Efeito in vitro da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em suspensão e na formação de biofilme : ensaio com azul de metileno e toluidina ativados por luz halógena

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE

DEPARTAMENTO DE ODONTOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ODONTOLOGIA ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: SAÚDE COLETIVA

____________________________________________________________

Emanuelle Dayana Vieira Dantas

EFEITO

IN VITRO

DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE

BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE

BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA

ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA.

Dissertação de Mestrado

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EFEITO

IN VITRO

DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE

BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE

BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA

ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA.

Dissertação de Mestrado

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Saúde Coletiva.

Orientador: Prof Dr Kenio Costa Lima.

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Dantas, Emanuelle Dayana Vieira.

Efeito in vitro _{da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em suspensão e} na formação de biofilme: ensaio com azul de metileno e toluidina ativados por luz halógena.\ Emanuelle Dayana Vieira Dantas. – Natal, RN, 2011.

67 f. : il.

Orientador: Prof. Dr. Kenio Costa Lima.

Dissertação (Mestrado em Odontologia) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Programa de Pós-Graduação em Odontologia.

– –

–

Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia

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EFEITO

IN VITRO

DA TERAPIA FOTODINÂMICA SOBRE

BACTÉRIAS ORAIS EM SUSPENSÃO E NA FORMAÇÃO DE

BIOFILME: ENSAIO COM AZUL DE METILENO E TOLUIDINA

ATIVADOS POR LUZ HALÓGENA.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em Odontologia, área de concentração em Saúde Coletiva.

Aprovada em: _______/_______/__________

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________________________________ Prof. Dr. Kenio Costa de Lima

Orientador

_______________________________________________________________ Profa. Dra Isauremi Vieira de Assunção Pinheiro

Examinador Interno – UFRN

_______________________________________________________________ Prof. Dr. Marcos Antônio Japiassú Resende Montes

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DEDICATÓRIA

Aos meus pais, Jacinto Moreira Dantas e Sônia Maria Vieira Dantas, pelo amor incondicional e pelo esforço em tornar possível cada um dos meus sonhos. Obrigada por sempre acreditarem em mim! Todas as minhas conquistas sempre serão dedicadas a vocês... Amo muito!!!

Aos meus irmãos, Emanuell e Ellyommany, pela amizade e pela certeza de saber que sempre poderei contar com vocês.

Ao meu sobrinho, Emanuell Júnior, por me fazer conhecer uma nova forma de amor e por encher nossa família de alegria com a sua chegada.

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AGRADECIMENTOS ESPECIAIS

Ao meu orientador, o Prof. Dr. Kenio Costa de Lima, pela amizade, ensinamentos e paciência ao longo deste trabalho. Agradeço a oportunidade de estar ao seu lado e poder aprender com você. Admiro sua competência, seu caráter e sua inquietude em busca de conhecimento. Sem dúvida, uma fonte de inspiração... Muito obrigada por tudo!

À Profa Dra Elizabethe Cristina Fagundes de Souza, minha orientadora durante a iniciação científica e em parte deste curso de mestrado, pela contribuição em minha formação acadêmica, pelo desprendimento e por ter me permitido seguir em busca de novos anseios. Sempre lhe serei grata.

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AGRADECIMENTOS

À Universidade Federal do Rio Grande do Norte, na pessoa de sua Magnífica Reitora Profa. Dra. Ângela Maria Paiva Cruz; à Faculdade de Odontologia, na pessoa de seu chefe de departamento Prof. Dr. Antonio Ricardo Calazans e do coordenador do Programa de Pós-Graduação em Odontologia, Prof. Dr. Kenio Costa de Lima, pela participação desta conceituada instituição no meu crescimento profissional e pessoal.

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão de bolsa de mestrado.

A todos os professores que integram o corpo docente do Programa de Pós-Graduação em Odontologia da UFRN, pela contribuição acadêmica ao longo deste curso de mestrado.

Às professoras Dra. Maria Celeste Nunes de Melo e Dra. Isauremi Vieira de Assunção Pinheiro, membros da banca de qualificação, pelas sugestões dadas para finalização deste trabalho.

Aos secretários Sandra Abrantes de Souza e Lucas Soares de Araújo, pelo incentivo e inestimável ajuda.

Às queridas Amanda, Ana e Isabel, pela colaboração constante durante os experimentos realizados no Laboratório de Microbiologia.

Às bibliotecárias Mônica Reis e Cecília dos Santos, pelo auxílio dispensado para a organização deste trabalho.

Aos colegas de turma, em especial a Ângela Medeiros, Camila Resende, Jônia Cybele e Neusa Sales, que trilharam comigo esse caminho, compartilhando angústias e alegrias.

Às melhores amigas que alguém poderia ter, Adélia Danielli, Mércia Cunha, Saziane de Sá, Silvana Nobre, Sofia Mariz e Virgínia Helena, pelo apoio e incentivo constantes.

Ao Sr. Ronaldo Martins e Sra. Francilene Martins, meus sogros, por terem me acolhido como uma filha.

E enfim, a todas as pessoas que direta ou indiretamente contribuíram para concretização desta pesquisa.

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“O homem é do tamanho do seu sonho”.

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RESUMO

A terapia fotodinâmica (TFD) tem sido proposta como um método alternativo para o tratamento de doenças orais biofilme-dependentes, como a cárie dentária. Tal terapia consiste na ação simultânea de uma fonte luminosa (FL) e de um agente fotossensibilizante (FS), na presença de oxigênio tecidual, levando à produção de radicais livres que ao interagirem com componentes celulares bacterianos, promovem a morte celular. Este estudo tem como objetivo avaliar a ação antimicrobiana da TFD sobre bactérias orais em suspensão, bem como na formação de biofilmes mono e multiespécies, in vitro, a partir de uma cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva, respectivamente. Os corantes azul de metileno (CM) e azul de toluidina (CT) foram administrados na concentração de 100 mg/L e ativados por luz halógena (600 a 750 nm) proveniente de um aparelho fotopolimerizador modificado (Ultralux®, Dabi Atlante, Ribeirão Preto, São Paulo, Brasil.). Suspensões monoespécies e mistas foram preparadas e submetidas a diferentes condições experimentais: 1. TFD na presença de CT; 2. TFD na presença de CM; 3. irradiação sem administração de qualquer corante; 4. sensibilização com CT e ausência de luz; 5. sensibilização com CM e ausência de luz; 6. ausência de irradiação e sem qualquer corante (controle negativo) e 7. administração de solução de digluconato de clorexidina a 0,12% (controle positivo) (Periogard®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA). A ação imediata e mediata da TFD sobre as suspensões bacterianas, bem como seu efeito sobre a formação de biofilme foram verificados, a partir do número de unidade formadoras de colônias por mL (UFC/mL) e de medidas de densidade ótica (DO). Os dados obtidos foram analisados estatisticamente através dos Testes Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, para o nível de significância de 5%. De acordo com os resultados, a TFD não apresentou ação antibacteriana sobre as suspensões de S. mutans, independente do corante utilizado. A TFD com CM ativado por luz halógena foi capaz de reduzir em 86,6% o número de UFC/mL diante de suspensões multiespécies, entretanto, tal redução não foi significativa (p > 0,05). A TFD apresentou efeito antibacteriano, mediato, sobre suspensões mistas, quer na presença de CT (p < 0,001) ou CM (p < 0,001), ativados por luz halógena. A TFD preveniu a formação de biofilme multiespécie, através da ativação de CT por luz halógena (p = 0,01). Conclui-se que a ativação dos corantes azul de toluidina e azul de metileno, pela luz halógena (TFD) apresentou ação antimicrobiana, frente a suspensões multiespécies preparadas a partir de amostras de saliva, ressaltando a possibilidade da utilização da terapia fotodinâmica como um método coadjuvante no tratamento de lesões de cárie dentária.

