Filogeografia e evolução de três espécies arbóreas amplamente distribuídas no Cerrado: Qualea grandiflora, Q. multiflora e Q. parviflora (vochysiaceae)

UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM GENÉTICA

Tese de Doutorado

F

E

T

E

A

A

D

C

: Q

, Q.

MULTIFLORA E

Q.

(V

)

Doutoranda: Renata Santiago de Oliveira Buzatti

Orientadora: Prof

. Dr

. Maria Bernadete Lovato

Coorientador: Prof. Dr. José Pires de Lemos-Filho

B

H

RENATA SANTIAGO DE OLIVEIRA BUZATTI

F

E

T

E

A

A

D

C

: Q

, Q.

MULTIFLORA E

Q.

(V

)

DEPTO. DE BIOLOGIA GERAL

INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS

BELO HORIZONTE

2015

Tese apresentada ao Programa de Pós-graduação em Genética do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como pré-requisito para obtenção do título de doutora em Genética.

Orientadora: Profª. Drª. Maria Bernadete Lovato

iii Agir, eis a inteligência verdadeira.

Serei o que quiser. Mas tenho que querer o que for.

O êxito está em ter êxito, e não em ter condições de êxito.

Condições de palácio tem qualquer terra larga,

mas onde estará o palácio se não o fizerem ali?

iv

v AGRADECIMENTOS

Agradeço à minha orientadora, Maria Bernadete Lovato, pela oportunidade de realizar o

doutorado no laboratório, pelo conhecimento compartilhado durante todo o processo e pela coleta

do material;

Agradeço ao meu coorientador, José Pires de Lemos-Filho, por todo o tempo dedicado ao

trabalho, pelas valiosas contribuições durante a escrita desta tese e por todo o esforço despendido

na realização das coletas;

Ao programa de pós graduação em Genética da UFMG que possibilitou a realização deste

doutorado;

Aos órgãos financiadores, CAPES pela concessão da minha bolsa e FAPEMIG pelo custeio do

projeto;

À todos do LBEM, LGEX, LGM e ao Juliano, pelos bons momentos compartilhados e pela

disponibilidade em ajudar;

Ao colegas do LDGH, por fazerem com que a nossa convivência não seja simplesmente por

dividirmos o espaço de trabalho. Vocês sempre foram muito atenciosos quando precisei e

conviver com cada um foi sempre muito agradável. Em especial agradeço ao Gil, à Moara, à

Marília e ao Thiago, pela ajuda com os softwares que às vezes travavam a minha caminhada;

Aos colegas do Genepop, com os quais compartilho ou compartilhei o dia-a-dia no laboratório

durante o mestrado e o doutorado: Helena, Rê Acácio, Rosangela, Jacque, Luciana, Mariana,

vi Andreia. Muito Obrigada por tudo! Em especial agradeço à Paula, por ter sido tão disponível em

ajudar com as dúvidas de inglês durante a escrita desta tese e por ter revisado os artigos ao final;

Às alunas de iniciação científica, que por algum período durante estes 4 anos se dedicaram para

que esse trabalho fosse concluído: Beatriz, Natália, Ana Emília e Aline;

À Priciane, à Moara e à Roxinha, que me acompanharam durante os 4 anos do doutorado,

agradeço imensamente pela amizade, pelas agradáveis e divertidas conversas, por dividir tanto as

angústias quanto os bons momentos e pela disponibilidade em ajudar: muito obrigada;

À querida Vilminha, por ter dividido comigo o seu conhecimento e ter pacientemente me dado

suporte durante o tempo no qual lecionei na UFMG e pelas palavras doces ditas em inúmeros

momentos difíceis;

Em especial, agradeço às pessoas que preenchem a minha vida e me estimulam a seguir: Meus

pais e Mateus, tão fundamentais, meus irmãos e meus sobrinhos queridos, Otávio, Lívia e Isabela.

A doce Flavinha, pelo carinho e pela boa vontade em ajudar sempre. A minha madrinha querida,

Tia Eneida. A todos os familiares que embora não citados, estão no meu coração. Aos amigos

vii SUMÁRIO

LISTA DE FIGURAS ...viii

LISTA DE TABELAS ...xi

APRESENTAÇÃO DA TESE ...1

RESUMO ...2

ABSTRACT ...4

I) INTRODUÇÃO I.1.OCERRADO I.1.1.CARACTERIZAÇÃO E ORIGEM ...6

I.1.2.MUDANÇAS CLIMÁTICAS DO QUATERNÁRIO E FILOGEOGRAFIA DO CERRADO ...8

I.1.3.OS ENCLAVES DE CERRADO NA AMAZÔNIA ...12

I.2.ESPÉCIES ESTUDADAS ...14

1.3.OBJETIVOS ...19

II) CAPÍTULOS CAPÍTULO 1 Artigo 1-Pleistocenic disjunctions between peripheral and central Cerrado: phylogeography and climatic niche modelling of two widely spread tree species ... 21

CAPÍTULO 2 Artigo 2 - Phylogeography of a tree species reveals Early/Middle Pleistocene connections between core Brazilian Cerrado and savannas of central Amazon ... 67

CAPÍTULO 3 Artigo 3 - Development of microsatellite markers in Qualea grandiflora (Vochysiaceae) and transferability to congeneric species, typical trees of the Brazilian savanna ... 105

III) CONCLUSÕES ...111

viii LISTA DE FIGURAS

INTRODUÇÃO

Figura 1 Qualea grandiflora com detalhes de flores e frutos ... 17

Figura 2Qualea multiflora com detalhes de flores e frutos ... 18

Figura 3 Qualea parviflora com detalhes de flores e frutos ... 18

ARTIGO 1

Figure 1. Geographic distribution of the cpDNA haplotypes across sampled area (A) and

median-joining network depicting the relationship between haplotypes in Q. multiflora based on

cpDNA regions (B). The map and network colors are equivalent and the size of the circles in (A)

and (B) are proportional to the number of individuals. Dashes in (B) represent the number of

mutations separating the haplotypes. Absence of dashes represents only one mutational step

between haplotypes (see Table S1 for details). ... 54

Figure 2. Geographic distribution of the cpDNA haplotypes across sampled area (A) and

median-joining network depicting the relationship between haplotypes in Q. parviflora based on

cpDNA regions (B). The map and network colors are equivalent and the size of the circles in (A)

and (B) are proportional to the number of individuals. Dashes in (B) represent the number of

mutations separating the haplotypes. Absence of dashes represents only one mutational step

between haplotypes (see Table S2 for details). ... 55

Figure 3. Phylogenetic relationship among haplotypes of congeneric species of Qualea.

Median-joining network showing the evolutionary relationship among the 36 haplotypes of Q. multifora

ix and Q. parviflora haplotypes. Dashes represent the number of mutation separating the haplotypes.

