Apolipoproteína E e a doença de Alzheimer.

Apolipoproteína E e a doença de

Alzheimer

E

P. B

O

A

B

B

E

D

N

*

Recebido: 17/11/2003 - Aceito: 26/11/2003

Abstract

Laboratório de Neurociências (LIM-27), Instituto de Psiquiatria, Faculdade de Medicina, Universi-dade de São Paulo.

* Pesquisador e vice-diretor do Laboratório de Neurociências (LIM27).

Endereço para correspondência: Laboratório de Neurociências (LIM27), Instituto de Psiquiatria, Hospital das Clínicas, Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (HC-FMUSP), Rua Dr. Ovídio Pires de Campos, s/n, Cerqueira César. CEP 05403-010, São Paulo - SP, Brasil. Telefone: (11) 3069-7267; FAX: (11) 3062-4851; E-mail: emmanuel@usp.br

Resumo

Sabemos hoje que os polimorfismos no gene da apolipoproteína E (apoE) são importantes fatores de risco para o desenvolvimento da doença de Alzheimer (DA). O gene apoE humano, mapeado no braço longo do cromossomo 19 (19q13.2), codifica uma glicoproteína com 317 aminoácidos, a qual desempenha um papel fundamental para o catabolismo de componentes ricos em triglicérides no corpo humano. Em humanos, existem três alelos principais do gene apoE, decorrentes de apenas duas alterações no DNA, chamados de ε2,

ε3 e ε4. A identificação da variante ε4 do gene apoE como o fator genético de risco mais comum para a DA de início tardio sugere que o colesterol deva ter um papel direto na patogênese da doença. Contudo, a simples presença do alelo apoE ε4 não é necessária nem suficiente para causar DA; este alelo apenas aumenta o risco de o indivíduo vir a desenvolver a doença, indicando que existem outros fatores ambientais e genéticos importantes no desenvolvimento da mesma.

P a l a v r a s - c h a v e : P a l a v r a s - c h a v e : P a l a v r a s - c h a v e : P a l a v r a s - c h a v e :

P a l a v r a s - c h a v e : Doença de Alzheimer, APOE, Apolipoproteína E

It is known that polymorphisms in the gene of the apolipoprotein E (apoE) are important risk factors in the development of the Alzheimer’s disease (AD). The human gene apoE, which is mapped in the long arm of chromosome 19 (19q13.2), codes for a glycoprotein with 317 amino acids, which plays a basic role for the catabolism of triglyceride-rich components in the human body. In our species the apoE gene appears in the form of three main alleles, produced from two alterations in the DNA sequence, called ε2, ε3 and ε4. The identification of the variant ε4 of gene apoE as the most relevant genetic marker for the risk for late-onset AD suggests that cholesterol may have a direct involvement in the patho-genesis of this disease. However, apoE ε4 is not necessary nor enough to cause Alzheimer’s disease. It only increases the risk of an individual to develop the illness, indicating that other environmental/genetic factors shoud play important roles in the development of the disease.

K e y W o r d s K e y W o r d s K e y W o r d s K e y W o r d s

Genética e biologia da DA

Há muito, é reconhecido que a doença de Alzheimer (DA) pode ocorrer com maior freqüência em algumas famílias. Esta observação, apesar de não excluir a im-portância dos fatores ambientais, constitui um dos pri-meiros indícios de que fatores genéticos pudessem ter influência no desenvolvimento da doença. Desta for-ma, o encontro de alterações de DNA, características de indivíduos portadores da doença, poderia fornecer um marcador biológico importante. O encontro deste marcador vem sendo o alvo de numerosos grupos in-ternacionais na pesquisa recente.