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ABSTRACT

Photodynamic therapy (PDT) has been proposed as an alternative method for the treatment of biofilm-dependent oral diseases like dental caries. This therapy consists of simultaneous action of a visible light (L) and a photosensitizer (FS) in the presence of oxygen, which leads to production of different reactive oxygen species that can interact with the bacterial cell components, and promote cell death. This study aims to evaluate the antimicrobial action of PDT on oral bacteria in suspension, as well as the formation of mono and multi-species biofilms, in vitro, from a standard strain of Streptococcus mutans (ATCC 25175) and saliva samples, respectively. The dye methylene blue (MB) and toluidine blue (TB) were used at a concentration of 100 mg/ L and activated by halogen light (600 to 750 nm) from a modified hand held photopolymerizer (Ultralux ®, Dabi Atlante, Ribeirão Preto , São Paulo, Brazil.). Planktonic cultures were prepared and submitted to different experimental conditions: 1. PDT using TB 2. PDT using MB, 3. L+ FS- , 4. TB + L - ; 5. MB+ L-; 6. L- FS- (negative control) and 7. administration of 0.12% chlorhexidine digluconate (positive control) (Periogard ®, Colgate-Palmolive Company, New York, USA). The immediate and mediated action of PDT on bacterial suspensions, as well as its effect on biofilm formation were observed from the number of colony-forming units per milliliter (CFU/mL) and measures optical density (OD). The data were statistically analyzed using the Kruskal-Wallis and Mann-Whitney test for the significance level of 5%. According to the results, the PDT showed no antibacterial action on suspensions of S. mutans, regardless of the dye used. PDT with MB activated by halogen light was able to reduce 86.6% CFU/mL multi-species planktonic cultures, however, this reduction was not significant (p > 0.05). PDT showed antibacterial effect, mediate on multi-species planktonic cultures with TB (p < 0.001) and MB (p < 0.001), activated by halogen light. PDT was able to prevent the formation of multispecies biofilm, through the activation of TB by halogen light (p = 0.01). We conclude that activation of the dye toluidine blue and methylene blue, by halogen light (PDT) showed antimicrobial activity, compared to multi-species planktonic cultures prepared from saliva samples.

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1: Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo I

... 24 Figura 2: Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo II

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1: Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica e significância estatística para cada condição testada. Natal, 2011... 39 Tabela 2. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011... 40 Tabela 3. Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011... 41 Tabela 4. Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011... 42 Tabela 5. Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para

suspensões de S. mutans. Natal,

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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS

FA - : ausência de fotoativação FS - : ausência de fotossensibilizante % : por cento

FA + : sem fotoativação °C: graus Celsius

AlPcS2: fitalacionia dissulfonado de alumínio

ATCC: American Type Culture Collection / Coleção de Culturas Americanas BHI : brain heart infusion / infusão cérebro coração

CLX: clorexidina

CM: corante azul de metileno CT: corante azul de orto-toluidina

DNA: deoxyribonucleic acid / ácido desoxirribonucleico DO: densidade ótica

ERO: espécies reativas de oxigênio FA: fotoativação

FL: fonte luminosa FS: fotossensibilizante h: hora

LED: light emmiting diode /diodo emissor de luz M: meio puro

mg/L: miligrama por litro mL: mililitro

mW/cm2: miliWatt por centímetro quadrado nm: nanometro

PPgO: Programa de Pós-graduação em Odontologia Q 25-75: quartis 25 e 75

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S. mutans: Streptococcus mutans

SPSS: Statistical Package for Social Sciences / Programa Estatístico para Ciências Socias

TFD: terapia fotodinâmica

UFRN: Universidade Federal do Rio Grande do Norte Zn: zinco

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SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO ... 17

2. REVISÃO DE LITERATURA ... 19

2.1. Formação de biofilmes dentários e sua relação com a cárie... 19

2.2. Cárie dentária e sua abordagem terapêutica menos invasiva... 21

2.3. Terapia Fotodinâmica... 22

2.3.1. Substâncias fotossensíveis... 25

2.3.2. Corantes fenotiazínicos... 26

2.3.3. Fontes de luz... 28

2.3.4. Perspectivas de aplicação da TFD na Odontologia... 29

3. OBJETIVOS... 30

3.1. Objetivo geral ... 30

3.2. Objetivos específicos ... 30

4. MATERIAIS E MÉTODOS... 31

4.1. Tipo do estudo... 31

4.2. Ensaios in vitro... 31

4.2.1. Linhagem bacteriana padrão... 31

4.2.2. Preparo das suspensões de S. mutans... 32

4.2.3. Obtenção de amostras de saliva estimulada... 32

4.2.4. Substâncias fotossensibilizantes e fonte luminosa... 33

4.2.5. Preparação das placas... 34

4.2.6. Terapia Fotodinâmica... 36

4.2.7. Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica... 37

4.2.8. Avaliação do efeito mediato da terapia fotodinâmica... 37

4.2.9. Avaliação do efeito da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécie... 38

4.3. Análise estatística... 39

5. RESULTADOS... 40

5.1. Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de toluidina... 40

5.1.1. Suspensões multiespécies... 40

5.1.2. Suspensões de S. mutans... 41

5.2. Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de metileno... 42

5.2.1. Suspensões multiespécies... 42

5.2.2. Suspensões de S. mutans... 43

5.3. Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de toluidina... 43

5.3.1. Análise a partir da contagem do número de UFC/mL... 43

5.3.2. Análise a partir da densidade ótica... 45

5.3.2.1. Influência dos produtos testados sobre a densidade ótica do meio de cultura puro... 45

5.3.2.2. Suspensões multiespécies... 46

5.3.2.3. Suspensões de S. mutans... 47

5.4. Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de metileno... 48

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5.4.1.1. Suspensões multiespécies ... 48

