use depends very much on the species which is distilled, as well as on the part of the plant that is utilized (Chericoni et al., 2005).
The labeling process of cellular and molecular structures with 99mTc depends on a reducing agent, such as stannous ion (Dewanjee et al., 1982). In the red blood cells, the transport of the pertechnetate ion by the band-3 system (Callahan and Rabito, 1990) and the stannous ion by the calcium channels (Gutfilen et al., 1996) to the interior of the cells have been suggested. The binding of 99mTc is mainly on the beta chain of hemoglobin (Dewanjee et al., 1982).
Several authors have reported the effect of synthetic and natural drugs on this radiolabeling process (Oliveira et al., 2003; Frydman et al., 2004; Moreno et al., 2004; Fonseca et al., 2005). The drugs could alter the labeling of blood constituents acting as oxidant agents, modifying the membrane structure or decreasing the efficiency of transmembrane transport system of stannous and pertechnetate ions into cells. These findings have stimulated the process to label blood constituents with 99mTc as an in vitro
assay to screening some properties of synthetic or natural products.
Moreover, qualitative and quantitative morphological analysis has been used as a method to evaluate if the effects of drugs on this radiolabeling process could be related to changes in shape of red blood cells (Oliveira et al., 2003).
2. Materials and methods
Animals
Adult male Wistar rats (3-4 months of age, body weight 250-300 g) were maintained in a controlled environment. The animals had free access to water and food,
and ambient temperature was kept at 25 r 2ºC. Experiments were conducted in accordance with the Institutional Committee of Animal Care (Comissão de Ética para o Cuidado e Uso de Animais Experimentais, Instituto de Biologia Roberto Alcantara
Gomes, Universidade do Estado do Rio de Janeiro) with the protocol number
CEA/134/2006.
Preparation of cinnamon extract
Cinnamon, powdered (lot 04E05C, validity to November 2006), the manufacturer of which is Yoki Alimentos S.A., Brasil (www.yoki.com.br/kitano), was purchased at a local supermarket. To prepare the extract, 1.2 g of powder were dissolved in 20 ml of hot saline (0.9% NaCl). After 15 minutes, this preparation was centrifuged (1500 rpm, 5 minutes) to obtain the final extract. All the experiments were performed before November 2006. Considering the information of the manufacturer about the expiration date of this product, it is expected that it was in condition to be used in various situations.
Spectrophotometry of the extract
the absorbance at 500 nm (1.06r0.002) was considered as a marker of the reproducibility of the conditions of the extract at the higher concentration used.
In vitro radiolabeling of blood constituents
The experiments were carried following the protocol published elsewhere (Bernardo-Filho et al., 1983; Bernardo-Filho et al., 1994; Vidal et al., 1998; Lima-Filho et al., 2002; Moreno et al., 2004; Fonseca et al., 2005; Freitas et al., 2007; Fonseca et al., 2007). The tubes used in these experiments were previously closed with a rubber cap and a syringe was used to reduce the air atmosphere (vacuum) inside the vials.
Heparinized blood (500 Pl, n=10 for each concentration) was withdrawn from Wistarrats (n=12) and incubated with 100 Pl of different concentrations of a cinnamon extract (0.6, 3.75, 7.5, 15, 30 and 60 mg/ml) or with a saline solution (0.9% NaCl) alone, as control,
for 1 hour (room temperature). Afterwards, 500 Pl of freshly prepared solution of stannous chloride (1.20 µg/ml) was added and the incubation continued for further 1 hour. After this period of time, 100 µl 99mTc (3.7 MBq) as sodium pertechnetate (Na99mTcO4), recently milked from a 99Mo/99mTc generator (Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, Comissão Nacional de Energia Nuclear, São Paulo, Brasil) were added and the incubation continued for another 10 minutes. These samples were
Morphological evaluation of red blood cells
Histological preparations were carried out with blood samples in vitro treated with cinnamon extract at different concentrations for 60 min at room temperature, or with saline solution as control group. Blood smears were prepared, dried, fixed and stained by the May-Grünwald-Giensa method (Junqueira and Carneiro, 2002). After that, the images of the red blood cells were acquired (Optronics, USA) from blood smears to qualitative morphology analysis under optical microscopy (x1000, Olympus, BX model, Japan). For morphometric analysis of red blood cells, the perimeter/area ratio was obtained from images by specific program (Image ProPlus Software, USA).
