Níveis séricos de proteína de células de Clara de 16 kDa e comprometimento pulmonar em pacientes com esclerose sistêmica.

(1)

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REVISTA

BRASILEIRA

DE

REUMATOLOGIA

Artigo

original

Níveis

séricos

de

proteína

de

células

de

Clara

de

16 kDa

e

comprometimento

pulmonar

em

pacientes

com

esclerose

sistêmica

Anna

Olewicz-Gawlik

a,∗

,

Dorota

Trzybulska

a

,

Barbara

Kuznar-Kaminska

b

,

Katarzyna

Katulska

c

_,

_Aleksandra

_{Danczak-Pazdrowska}

d

_,

Halina

Batura-Gabryel

b

_e

_Pawel

_Hrycaj

a

a_Departamento_de_Reumatologia_e_Imunologia_Clínica,_Poznan_University_of_Medical_Sciences,_Poznan,_Polônia

b_Departamento_de_Pneumologia,_Alergologia_e_Pneumologia_Oncológica,_Poznan_University_of_Medical_Sciences,_Poznan,_Polônia

c_Departamento_de_Radiologia_Geral_e_{Neurorradiologia,}_Poznan_University_of_Medical_Sciences,_Poznan,_Polônia

d_Departamento_de_{Dermatologia,}_Poznan_University_of_Medical_Sciences,_Poznan,_Polônia

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem22deabrilde2014 Aceitoem30deabrilde2015 On-lineem17dejulhode2015

Palavras-chave: CC16

Doenc¸aintersticialpulmonar Esclerosesistêmica

r

e

s

u

m

o

Objetivo:AvaliarautilidadeclínicadasmediçõesséricasdaproteínadecélulasdeClarade 16-kDa(CC16)emrelaçãoaosistemadeestadiamentoparadoençapulmonarintersticial associadaaesclerosesistêmica(DPI-ES).

Materiaisemétodos:ForamdeterminadososníveisséricosdeCC16porELISAem28 pacien-tescomESe30controlessaudáveisecorrelacionadoscomosistemadeestadiamentopara DPI-ESempacientescomES.Oenvolvimentopulmonarfoiavaliadofuncionalmente (ple-tismografiacorporal,capacidadededifusãodemonóxidodecarbono)eradiologicamente (extensãomédiadadoenc¸anatomografiacomputadorizadadealtaresoluc¸ãodospulmões, TCAR)empacientescomES.

Resultados: Foramencontradasdiferençasestatisticamentesignificativasnosníveis séri-cosdeCC16entrepacientescomESecontrolessaudáveisapenasemnãotabagistas.No entanto, asconcentrações séricasdeCC16eramsignificativamenteelevadasem pacien-tescomextensão>20%naTCARemcomparaçãocompacientescomextensão< 20%na TCAR(p=0,01).OsníveisséricosdeCC16secorrelacionarampositivamentecoma exten-sãomédiadadoençanaTCAR(p=0,04)ecomaextensãodepadrãoreticularnaTCAR(p< 0,01)enegativamentecomacapacidadepulmonartotal(CPT)(p=0,03)ecomosresultados dotestedecaminhadadeseisminutos(p<0,01).

Conclusões:OsníveisdeCC16podemserconsideradoscomobiomarcadoresséricos suple-mentaresparaaDPI-ES.

(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

∗ _Autor_para_{correspondência.}

E-mail:anolegaw@wp.pl(A.Olewicz-Gawlik). http://dx.doi.org/10.1016/j.rbr.2015.04.001

(2)

Serum

Clara

cell

16-kDa

protein

levels

and

lung

impairment

in

systemic

sclerosis

patients

Keywords: CC16

Interstitiallungdisease Systemicsclerosis

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective: ToassessclinicalutilityofserumClaracell16-kDaprotein(CC16)measurements inrelationwithstagingsystemforsystemicsclerosisassociatedinterstitiallungdisease (SSc-ILD).

Materialsandmethods:SerumlevelsofCC16weredeterminedbyELISAin28SScpatientsand 30healthycontrols,andcorrelatedwithstagingsystemforSSc-ILDinSScpatients.Lung involvementwasassessedfunctionally(bodyplethysmography,diffusingcapacityofthe lungforcarbonmonoxide)andradiologically(anaveragediseaseextentonhighresolution computedtomographyofthelungs,HRCT)inSScpatients.