5.5. Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de biofilme com utilização do corante azul de toluidina... 50

5.5.1. Análise a partir da contagem do número de UFC/mL... 50

5.6. Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de biofilme, com utilização do corante azul de metileno... 52

6. DISCUSSÃO... 55

7. CONCLUSÃO... 61

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1. INTRODUÇÃO

A terapia fotodinâmica consiste em um processo fotoquímico, no qual uma substância fotossensibilizante (FS) é ativada pela exposição a uma luz, de comprimento de onda específico, na presença do oxigênio26. Após ativação, componentes moleculares da FS transferem energia para o oxigênio tecidual, ocasionando a produção de formas iônicas altamente reativas, capazes de promover oxidação de componentes essenciais à célula bacteriana, levando à morte celular 50;57.

A terapia fotodinâmica tem sido estudada há mais de 100 anos, desde que a morte de um microrganismo unicelular foi observada por Oscar Raab41, em consequência da aplicação de um corante associado a uma fonte luminosa. A partir da década de 70, seu uso clínico passou a ser difundido na área médica devido aos bons resultados terapêuticos frente a diferentes tipos de câncer, além de desordens oftalmológicas e dermatológicas 24. Desde a década de 90, o interesse pelo efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica tem crescido e sua aplicação no tratamento de infecções localizadas tem sido proposta7.

Nesse contexto, pesquisas envolvendo o desenvolvimento de terapias antimicrobianas alternativas, como a fitoterapia e a TFD, têm sido conduzidas. Uma das razões para justificar o desenvolvimento de tais terapias tem sido o gradativo aumento da resistência de inúmeras espécies bacterianas frente às terapias convencionais, pautadas basicamente no uso de antibióticos25_.

A terapia fotodinâmica apresenta algumas vantagens frente à utilização dos antimicrobianos químicos usuais: sua ação está confinada ao local de aplicação, restrita à área de interesse; apresenta baixo risco de ocorrência de resistência bacteriana, devido ao curto período de tempo necessário para causar dano ou morte à célula bacteriana; é seletiva às células-alvo, diminuindo o risco de lesar células do hospedeiro; e ainda não há relatos de ocorrência de reações sistêmicas, mesmo após repetições de sua aplicação29.

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gingivalis 28_{e F. nucleatum}43_{, além de E. faecalis}48_{, patógenos frequentemente} envolvidos no desenvolvimento de infecções orais.

Diante disso, a terapia fotodinâmica poderia ser empregada como um método coadjuvante ao tratamento conservador de lesões de cárie dentária, devido à sua ação antibacteriana. Trata-se de um método não-invasivo, o que contribuiria sobremaneira para a diminuição da quantidade de tecido dentinário a ser removido, e conseqüentemente, preveniria o comprometimento do órgão pulpar 55.

O aprimoramento do protocolo de aplicação da terapia fotodinâmica deve visar além de segurança e efetividade, fatores como praticidade e custo, para que sua adoção clínica seja viável. Logo, a utilização de aparelhos fotopolimerizadores, como fontes de irradiação de luz, tem sido experimentada e incentivada pelo fato destes equipamentos estarem usualmente presentes na prática odontológica clínica e em nível de saúde pública 38;21;6.

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2. REVISÃO DE LITERATURA

Com o intuito de tornar a revisão de literatura mais elucidativa, essa foi dividida, didaticamente, em três tópicos. O primeiro versará a respeito do biofilme dentário e seu papel na rede de causalidade da cárie; o segundo discorre sobre a cárie e a nova abordagem terapêutica em curso, menos invasiva – Odontologia Minimamente Invasiva; e por fim, o terceiro, acerca da terapia fotodinâmica e sua aplicação na Odontologia, como um método coadjuvante no tratamento da cárie dentária, devido ao seu potencial antibacteriano.

2.1 Formação de biofilmes dentários e sua relação com a cárie

A cavidade oral dos seres humanos é colonizada por uma grande diversidade de microrganismos: fungos, protozoários, vírus e em maior número, por bactérias31_{. A manutenção desses microrganismos na cavidade é} dependente da capacidade de se manterem aderidos a estruturas orais, diante do desafio imposto por fatores locais como a função salivar de limpeza; as ações de mastigação e de deglutição, além da descamação das superfícies mucosas 14_.

Nesse sentido, certas bactérias orais apresentam vantagens competitivas, principalmente, devido à sua capacidade de aderir seletivamente às superfícies dentárias, estruturas duras, que não sofrem descamação, favoráveis à formação e maturação do biofilme dentário 48_{. O termo biofilme é usado para descrever} uma comunidade de microrganismos aderidos a uma superfície, encerrados em uma matriz extracelular e organizados em estrutura tridimensional 33.

A formação do biofilme dentário se dá minutos após a limpeza das superfícies dos dentes, quando se inicia a deposição de uma camada acelular sobre o esmalte, denominada película adquirida 36. Componentes salivares e do fluido gengival (proteínas, glicoproteínas e lípidios), além de remanescentes celulares bacterianos são os principais constituintes da película, desempenhando papel determinante na colonização dos microrganismos pioneiros 8.

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microbiota total inicial, a qual ainda se somam o Actinomyces spp., Haemophilus spp. e Neisseria spp. 14_.

A especificidade da colonização bacteriana nos estágios iniciais é mediada por interações físico-químicas entre moléculas presentes na superfície bacteriana e proteínas salivares adsorvidas no esmalte, as quais atuam como receptores no mecanismo de adesão bacteriana 15. O crescimento das bactérias pioneiras aderidas leva à formação de microcolônias distintas, que através de relações interbacterianas como coagregação, interações nutricionais e liberação de bacteriocinas, mediam a sucessão microbiana, contribuindo para o aumento da diversidade de espécies, até que uma comunidade clímax seja atingida 33.

A formação, crescimento e maturação dos biofilmes dentários ocorrem de forma natural, logo após as superfícies dentárias serem limpas. Devido a relações metabólicas e competitivas, as bactérias constituintes do biofilme dentário conferem proteção frente à colonização do ambiente oral por microrganismos potencialmente patogênicos. A manutenção de níveis de saúde está intimamente relacionada à capacidade do indivíduo de controlar o acúmulo do biofilme sobre as superfícies dentárias 57_.