Absence of dashes represents only one mutational step between haplotypes. The size of each

circle is proportional to the number of individuals sampled. ... 56

Figure 4. Phylogenetic tree obtained from Bayesian-inference approach among 36 haplotypes of

Q. multiflora (initial capital letters M) and Q. parviflora (initial capital letters P) and two

haplotypes of Q. grandiflora (Qg). The time of split among the three species and among the

haplotypes of Q. multiflora e Q. parviflora are shown for two cpDNA mutation rates: one slow

(time scale in dark grey)and one fast (time scale in light grey), both in Ma. The bars in the tree

represent the time intervals between the smallest and the highest HPD 95% values based on slow

(dark grey) and fast (dark grey) rates recovered for bayesian skyline evolutionary model. The

bootstrap support are shown above the branches. ... 57

Figure 5. Result from population structure analyses of Q. multiflora populations and putative

barriers among them obtained with Monmonier's algorithm. ... 58

Figure 6. Predictions of suitable areas for the occurrence of tree species of Qualea multiflora and

Qualea parviflora under past and current environmental conditions: Last Interglacial (LIG. 120

ka); Last Glacial Maximum (LGM. 21 ka) and Current (0 ka pre-industrial). ... 59

ARTIGO 2

Figure 1. Median-joining network showing the relationships between haplotypes of Qualea

grandiflora based on concatenated cpDNA sequences (A) and geographic distribution of the

x size of the circles in (A) and (B) are proportional to the number of individuals. Dashes represent

the number of mutations separating the haplotypes. Absence of dashes represents only one

mutational step between haplotypes. ... 97

Figure 2. Median-joining network showing the relationships between haplotypes of Qualea

grandiflora based on nrDNA region (A) and geographic distribution of the nrDNA haplotypes

across sampled area (B). The network and map colors are equivalent and the size of the circles in

(A) and (B) are proportional to the number of individuals. Dashes represent the number of

mutations separating the haplotypes. Absence of dashes represents only one mutational step

between haplotypes. ... 98

Figure 3. Population Population structure of Qualea grandiflora obtained from Spatial Molecular

Variance Analysis (SAMOVA) and putative barriers obtained with Monmonier’s algorithm

xi LISTA DE TABELAS

ARTIGO 1

Table 1. Locations and diversity indices of 23 populations of Qualea multilora and 12 of Qualea

parviflora in the Brazilian savanna. ... 60

Table 2. Genetic diversity indices for the phylogeographic groups and all populations of Qualea

multiflora based on chloroplast DNA (cpDNA). ... 61

Table 3. Estimates of TMRCA (Ma) of the three sp (Qualea grandiflora, Q. multiflora and Q.

parviflora) and between two species (Q. multiflora and Q. parviflora) considering two

evolutionary models and slow (s: 1.01x10-3) and fast (f: 2.5x10-3) cpDNA mutation rates. ... 62

Table 4. Summary statistics and demographic and spatial expansion tests for Qualea parviflora

based on chloroplast DNA (cpDNA). ... 62

Table 5. Demographic and spatial analysis for phylogeographic groups and all populations of

Qualea multiflora based on chloroplast DNA (cpDNA). ... 63

Table S1. Variable sites, distribution and frequency of 18 haplotypes generated from aligned

sequences of two regions of chloroplast DNA (cpDNA- psbA-trnH, trnS-trnG) for Qualea

multiflora. ... 64

Table S2. Variable sites, distribution and frequency of 18 haplotypes generated from aligned

sequences of two regions of chloroplast DNA (cpDNA- psbA-trnH, trnS-trnG) for Qualea

parviflora. ... 65

Table S3. Fs statistics generated by Spatial Molecular Variance Analysis (SAMOVA) from

xii ARTIGO 2

Table 1. Locations of Qualea grandiflora populations in the Brazilian Cerrado biome, genetic

diversity indices and the distribution of the chloroplast DNA (cpDNA) and nuclear DNA

(nrDNA) haplotypes. ... 100

Table 2. Genetic diversity indices for the phylogeographic groups of Qualea grandiflora based

on chloroplast DNA (cpDNA) and for all populations based on cpDNA and nuclear DNA

(nrDNA) data. ... 102

Table 3. Mismatch distribution analysis (parameters of demographic and spatial expansion) for

phylogeographic groups of Qualea grandiflora based on chloroplast DNA (cpDNA) data and for

all population based on cpDNA and nuclear DNA (nrDNA) data. ... 103

Table S1 Fs statistics generated by Spatial Molecular Variance Analysis (SAMOVA) from

chloroplast DNA data for k (k = 2 until k = 9) groups. ... 104

ARTIGO 3

Table 1 Characterization of microsatellite loci in Qualea grandiflora, Q. multiflora and Q.

parviflora. ... 108

Table 2 Results of primer screening for ten microsatellite loci in two populations of Qualea

grandiflora. ... 108

Table 3 Results of primer screening for eight microsatellite loci in one populations of Qualea

1 APRESENTAÇÃO DA TESE

A tese é composta de uma introdução, subdividida em cinco tópicos, seguidos de três

capítulos redigidos no formato de artigo científico e ao final as conclusões. Os dois primeiros

artigos serão submetidos para publicação após a defesa desta tese e o terceiro já foi publicado. Os

tópicos introdutórios reúnem informações relevantes que embasam o conteúdo abordado nos

artigos apresentados, sendo apenas o primeiro tópico dividido em três subtópicos: (I.1) O Cerrado

abordando (I.1.1) Caracterização e origem, (I.1.2) Mudanças climáticas do Quaternário e

Filogeografia, (I.1.3) Os enclaves amazônicos; (I.2) Espécies estudadas; (I.4) Justificativa e (1.5)

Objetivos. Os capítulos foram intitulados: Artigo 1 - " Pleistocenic disjunctions between

peripheral and central Cerrado: phylogeography and climatic niche modelling of two widely

spread tree species"; Artigo 2 - " Phylogeography of a tree species reveals Early/Middle

Pleistocene connections between core Brazilian Cerrado and savannas of central Amazon";

Artigo 3 - "Development of microsatellite markers in Qualea grandiflora (Vochysiaceae) and

transferability to congeneric species, typical trees of the Brazilian savanna". Este terceiro trabalho

foi realizado com o intuito de fornecer novas ferramentas importantes para dar continuidade aos

estudos genéticos das três espécies de Qualea. Para Q. grandiflora um estudo de diversidade

genética utilizando estes marcadores e de morfologia de folhas está em andamento. Por fim são

2 RESUMO

O gênero Qualea é compreendido por aproximadamente 60 espécies, com uma

distribuição geográfica estendendo da América Central ao estado de Santa Catarina no Brasil.

Dentre estas espécies, Q. grandiflora, Q. multiflora e Q. parviflora são amplamente distribuídas

no Cerrado e destacam-se pela importância florística e fisionômica neste bioma. O Cerrado é a

maior e mais biodiversa savana tropical do mundo e está atualmente altamente ameaçada. Desse

modo, são prementes estudos que permitam melhorar a nossa compreensão dos fatores históricos

e evolutivos que moldaram esse bioma e a distribuição de sua diversidade. Os objetivos do

primeiro estudo foram investigar a história evolutiva de Q. multiflora e Q. parviflora através de

abordagem filogeográfica e de modelagem de nicho, buscando compreender as relações

filogenéticas e tempos de divergência no nível específico e de linhagens; avaliar a estruturação

genética em ambas as espécies e possíveis fatores que a moldaram e identificar possíveis

refúgios. Utilizando sequências plastidiais (cpDNA) foi encontrado que as mudanças climáticas

ocorridas durante o Pleistoceno podem ter desempenhado um importante papel na separação de