A DA de início precoce foi associada, até o mo-mento, a mutações em genes que codificam para a pro-teína precursora da β-amilóide (APP: β-amyloid

precur-sor protein - 21q21.3), presenilina 1 (PSEN1: presenilin 1 - 14q24.3) e presenilina 2 (PSEN2: presenilin 2 - 1q31-q42). As mutações nesses genes são responsáveis por aproximadamente 40% dos casos de DA com início pre-coce (revisão em Tanzi e Bertram, 2001). Porém, a DA de início precoce foge do padrão da doença, em que cerca de 95% dos casos ocorrem com início tardio. Nes-tes casos, o espectro de mutações é distinto. Embora já tenham sido relatados na literatura mais de 30 possí-veis marcadores genéticos para a DA de início tardio, até o momento, apenas o alelo ε4 do gene apoE (19q13.2)

mostrou uma associação consistente com a DA em vários estudos independentes (revisão em Laws et al., 2003).

Apolipoproteína E

O gene apoE humano está localizado no braço lon-go do cromossomo 19 (19q13.2) (Olaisen et al., 1982; Das et al., 1985; Paik et al., 1985) estando próximo aos genes TOMM40 e apoC1, dentro do loco RELB (Figura 1) (UCSC Genome Browser, http://genome.ucsc.edu/). O apoE é composto por quatro exons, distribuídos ao longo de 6.740 nucleotídeos no genoma humano. Reti-rando-se os introns, sobram apenas 1.156 pares de bases que compõem o mRNA que será transcrito, res-ponsável pela tradução de três isoformas da proteína. A região transcrita de apoE possui uma grande quan-tidade de citosinas e guaninas (respectivamente 31,84% e 37,37% do mRNA transcrito) que, por formarem três ligações de hidrogênio na dupla fita de DNA, conferem à região uma estabilidade maior, dificultando dessa maneira o processo de amplificação e análise laboratorial deste gene pelo método da PCR (Polymerase Chain Reaction).

A apoE é uma glicoproteína com 317 aminoácidos e é uma das principais proteínas presentes no plasma humano, para onde é exportada após sua síntese no fígado (Lin et al., 1986; Elshourbagy et al., 1985), além de ser a principal apolipoproteína encontrada no cé-rebro. No plasma, a apoE é o principal componente das lipoproteínas de muito baixa densidade (VLDL) e de um grupo de lipoproteínas de alta densidade (HDL), envolvida na redistribuição de triglicerídeos e

nas variações, ou alelos. Estas alterações primárias ocor-reram em nível de DNA e resultam em alterações na seqüência da proteína. Em humanos, existem três alelos principais do gene apoE, decorrentes de apenas duas alterações no DNA, chamados de ε2, ε3 e ε4. As

isoformas protéicas produzidas por esses alelos dife-rem na composição de aminoácidos nas posições 112 e/ou 158 (Weisgraber et al., 1981; Rall et al., 1982a,b; Weisgraber et al., 1982): o alelo ε2 possui o aminoácido

cisteína nas duas posições da proteína (aminoácidos 112 e 158), o ε3 tem a cisteína na 112 e uma arginina

na 158 (sendo este o alelo mais comum da apoE), en-quanto que o alelo ε4 possui argininas nestas duas

po-sições (Figura 2). As outras variantes da apoE são cha-madas de ε1, ε5 e ε7, mas elas são extremamente raras.

A natureza polimórfica do gene apoE não é restri-ta a esses polimorfismos mencionados, os quais defi-nem as três isoformas mais comuns da proteína na população. Foram identificados outros polimorfismos próximos à região promotora (Nickerson et al., 2000; Fullerton et al., 2000), mas a sua importância na DA ainda não foi determinada de maneira consistente.

As várias combinações possíveis de dois dos três alelos principais podem dar origem a seis possíveis genótipos: apoE ε2/ε2, apoE ε3/ε3, apoE ε4/ε4, apoE ε2/ε3, apoE ε3/ε4 e apoE ε2/ε4. A freqüência desses

três alelos na população caucasiana em geral é de apro-ximadamente 8%, 78% e 14% para o apoE ε2, apoE ε3 e

apoE ε4, respectivamente (Utermann et al., 1980;

Martins et al., 1995). Corbo e Scacchi (1999) analisa-ram a distribuição das freqüências alélicas de apoE em diferentes populações e encontraram que o alelo ε3 é o

mais freqüente em todas as populações humanas (va-riando de 48% a 89%). Nesse estudo, a freqüência do alelo ε4 só se mostrou elevada (24% a 40%) em

algu-mas populações (pigmeus, aborígenes da Malásia e Austrália, da tribo de Papua-Nova Guiné, Lapônia e al-guns nativos americanos), onde ainda há uma cultura de busca de alimentos, ou a comida ainda é escassa ou o foi até recentemente, ou está disponível de forma esporádica, ou ainda, é qualitativamente pobre.