O surgimento de doenças, dentre elas a cárie dentária, ocorre quando um desequilíbrio é formado, predispondo à seleção de microrganismos patogênicos específicos. A cárie dentária é uma doença socialmente determinada, que se configura como o mais prevalente agravo à saúde bucal, acometendo indivíduos em todas as faixas etárias 35;38. Trata-se de uma doença crônica, progressiva e localizada, causada pela dissolução ácida dos tecidos duros do elemento dentário 39.

Dentre os fatores que compõem a rede de causalidade da cárie, o biofilme dentário pode ser apontado como o fator etiológico primário 32. A produção de ácidos por microrganismos presentes no biofilme, a partir da degradação de carboidratos fermentáveis oriundos da dieta, é essencial para o processo de desmineralização da estrutura dentária 48. As frequentes quedas de pH levam à seleção de espécies bacterianas acidúricas e acidogências, dentre elas S. mutans e Lactobacillus casei, responsáveis, respectivamente, pela iniciação e propagação das lesões cariosas 13.

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cárie dentária, convencionalmente pautado na remoção mecânica e no controle químico do acúmulo de biofilme dentário.

2.2 Cárie dentária e sua abordagem terapêutica menos invasiva

A cárie dentária é uma doença infecciosa causada por bactérias orais aderidas à superfície dos elementos dentários, que se não tratada, pode culminar na perda dentária 60. É sem dúvida a afecção oral mais pesquisada, tendo seu processo histopatológico bem fundamentado na literatura, sendo considerada como a mais prevalente dentre as doenças que acometem o meio ambiente oral 10. Embora dados apontem para a redução na prevalência de cárie dentária ao redor do mundo, essa ainda pode ser tida como um sério problema de saúde pública em populações menos favorecidas economicamente 35.

Devido à complexa rede de causalidade que envolve a doença, o que se preconiza é que o controle da cárie dentária englobe desde ações de promoção à saúde e de prevenção dos agravos, como ações de recuperação, reabilitação e manutenção da saúde 3_{. O que nos parece ser bastante óbvio, na verdade,} contrasta com a prática odontológica adotada tradicionalmente, pautada quase que exclusivamente no tratamento cirúrgico restaurador das lesões cariosas, e não da doença em si.

Com o avanço das pesquisas que aprimoraram as técnicas restauradoras adesivas e, principalmente, no aprofundamento do conhecimento da doença e sua rede de causalidade, tendo como novo enfoque o processo saúde-doença que acomete o indivíduo, procedimentos restauradores menos invasivos vêm sendo adotados 5. Neste contexto, o conceito de Odontologia minimamente invasiva ou de mínima intervenção, baseia-se nos novos conhecimentos acerca do processo carioso, bem como no uso de materiais de proteção capazes de estimular a recuperação dos tecidos dentários e/ou de materiais restauradores adesivos, a fim de realizar uma abordagem preventiva e conservadora, na medida em que busca a paralisação da lesão, pautada na preservação da estrutura dentária sadia e do órgão pulpar 42;5.

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esclerótica 27_{. De acordo com Fejerskov e Kidd}14_{, a lesão pode ser paralisada} pelo controle do biofilme presente. Logo, a remoção da dentina cariada, ao diminuir o número de microrganismos presentes no tecido dentinário, auxiliaria na interrupção da progressão da lesão.

Quanto à sua estrutura química e morfológica, a lesão de cárie pode ser dividida em duas camadas distintas. A camada superficial, denominada camada infectada, é bastante desmineralizada, amolecida e com grande quantidade de bactérias. Localizada abaixo dessa, a camada afetada, apresenta-se mais endurecida, apenas parcialmente desmineralizada, com menor carga bacteriana. É constituída de fibras colágenas e ainda passível de sofrer o processo de remineralização 47. Daí, em situações clínicas que houvesse risco de exposição do tecido pulpar, a remoção apenas da camada superficial, infectada, com preservação da dentina afetada, proporcionaria uma maior proteção do órgão pulpar 16;22.

Desde o início dos anos 90, muitos estudos vêm sendo realizados com o objetivo de propor técnicas capazes de eliminar ou reduzir ao máximo a carga microbiana na porção de dentina afetada remanescente, em lesões profundas de cárie, onde a remoção total do tecido cariado poderia levar á exposição pulpar 52_.

Nesse contexto, a realização de um maior número de estudos envolvendo a aplicação da terapia fotodinâmica ainda é necessária, a fim de consolidar sua abordagem preventiva na formação de biofilmes orais cariogênicos, bem como sua ação terapêutica na paralisação de lesões de cárie ativas, quer em estágios iniciais, como na lesão branca de esmalte, quer em estágios avançados, nos quais a remoção total do tecido cariado pode levar ao comprometimento do órgão pulpar.

2.3. Terapia fotodinâmica

A terapia fotodinâmica, também denominada fotoquimioterapia ou fototerapia, representa uma promissora alternativa para o tratamento de algumas doenças.

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Tappeiner, através de seus experimentos, perceberam o efeito letal da associação do corante vermelho acridina e a luz solar sobre o protozoário causador da malária 41. Desde então, a TFD tem sido proposta como um método alternativo para algumas áreas da Medicina, como no diagnóstico e tratamento de determinados tipos de câncer 11 e de infecções virais, bacterianas e fúngicas, devido à sua ação antimicrobiana 26;4.

No campo de pesquisas da Odontologia, a terapia fotodinâmica é relativamente recente e tem sido investigada como uma alternativa para o tratamento das infecções orais mais prevalentes: a cárie dentária, as doenças periodontais e infecções do canal radicular 53;55.

De maneira geral, o mecanismo de ação da TFD é o mesmo, independentemente do tipo de células-alvo, quer sejam células tumorais, quer sejam microrganismos patogênicos. É decorrente da ação simultânea de um agente sensibilizante, também chamado de corante fotossensível, e de uma fonte de luz, na presença do oxigênio dos tecidos 21_.

Após irradiação, a molécula da FS absorve fótons de energia, passando a um primeiro estágio excitado singleto, altamente instável, podendo retornar ao estado fundamental, pela liberação de energia na forma de luz visível (fluorescência), ou por conversão interna de mesma multiplicidade, sendo convertida ao estado excitado tripleto, através de cruzamento intersistema. O estado tripleto, apesar de ser menos energético do que o estado singleto, possui tempo de vida longo, o bastante para permitir a interação da substância fotossensível com as moléculas vizinhas 23_.

A ação da terapia fotodinâmica, sobre as células-alvo, pode ocorrer a partir de dois mecanismos distintos, denominados: reação de Tipo I ou reação de Tipo II 24. Na primeira, o corante interage com o substrato, desencadeando a produção de radicais livres, os quais, posteriormente, irão reagir com o oxigênio molecular, produzindo espécies altamente reativas (Figura 1). Na segunda, o agente fotossensibilizante interage diretamente com a molécula de oxigênio, dando origem ao oxigênio singleto(Figura 2) 9.