Q. multiflora e Q. parviflora e de suas linhagens. Uma clara estruturação foi obtida para ambas

espécies e a combinação dos resultados genéticos e de modelagem de nicho permitiram

identificar tanto um refúgio no core do bioma quanto outro pequenos refúgios não descritos

anteriormente. O segundo estudo objetivou, através de uma extensiva amostragem da espécies

arbórea mais comum do Cerrado Q. grandiflora, identificar possíveis conexões históricas entre o

core do bioma, as savanas Amazônicas e outras populações periféricas; verificar regiões de alta

diversidade que poderiam ter sido refúgio para a espécie; testar a hipótese de recolonização do sul

do Cerrado a partir de populações do norte após oscilações climáticas do Quaternário e estimar o

período no qual ocorreram conexões entre o core do Cerrado e os enclaves amazônicos. Para isto

3 diversidade na região central do core do bioma e expansão recente para ambos conjuntos de

dados. As relações filogenéticas obtidas com cpDNA revelaram conexões entre o core e as

savanas amazônicas. A primeira delas, localizada no centro do bioma, foi datada do início-meio

do Pleistoceno (1.8 - 0.74 Myr); a outra ocorreu através da Bolívia ligando sul do Cerrado e

sudeste da Amazônia e uma terceira, que sugere expansão a partir da região central do core do

bioma em direção à porção noroeste, em uma área de transição entre o Cerrado e a Floresta

Amazônica. O terceiro estudo foi realizado com o intuito de isolar marcadores microssatélites

para Q. grandiflora e caracterizá-los tanto para esta espécie quanto para Q. multiflora e Q.

parviflora. Esses marcadores apresentaram elevado número de alelos por locus e altos níveis de

4 ABSTRACT

The Qualea genus is comprised of approximately 60 species, with a geographic

distribution ranging from Central America to the state of Santa Catarina in Brazil. Among these

species, Q. grandiflora, Q. multiflora and Q. parviflora are widely distributed in the Cerrado and

stand out for their floristic and physiognomic importance in this biome. The Cerrado is the largest

and most biologically diverse tropical savanna in the world, and is currently highly threatened.

Thus the urgent need for studies that can improve our understanding of the historical and

evolutionary factors that shaped this biome and the distribution of its diversity. The aim of the

first study were to investigate the evolutionary history of Q. multiflora and Q. parviflora through

phylogeographic approach and niche modelling, trying to understand the phylogenetic

relationships and divergence times at both the species and lineage levels, to evaluate the genetic

structuring of both species and factors that possibly shaped it, and to identify possible refugia.

Using plastid sequences (cpDNA) was found that climatic changes during the Pleistocene may

have played an important role in the separation of Q. multiflora and Q. parviflora and their

lineages. A clear structuring was found for both species and the combination of genetic results

and niche modeling have identified a refugium in the core of the biome and other small refugia

not previously described. Our second study aimed, through extensive sampling of the most

common tree species in the Cerrado (Q. grandiflora), to identify possible historical connections

between the core of this biome, the Amazonian savannas and other peripheral populations; to

check for high diversity regions that could have been refugium for the species; to test the

hypothesis of recolonization of the southern Cerrado from northern populations after climatic

oscillations in the Quaternary, and to estimate the period in which there could have been

5 and nuclear sequences (nrDNA), for which found a high level of diversity in the central core of

the biome and a recent expansion was found for both datasets. The phylogenetic relationships

obtained with cpDNA revealed connections between the core and the Amazonian savannas. The

first one, located at the center of the biome, was dated from the Early-Middle Pleistocene (1.8 -

0.74 Ma); the other one, occurred through Bolivia, linking the southern Cerrado and southeastern

Amazon; and a third, which suggests expansion from the central core of the biome towards the

northwest portion, in an area of transition between the Cerrado and the Amazon rainforest. The

third study was carried out in order to isolate microsatellite markers for Q. grandiflora and

characterize them for this species as well for Q. multiflora and Q. parviflora. These markers

showed a high number of alleles per locus and high levels of heterozygosity, and they will be

6 I.INTRODUÇÃO

I.1.OCERRADO

I.1.1. CARACTERIZAÇÃO E ORIGEM

O Cerrado, savana tropical mais extensa e biodiversa do mundo, pode ser encontrado em

cerca de 22% do território brasileiro e em pequenas áreas da Bolívia e do Paraguai, ocupando

aproximadamente dois milhões de Km2 (Oliveira-Filho e Ratter 2002, Silva e Bates 2002). No

Brasil sua distribuição estende-se do sul da Floresta Amazônica até o norte do estado do Paraná,

sendo bastante coincidente com o Platô do Brasil Central (Oliveira-Filho e Ratter 2002). Pode ser

encontrado ainda como pequenas manchas disjuntas no interior da Floresta Amazônica (Eiten

1972). Esta distribuição entende-se por uma amplitude latitudinal de 3°S a 24°S, com altitudes

variando do nível do mar à aproximadamente 1.800 m (Oliveira-Filho e Ratter 2002). O bioma

forma, junto à Caatinga (nordeste do Brasil) e ao Chaco (Paraguai, Bolívia e Argentina), um

complexo corredor de vegetação aberta (Pennington et al. 2006). Este corredor é delimitado por

dois dos principais biomas de florestas tropicais da América do Sul: a Amazônia, ao nordeste, e a

Floresta Atlântica, ao sudeste.

No Cerrado ocorrem seis importantes bacias hidrográficas brasileiras: Amazônica,

Araguaia-Tocantins, Paraná-Paraguai, São Francisco, Atlântico Norte-Nordeste e Atlântico Leste

(Oliveira-Filho e Lima 2002). O solo é, em sua maioria, distrófico, bem drenado, profundo,

ácido, pobre em nutrientes e altamente saturado em alumínio e ferro, além de possuir cálcio e

magnésio (Furley e Ratter 1988, Scariot et al. 2005). O clima é caracterizado por estações secas

bem longas (abril a setembro), com precipitação em torno de 800 a 2000 mm e temperatura

7 topológicas e climáticas caracteriza o Cerrado e define variações fitofisionômicas de sua

vegetação. De acordo com Eiten (1972) e Silva e Bates (2002) são reconhecidos cinco tipos

estruturais principais de Cerrado: Cerradão, de maior densidade vegetacional, com árvores que

atingem até aproximadamente 15 m e formam um dossel contínuo; Cerrado stricto sensu, que

apresenta arbustos e árvores espaçados, com 5 a 8 m de altura, sem formação de dossel contínuo;

Campo Cerrado, constituído por um Cerrado aberto com poucas árvores de até 6 m; Campo Sujo,

composto por estrato gramíneo com arbustos de até 3 m distantes uns dos outros; e Campo

Limpo, onde predominam espécies herbáceas e ocorrem poucos ou nenhum arbusto ou árvore. As

diferenças da vegetação têm sido atribuídas principalmente à fertilidade e drenagem do solo, à

precipitação sazonal, aos regimes de fogo e ainda às oscilações climáticas do período Quaternário

(Eiten 1972, Furley e Ratter 1988, Oliveira-Filho e Ratter 1995, Furley 1999).

Considerado um dos mais importantes hotspots para a preservação da biodiversidade do

mundo, o Cerrado abriga aproximadamente 10.000 espécies de plantas, 161 espécies de

mamíferos, 837 espécies de aves, 120 espécies de répteis e 150 espécies de anfíbios (Myers et al.

2000). Entretanto, essa diversidade está ameaçada por ser pouco estudada e pelo crescimento das

atividades humanas. Estimativas apontam que mais da metade da cobertura vegetal nativa do

bioma já foi substituída por cultivos agrícolas e áreas de pastagem, com as taxas de

desmatamento podendo chegar a três milhões de hectares por ano (Machado 2004, Klink e

Machado 2005). O Cerrado, mesmo sendo um dos biomas mais ameaçados do continente

sul-americano, possui pouquíssimas áreas de preservação, que totalizam apenas 2,2% de seus

remanescentes (Myers et al. 2000, Klink e Machado 2005).