O efeito funcional das variantes de apoE

Um estudo recentemente realizado em ratos procurou elucidar o papel das isoformas ε3 e ε4 no catabolismo e

metabolismo de HDL, sugerindo que a presença da isoforma ε4 implica níveis de LDL um pouco elevados

no plasma sangüíneo e um pequeno, porém significati-vo, decréscimo no nível do HDL, inclusive em situações terol em diferentes tecidos (Mensenkamp et al., 1999).

A identificação da variante ε4 do gene apoE, como o

fator genético de risco mais comum para a DA de iní-cio tardio, sugere que o colesterol pode ter um papel direto na patogênese da doença.

A apoE é sintetizada em uma grande variedade de tecidos além do fígado, órgão responsável pela pro-dução de cerca de três quartos da apoE circulante no plasma (Elshourbagy et al., 1985; Lin et al., 1986). Nos humanos, o cérebro é o segundo sítio de maior síntese de apoE, sendo produzida principalmente por astrócitos (Boyles et al., 1985; Pitas et al., 1987) e pela micróglia (Nakai et al., 1996). Outros estudos sugerem que, pelo menos sob certas condições, os neurônios humanos podem sintetizar apoE em quantidades significantes (Roses et al., 1998; Xu et al., 1999), possivelmente como uma parte de um programa compensatório para conter a neurodegeneração (Boschert et al., 1999). A apoE é uma das muitas classes diferentes de apolipo-proteínas, incluindo apoA, apoB, apoC, apoD e apoJ, as quais transportam lipídios no plasma e em outros fluidos corpóreos.

Comprovando o papel específico da apoE na for-mação de placas amilóides e emaranhados neurofibri-lares, existem estudos mostrando que a apoE é um dos componentes das placas amilóides cerebrais; a apoE4 promove a fibrilogênese in vivo e in vitro do peptídio

β-amilóide e a apoE3 liga-se à proteína Tau,

diminuin-do a sua taxa inicial de fosforilação e a formação de filamentos (Corder et al., 1998; Czyzewski et al., 1998). A apoE desempenha um papel fundamental para o catabolismo de componentes ricos em triglicérides no corpo humano. Deficiências dessa proteína causam inúmeras doenças envolvidas com o aumento no nível de colesterol e triglicérides na circulação, devido ao não-reconhecimento dessas moléculas pelos recepto-res de membrana dos quilomícrons e pelas moléculas de VLDL, responsáveis por sua captação no fígado. Por causar o aumento na concentração dessas substâncias é que a apoE é muito estudada em doenças cardiovas-culares, apresentando uma relação direta com estenoses e infartos. A apoE está presente em todas as frações lipoprotéicas do plasma, constituindo de 10% a20% das moléculas de VLDL e 1% a 2% das moléculas de HDL.

As variantes de apoE

peque-nas quais esses animais foram submetidos a uma dieta rica em gorduras (revisão em Puglielli et al., 2003).

Os ratos homozigotos para a isoforma ε4

apre-sentaram uma concentração maior de apoE circulante do que aqueles indivíduos heterozigotos ε3/ε4 que,

por sua vez, apresentam níveis maiores que aqueles homozigotos para a isoforma ε3. Isso sugere que há

uma velocidade maior no catabolismo de lipoproteí-nas em indivíduos portadores do alelo ε4, quando

comparada aos que contêm ε3. Dessa forma, o nível

elevado no catabolismo de remanescentes lipoprotéi-cos em indivíduos ε4 pode levar a um déficit dos

re-ceptores lipoprotéicos hepáticos, acarretando um au-mento no LDL circulante, um dos maiores responsá-veis pelo risco de arterioscleroses.