(25)

provocar alterações irreversíveis em atividades metabólicas, levando à morte celular 7_.

FIGURA 1 - Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo I.

Fonte: Elaboração própria.

FIGURA 2 - Esquema representativo da ação da TFD - Reação de tipo II.

(26)

Para que a reação fotoquímica ocorra, é necessário que o agente fotossensibilizante seja capaz de absorver a energia irradiada pela fonte de luminosa 57. Embora alguns componentes bacterianos apresentem tal capacidade, a grande maioria das bactérias orais não possui esses componentes, sendo indispensável o uso de fotossensibilizadores exógenos, para o sucesso da TFD 30.

2.3.1 Substâncias fotossensíveis

Uma substância fotossensibilizante deve ser inócua aos tecidos; seus componentes em estado excitado devem apresentar tempo de vida suficiente para interagir com células vizinhas e com oxigênio molecular eficientemente; e ainda, deve apresentar alta absortividade, com picos de absorção próximos ao comprimento de onda da luz utilizada 26;21. Características inerentes a uma substância fotossensibilizante podem ser vistas no Quadro 1.

QUADRO 1 - Resumo das propriedades requeridas para uma substância fotossensibilizante ideal

PROPRIEDADES DE UM FOTOSSENSIBILIZANTE IDEAL Ser quimicamente puro e ter composição constante e conhecida

Ter mínima toxicidade no escuro

Seletividade às células-alvo

Ser rapidamente eliminado do organismo

Ser solúvel em água

Facilidade de obtenção em escala industrial Características fotofísicas favoráveis

(27)

O termo “características fotofísicas favoráveis” refere-se basicamente a duas características ideais para os agentes fotossensibilizantes, sendo a primeira, a capacidade de absorver luz na região de 600-800 nm, faixa espectral conhecida como janela terapêutica, na qual devido aos maiores comprimentos de onda, há uma maior penetração do FS nos tecidos e, consequentemente, um maior efeito terapêutico12. Comprimentos de onda abaixo dessa faixa sofrem maior espalhamento e podem ser absorvidas por cromóferos endógenos, diminuindo a penetração de luz, ao passo que comprimentos acima de 800 nm, além de serem absorvidas pela água, não possuem energia suficiente para produção de oxigênio singleto 49.

A segunda característica fotofísica favorável seria uma alta reatividade foquímica, para que um alto rendimento do estado excitado tripleto seja alcançado, o qual deve possuir um tempo de vida longo para produzir outras espécies reativas de oxigênio, como o estado singleto 2.

Em muitos estudos, uma grande variedade de agentes fotossensibilizantes tem sido empregada diante de microrganismos orais. O corante rosa-bengala 38_{; os derivados de fitalacionina, como fitalacionina} dissulfonado alumínio (AlPcS2) e fitalacionina catiônica com Zn (II) 54; porfirinas 23_{; verde de malaquita}40_{; além do azul de metileno e azul de orto-toluidina}61_. Estes dois últimos são as substâncias fotossensíveis mais testadas, representantes do grupo dos corantes fenotiazínicos.

2.3.2 Corantes fenotiazínicos

Os corantes fenotiazínicos são compostos catiônicos com estrutura fundamental composta por um anel aromático tricíclico planar, constituindo um sistema altamente conjugado, o qual funciona como o componente cromóforo destes corantes 44. Os compostos fenotiazínicos possuem propriedades adequadas para utilização na terapia fotodinâmica devido à sua intensa absorção de luz na região de 620-660 nm, região espectral inserida na faixa que compreende a janela 18.

(28)

estruturas químicas (Figuras 3 e 4) e propriedades físico-químicas 44_{. O pico de} absorção de energia para cada um desses compostos pode ser observado no Quadro 2.

FIGURA 3 - Fórmula molecular do corante azul de metileno

Fonte: Soukos 44.

FIGURA 4 - Fórmula molecular do corante azul de toluidina

Fonte: Soukos 44.

QUADRO 2 - Compostos fenotiazínicos mais utilizados, com seus respectivos picos de absorção de luz em nm.

COMPOSTOS FENOTIZÍNICOS PICO DE ABSORÇÃO DE LUZ (nm)

Azul de metileno 660

Azul de toluidina 625

(29)

Grande parte da capacidade de uma substância atuar como agente sensibilizante é dependente de sua capacidade de absorver a luz no comprimento de onda complementar àquele emitido pela fonte de luz 56.

2.3.3 Fontes de luz

Embora os lasers de baixa potência sejam, convencionalmente, utilizados como fonte de irradiação na TFD, o uso dos diodos emissores de luz (LED) tem se intensificado 19. Em parte, devido a certas propriedades dos LED que resultam em bandas de emissão mais largas, favorecendo a complementaridade com a substância fotossensível, e conseqüentemente, a absorção de energia luminosa por parte dessa 30;62.

A maioria dos trabalhos ainda apresenta a associação da terapia fotodinâmica com lasers ou LED, entretanto, outras fontes luminosas têm sido testadas, como as lâmpadas de tungstênio 57_{ou halogênio}38_{, o que reduz o} custo da terapia, já que os equipamentos, tradicionalmente utilizados, apresentam alto valor de mercado.

A terapia fotodinâmica, decorrente da associação entre o corante rosa-bengala e luz halógena, proveniente de um aparelho fotopolimerizador, apresentou atividade antimicrobiana, in vitro, frente a suspensões de S. mutans 38_{. Resultados semelhantes foram apresentados por Gonçalves}21_{, que observou} uma redução percentual na viabilidade bacteriana de 99,5% , quando da associação do corante azul de metileno e luz halógena proveniente de um aparelho fotopolimerizador, frente a suspensões de S. mutans, in vitro.

Além dos bons resultados obtidos, mediante o uso do aparelho fotopolimerizador, como fonte luminosa, sua utilização reduz os custos da terapia, na medida em que tal equipamento já se faz presente no conjunto de tecnologias duras da prática odontológica 38;21. Nesse sentido, a aquisição de um novo aparelho para realização da TFD não seria necessária, o que tornaria a técnica mais acessível, principalmente, em nível de setor público.

(30)

2.3.4 Perspectivas de aplicação da TFD na Odontologia

(31)

3. OBJETIVOS

3.1 Objetivo Geral

A presente pesquisa tem como objetivo avaliar o efeito in vitro da terapia fotodinâmica, com ativação por luz halógena, sobre bactérias orais em culturas planctônicas e na formação, de biofilmes mono e multiespécies, a partir de uma cepa padrão de Streptococcus mutans (ATCC 25175) e de amostras de saliva, respectivamente.