As poucas evidências fósseis documentadas indicam a presença de gramíneas típicas de

savana na América do Sul a partir do Terciário, sendo que durante o Neogeno, aproximadamente

8 passando a ocorrer em larga-escala (van der Hammen 1983, Gottsberger e

Silberbauer-Gottsberger 2006). Turcheto-Zolet et al. (2013), revisando estudos filogeográficos estimou que

43% da divergência de linhagens sul americanas ocorreu durante o Plioceno e/ou Mioceno e

57% ocorreu durante o Pleistoceno, sendo as oscilações climáticas deste período sugeridas como

fator determinante nesse processo de diversificação. Estimativas de tempo baseadas em estudos

filogenéticos sugerem que o início de sua diversificação ocorreu a menos que 10 milhões de anos,

sendo a maior parte desta diversificação coincidente com a origem de gramíneas do tipo C4 (4

milhões de anos ou menos - Jacobs et al. 1999, Simon et al. 2009). As gramíneas do tipo C4

diferenciam-se das plantas ancestrais (tipo C3) por serem bem adaptadas a ambientes quentes e

com escassez de CO2, tendo grande capacidade fotossintética sob estas condições (Ehleringer e

Björkman 1977). Durante períodos com elevadas quantidades de luz, calor e umidade, as

gramíneas C4 rapidamente acumulam biomassa e ao serem submetidas a extensos períodos secos

tornam-se inflamáveis (Scholes e Archer 1997, Bond e Keeley 2005). O fogo é um importante

fator na manutenção das áreas abertas características do Cerrado e várias espécies deste bioma

são bem adaptadas a ele (Bond e Keeley 2005, Gottsberger e Silberbauer-Gottsberger 2006). A

riqueza de espécies encontradas na América do Sul está fortemente ligada à eventos antigos como

vulcanismo, soerguimento de montanhas, mudança no curso de rios e flutuações climáticas do

Quaternário (Ratter et al. 1997, Rull 2011 e Turchetto-Zolet et al. 2013).

I.1.2.MUDANÇAS CLIMÁTICAS DO QUATERNÁRIO E FILOGEOGRAFIA DO CERRADO

O Quaternário é o período geológico iniciado há 2,58 milhões de anos (Ma) e se divide

em Pleistoceno, que terminou há 12.000 anos e Holoceno, período atual iniciado no fim do

Pleistoceno (Gibbard et al. 2010). Períodos glaciais e interglaciais alteraram a paisagem e

9 1996). De acordo com Hewitt (1996), no hemisfério sul os períodos glaciais foram menos

extensos que no norte, mas ainda assim ocorreram consideráveis alterações climáticas. As

mudanças paleoambientais na América tropical ainda são alvo de muitas discussões,

principalmente no que se refere à distribuição das formações vegetacionais durante o Quaternário

(Oliveira-Filho e Ratter 2002). Estudos palinologia, padrões de distribuição das espécies e

modelagem de nicho tem apontado que, em períodos nos quais o clima sul-americano tornou-se

mais seco e frio, as florestas úmidas perderam área em favor da expansão de formações abertas

(Behling e Lichte 1997, Behling 1998, Silva e Bates 2002, Werneck et al. 2012. Em relação à

dinâmica vegetacional do Cerrado, evidências palinológicas apontam que durante períodos

glaciais, em épocas nas quais a umidade e temperatura eram mais baixas, ocorreu uma expansão

deste bioma a leste, em direção ao Oceano Atlântico e ao norte (Behling e Lichte 1997, Behling

1998). Em contrapartida, a porção sul do bioma, ao sul de 20°S, teria sido substituída por

gramíneas subtropicais (Behling e Lichte 1997, Behling 1998). Essa dinâmica da distribuição do

Cerrado foi evidenciada em um estudo de modelagem de nichos, no qual Werneck et al. 2012

simularam ambientes adequados para a ocupação de espécies da ordem Squamata durante o

Último Interglacial (LIG - 120.000 anos atrás) e o Último Glacial Máximo (LGM - 21.000 anos

atrás) . Neste estudo os resultados apontaram área de estabilidade climática no centro-norte do

bioma, que seriam possível refúgio durante as glaciações. Essa área estável está associada às

áreas de alta diversidade de espécies do grupo no Cerrado (Werneck et al. 2012).

A abordagem filogeográfica tem sido utilizada no intuito investigar a distribuição das

espécies/populações num contexto geográfico e temporal, auxiliando na busca de respostas para

inúmeras questões evolutivas. A filogeografia objetiva relacionar linhagens genealógicas à

distribuição geográfica, baseando-se principalmente no estudo de genomas citoplasmáticos

10 história evolutiva das espécies, identificando eventos como expansões e retrações populacionais,

refúgios, rotas migratórias pós-glaciais, centros de diversidade, eventos de divergência,

hibridização e introgressão entre linhagens divergentes e zonas de contato secundário das

populações (Comes e Kadereit 1998, Hewitt 2001, Richardson et al. 2001, Ramos et al. 2007,

Beheregaray 2008, Ramos et al. 2009, Novaes et al. 2010). Beheregaray (2008) relatou, em uma

revisão que avaliou os 20 primeiros anos de existência da filogeografia (de 1987 a 2006), um

grande crescimento desta área de estudo, com aumento expressivo das publicações a partir de

1996. Classificando as publicações de acordo com a origem continental do organismo avaliado, a

Europa destaca-se como a mais estudada (31%), seguida da América do norte (30%).

Beheregaray (2008) evidencia que, embora a América do Sul seja considerada o continente mais

biodiverso da Terra, apenas 6,3% dos trabalhos avaliaram a dinâmica evolutiva de suas espécies.

Dentre estes, raros incluem espécies arbóreas do Cerrado (Collevatti et al. 2003, Ramos et al.

2007, Novaes et al. 2010, Collevatti et al. 2012, Novaes et al. 2013, Ribeiro et al. 2014).

Embora escassos, os resultados de estudos filogeográficos com espécies de plantas do

Cerrado tem mostrado a presença de uma clara estruturação dos haplótipos, atribuída

principalmente às mudanças climáticas do passado. Ramos et al. (2007) sugeriram que durante o

LGM as populações de Hymenaea stigonocarpa atualmente existentes no porção sul do Cerrado

se extinguiram. Somente após o restabelecimento de clima mais ameno esta região foi

recolonizada por linhagens mantidas no norte. Tais resultados corroboraram os encontrados para

a espécie do Cerrado Caryocar brasiliense (Collevatti et al. 2003). Para H. stigonocarpa, Ramos

et al. (2007) encontraram ainda uma disjunção longitudinal entre as populações estudadas. Tais

populações formaram três áreas geneticamente distintas, sendo uma delas composta por Bahia e

leste de Minas Gerais, outra pela porção oeste de Minas e a terceira por Goiás, Tocantins e São

11 porção centro-norte do estados de Minas Gerais e Goiás. Nestas regiões ocorreram 83% dos

haplótipos presentes em todas as áreas amostradas. Assim, sugeriu-se que a área é provavelmente

a mais antiga ocupada por Plathymenia reticulada, sendo um possível centro de diversidade da

espécie. Maior diversidade nas populações do norte de Minas Gerais e Goiás também foi

encontrada por Ramos et al. (2007). Estes resultados corroboram os descritos por Weneck et al.