Results: WeobservedstatisticallysignificantdifferencesinserumCC16levelsbetweenSSc patientsandhealthycontrolsonlyinnon-smokers.However,serumCC16concentrations weresignificantlyelevatedinpatientswithHRCTextent>20%incomparisontopatients withHRCTextent<20%(p=0.01).Theycorrelatedpositivelywithaveragediseaseextenton HRCT(p=0.04),anextentofareticularpatternonHRCT(p<0.01),andnegativelywitha totallungcapacity(TLC)(p=0.03)andtheresultsofthe6-minwalktest(p<0.01).

Conclusions: CC16levelscanbeconsideredasasupplementalserumbiomarkerforSSc-ILD. ©2015ElsevierEditoraLtda.ThisisanopenaccessarticleundertheCCBY-NC-ND license(http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Introduc¸ão

A esclerose sistêmica (ES) é uma doenc¸a autoimune

crô-nica do tecido conjuntivo caracterizada por vasculopatia, inflamac¸ão e fibrose progressiva da pele e órgãos

inter-nos. As principais causasde morbidade emortalidade em

pacientescom ES sãoduassíndromes pulmonares

relacio-nadas com aES: hipertensão arterialpulmonar (HAP-ES) e

doençapulmonarintersticial(DPI-ES).1_Para_avaliar_a_DPI-ES, são feitas tomografias computadorizadas de alta resolução (TCAR)etestesdefunçãopulmonar.Alémdisso,foram des-critosalguns marcadores sorológicos da DPI-ES específicos do pulmão.2-4 _Esse _grupo _inclui _a _proteína _de _células _de Clarade16kDa(CC16). Essaéumadasprincipaisproteínas secretadas pelas células de Clara e há cada vez mais evi-dênciasdeseupapelprotetorcontraarespostainflamatória pulmonar.5

ACC16éumaproteínahomodiméricade15,8kDa codifi-cadaporumgenelocalizadonocromossomo11.6_Tem

poten-tes propriedades imunossupressoras e anti-inflamatórias

naturais.ACC16mostroumodular arespostainflamatória, incluindo ainibic¸ão da atividade da fosfolipaseA2 citosó-licaeinterferon-␥in vitro.7 Foramobservadasalterac¸õesnas

concentraçõesséricasdeCC16empacientescomdiferentes doençasqueafetamospulmões,incluindoumadiminuição

nos níveis de CC16 na asma brônquica e um aumento

na sarcoidose e na fibrose pulmonar idiopática.8,9 _A pro-teína também foi observada após a exposic¸ão a irritantes pulmonares.10 _Além_disso,_descobriu-se_que_o_nível_sérico_de

CC16éumindicadorde fibrosepulmonarativaem

pacien-tescomES.11 _Em_relação_a_esse_achado,_no_presente_estudo foramavaliados osníveis séricosdeCC16efoi examinada aassociaçãocom a avaliaçãodeDPI-ESempacientes com ES.

Materiais

e

métodos

Foram recrutados para o estudo28 pacientes consecutivos

comES(25mulheresetrêshomensentre24e70anos),de acordocomoscritériosdeclassificac¸ãodoAmericanCollege

ofRheumatology.12 _Todos_os_pacientes_foram_também

ana-lisados comos critérios declassificac¸ão paraES de2013.13 Os pacientes foramainda classificadosemdois subgrupos,

deacordocomoacometimentocutâneo;combasena

exten-sãodoseuenvolvimentodepele,podiamteraformacutânea difusa(EScd)oucutânealimitada(EScl)dadoenc¸a.14 _Os con-troles saudáveis (n=30) eram voluntários não tabagistas e foramestatisticamentepareadosporsexoeidade(18-29, 30-44,45-54 e55-70anos).O estudofoi aprovadopelo Comitê

de Ética da Universidadede Ciências Médicasde Poznane

foi obtidoumconsentimentoinformadodetodos os

parti-cipantes. O protocolo de pesquisa está de acordo com os

princípios da Declarac¸ão de Helsinque da World Medical

Association.