3.2 Objetivos Específicos

 Avaliar a ação, in vitro, dos corantes azul de metileno e azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies.  Avaliar a ação, in vitro, da luz halógena, proveniente de um aparelho

fotopolimerizador com espectros de emissão entre 600 e 750 nm, como fonte luminosa, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies.

 Avaliar o efeito da TFD, in vitro, sobre microrganismos orais em culturas planctônicas e na formação de biofilmes mono e multiespécies, através da fotoativação do corante azul de metileno por luz halógena com espectro de emissão entre 600 e 750nm.

(32)

4. MATERIAIS E MÉTODOS

A avaliação da eficácia antimicrobiana da TFD foi realizada a partir de ensaios in vitro, nos quais foram utilizados os agentes fotossensibilizantes azul de metileno e azul de orto-toluidina, na concentração de 100mg/L. O aparelho fotopolimerizador Ultralux® (Dabi Atlante, Ribeirão Preto, Brasil) foi usado na reação de fotoativação.

4.1 Tipo do estudo

Trata-se de um estudo experimental, in vitro, realizado no Laboratório de Microbiologia do Departamento de Odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte, referente à Linha de Pesquisa Prevenção dos agravos à saúde bucal em sua expressão individual e coletiva, Área de concentração em Saúde Coletiva, Grupo de Estudos em Saúde Bucal, do Programa de Pós-Graduação em Odontologia/UFRN.

4.2 Ensaios in vitro

A fase experimental foi dividida em duas etapas. A primeira foi realizada a fim de avaliar o efeito da terapia fotodinâmica sobre bactérias orais em culturas planctônicas, obtidas a partir de uma linhagem bacteriana de referência e de amostras de saliva. A segunda etapa teve como objetivo avaliar o efeito preventivo da terapia fotodinâmica, frente à formação de biofilmes mono e multiespécies, in vitro.

Os ensaios foram realizados com a utilização de microplacas estéreis de poliestireno inerte de fundo chato, contendo 96 poços (Nunclon®; InterMed, Roskilde, Dinamarca), adaptado de Stepanovic 46.

4.2.1 Linhagem bacteriana padrão

(33)

4.2.2. Preparo das suspensões de S. mutans

A partir do estoque, uma alíquota da cepa padrão foi semeada por esgotamento em placa de Petri contendo ágar Brain Heart Infusion (BHI), (DIFCO®, Michigan, Estados Unidos) e incubada por 24 horas a 37º C, em microaerofilia. Passado o tempo de incubação, três colônias foram retiradas da placa e então repicadas para um tubo de ensaio contendo 2 mL de caldo BHI, suplementado com sacarose 10%. Após homogeneização, o tubo contendo o inóculo foi armazenado em estufa a 37 ºC, por 24 horas em microaerofilia (Figura 5).

FIGURA 5 - Esquema ilustrativo da obtenção da cultura planctônica a partir de uma cepa padrão de S. mutans.

4.2.3 Obtenção de amostras de saliva estimulada

Nesta etapa experimental, três pesquisadores envolvidos no estudo tiveram sua saliva coletada. A estimulação foi feita através da mastigação de um

tablete de parafina (Parafilm “M” – Laboratory Film – American National Can –

(34)

durante 5 min. As amostras de saliva coletadas foram armazenadas no gelo durante o experimento (Figura 6).

FIGURA 6 - Esquema ilustrativo da obtenção da culturas planctônicas mistas, a partir de amostras de saliva.

Fonte: Elaboração própria

4.2.4 Substâncias fotossensibilizantes e fonte luminosa

As soluções contendo azul de metileno e azul de orto-toluidina foram obtidas a partir de diluições dos corantes em água destilada e mantidas no escuro até sua utilização. A concentração de 100mg/L foi testada para ambas substâncias fotossensibilizantes 1; 62.

(35)

Figura 7 – Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado.

Figura 8 – Esquema ilustrativo dos componentes do aparelho fotopolimerizador utilizado, após remoção do filtro de onda.

4.2.5 Preparação das placas

Para cada suspensão bacteriana obtida foram preparados 05 grupos de comparação e 02 grupos experimentais relativos à terapia fotodinâmica propriamente dita:

 Controle positivo: 90 µl de solução de digluconato de clorexidina a 0,12% foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura em teste (S. mutans ou amostra de saliva, previamente preparadas).

(36)

 Controle (CT + FA- ): 90 µl de solução do corante azul de toluidina (100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.  Controle (CM + FA-): 90 µl de solução do corante azul de metileno

(100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.  Controle (FS - FA + ) : uma suspensão, contendo 990 µl de caldo

BHI sacarosado a 10% e 10 µl do inóculo.

 Terapia fotodinâmica (CT + FA +): 90 µl de solução do corante azul de toluidina (100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.

 Terapia fotodinâmica (CM + FA +): 90 µl de solução do corante azul de metileno (100mg/L) foram adicionados a um tubo de ensaio contendo 900 µl de caldo BHI sacarosado a 10% e inoculado com 10 µl da cultura.

Cada uma das sete condições experimentais preparadas, a partir de suspensões de células mono (S. mutans) e multiespécies (amostras de saliva), foram dispensadas em tubos de ensaio estéreis, perfazendo um volume total de 01 mL para cada tubo.

Os tubos de ensaio foram agitados, para homogeneização das suspensões. Em seguida, 200 µL foram retirados de cada tubo e repicados para os poços da placa de microtitulação, em triplicata.

(37)

FIGURA 9 - Esquema ilustrativo da preparação das condições experimentais, a partir de suspensões mono e multiespécies.

4.2.6 Terapia fotodinâmica

Após preparação das placas, os poços destinados à terapia fotodinâmica foram irradiados. Como protocolo para aplicação da TFD, os corantes foram mantidos em contato com as suspensões microbianas durante 5 minutos, correspondendo ao tempo de pré-irradiação. Em seguida, realizou-se a fotoativação de cada poço por 60 segundos. Durante a irradiação, a ponteira do aparelho fotopolimerizador foi mantida em contato com a embocadura do poço, para evitar variação nessa distância. Um anteparo negro fosco foi utilizado para evitar o espalhamento de luz. Anteriormente à irradiação de cada placa, a intensidade de luz visível emitida pelo aparelho fotopolimerizador foi aferida, através de um radiômetro (Radiômetro RD-7, ECEL, Ribeirão Preto, SP, Brasil).