(2012) no estudo de modelagem citado anteriormente, no qual a região central do core do

Cerrado foi apontada como possível refúgio por apresentar maior estabilidade durante as

oscilações climáticas no LIG e LGM. Collevatti e colaboradores (2012) avaliaram a

filogeografia de Tibuichina papyrus, uma espécie endêmica de campos rupestres. Este estudo

apresentou uma distribuição disjunta da espécie, proposta como provável reflexo de uma

contração em épocas frias e secas de populações que anteriormente eram amplamente

distribuídas. Em um estudo recente Novaes et al. (2013) encontraram uma estruturação

filogeográfica para a espécie arbórea de ampla distribuição Dalbergia miscolobim concordante

com províncias fitogeográficas descritas por Ratter et al. (2003) . Os resultados de Ratter et al.

(2003) foram obtidos a partir de dados de ocorrência de espécies de plantas e demonstraram que

o Cerrado, incluindo o core e as regiões disjuntas, delimitam grupos bem distintos. O core é

dividido em grupos oeste e leste, sendo este último subdividido em três grupos latitudinalmente

dispostos em norte, centro e sul (Ratter et al. 2003). Este padrão fitogeográfico foi atribuído

principalmente à estações secas e médias de temperatura, fertilidade e drenagem do solo, altitude

e oscilações climática do passado (Ratter et al. 2003). Além dos trabalhos de Ramos et al. (2007)

e Novaes et al. (2013), Ribeiro et al. (2014) também descreveram um padrão filogeográfico

longitudinal para Annona coriacea, dividindo o core do Cerrado em leste e oeste.

12 Fitofisionomias características do Cerrado podem ser observadas de forma disjunta tanto

em regiões limítrofes do bioma como em algumas áreas dentro da Floresta Amazônica (Eiten

1972). Estes enclaves de Cerrado, denominados Savanas Amazônicas, ocorrem nos estados do

Amazonas, Amapá, Pará, Rondônia e Roraima (Prance 1996, Ratter et al. 2003, IBGE 2004).

Eles possuem solo pobre e abrigam baixa diversidade em relação ao core do Cerrado, com

exceção de Alter do Chão (Pará) e um sítio localizado em Humaitá (Amazonas) (Ratter et al.

2003). Duas hipóteses biogeográficas distintas são propostas na tentativa de explicar a existência

dessas áreas disjuntas de Cerrado: a hipótese dispersiva e a hipótese vicariante. A hipótese

dispersiva se adequa principalmente às espécies com capacidade de dispersão a longas distâncias,

sendo a hipótese vicariante, de acordo com muitos estudos, a mais aplicável, uma vez que grande

similaridade biótica é observada entre enclaves e core do Cerrado (Sarmiento 1983, Silva e Bates

2002).

Segundo a hipótese vicariante, as Savanas Amazônicas podem representar remanescentes

de áreas alcançadas durante possíveis expansões da savana ocorridas no passado e que persistem

atualmente somente em regiões com características adequadas (Haffer 1967, Sarmiento 1983,

Prance 1996, Silva e Bates 2002). De acordo com Haffer (1969) durante Quaternário, em

períodos nos quais o clima foi extremamente frio e seco, grandes extensões da Floresta

Amazônica foram substituídas por savana ou outro tipo de vegetação similar. Desse modo

pequenos fragmentos de florestas teriam sido circundados por grandes extensões de vegetação

aberta. Entretanto, esta hipótese vicariante inicialmente aceita de forma ampla, denominada

Hipótese de Refúgios do Pleistoceno (PRH), tem sido alvo de muitas críticas e debates.

Colinvaux (1989) afirma que as conclusões que levaram à proposição desta hipótese não foram

baseadas em quaisquer dados paleopalinológicos. De acordo com Colinvaux et al. (2000) e Bush

13 modificações durante o Pleistoceno e a partir destes registros é improvável que a hipótese de

Haffer (1969) esteja correta. Por outro lado, Haffer e Prance (2001) e van der Hammen e

Hooghiemstra (2000) arguiram que os dados de pólen são insuficientes refutar a PRH para a

Amazônia como um todo, uma vez que foram obtidos a partir de pequenas áreas. Van der

Hammen e Hooghiemstra (2000) sugerem ainda que o curto espaço de tempo que os registros de

pólen representam (62.000 anos) não são suficientes para sugerir que refúgios jamais existiram.

Poucas evidências palinológicas corroboram a ideia de grande expansão do Cerrado na Amazônia

durante o LGM e no final do Pleistoceno (os últimos 18.000 – 50.000 anos) (Colinvaux et al.

1996, Colinvaux et al. 2001, Kastner e Goñi 2003), sendo assim não existem evidências que

apontam que esta expansão tenha ocorrido ou não durante períodos iniciais e intermediários do

Pleistoceno (Wüster et al. 2005).

Independente das controvérsias sobre a existência ou não de áreas mais extensas de

vegetação aberta substituindo áreas de Floresta Amazônica durante o Pleitoceno, existe a questão

das conexões florísticas entre os enclaves de Cerrado na Amazônia e o core do bioma. Haffer

(1967, 1974) e Webb (1991) propuseram três principais conexões entre o norte e o sul das regiões

savânicas: (1) Corredor Andino, ligando o bloco sul da savana diretamente com Lhanos e

Roraima, através dos Andes; (2) Corredor Central, que liga o bloco sul com alguns fragmentos

localizados no norte da Amazônia e (3) Corredor da Costa, que conecta os blocos do sul e norte

através de fragmentos de savana localizados próximo à costa Atlântica. A presença do corredor

Andino e do corredor da costa foi evidenciada pela padrão de distribuição de aves características

das savanas da América do Sul (Silva e Bates 2002). Estudos de paleomodelagem do Cerrado

realizado por Werneck et al. (2012) corroboraram a existência destes mesmos corredores e

14 Interglacial (LIG – cerca de 120.000 anos atrás). Estes três estudos não encontraram quaisquer

evidências de uma conexão através do centro, ou corredor central.

I.2.ESPÉCIES ESTUDADAS

Para os estudos desenvolvidos nesta tese foram selecionadas espécies características,

endêmicas e amplamente distribuídas no Cerrado, todas pertencentes ao gênero Qualea

(Vochysiacea): Q. grandiflora, Q. multiflora e Q. parviflora (Figuras 1, 2 e 3, respectivamente).

A família Vochysiaceae abrange seis gêneros e cerca de 200 espécies exclusivas de regiões

tropicais, distribuídas na região Guiano-Amazônica e no Planalto Central brasileiro e Floresta

Atlântica (Vianna 2006). As plantas pertencentes a essa família são acumuladoras de alumínio e

habitam solos pobres em minerais e com baixo pH (Shimizu 2009). O gênero Qualea, descrito

por Aublet em 1775, possui cerca de 60 espécies e é quase exclusivo de áreas tropicais ou

subtropicais da América do Sul, podendo ser encontrado da América Central ao estado de Santa

Catarina no Brasil, no Paraguai e na Bolívia (Stafleu 1953, species link). A maioria das espécies

ocorre na zona equatorial, predominantemente nas áreas montanhosas, em regiões de savanas do

escudo das Guianas (Lisboa 2000). Existem espécies de florestas pluviais e áreas alagáveis como

o Pantanal mato-grossense, embora em menor número (Lisboa 2000). As espécies possuem

folhas opostas, raramente verticiladas, pecioladas, com estípulas geralmente glandulosas, lâminas

simples e inteiras. As flores possuem uma única pétala e o fruto, capsular, libera várias sementes

aladas (Lisboa 2000). Q. grandiflora, Q. parviflora e Q. multiflora apresentam grande

importância florística e fisionômica no Cerrado, ocorrendo em mais que 50% dos sítios

amostrados do bioma (Ratter et al. 2003).