Aavaliaçãoclínicacompreendeuohistóricodesaúde com-pletoeexamesfísicos,queincluíramaavaliaçãodaúlcerae aavaliaçãodoenvolvimentodapelecomoEscoredeRodnan Modificado.15_Foi_calculado_o_escore_de_atividade_da_esclerose sistêmica (Systemic Sclerosis Activity Score) da European

LeagueAgainstRheumatism(EULAR)SclerodermaTrialsand

Research(EUSTAR)detodosospacientescomES.Adurac¸ão dadoenc¸afoi medidaapartirdoiníciodoprimeirosintoma,

com excec¸ão do fenômeno de Raynaud, consistente com

ES. O envolvimento pulmonar foi avaliado funcionalmente

(pletismografiacorporal,capacidadededifusãodomonóxido

de carbono [CDCO] e testede caminhada de seisminutos)

e radiologicamente (tomografia computadorizada de alta

resoluc¸ão do pulmões, TCAR),conformeproposto porGoh

(3)

avaliadasàprocuradosseguintesachados:extensãomédia dadoenc¸a,extensãodopadrãoreticular,extensãodopadrão devidrofoscoepresenc¸adefaveolamento. Todososexames

de TCAR foram avaliados por um radiologista especialista

emTCAR eDPI. Para descreverospacientescom EScomo

“sem comprometimento da func¸ão pulmonar”, definiu-se

quetrêsparâmetrosfuncionais–capacidadepulmonartotal (CPT),capacidadevital(CV)eCDCO–deveriamestaracima

de80% previsto. Foramcoletadasamostras desangue dos

pacientes nomomento doexameclínico,emjejum.Osoro

obtidofoi armazenado a-70◦_C _antes_da _feitura _dos_testes.

A atividade inflamatória foi determinada pela velocidade

de hemossedimentac¸ão (VHS, Westergren), concentrac¸ão

deproteína C-reativa de altasensibilidade (PCR,ensaio de imunoadsorc¸ãoenzimática[ELISA], Biocheck, EUA)eníveis

doscomponentes do complemento C3 e C4

(imunoeletro-foreseradial). Ostítulosdeanticorpos antinucleares(ANA)

foram avaliados por uma reac¸ão de imunofluorescência

indiretacomdoisbiochipsporcampocontendocélulas HEp-20-10etecidodefígadodemacaco(Euroimmun,Alemanha). Osanticorposparaantígenosnuclearesextraíveis(ENA)foram determinadoscomotestetipoblotANAProfile3(Euroimmun, Alemanha).Asconcentrac¸õesséricasdeCC16forammedidas

com kits ELISA comercialmente disponíveis (BioVendor,

RepúblicaCheca),deacordocomoprotocolodofabricante.

Os dados demográficos dos pacientes foram analisados

por meio de estatística descritiva e a distribuic¸ão normal

dosdadosfoi aferida com o testedeKolmogorov-Smirnov.

Osresultados sãoapresentados aolongodoartigo como a

média±desviopadrão(DP)paradadosdedistribuiçãonormal oucomoamediana(intervalo interquartil,IQR)paradados semdistribuiçãonormal. Asassociaçõesentreosdiferentes

valores foram examinadas com a análiseda correlac¸ãode

postosdeSpearman.Asdiferenc¸asentreosgruposforam cal-culadascomotesteUdeMann-Whitney.Umvalordepinferior a0,05foi consideradoestatisticamentesignificativo. Todas asanálisesestatísticasforamfeitascomosoftwareStatistica (StatSoft,Inc.,2011),versão10,www.statsoft.com).

Resultados

Dentreos28pacientescomES,11tinhamEScd(novemulheres edoishomens)e17tinhamEScl(16mulhereseumhomem).

Dez pacientes(35,7%) tinham umEscorede Rodnan

Modi-ficadode maisde 14 esete(25%)tinham doenc¸a ativa,de

acordocom oescoredeatividade daEUSTAR.Umpaciente

(3,6%)tinhaHAP-ESenenhumtinhafunc¸ãorenalprejudicada. Em27pacientes(96,4%)ostestesdefunc¸ãopulmonar

apre-sentaramdiminuic¸ão na CDCO,aCVestava diminuídaem

quatro(14,3%)eaCPTemum(3,6%).Nãohouvecasodeasma brônquicaousarcoidoseconcomitantenogrupopesquisado. AcomparaçãoentreaEScdeaESclnãoreveloudiferenças estatisticamentesignificativasnostestesdefunção

pulmo-naremrelac¸ãoàporcentagempredita daCPT,CVeCDCO.