(38)

4.2.7 Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica

Imediatamente após o experimento, uma alíquota de 10 µL de suspensão bacteriana foi retirada de cada poço e diluída em 5mL de solução salina estéril, homogeneizada e semeada em placas contendo ágar BHI, suplementado com sacarose a 10%, para posterior avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica sobre as suspensões mistas e de S. mutans, a partir da contagem do número de unidades formadoras de colônia por mL. As placas de Petri e de microtitulação foram então incubadas a 37 ºC, em microaerofilia, durante overnight (Figura 10).

Após o período de incubação, o número de unidades formadoras de colônia foi obtido, e a conversão para a unidade UFC/mL, foi realizada a partir da multiplicação do valor obtido pelo fator de diluição em questão (2 X 10-3).

Figura 10 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito imediato da TFD.

4.2.8 Avaliação do efeito mediato da terapia fotodinâmica

(39)

procedimentos descritos anteriormente, desta vez, para avaliação do efeito mediato da terapia fotodinâmica, a partir da contagem de UFC/mL (Figura 11).

Figura 11 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD.

4.2.9 Avaliação do efeito da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécie

O sobrenadante foi aspirado de cada poço e em seguida descartado. Foram realizadas três lavagens com solução salina estéril, a fim de remover as células não aderidas. Em sequência, com o auxílio de alças estéreis descartáveis, o biofilme aderido foi desalojado das paredes dos poços e ressuspendido com a adição de 200 µL de solução salina estéril, adaptado de Stepanovic 46_.

(40)

Ao fim do experimento, as placas de microtitulação foram submentidas a uma segunda leitura através do espectofotômetro, para obtenção da DO final, correspondendo à medida de densidade ótica dos biofilmes multiespécies formados a partir das amostras de saliva e dos biofilmes monoespécie, a partir das suspensões de S. mutans (Figura 12).

Figura 12 – Esquema ilustrativo da sequência de procedimentos realizados para avaliação do efeito mediato da TFD na formação de biofilmes mono e multiespécies.

4.3 Análise Estatística

Os resultados obtidos foram analisados estatisticamente através dos testes de Kruskal-Wallis e Mann-Whitney, já que os dados não apresentaram uma distribuição normal. O nível de confiança utilizado para os testes foi de 95%.

(41)

5. RESULTADOS

Os resultados ora apresentados se referem aos ensaios realizados com as amostras de saliva e de S. mutans.

5.1 Avaliação do efeito imediato da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de toluidina

5.1.1 Suspensões multiespécies

No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as suspensões obtidas a partir das amostras de saliva, com a utilização do corante azul de toluidina, imediatamente após o experimento, uma diferença estatisticamente significativa foi observada para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 1.

TABELA 1 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de toluidina. Natal, 2011.

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CT a ₉

10.000 5.000 – 13.000

< 0,001 Controle negativo a ₉ _30.000 _21.000_–_101.000

Controle positivo b ₉ ₀ ₀

FA+ FS- a ₉ _76.000 _16.000_–_113.000

FA- CT+ a ₉ _59.000 _33.000_–_68.500

Letras iguais revelam ausência de diferença estatisticamente significativa.

(42)

ação destes aumentou aos valores de mediana. No entanto, a diferença significativa, foi mantida apenas para a comparação 2 a 2, realizada entre o controle positivo e demais grupos, com o valor de p permanecendo sempre menor do que 0,05.

5.1.2 Suspensões de S. mutans

No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de toluidina, imediatamente após o experimento, uma diferença estatisticamente significativa foi observada para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 2.

TABELA 2 - Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans, utilizando o

corante azul de toluidina. Natal, 2011.

Condição N MED Q 25 p

TFD CT a ₃

2.000 0

0,02 Controle negativo a ₃ _2.000 _2.000

Controle positivo a ₃ ₀ ₀

FA+ FS- a ₃ _2.000 _2.000

FA- CT+ a ₃ _8.000 _4.000

(43)

5.2 Avaliação do efeito imediato da terapia Fotodinâmica com utilização do corante azul de metileno

5.2.1 Suspensões multiespécies

No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as suspensões obtidas a partir das amostras de saliva, com a utilização do corante azul de metileno, imediatamente após o experimento, uma diferença estatisticamente significativa foi observada para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 3.

TABELA 3 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões multiespécies, utilizando o corante azul de metileno. Natal, 2011.

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CM a, b ₉

4.000 1.000 – 14.000

< 0,001 Controle negativo a ₉ _30.000 _21.000_–_101.000

Controle positivo b ₉ ₀ ₀

FA+ FS- a ₉ _76.000 _16.000_–_113.000

FA- CM+ a ₉ _42.000 _16.000_–_48.000

(44)

diferença significativa entre o controle positivo e o grupo no qual se aplicou a terapia fotodinâmica (p = 0,17), nem entre este último e o controle negativo, mesmo diante da acentuada redução provocada no valor de mediana (86, 6%).

5.2.2 Suspensões de S. mutans

No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de metileno, imediatamente após o experimento, não foi observada qualquer diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 4.

TABELA 4 - Mediana e quartil 25 dos valores de UFC/mL, imediatamente após o experimento, e significância estatística, para cada condição testada para suspensões de S. mutans. Natal, 2011.

TFD CM 3 _4.000 2.000

0,07 Controle negativo 3 2.000 2.000

Controle positivo 3 0 0

FA+ FS- 3 2.000 2.000

FA- CM+ 3 2.000 2.000

5.3 Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica com utilização do corante azul de toluidina

5.3.1 Análise a partir da contagem do número de UFC/mL

(45)

onde se foi possíver fazer a contagem, o número de UFC/mL foi bastante elevado. Esta situação foi semelhante para todos os grupos experimentais, com exceção para aqueles em que se utilizou a solução de digluconato de clorexidina a 0,12%, para os quais não foi verificado crescimento bacteriano, sendo o número de UFC/mL igual a zero (Figura 14).

Figura 13 – Fotografia demonstrando grande crescimento bacteriano.

Fonte: Acervo do pesquisador

Figura 14 – Fotografia demonstrando ausência de crescimento bacteriano.

(46)

5.3.2 Análise a partir da densidade ótica

5.3.2.1 Influência dos produtos testados sobre a densidade ótica do meio de cultura puro

Inicialmente, foi vista a necessidade de avaliar se a presença dos corantes azul de metileno e azul de toluidina e da solução de clorexidina alteraria a densidade ótica do meio de cultura puro. Tal alteração poderia causar erros quando da interpretação dos resultados, já que a DO final poderia estar aumentada, mas não devido ao crescimento bacteriano, e sim, pelo aumento na densidade ótica causada pelas substâncias adicionas ao meio de cultura. Os resultados dessa avaliação encontram-se na Tabela 5.