Q. grandiflora é popularmente conhecida como pau-terra, pau-terra-do-Cerrado ou ariauá

15 apresentando fissuras longitudinais, profundas e descamantes nos ramos terminais (Lorenzi 1992,

Shimizu 2009). As flores apresentam pétala amarela, a polinização é feita por mariposas e a

dispersão pelo vento (Shimizu 2009). Qualea grandiflora é a espécie lenhosa mais frequente no

Cerrado, presente em 85% desse bioma (Ratter et al. 2003). Possui registros de ocorrência em 16

estados brasileiros, incluindo aqueles da região norte que apresentam áreas disjuntas do Cerrado

(Acre, Amazonas, Bahia, Ceará, Distrito Federal, Goiás, Maranhão, Mato Grosso do Sul, Mato

Grosso, Minas Gerais, Pará, Piauí, Paraná, São Paulo, Tocantins, Rondônia) e também no

Paraguai, Bolívia e Peru (Shimizu 2009, Species link). Apresenta propriedades medicinais,

atuando no combate a úlceras gástricas, como analgésico e anticonvulsivo (Gaspi et al. 2006,

Hiruma-Lima et al. 2006).

Qualea multiflora, popularmente conhecida como pau-terra-liso ou pau-terra-do-campo,

atinge de 4 a 6 m de altura (Lorenzi 1992), possui flores brancas com linhas amarelas e manchas

rosadas, é polinizada por abelhas e dispersada pelo vento (Shimizu 2009). Pode ser diferenciada

das outras espécies do gênero por apresentar casca com fissuras horizontais e aspecto

aparentemente liso (Shimizu 2009). Esta espécie ocorre em aproximadamente 51% dos sítios

amostrados no Cerrado (Ratter et al. 2003) e possui registros de ocorrência no Distrito Federal,

Espírito Santo, Goiás, Maranhão, Minas Gerais, Mato Grosso do Sul, Mato Grosso, Pará, Paraná,

São Paulo, Tocantins, norte do Paraguai, leste da Bolívia e leste do Peru (Shimizu 2009, Species

link). De acordo com Souza et al. (1984), esta espécie apresenta compostos capazes de eliminar

tanto ovos quanto formas adultas de Schistosoma mansoni.

Qualea parviflora ou pau-terrinha, como é popularmente conhecida, é uma espécie de

altura entre 6-10 m (Lorenzi 1992), que apresenta caule com fissuras verticais, bem marcadas,

pequenas flores com pétala de cor violácea (Shimizu 2009). Sua polinização é feita por abelhas e

16 Cerrado, ocorrendo em 78% dos sítios amostrados do bioma (Ratter et al. 2003). A espécie foi

registrada no Amazonas, Bahia, Ceará, Distrito Federal, Goiás, Maranhão, Minas Gerais, Mato

Grosso do Sul, Pará, São Paulo, Tocantins, Bolívia e norte do Paraguai (Shimizu 2009, Species

link). Em estudos farmacológicos essa espécie demonstrou ter propriedades séptica,

anti-inflamatória, cicatrizante e adstringente (Silva et al. 2000).

A ampla distribuição destas três espécies as torna muito informativas em estudos

filogeográficos, auxiliando na compreensão de como processos históricos interferiram na

distribuição geográfica e na diversidade genética da flora do Cerrado. Tal conhecimento pode

ajudar, por exemplo, a prever possíveis respostas da vegetação à fragmentação e às atuais

mudanças climáticas globais e assim fornecer informações úteis para planos de manejo,

recuperação e/ou conservação mais efetivos do bioma. Apesar de terem sido realizados estudos

filogeográficos com algumas espécies de árvores nativas do Cerrado, o conhecimento de como as

flutuações climáticas passadas (como as que ocorreram no Pleistoceno) influenciaram os padrões

de variação genética deste bioma somente será alcançado quando um número maior de espécies

for analisado. O estudo realizado com Q. grandiflora, espécie arbórea mais representativa do

Cerrado e encontrada tanto no core do bioma quanto nas Savanas Amazônicas, trará importantes

contribuições sobre as controversas questões que envolvem a ocorrência dos enclaves de Cerrado

na Floresta Amazônica. A comparação destes três estudos genéticos, junto à paleomodelagem

climática realizada para Q. multiflora e Q. parviflora auxiliará tanto na verificação da ocorrência

de centros de diversidade genética e dos locais de linhagens raras já documentados para outras

17 Figura 1 – Qualea grandiflora com detalhes de flores e frutos

18 Figura 2 – Qualea multiflora com detalhes de flores e frutos

Figura 3 – Qualea parviflora com detalhes de flores e frutos

Harri Lorenzi Harri Lorenzi

Luciana Resende

19 I.3.OBJETIVOS

O presente trabalho analisou a filogeografia e a diversidade genética, isolou e caracterizou

marcadores moleculares de três espécies de Qualea (Vochysiaceae) amplamente distribuídas no

Cerrado, visando contribuir para o entendimento da evolução da flora do Cerrado e fornecer

subsídios para a sua conservação. Os seguintes objetivos foram propostos:

1) Investigar comparativamente a diversidade genética e estrutura filogeográfica de três

espécies de Qualea, Q. multiflora, Q. parviflora e Q. grandiflora;

2) Identificar, com base tanto no estudo filogeográfico quanto em modelagem de nicho, a

localização de possíveis refúgios de Q. multiflora e Q. parviflora, sob a hipótese de que por

apresentarem similares requerimentos ecológicos, áreas de alta diversidade genética e de

adequabilidade de nicho tendem a ser bastante coincidentes;

3) Identificar possíveis rotas de colonização de regiões que sofreram retrações

demográficas;

4) Testar a hipótese de divergência recente de linhagens de Q. multiflora e Q. parviflora,;

5) Investigar a demografia histórica das espécies;

6) Contribuir para o entendimento dos eventos que proporcionaram a ocorrência de

enclaves de Cerrado na Floresta Amazônica, identificando possíveis conexões entre o core do

20 7) Isolar e caracterizar marcadores microssatélites para Q. grandiflora e verificar a

aplicabilidade destes marcadores para Q. multiflora e Q. parviflora, fornecendo novas

21 II)CAPÍTULOS

CAPÍTULO 1

Artigo 1:

PLEISTOCENIC DISJUNCTIONS BETWEEN PERIPHERAL AND CENTRAL CERRADO:

PHYLOGEOGRAPHY AND CLIMATIC NICHE MODELLING OF TWO WIDELY SPREAD TREE

SPECIES

22 ORIGINAL ARTICLE

Pleistocenic disjunctions between peripheral and central Cerrado: phylogeography and

climatic niche modelling of two widely spread tree species

Renata Santiago de Oliveira Buzatti1, José Pires Lemos-Filho2, Marcelo Leonardo Bueno2,

Maria Bernadete Lovato1*

1

Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Biologia Geral, Instituto de

Ciências Biológicas, Belo Horizonte, Brazil

2

Universidade Federal de Minas Gerais, Departamento de Botânica, Instituto de Ciências

Biológicas, Belo Horizonte, Brazil

*

corresponding author: Maria Bernadete Lovato, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo

23 ABSTRACT

Aim Our aim was to investigate the evolutionary history of two species of the genus Qualea

using phylogeographic and niche modelling approaches in order to clarify species and

lineage-level relationships, divergence times and to identify putative refugia.