Statistical analysis
3. Results
Figure 1 shows the absorbance spectrum of the cinnamon extract at higher concentration used in the range of 400-700 nm. The data in this figure indicate that the
extract studied presents an absorption peak (1.06r0.002) at 500 nm.
Figure 2 shows the ATI% in insoluble (IF-P) and soluble (SF-P) fractions isolated from plasma separated from whole blood incubated with different concentrations of an aqueous cinnamon extract. The analysis of this data indicates that aqueous cinnamon extract has significantly (p<0.05) reduced the ATI% of IF-P in the incubation with the highest doses (30 and 60 mg/ml) suggesting a reducing of 99mTc fixation by plasma proteins at this concentration.
Figure 3 shows the ATI% in insoluble (IF-BC) and soluble (SF-BC) fractions isolated from blood cells separated from blood incubated with different concentrations of an aqueous cinnamon extract. Similarly in the results obtained with plasma proteins, aqueous cinnamon extract has also significantly (p<0.05) reduced the ATI% of IF-BC at highest doses suggesting a reducing of 99mTc fixation by the cellular proteins at these
concentrations studied.
Figure 4 shows the ATI% in blood cells (BC) and plasma (P) compartments from whole blood incubated with different concentrations of an aqueous cinnamon extract. The analysis of these data indicates that aqueous cinnamon extract in various concentrations decreases the ATI% of cells suggesting an alteration in the distribution of the 99mTc between cellular and plasma compartments.
cinnamon does not induce important changes on shape of red blood cells observed under optical microscopy.
The figure 7 shows the perimeter/area ratio for red blood cells from blood samples treated with aqueous cinnamon extract at different concentrations. The analysis of these data confirms the qualitative evaluation (Figure 6), indicating that the extract used didn’t modify the perimeter/area ratio of the red blood cells.
4. Discussion
There are numerous clinical and experimental studies about the effects and pharmacological interactions between natural and synthetic drugs. The data concerning interaction of diagnostic agents, including radiopharmaceuticals, with therapeutic drugs are relatively scarce. The development and use of in vitro tests can bring important information about the possible drug/radiopharmaceutical interactions. The labeling of blood constituents with 99mTc could be an useful method to study this labeling process and important findings have already been published (Bernardo-Filho et al., 1983; Bernardo-Filho et al., 1986). These works revealed that further manipulations of the blood was not necessary after the labeling process, as centrifugation or treatment with chelating agents (Brunelle and Nouel, 1970; Sodee and Early, 1995), although it would need to increase the incubation time with stannous chloride. Moreover, our experimental model has permitted evaluating some properties of various products used by the human beings (Oliveira et al., 2003; Moreno et al., 2004; Fernandes et al., 2005; Fonseca et al., 2007).
al., 2005). This procedure has been proposed as an in vitro assay to attempt ascertain some effects, as redox activities, of products used daily by the human beings.
The analysis of data presented in this study shows that the aqueous cinnamon extract should alter the fixation of 99mTc in plasma and cellular proteins in the treatments with the highest doses (30 and 60 mg/ml, Figures 2 and 3). Moreover, the data show that the aqueous cinnamon extract seems to modify the distribution of 99mTc between
cellular and plasma compartments when low and high concentrations of this natural product (Figure 4) were used in the experiments. To ascertain whether if the aqueous cinnamon extract used could cause morphological modifications in the membrane of red blood cells and alter the labeling of these cells with 99mTc, qualitative (Figures 5 and 6) and quantitative (Figure 7) morphological analyses was carried out. These analyses suggested no modifications on shape of red blood cells.