TABELA 5 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica e significância estatística para cada condição testada. Natal, 2011.

Condição n MED Q 25-75 p

Meio Puro 3 0,074 0,072-0,074

0,021 Meio + Clorexidina 3 0,075 0,073-0,086

Meio + Azul de Toluidina 3 0,339 0,327– 0,341

Meio + Azul de Metileno 3 0,189 0,187– 0,196 Fonte: Elaboração própria

(47)

5.3.2.2 Suspensões multiespécies

Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as suspensões mistas, com a utilização do corante azul de toluidina, aferida a partir da densidade ótica, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 6.

TABELA 6 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de

toluidina. Natal, 2011.

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CT a ₉

0,143 0,049 – 0,364

< 0,001 Controle negativo b ₉ _1,039 _0,931_–_1,094

Controle positivo a ₉ _0,084 _0,079_–_0,093

FA+ FS- b ₉ _0,897 _0,833_–_0,994

FA- CT+ a ₉ _0,154 _0,095_–_0,448

(48)

5.3.2.3 Suspensões de S. mutans

No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de toluidina, aferida a partir da densidade ótica, após overnight, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 7.

TABELA 7 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após

overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de

TFD CT a ₃

0,613 0,561

0,013 Controle negativo a ₃ _0,655 _0,589

Controle positivo a ₃ _0,067 _0,063

FA+ FS- a ₃ _0,716 _0,673

FA- CT+ a ₃ _0,343 _0,305

(49)

5.4 Avaliação do efeito mediato (overnight) da terapia fotodinâmica, com utilização do corante azul de metileno

Em relação à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as suspensões mistas, com a utilização do corante azul de metileno, aferida a partir da densidade ótica, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 8.

TABELA 8 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após

overnight, e significância estatística, para suspensões multiespécies, com o corante azul de

metileno. Natal, 2011.

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CM a ₉

0,421 0,304 – 0,503

Controle positivo c ₉ _0,084 _0,079_–_0,093

FA+ FS- b ₉ _0,897 _0,833_–_0,994

FA- CM+ a, b ₉ _0,307 _0,254_–_0,947

(50)

No que diz respeito à ação antimicrobiana da terapia fotodinâmica sobre as suspensões de S. mutans, com a utilização do corante azul de metileno, aferida a partir da densidade ótica, após overnight, foi verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 9.

TABELA 9 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD, após

overnight, e significância estatística, para suspensões de S. mutans, utilizando o corante azul de

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CMa ₃

0,630 0,464

FA+ FS- a ₃ _0,716 _0,673

FA- CM+ a ₃ _0,270 _0,259

(51)

5.5 Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de biofilme com utilização do corante azul de toluidina

5.5.1 Análise a partir da contagem do número de UFC/mL

Após o período de incubação, o número de UFC/mL de algumas placas não foi possível de ser obtido devido ao grande crescimento bacteriano observado, inviabilizando a contagem, tanto para as supensões de S. mutans, quanto para aquelas obtidas a partir da saliva, quer para TFD aplicada com o corante azul de toluidina, quer com o azul de metileno. Mesmo naquelas onde se foi possível fazer a contagem, o número de UFC/mL foi bastante elevado. Esta situação foi semelhante para todos os grupos experimentais, com exceção para aqueles em que se utilizou a solução de digluconato de clorexidina a 0,12%, para os quais não foi verificado crescimento bacteriano, sendo o número de UFC/mL igual a zero.

(52)

TABELA 10 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies, e significância estatística, com o corante azul de

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CT a ₉

0,131 0,081 – 0,246

Controle positivo a ₉ _0,052 _0,049_–_0,055

FA+ FS- b ₉ _0,528 _0,387_–_0,630

FA- CT+ a ₉ _0,047 _0,045_–_0,074

De acordo com a Tabela 10, os menores valores de densidade ótica exibidos foram referentes aos grupos TFD CT, controle positivo e o FA – CT +. Tal redução foi estatisticamente significativa quando da comparação entre o controle negativo e grupo na qual a TFD foi aplicada (p = 0,01), bem como entre os controles positivo e negativo (p < 0,001) e entre o grupo FA – CT + e o controle negativo, evidenciando a atividade antibacteriana do corante azul de toluidina, prevenindo assim a formação de biofilme, mesmo na ausência de fotoativação (p = 0,01).

(53)

TABELA 11 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies, e significância estatística, utilizando o corante azul de

TFD CT a ₃

0,229 0,228

FA+ FS- a ₃ _0,621 _0,261

FA- CT+ a ₃ _0,173 _0,157

A partir da análise da Tabela 11, é possível observar que houve apenas uma pequena redução no valor da mediana obtido para o grupo em que se aplicou a TFD, em relação ao controle negativo. No entanto, naquele em que a solução de clorexidina a 0,12% foi utilizada, houve uma acentuada redução, apresentando valor próximo ao zero, também em relação ao controle negativo. Uma redução também foi observada no valor de mediana obtido para o grupo FA- CT+, referente à ação do corante azul de toluidina. No entanto, a diferença significativa previamente encontrada, não se manteve após comparação grupo a grupo (p > 0,05).

5.6 Avaliação do efeito da terapia fotodinâmica sobre a formação de biofilme, com utilização do corante azul de metileno

(54)

verificada ocorrência de diferença estatisticamente significativa para a comparação realizada entre os grupos experimentais, conforme pode ser observado na Tabela 12.

TABELA 12 - Mediana, quartis 25 e 75 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes multiespécies e significância estatística, com o corante azul de

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CM a ₉

0,532 0,366 – 0,576

< 0,001 Controle negativo a ₉ _0,558 _0,494_–₇₈₁

Controle positivo b ₉ _0,052 _0,049_–_0,055

FA+ FS- a ₉ _0,528 _0,387_–_0,630

FA- CM+ a ₉ _0,338 _0,142_–_0,457

De acordo com a Tabela 12, os menores valores de densidade ótica exibidos foram referentes ao controle positivo e ao grupo FA – CM +, embora tal redução só tenha sido estatisticamente significativa quando da comparação entre o controle positivo e o negativo (p < 0,001). Com relação à pequena redução nos valores de DO, causada pela ação da TFD, essa não foi significativa, quando comparada ao controle negativo (p > 0,05).

(55)

TABELA 13 - Mediana e quartil 25 dos valores de densidade ótica, para o efeito da TFD sobre a formação de biofilmes monoespécies e significância estatística, utilizando o corante azul de

Condição N MED Q 25-75 p

TFD CMa ₃

0,185 0,133

FA+ FS- a ₃ _0,621 _0,261

FA- CM+ a ₃ _0,208 _0,159