Location Brazilian Cerrado

Methods Two cpDNA regions (trnH-psbA and trnS-trnG) were sequenced for 175

individuals of Qualea multiflora and 75 individuals of Q. parviflora, sampled from 23 and 12

populations, respectively. Population genetic diversity, haplotype relationship using

Bayesian-inference and median-joining algorithm, structuring, putative barriers to gene flow

with Monmonier’s algorithm, and demographic history were verified. These species and

samples of Q. grandiflora were used to estimate the divergence time among species and

lineages using Bayesian approach. In addition, models to infer the palaeodistribution of Q.

multiflora and Q. parviflora in the Last Interglacial (LIG) and Last Glacial Maximum (LGM)

were produced via maximum entropy niche modelling methods.

Results A total of 18 haplotypes were found for each species and though none of them are

shared, some were genetically close. The central core area showed exclusive haplotypes and

high diversity, which decreased continuously from north to south and small areas not

documented in previous studies showed high diversity for Q. multiflora and Q. parviflora,

corroborating the results found with niche modelling. The mismatch distribution tests detected

demographic and spatial expansion for both species. Time to the Most Recent Common

Ancestor (TMRCA) among Q. grandiflora, Q. multiflora and Q. parviflora was estimated to

11.01 and 4.42 Ma whereas the TMRCA of Q. multiflora and Q. parviflora was dated to 3.5 -

1.4 Ma.

Main conclusions This study reveals ancient speciation of Q. grandiflora and more recent

24 changes, including Pleistocene climatic oscillations and the emergence of geographical

barriers may have played an important role in the differentiation process of these species and

their lineages. A clear structuring in both species was found. The combination of

phylogeographic, demographic history and niche modelling approaches points toward several

temporal disjunctions in the distribution of the species, which could have given rise to several

refugia during glacial times: a large one in the central Cerrado and other smaller ones,

geographically distant from the central core.

Keywords South America, Cerrado, evolution, biogeography, Vochysiaceae, Qualea

25 INTRODUCTION

The savannas are among the major biomes of the world, covering around 33 million

km2 of the Earth (Ramankutty & Foley, 1999; Sankaran et al., 2005). Among the tropical

savannas, the Cerrado stands out as the largest and richest one, and covers almost two million

km2 of Brazilian territory and parts of Bolivia and Paraguay (Simon et al., 2009). The Cerrado

harbors around 16,000 species, of which approximately 34% are endemic to the biome (Klink

& Machado, 2005), and the number of plant species is especially high (Klink & Machado,

2005). This biome is considered a conservation hotspot due its high diversity, endemism and

degree of threat (Myers et al., 2000). Despite its importance, more than 50% of its natural

vegetation has already been substituted by agriculture and cultivated pasture, with only 2.2%

of its extension under legal protection (Machado, 2004, Klink & Machado, 2005).

The Cerrado became established as a vegetation type during the Neogene (25 - 2 Ma)

(Gottsberger & Silberbauer-Gottsberger, 2006) and fully developed only after the rise of

flammable C4 grasslands about 4 Ma (Jacobs et al., 1999). The C4 grasslands leverage the

high availability of light during the hot, humid summers to rapidly accumulate biomass, and

become flammable during the long dry winters (Scholes & Archer, 1997; Bond & Keeley,

2005). Several species of flora endemic to the Cerrado are well adapted to fire (Gottsberger &

Silberbauer-Gottsberger, 2006), which is an important factor in maintaining the open areas

characteristic of the biome (Bond & Kelley, 2005). In a study about the Cerrado flora

evolution, Simon et al. (2009) highlighted the importance of fire and the expansion of

flammable grass in the diversification of this biome.

The timing and causes of diversification of Neotropical biomes has been the focus of

intense debate (Garzón-Orduña et al., 2014). Molecular phylogenetic studies dating

divergence times have showed that most of the lineage diversification occurred during the

26 rearrangements, such as the Andean uplift and shifts on the course of rivers are the main

drivers of diversification in Amazonia (Antonelli et al., 2009; Hoorn et al., 2010; Rull, 2011).

However, several authors have argued that estimates of diversification of lineages based on

crown group ages of major clades provide an overestimate of the timing of speciation (Rull,

2011; Ribas et al., 2012; Garzón-Orduña et al., 2014). Approaches based on diversification

time of sister species provide evidences about age of extant species (Garzón-Orduña et al.,

2014). Phylogeographic studies involving sister species can provide both time of

diversification between sister species and between intra-specific lineages. A recent review of

phylogeographic studies in South America (Turchetto-Zolet, 2013) revealed that 43% of

species lineage splits occurred during the Pliocene and/or Miocene, but for most of the species

(57%) the lineage divergences were dated to the Middle-Pleistocene, suggesting that climatic

fluctuations during the Pleistocene drove their diversification. The periods of diversification

of the Cerrado biota have not been very well studied so far. Simon et al. (2009), based on

time-calibrated phylogenies, suggested that the diversification of Cerrado plants started less

than 10 Ma, with most of it occurring approximately four Ma or later (Simon et al., 2009).

Pleistocene climatic fluctuations promoted changes in landscape occupation in tropical

South America. Based on palynological, geochemical and stable oxygen isotope data, Anhuf

et al. (2006) concluded that during the Last Glacial Maxima (LGM), the Amazon humid

forest area was reduced by 46% of its current extension. Using pollen records from south and

southeast Brazil, Behling (2002) suggested that during the LGM tropical semidecidous forest

and Cerrado were replaced by subtropical grassland that extended northwards over 750 km,

due to drier and colder climate in this area. Climatic modelling studies suggested a great

reduction of Cerrado area during the LGM and pointed toward the existence of a large

refugium in the center-north of the Cerrado (Werneck et al., 2012). This modelling study is

27 documented the existence of regions of high diversity in the central Cerrado core area

(Novaes et al., 2010, 2013), evidencing that this area was probably more stable during

Quaternary climatic fluctuations.

In this study, we assessed the geographic distribution of genealogical lineages of two

sister species, Qualea multiflora and Q. parviflora. The genus Qualea (Vochysiaceae family)

is composed of roughly 60 species that occur in Central and South America (Lisboa, 2000).

The studied species are typical components of the Cerrado, occurring respectively in 78% and

51% of the 376 sampled areas in a wide survey by Ratter et al. (2003). Their geographic

distribution ranges from the extreme south of the Cerrado (c. 24o S) to the extreme northeast

in ecotonal sites between dry vegetation (Caatinga) and savanna, including northern parts of

the biome in transition with the Amazon Forest, and also in the Amazonian savanna enclaves.

We performed a wide survey of these species, sampling populations in the core Cerrado and

northern and southern peripheral areas, and in the Occidental Amazonian savanna enclaves.

Due to the extensive sampling, the wide distribution of these species, and their close

relationship, we consider that phylogeographic data of them can be very informative to help

find answers to evolutionary questions about the Cerrado.