Alterac¸õessignificativasnaTCAR(extensãodaDPI>5%) em 53,6%dospacienteseextensãodaDPI>20%estavam

presen-tesem32,1%dospacientescomES.Nãoforamencontrados

pacientescomaextensãoindeterminadadadoenc¸anaTCAR.

Tabela1–Característicasclínicas,laboratoriaise radiológicasdospacientescomesclerosesistêmica

Duraçãodadoença(meses) 51,5±12,1 EscoredeRodnanmodificado 13(17) Anticorposantinucleares 25(89,3) Anticorposantitopoisomerase 10(35,7) Anticorposanticentrômero 15(53,6) Velocidadedehemossedimentação(mm/h) 25(22) ProteínaC-reativa(mg/L) 0(5,4) ComponentedocomplementoC3(g/L) 1162(236) ComponentedocomplementoC4(g/L) 191(66) EscoredeatividadedaesclerosesistêmicaEUSTAR 2(3)

TCAR 15(25)

Extensãodadoenc¸a,% 10(15) Extensãodopadrãoreticular,% 5(10) Extensãodopadrãodevidrofosco,% 9(32,1) Presenc¸adefaveolamento 58,4(16,5) Capacidadepulmonartotal(%p) 108,2(21) Capacidadevital(%p) 98,3(19,7) Testedecaminhadade6minutos,distância(m) 375(90) Tratamentocomciclofosfamida 9(32,1) Tratamentocommetotrexato 5(17,9) Tratamentocomazatioprina 2(7,1)

Tabagistaatual 6(21,4)

TCAR,tomografiacomputadorizadadealtaresoluc¸ão.

Dados apresentados como a mediana (intervalo interquartil), média±desviopadrãooucomon(%).

Outrascaracterísticasdogrupodepacientesnomomentoda análisesãomostradasnatabela1.

Não foramobservadasdiferençasestatisticamente signi-ficativas nosníveisséricosdeCC16entrepacientescomES (medianade9,9(7,3)ng/mL)econtrolessaudáveis(mediana de8,4(3,7)ng/mL)(fig.1)ouentreossubgruposEScdeEScl. Noentanto,aexclusãodostabagistasdessaanáliserevelou concentrações séricas significativamente elevadas de CC16 nospacientescomESnãotabagistasemcomparaçãocomos controles [medianade10,2(5,8)vs. 8,4(3,7)ng/mL,p=0,03] (fig.2).EmtodoogrupocomESinvestigado,asconcentrações deCC16tambémestiveramassociadasàidadedospacientes

35

0

Esclerose sistêmica Controles 5

10

CC16 [ng/mL]

15 20 25 30

Média

(4)

Pacientes não tabagistas com esclerose sistêmica

Controles 0

2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

CC16

[n

g/m

L]

Média

Figura2–Concentrac¸õesséricasdeCC16(ng/mL)em pacientesnãotabagistascomesclerosesistêmica(n=22) econtrolessaudáveis(n=30).

(r=0,41, p=0,03) e foram significativamente menores em tabagistas(p=0,03).Osníveisséricosde CC16eram signifi-cativamenteelevadosempacientes com extensão>20% na TCARemcomparaçãocompacientescomextensão<20%na TCAR(p=0,01)(fig.3).Alémdisso,osníveisdeCC16se correla-cionaramsignificativamentecomaextensãonaTCARquando apresentadascomo umavariável contínua(r=0,44,p=0,04) ecomaextensãodopadrão reticular(r=0,61,p<0,01). Em relação aos testes de função pulmonar, as concentrações

de CC16 estiveram negativamente associadas com a CPT

(r=-0,41,p=0,03)ecomoresultadodotestedecaminhadade seisminutos(r=-0,55,p<0,01).Nãoforamdetectadasoutras associac¸ões estatisticamente significativas entre os níveis

35

30

25

CC16 [ng/mL]

Extensão < 20% na TCAR Extensão > 20% na TCAR 20

15

10

5

0

Média

Figura3–Concentrac¸õesséricasdeCC16(ng/mL)em pacientescomesclerosesistêmicacomextensão<20% eextensão>20%naTCAR.

séricosdeCC16eresultadosclínicosoulaboratoriais,como mostradonatabela1.