Pharmacological effects of interest to human health have been reported with 1 up to 6 g per day of cinnamon as crude drug or extracts (Safdar et al., 2004; Khan et al., 2003; Mang et al., 2006). These values are close to commonly-suggested doses (2 up to 4 g) to cinnamon as crude drug (WHO, 1999). Although our experiments were carried out in an in vitro assay, the data with cinnamon extract could correspond to these doses, since alterations in radiolabeling of red blood cells and plasma proteins were obtained at low doses (3.75 mg/ml and 7.5 mg/ml, respectively).
99mTc in these proteins, in the presence of cinnamon extract, plasma protein labeling
with99mTc could be reduced. This fact was observed with 30 mg/ml (Figure 2).
Antioxidant compounds are of great interest because could they be used to prevent several chronic diseases such as heart disease, diabetes, cancer, arterial thrombosis, and may provide health-promoting effects (Kimura et al., 1985; Craig, 1999; Ferrari, 2004; Treasure, 2005). The antioxidant effect of phenolic compounds present in cinnamon extracts is mainly due to their redox properties and could result in various mechanisms: free-radical scavenging activity, transition-metal-chelating and singlet-oxygen-quenching capacity (Shan et al., 2005). These substances could act as chelating on stannous ions decreasing the fixation of 99mTc on plasma and cellular proteins (Figure 2 and 3), as well as could be related to radiolabeling alteration of blood cells (Figure 4).
Data have demonstrated that cinnamon extracts present activity against a number of microorganisms such as: Salmonella typhimurium and Escherichia coli (Mau et al., 2001; Alzoreky and Nakahara, 2003; Yuste and Fung, 2004), Salmonella infantis, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes and Bacillus cereus (Mau et al., 2001; Alzoreky and Nakahara, 2003). This effect may be related to action on plasma membrane modifying its structure and decreasing or impeding the transport of stannous and pertechnetate ions into blood cells.
that this extract could inhibit the Na+ - K+- ATPase in rat intestines and kidneys (Verspohl et al., 2005). Other data have demonstrated that cinnamophilin could inhibit potassium, sodium and calcium currents in rat cardiac tissues (Su et al., 1999). In addition, trans-cinnamaldehyde, the main component of cinnamon extracts, can depolarize the membrane and release noradrenaline from ileal synaptosomes by calcium-dependent and cyclic AMP-related systems (Cheng et al., 2000). Thus, cinnamon extract could cause alterations in membrane structures involved in ion transport and alter the internal cellular conditions and/or stannous and pertechnetate ions transport into cell thus explaining the decrease in radiolabeling of blood cells with
99mTc (Figure 4). However, these effects on membrane structure could not induce
alterations on shape of red blood cells, as ascertained by morphological analysis (Figures 6 and 7).
Moreover, in general, the labeling of blood constituents could decrease due to drug action in: (i) binding at same sites on the blood constituents; (ii) direct oxidation or generation of free radicals which could oxidize the stannous ion; (iii) direct inhibition (chelating action) of the stannous and pertechnetate ions, and (v) alteration of the plasma membrane structure or modifying the transport systems of stannous and pertechnetate ions into cells.
Acknowledgements
This research was supported by Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) and Universidade do Estado do Rio de Janeiro (UERJ). We are grateful to Carlos Brown Scavarda (B.A. University of Michigan) for the English grammar review.
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Figure and legends
Figure 2: Effect of cinnamon extract on uptake of 99mTc by insoluble (IF-P) and soluble (SF-P) fractions of plasma (P), in the radiolabeling procedure of blood elements. Heparinized blood samples of Wistar rats were incubated with different concentrations
of cinnamon extract (1 hour) and after with SnCl2 (1.20 Pg/ml, 1 hour) and in sequence
with Na99mTCO4 (3.7 MBq 10 minutes). Insoluble and soluble fractions of plasma (IF-P
and SF-P) were obtained by precipitation with trichloroacetic acid (5%) and centrifugation (1500 rpm, 5 minutes). The radioactivity in these fractions was counted
and the %ATI was calculated. () IF-P and (Ƒ) SF-P. (***) pd0.001, when compared to control group of IF-P.