A apoE está intimamente relacionada com ou-tras doenças, como doenças cardíacas (infarto do miocárdio e estenoses de válvulas cardíacas e arté-rias), hiperlipoproteinemia tipo III, além de condições, nas quais seu papel ainda não foi totalmente elucidado.

ApoE e a DA

A apoE e a DA foram primeiramente associadas gra-ças a um estudo feito em 1993 na Universidade Duke, onde foi observada uma freqüência maior de apoE

ε4 em pacientes classificados como possíveis ou

pro-váveis portadores da DA, quando comparados com a freqüência observada em indivíduos-controle (Saunders et al., 1993).

O estudo de Corder et al. (1993) foi o primeiro a mostrar que o risco de DA conferido pelo alelo apoE

ε4 aumenta de forma dose-dependente, ou seja, o

ris-co de DA aumenta de 20% a 90%, e a média de idade de início da doença diminui de 84 para 68 anos com o aumento no número de alelos ε4. A homozigose

para apoE ε4 chegou a ser declarada como suficiente

para desenvolver a doença por volta dos 80 anos de idade. Contudo, o alelo apoE ε4 não é necessário nem

suficiente para causar DA; ele apenas aumenta o ris-co de o indivíduo desenvolver a doença, indicando

que existem outros fatores ambientais e genéticos atuando no desenvolvimento da doença (revisão em Rocchi et al., 2003).

Os mecanismos que associam a DA e o alelo apoE

ε4 ainda não foram esclarecidos. Estudos com

camun-dongos transgênicos para o gene APP sugerem que a apoE contribui para o depósito da proteína β-amilóide

(Aβ), sendo este depósito mais severo na presença

da isoforma apoE ε4. A interrupção do gene apoE em

camundongos nocaute inibiu a deposição da Aβ

(Ba-les et al., 1997). A ausência de apoE afetou o acúmulo extracelular da Aβ, mas não a sua síntese

(Bales et al., 1999).

Existem dois modelos que tentam explicar o pa-pel da apoE no acúmulo da Aβ: no primeiro, a Aβ

solú-vel interagiria com a apoE associada a uma partícula lipídica, seguindo para a endocitose mediada por re-ceptor. As lipoproteínas são então digeridas enzimaticamente no compartimento lisossômico, libe-rando o colesterol para a célula. Nos lisossomos, uma fração de apoE-Aβ é degradada, enquanto o restante

da apoE permanece associada à Aβ e promove a sua

agregação em fibrilas amilóides que são secretadas de volta para o meio extra-celular. Dado que a apoE ε4

tem uma afinidade maior pela Aβ do que pelas demais

isoformas, pode ser esperada uma aceleração nesse processo. No segundo modelo, além de facilitar direta-mente a entrada da Aβ na célula e a sua agregação, a

apoE poderia também aumentar a taxa de produção de Aβ, através do aumento do colesterol celular. Após

a endocitose mediada por um receptor e a digestão enzimática das lipoproteínas, o colesterol é liberado para as membranas celulares. As lipoproteínas apoE ε4

tendem a conter mais colesterol, e o aumento do con-teúdo de esterol nas membranas intracelulares promo-veria um aumento na taxa de geração de Aβ,

resultan-do em uma liberação maior para o meio extracelular (revisão em Puglielli et al., 2003).

Devido à freqüente associação de distúrbios psi-quiátricos e a DA, estudos foram feitos com o intuito de verificar se o surgimento e a intensidade desses dis-túrbios poderiam ser previstos através da tipagem das isoformas de apoE. Como resultado de um desses estu-dos, inferiu-se que a presença de apenas uma isoforma

ε4 implicaria aumento de 2,5 vezes na probabilidade

de o paciente apresentar ilusões, ao passo que ao apre-sentar duas isoformas ε4, a probabilidade aumentaria

5,6 vezes, mesmo levando-se em conta aspectos como a diferença de sexo, etnia, grau de instrução e duração da doença. Como resultado, tem-se que a presença de um ou mais alelos ε4 é um fator importante na

predi-ção de ilusões na DA, o que também nos auxilia a traçar uma linha cada vez mais consistente de ligação entre a apoE e DA (Scarmeas et al., 2002). No entanto, Yip et al.