Discussão

Opresenteestudocentra-senosníveisséricosdeCC16em pacientescomESemrelac¸ãoaosistemadeestadiamentoda DPI-ES.

Foi encontrada diferenc¸a estatisticamente significativa somentenosníveisséricosdeCC16entrepacientescomES nãotabagistasecontrolessaudáveis,masnãoquando paci-entestabagistasenãotabagistascomESforamanalisadosem

conjuntocomo umgrupo único. Issoéconsistentecom os

resultadosdeumestudoanterioremqueospacientescomES tinhamníveisséricosdeCC16maiselevados,masnão esta-tisticamentesignificativos,emcomparac¸ãocomosníveisde controlessaudáveis.11_No_entanto,_não_se_pode_excluir_uma

polarizac¸ãocausadapelo pequenotamanho daamostra de

tabagistasepelaamostratotalrelativamentepequenade indi-víduosincluídosnoestudo.

Além disso, não foi encontrada relação entre os níveis de CC16e a CV, como foi relatado poroutros trabalhos.11 A explicação mais provável para as discrepâncias está na diferençadetratamento(semtratamentovs.57,1% dos paci-entestratadoscomfármacosimunossupressoresnopresente

estudo). Esses resultados divergentes também podem ter

sidoinfluenciadospelopequenotamanhodaamostradeste

estudo.Noentanto,descobriu-sequeosníveisdeCC16eram significativamenteelevadosempacientescomEScommédia deextensãodadoença>20%naTCARemrelaçãoaos pacien-tescommédiadeextensãodadoença<20%equeosníveis séricosde CC16secorrelacionaramsignificativamente com

amédiadeextensãodadoenc¸anaTCARquandoanalisados

como variávelcontínua. Essasobservac¸õesestãodeacordo comoachadodequeosníveisséricosdeCC16empacientes

comEScomfibrosepulmonarforamnotavelmentemaiores

na doença pulmonarativavs. inativa.No estudode Hase-gawaetal.,odiagnósticodefibrosepulmonarativabaseou-se na presençade aspecto de vidro foscoou padrãoreticular naTCARdotóraxemudança>10%naCVoumudança>15%

naCDCOdentrodeumano. Comonossoestudobaseou-se

naabordagem decaso-controle,nãopoderíamosanalisara

atividadedaDPI-EScombasenosmesmoscritérios,masos

resultadosdesteestudotambémindicaramoCC16comoum

marcadordaDPI-ES,jáquefoimostradaumaassociac¸ãodos níveisséricosdeCC16comaextensãodopadrãoreticularna TCAR.Esseachadoédeparticularimportânciaclínica,jáque noestudodeGohetal.16 _a_mortalidade_em_pacientes_com ESestavafortementeligadanãosóàextensãodadoenc¸ana TCAR,mastambémàextensãodopadrãoreticular.Portanto,o nívelséricoelevadodeCC16podeserumcandidatoaum mar-cadordeprognósticonospacientescomES,especialmenteem nãotabagistas.

Alémdisso,nesteestudoobservou-seumadiminuic¸ãonas concentrac¸õesséricasdeCC16empacientestabagistas.Isso concordacomosresultadosdeestudosanteriores,que

mos-traramumareduc¸ãodeaproximadamente30%nosníveisde

(5)

Em suma, os resultados deste estudo indicam que concentrac¸õeselevadasdeCC16refletemograudelesão

pul-monarnodecorrerdaES,conformedestacadopelosistema

deestadiamentodeGohetal.16_Além_disso,_o_nível_de_CC16 poderiaserconsideradocomoumpotencialmarcadorsérico deprognósticonestegrupodepacientes,massão necessá-riosestudosprospectivoselongitudinaisparaqueissoseja confirmado.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

A pesquisa aquidescrita e a preparac¸ão deste manuscrito foram parcialmente financiadaspelo Ministério da Ciência eEducac¸ãoSuperiordaPolônia(concessãon◦_{N402.472.737).} GostaríamosdeagradeceràSra.EwaMazurkiewiczpela revi-sãodomanuscrito.

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e

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