The present study using variation on cpDNA sequences and niche modelling was

conducted to test hypotheses and answer questions, which could shed light on the evolution of

the Cerrado. Based on the dating of lineage divergences in the South American

phylogeographic studies reviewed by Turchetto-Zolet et al. (2013), we hypothesize that

lineage divergences in Q. multiflora and Q. parviflora are recent, having most of them

occurred during the Pleistocene. Considering the close relationship between the species, their

similar wide distribution in the Cerrado and, thus, the sharing ecological requirements, we

hypothesize that the species would show similar genetic signatures shaped by past climatic

28 spatial localization of stability areas in the niche models, where they would show higher

genetic diversity. We also aimed to answer the following questions: (1) are the stability areas

located in the central Cerrado core, as suggested by the climatic modelling study (Werneck et

al., 2012) and phylogeographic data of other widely spread Cerrado trees (Novaes et al.,

2010, 2013)?; (2) would there be other stability areas to the north of the central core of the

Cerrado for the studied species? Considering that, to our knowledge, these northern areas

have not been sampled in phylogeographic studies with tree species from the Cerrado, we

predicted the existence of a refugium, which would be evidenced by niche modelling and high

levels of genetic diversity.

MATERIALS AND METHODS

Population sampling and DNA isolation

Thespecies used in this study are morphologically distinct and easily identified in the

field. The majority of material for DNA extraction was collected during the blooming period,

being this the main characteristic used to identify the species. Q. multiflora's flower has a

single white petal with yellow lines and pinkish dots in the central adaxial surface. These

flowers become slightly yellowish after pollination. Q. parviflora has small flowers with a

single violaceous petal, which has a central white line. When flowers are absent, the fruits

(which are scaly in Q. parviflora but not in Q. multiflora) and the trunk are used for correct

identification. The stem in Q. multiflora presents horizontal fissures and a smooth surface,

whereas in Q. parviflora it has vertical fissures and the bark is very thick (Shimizu, 2009).

Young leaves of 179 adult individuals were sampled from 23 populations of Q.

multiflora Mart., between latitudes 10° 43' and 23° 33' S and longitudes 44° 24' to 65° 15' W.

In Q. parviflora Mart., we sampled 75 adult individuals in 12 populations with latitudes

29 the sampling sites range from 273 to 1,313 m and from 67 to 1,082 m, for Q. multiflora and

Q. parviflora populations, respectively (Table 1). All samples were dried in silica gel and

stored at -20 °C. Voucher specimens of the collected populations, for both species, were

deposited in the Herbarium of the Departamento de Botânica of Universidade Federal de

Minas Gerais (BHCB). Total DNA was extracted using a modified CTAB (cetyl trimethyl

ammonium bromide) protocol (Doyle & Doyle, 1987). The quantity and quality of the DNA

were assessed by visualization on a 1% agarose gel and NanoDrop® spectrophotometer

(Thermo Scientific).

Plastid DNA amplification and sequencing

Polymerase chain reactions (PCR) were carried out in 25 μl final volume, containing

10 ng of template DNA, 1X PCR buffer [IC; Phoneutria; 2.0 mM of MgCl2, 10 mM Tris–

HCl (pH 8.4), 50 mM KCl, 0.1% Triton X-100], 0.2 ng of bovine serum albumin (BSA), 0.5

μg of each primer and 1 U Taq polymerase (Phoneutria). Amplification was performed using

Eppendorf thermocyclers under the following conditions: 94°C for 4 min, 29 cycles of

denaturation at 94°C for 1 min, annealing at 54°C (psbA-trnH; Azuma et al., 2001) and 56°C

(trnS-trnG; Hamilton, 1999) for 1 min and extension at 72°C for 2 min, and a final extension

at 72° for 7 min. The PCR products were visualized on 1% agarose gels stained with ethidium

bromide and purified with a polyethylene glycol (PEG 20%) precipitation protocol.

Sequencing was carried out using the ABI Big Dye version 3.1 terminators in an ABI3130XL

automated sequencer (Applied Biosystems, Foster City, CA).

Consensus sequences were assembled for each individual using the package

PHRED/PHRAP/CONSED (Ewing & Green, 1998; Ewing et al., 1998; Gordon et al., 1998).

30

et al., 2011) and edited manually to minimize software errors. The ends of the sequences were

removed due to low quality in some individuals, preserving only high confidence bases.

Phylogenetic and phylogeographic structure analyses

The cpDNA haplotypes were defined by analyzing sequences with DNAsp 5.10

(Librado & Rozas, 2009). All insertion/deletions (indels) were considered as fifth character

states and were coded as single mutations, regardless of their size. The relationship among the

three species (considering all lineages of Q. multiflora and Q. parviflora and two lineages of

Q. grandiflora, one of them considered as outgroup) was inferred using Bayesian-inference

(BI) approach implemented in MrBayes v.3.1.1 (Ronquist & Huelsenbeck, 2003). Two

simultaneous independent runs with four Markov chains were employed and monitored over

four million generations, under the GTR+I substitution model. This model was previously

selected using the Akaike Information Criterion (AIC - Kelchner & Thomas, 2007)

implemented in JModelTest v.2.1.5 5 (Darriba et al., 2012; Guidon & Gascuel, 2003). The

trees were sampled every 100 generations. The first 25% of all trees were discarded as

burn-in, and a majority-rule consensus tree was computed to obtain posterior probabilities (PP).

The final tree was visualized in Treeview v.1.6.6 (Page, 1996). In BI analysis, gaps were

considered as binary data. Additionally, intraspecific and interspecific relationships for Q.

multiflora and Q. parviflora were inferred by the construction of haplotype networks using

the median-joining (MJ) algorithm (Bandelt et al., 1999), implemented in the software

NETWORK 4.6.1.2 (fluxus-engineering.com).

Analyses of molecular variance (AMOVA) using pairwise differences to assess

population genetic structure in Q. multiflora and Q. parviflora based on cpDNA were

31 was employed to evaluate the relationship between genetic and geographic distances in both

species.

The best clustering for Q. multiflora and Q. parviflora was estimated with Bayesian

Analysis of Genetic Population Structure implemented in BAPS 6.0 (Corander et al., 2008)

and Spatial Molecular Variance Analysis performed by software SAMOVA (Dupanloup et

al., 2002). The BAPS analysis is performed considering each population as a single group and

using their respective geographical coordinates. SAMOVA defines the number (K) of groups

of population that are geographically homogeneous and maximally differentiated from each

other, using AMOVA approach and the geographic coordinates of each population. Different

K groups are simulated (herein, up to K = 8) and three F statistic tests (FSC, FST, FCT) are performed. The best value of K corresponds to the highest value of FCT (differentiation among

groups) in which no group is composed of a single population (according Huertz et al., 2004).

Putative barriers to gene flow were identified using Monmonier maximum difference

algorithm (Monmonier, 1973), implemented in BARRIER 2.2 (Manni & Guérard, 2004).

After defining the groups, diversity indices were estimated considering all populations

together for both species and each group delimited by BAPS and SAMOVA for Q. multiflora.

The number of groups was also estimated for Q. parviflora, but SAMOVA isolated one group

formed by a single population in the first run (i.e. when divided into two groups). Thus no

groups or barriers were considered for this species. Nucleotide diversity (π) and haplotype (h)

diversity were calculated using Arlequin ver. 3.5 (Excoffier et al., 2005) for each population

in both species and allelic richness after rarefaction was estimated only for Q. multiflora using

Contrib software (Petit et al., 1998). The rarefaction is used to correct for sample size (N),

standardizing allelic richness to the smallest N in a comparison (Petit et al., 1998). After