(2002) sugerem que estes achados devem ser questio-nados, pois na idade de manifestação da demência na DA, o nível de apoE já se apresenta em significativo de-créscimo. Para outros sintomas, como distúrbios de com-portamento e depressão, não foram encontradas evi-dências que possam associá-las à apoE ou a outros fato-res genéticos (Scarmeas et al., 2002).

O peso da presença do alelo ε4 no

desenvolvi-mento da DA parece variar de acordo com a idade, a etnia e o sexo. A idade possui um papel particularmen-te importanparticularmen-te no desenvolvimento de DA. O risco de desenvolver a doença parece aumentar com a idade até certo ponto, a partir do qual o mesmo cai vertigi-nosamente. A presença de dois alelos ε4 é responsável

por uma grande diminuição na idade de início da doen-ça, enquanto que a presença de apenas um alelo ε4 é

responsável por uma diminuição menos acentuada (re-visão em Panza et al., 2002). Um estudo recente ava-liou o grau de risco conferido pelos diferentes genótipos de apoE entre indivíduos da mesma faixa etária. Os resultados mostram que indivíduos com idade de 80 anos que apresentam ε3/ε4 possuem uma taxa de

inci-dência de DA aumentada em 3,4 vezes em relação a indivíduos ε3/ε3. Indivíduos que são ε4/ε4 possuem

taxa de incidência aumentada 9,4, enquanto os que possuem a isoforma ε2 apresentam redução de 43% no

risco apresentado por um indivíduo ε3/ε3, sugerindo

um papel protetor do alelo ε2 (Ewbank, 2002).

A importância dos alelos de apoE no desenvolvi-mento da DA parece ser consistente mesmo entre os diferentes grupos étnicos. Povos caribenhos descenden-tes de hispânicos apresentam uma alta taxa de asso-ciação entre DA e apoE ε4 (Goldstein et al., 2001);

pa-rentes de primeiro grau de indivíduos classificados como afro-americanos possuem um risco acumulado maior (sexo, etnia, grau de escolaridade etc.) de de-senvolver DA do que parentes de mesmo grau de indi-víduos classificados como caucasianos (Kim et al., 2002); um estudo feito na região sudeste do Brasil iden-tificou uma forte associação entre apoE ε4 e DA. O alelo ε4 foi encontrado com uma freqüência de 39% em

por-tadores da DA, valor cerca de quatro vezes maior que o encontrado nos indivíduos saudáveis da mesma lo-calidade (de-Andrade et al., 2000). Um outro estudo com 126 indivíduos brasileiros (Souza et al., 2003) mostrou que a freqüência do alelo apoE ε2 foi

apoE ε3/ε3 foram maiores nos controles (84% e 72%,

respectivamente; n = 58), enquanto as freqüências do alelo apoE ε4 e do genótipo apoE ε3/ε4 foram

maiores nos indivíduos com DA (25% e 41%, respec-tivamente). Uma somatória dos achados destes dois trabalhos, os mais recentes que avaliaram a distri-buição de alelos de apoE na população brasileira, baseada em 91 pacientes com DA e 258 controles, oferece uma distribuição das freqüências alélicas e genotípicas em nossa população (Tabela 1).

Perspectivas no estudo de apoE e DA

Diversos estudos confirmam que a simples presença da isoforma ε4 de apoE não é suficiente para o

de-senvolvimento da DA. No entanto, não restam dúvi-das de que os alelos da apoE são fatores importantes que, de acordo com sua variação, têm o efeito de agonistas ou antagonistas no processo de instaura-ção da doença. Neste sentido, alguns grupos vêm es-tudando o papel dos polimorfismos da região pro-motora do gene da apoE ε4 e sua influência no

de-senvolvimento da DA. Polimorfismos na região pro-motora dos genes podem alterar a sua transcrição, gerando diferentes quantidades do RNA mensageiro e da respectiva proteína. Na região promotora do gene da apoE, já foram identificados polimorfismos nas regiões -219 G/T, -427 C/T e -491 A/T.