Figure 3: Effect of cinnamon extract on uptake of 99mTc by insoluble (IF-BC) and soluble (SF-BC) fractions of blood cells (BC), in the radiolabeling procedure of blood elements. Heparinized blood samples of Wistar rats were incubated with different concentrations
of cinnamon extract (1 hour), after with SnCl2 (1.20 Pg/ml, 1 hour) and in sequence with
Na99mTcO4 (3.7 MBq 10 minutes). Insoluble and soluble fractions of blood cells (IF-BC
and SF-BC) were obtained by precipitation with trichloroacetic acid (5%) and centrifugation (1500 rpm, 5 minutes). The radioactivity in these fractions was counted
and the %ATI was calculated. () IF-BC and (Ƒ) SF-BC. (*) p<0.05 and (***) pd0.001, when compared to control group of IF-BC.
Figure 4: Effect of cinnamon extract on the distribution of the 99mTc in the plasma and
blood cells (BC) compartments in the radiolabeling procedure of blood elements. Heparinized blood samples of Wistar rats were incubated with different concentrations
with Na99mTcO4 (3.7 MBq 10 minutes). After centrifugation, plasma (P) and blood cells
(BC) were isolated, the radioactivity was counted and the %ATI calculated. () P and
(Ƒ) BC. (***) pd0.001, when compared to control group of BC.
Figure 5: Photomicrography of blood smears from blood samples treated with NaCl 0.9% solution (control group). Samples of whole blood from Wistar rats were treated with NaCl 0.9% solution for 60 minutes. Blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy after image capture.
Figure 6: Photomicrography of blood smears from blood samples treated with cinnamon extract. Samples of whole blood from Wistar rats were treated with aqueous cinnamon extract (60.0 mg/ml) for 60 minutes. Blood smears were prepared, dried, fixed and staining by May-Grünwald-Giensa method. The morphology of red blood cells was evaluated under optical microscopy (x 1000) after image capture.
Figure 1 0 0,2 0,4 ,6 0,8 1 2
400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
WAVE LENGTH ABSORBANC 1, E 0 Figure 2
0 0.6 3.5 7.5 15 30 60
0 20 40 60 80 100 *** *** %A T I
CINNAMON EXTRACT (mg/ml)
Figure 3
0 0.6 3.5 7.5 15 30 60
0 20 40 60 80 100 *** *** * %A T I
Figure 4
0 0.6 3.5 7.5 15 30 60 0
20 40 60 80 100
*** *** *** *** ***
%A
T
I
CINNAMON EXTRACT (mg/ml)
Figure 6
Figure 7
0.00 0.60 3.75 7.50 15.00 30.00 60.00
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
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4 COMENTÁRIOS, CRÍTICAS E CONCLUSÕES.
Todo profissional que busca a excelência no desempenho e vislumbra a possibilidade de ser um formador de opinião e um multiplicador de conhecimentos, precisa cumprir uma etapa marcante e fundamental na carreira acadêmica: o mestrado.
A educação continuada, através de um curso de pós-graduação
strictu sensu, possibilita ao aluno participar das mudanças no contexto social decorrentes dos avanços tecnológicos, a partir do aperfeiçoamento, capacitação e qualificação técnica, bem como agregar valores inerentes ao cientista: criatividade, investigação e crítica.
Ingressar no Programa de Pós-graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Rio Grande do Norte foi uma experiência ímpar. Ainda que cumprindo créditos e exercendo as atividades acadêmicas e científicas em outra Universidade, na UERJ. Cursar as disciplinas em diferentes departamentos e compartilhar o saber com profissionais das áreas mais diversas foi muito enriquecedor.
Estar vinculada a uma Instituição Pública de Ensino Superior me proporcionou inúmeras vantagens. Docentes altamente capacitados; bibliotecas com acervo moderno; autonomia proporcionada aos alunos, os quais são estimulados a publicar; parceria entre os departamentos de pesquisa e entre Instituições são alguns exemplos.
Entretanto, como todo serviço público, as restrições orçamentárias estão presentes e prejudicam muitos projetos. A restrição do número de “bolsas de estudo” impede a dedicação integral do discente, visto que o trabalho remunerado é uma realidade para muitos. A carência de recursos humanos (secretário ou auxiliar administrativo) e recursos materiais (por exemplo computadores), podem ser citados como pontos críticos nas condições gerais do desenvolvimento de uma pesquisa científica. Contudo, as dificuldades foram superadas com o trabalho em equipe e a boa vontade de todos os integrantes do grupo de pesquisa.