Artiga et al. (1998) destacaram a importância da variante alélica -491C e do haplótipo [- 491A-427C] no aumento do risco de desenvolver DA, po-rém, esse mesmo grupo não confirmou essa associa-ção em outro estudo (Roks et al., 1998). Outro estu-do refere ter encontraestu-do uma pequena, porém signi-ficativa, alteração na concentração da apoE no plas-ma, independentemente do genótipo para essa ca-racterística. Como resultado desse estudo, foi obser-vado que o polimorfismo - 491 A/T apresenta um papel independente do genótipo para apoE nos ní-veis dessa apolipoproteína no plasma sangüíneo, mas não independente para o risco de desenvolver DA (Beyer et al., 2002). Esses resultados foram confir-mados por um estudo posterior que acrescentou que o polimorfismo na região - 491 é causado pela subs-tituição de uma timina por uma adenina, além de acrescentar a importância da região - 219 no desen-volvimento de Alzheimer como fator de risco, sendo que esta região passa a desempenhar um papel cada vez mais significativo com o avanço da idade.

Embora o estudo da genética da DA já esteja avan-çado, diversos passos ainda são necessários na eluci-dação de seus mecanismos de instauração, desenvol-vimento e fatores de risco associados, quer sejam eles genéticos ou ambientais. Com este avanço, os acha-dos da genética poderão ser utilizaacha-dos no diagnóstico precoce da doença, no seu tratamento ou mesmo na elaboração de estratégias de prevenção. Devemos res-saltar que há um consenso na comunidade científica: a determinação das isoformas de apoE ainda é insufi-ciente como método diagnóstico. É precipitado afir-mar que um indivíduo assintomático irá desenvolver a doença, baseado apenas no seu genótipo de apoE.

Tabela 1 - Distribuição das freqüências alélicas e

genotípicas do gene apoE na população brasileira,

em indivíduos com a DA e indivíduos-controle, com

base na somatória de genótipos definidos em dois

estudos (de-Andrade et al., 2000; Souza et al., 2003)

Apesar da contradição existente entre muitos estudos atuais, sabemos que o polimorfismo de apoE é apenas um dos diversos fatores genéticos envolvi-dos na DA. A apoE desempenha um papel importan-te na instauração da DA, mas o simples fato de um indivíduo possuir, mesmo que em homozigose, a isoforma ε4, não implica necessariamente o

desen-volvimento da doença. Outro fato importante é que a isoforma ε4 não parece estar diretamente

relacio-nada com a DA precoce, sendo mais freqüentemente associada com a forma tardia e esporádica da doen-ça (Yoshizawa et al., 1994).

Embora o estudo da genética de DA esteja ape-nas em seu começo, os resultados já obtidos permi-tem começar a decifrá-la, compreendendo alguns de seus fatores de risco e sua epidemiologia, permitin-do vislumbrar o desenvolvimento de novos mecanis-mos de abordagem e combate à doença, quer sejam através da genética, quer sejam através de estudos farmacológicos (Cacabelos, 2002).

Alelos

apoE ε2 apoE ε3 apoE ε4 Genótipos

apoE ε2/ε2 apoE ε2/ε3 apoE ε2/ε4 apoE ε3/ε3 apoE ε3/ε4 apoE ε4/ε4 Total

Número de indivíduos (freqüência %)

Pacientes com DA Controles

5 (2,75) 35 (6,78)

125 (68,68) 399 (77,33) 52 (28,57) 82 (15,89)

Número de indivíduos (freqüência %)

Pacientes com DA Controles

0 (0) 1 (0,39)

2 (2,20) 27 (10,47)

2 (2,20) 6 (2,32)

44 (48,35) 160 (62,02) 36 (39,56) 52 (20,16)

7 (7,69) 12 (4,64)

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