Como nutricionista, investigar os efeitos biológicos de produtos naturais comestíveis era pertinente. Afinal, na prática clínica essa abordagem é comum, principalmente quanto à interação droga-nutriente.
A escolha de um produto natural que tivesse efeitos biológicos diversos e com boa aceitação no mercado mundial foi meu primeiro passo investigatório. A canela-do-Ceilão (Cinnamomum zeylanicum), uma especiaria largamente empregada na culinária, na medicina tradicional e na indústria de perfumaria, tem sido investigada por inúmeras propriedades e daí a curiosidade de estudá-la.
amostras de sangue isoladas de animais foram incubadas com extrato de canela; e no tratamento in vivo, amostras de sangue foram retiradas de animais que receberam extrato de canela. Esses modelos são bem estabelecidos, com diversas publicações em revistas indexadas.
Este estudo, apesar de ser uma pesquisa experimental, tem caráter multidisciplinar. Foi realizado com a colaboração do Setor de Medicina Nuclear e do Laboratório de Endocrinologia do Hospital Universitário Pedro Ernesto – UERJ e através do convênio entre duas universidades públicas, a UERJ e a UFRN. Essas parcerias possibilitaram novas idéias e perspectivas, e também agregaram conhecimentos de diferentes áreas.
Os resultados deste estudo viabilizaram a publicação de um artigo original intitulado: Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabeling of blood constituents and the morphometry of red blood cells: in vitro assay, em revista internacional de impacto relevante, Applied Radiation and Isotopes, com índice de impacto 0,9 (referente ao ano de 2006) e Qualis A Internacional, bem como a possível submissão de outro artigo, com os resultados do tratamento in vivo .
Verificou-se, através de pesquisa bibliográfica e experimental, que as substâncias presentes nos extratos vegetais podem produzir efeitos que possibilitem uma alteração no processo de marcação de hemácias com 99mTc, assim como na
morfologia das células vermelhas.
Observou-se que no tratamento in vitro o extrato de canela foi capaz de diminuir significativamente (p<0,05) a porcentagem de radioatividade nos compartimentos celulares e na fixação das proteínas celulares e plasmáticas. Esses efeitos não foram observados no tratamento in vivo. Os resultados obtidos para a morfologia de hemácias sugerem que os tratamentos in vitro e in vivo não alteram a forma nem a razão perímetro/área.
Os dados obtidos neste trabalho são de relevante importância por descreverem algumas das interações entre a canela, como especiaria e como planta medicinal, e os constituintes sanguíneos marcados com 99mTc, como radiobiocomplexos. Além disso, até o momento não foram encontrados relatos dos efeitos de extratos de canela sobre radiofármacos.
Embora, os resultados apresentados sejam experimentais, podem ser úteis para compreensão de problemas associados à interpretação inadequada de exames de medicina nuclear e/ou à necessidade de repetição deste tipo de procedimento clínico em pacientes que estejam fazendo uso da canela como especiaria ou como planta medicinal.
A canela vem sendo largamente estuda em diferentes áreas, seja nas ciências biomédicas ou na indústria de alimentos e bebidas. Portanto colaborar com o meio científico com informações da pesquisa básica pode em algum aspecto trazer esclarecimentos sobre o tema.
5 ANEXO
Carta de aceite
Ms. Ref. No.: ARI-D-07-00215R1
Title: Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabeling of blood constituents and the morphometry of red blood cells: in vitro assay
Applied Radiation and Isotopes Dear Dr. Adenilson Souza Fonseca,
Thank you for submitting the revision, together with a detailed response to the reviewers' critiques.
I am pleased to confirm that your paper "Cinnamomum zeylanicum extract on the radiolabeling of blood constituents and the morphometry of red blood cells: in vitro assay" has been accepted for publication in Applied Radiation and Isotopes. Comments from the Editor and Reviewers can be found below.
Thank you for submitting your work to this journal. With kind regards,
LEONARD I. WIEBE, DSc, PhD Receiving Editor
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Radiobiocomplexes are used to obtain images in nuclear medicine and employed in basic research. Blood constituents labeled with technetium-99m (99mTc) have also been employed as radiobiocomplexes and used also experimental model for evaluation of the biological effects of natural or synthetic drugs. The analysis of the morphology and the morphometrics parameters (perimeter/área ratio) can be used to evaluate the effects of drugs upon the structure of the membrane of red blood cells. Cinnamomum zeylanicum
(cinnamon) is a spice used as herbal medicine to treat diseases. The aim of this study was to evaluate the effect of in vitro and in vivo treatment with an aqueous cinnamon extract on the labeling of blood constituents with 99mTc and on the morphology of red
blood cells from Wistar rats. In the in vitro treatment, isolated blood sample from animals were incubated with cinnamon extract. In the in vivo treatment, blood samples were also withdrawn from animals treated with cinnamon extract. In both cases, the radiolabeling of blood constituents was done. The morphological analysis of red blood cells was also done. As control, blood or animals treated with NaCl 0.9%. The data obtained on the labeling of blood constituents with 99mTc experiments indicated that the
in vitro treatment with cinnamon extract was capable to decrease signiicantly (p<0.05) the percentage of radioactivity in cellular compartments and on the fixation of cellular and plasma proteins. These effects were not observed on the in vivo treatment. The results obtained for the morphology of red blood cells suggest that the in vitro and in vivo treatments did not alter the morphology and the perimeter/area ratio. The in vitro
Services of the Hospital Universitário Pedro Ernesto of the Universidade do Estado do Rio de Janeiro.
Key-words: blood constituents, technetium-99m, sodium pertechnetate, rats,
1. Efeito do tratamento in vivo com extrato aquoso de canela em diferentes doses, na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc.
(%ATI) Dose
(mg/kg) P C FI-P FS-P FI-C FS-C
Controle 3,5±2,48 96,5±2,48 61,9±4,48 38,1±4,48 68,8±3,44 31,2±3,44
1,5 2,0±0,59 98,0±0,59 60,8±6,52 39,2±6,52 69,4±2,59 30,6±2,59
15,0 2,4±0,70 97,6±0,70 62,5±7,53 37,5±7,53 68,9±2,55 31,1±2,55
150,0 2,6±0,91 97,4±0,91 61,3±5,66 38,7±5,66 68,5±1,67 31,5±1,67
tempo, na marcação de constituintes sanguíneos com 99mTc.
(%ATI) Tempo
(min.) P C FI-P FS-P FI-C FS-C
0 2,4±1,15 97,6±1,15 66,1±5,98 33,9±5,98 77,0±3,77 23,0±3,77
15 4,7±4,26 95,3±4,26 67,7±6,75 32,3±6,75 76,4±3,43 23,6±3,43
60 3,7±2,76 96,3±2,76 63,8 ± 7,55 36,2±7,55 76,9±4,49 23,1±4,49
120 3,2±1,47 96,8±1,47 64,6±6,79 35,4±6,79 77,7±4,00 22,3±4,00
Ratos Wistar foram tratados com um extrato aquoso de canela (150,0 mg/kg) em diferentes períodos de tempo. Em seguida, o sangue foi retirado e os constituintes sanguíneos foram marcados com 99mTc . Plasma (P) e células (C) foram separados por
tratados com salina (controle).
tratado com extrato aquoso de canela por 60 minutos.
na razão perímetro/área das hemácias.
0,00 1,50 15,00 150,00 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 R A ZÃ O P E R ÍM E TR O /Á R E A (1 / P m)
EXTRATO AQUOSO DE CANELA (mg/kg)
preparadas imediatamente após o tratamento com extrato aquoso de canela.
tratados com extrato de aquoso de canela por 120 minutos.
períodos de tempo na razão perímetro/área das hemácias.
0 15 60 120
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
PE
R
]IM
ET
R
O
/Á
R
E
A
(1
/
P
m)
TEMPO DE TRATAMENTO (minutos)
