Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada
Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br
Biociências PG-BGA
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE REPRODUTIVA DA
SINVASTATINA EM RATOS MACHOS ADULTOS
THAIS PETROCHELLI BANZATO
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional.
Profa Dra Wilma De Grava Kempinas
Programa de Pós-graduação em Biologia Geral e Aplicada
Distrito de Rubião Júnior s/n CEP 18618-000 Cx Postal 510 Botucatu-SP Brasil Tel (14) 3811-6148 Fax (14) 3811-6148 posgraduacao@ibb.unesp.br
Biociências PG-BGA
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“Julio de Mesquita Filho”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS DE BOTUCATU
AVALIAÇÃO DA TOXICIDADE REPRODUTIVA DA
SINVASTATINA EM RATOS MACHOS ADULTOS
THAIS PETROCHELLI BANZATO
Dissertação apresentada ao Instituto de Biociências, Campus de Botucatu, UNESP, para obtenção do título de Mestre no Programa de Pós-Graduação em Biologia Geral e Aplicada, Área de concentração Biologia Celular Estrutural e Funcional.
Profa Dra Wilma De Grava Kempinas
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO TÉCNICA AQUISIÇÃO E TRATAMENTO DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Banzato, Thais Petrochelli.
Avaliação da toxicidade reprodutiva da sinvastatina em ratos machos adultos / Thais Petrochelli Banzato. – Botucatu : [s.n.], 2013
Dissertação (mestrado) – Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Botucatu
Orientador: Wilma De Grava Kempinas Capes: 20600003
1. Reprodução. 2. Rato como animal de laboratório. 3. Toxicidade - Testes.
4. Experimentos clínicos. 5. Fármacos.
Dedico este trabalho a minha família , minha essência
vital: minha mãe meu pai e a minha irmã
Sólo el amor de una Familia apoyará,
cuando todo el mundo deja de hacerlo.
Sólo el amor de una Familia confiará,
cuando nadie otro cree.
Sólo el amor de una Familia perdonará,
cuando ninguno otro entenderá.
Sólo el amor de una Familia honrará,
no importa en qué pruebas haz estado.
Sólo el amor de una Familia resistirá,
por cualquier tiempo de prueba.
No hay ningún otro amor terrenal,
À Deus por guiar, intuir e me dar forças para lutar e aprender.
À minha mãe por todos os conselhos, por sempre estar disposta a me ouvir
ou apenas me abraçar quando não há nada a dizer. Ao meu pai que me
incentivou a estudar e ser integra com todos aqueles que estão ao meu
redor e a acreditar. A minha irmã Juliana por ser meu porto seguro e
minha melhor amiga.
À minha família por me dar oportunidades de estudo e por acreditar em
mim (Mainha, Mané, Tio Maurício).
Ao meu namorado Henrique por estar sempre ao meu lado.
À minha orientadora, Prof
aDr
aWilma De Grava Kempinas por confiar em
mim e no meu trabalho mesmo quando eu estava em outra instituição, por
me dar a oportunidade de fazer a iniciação científica e conhecer tantas
pessoas, por ser a pessoa que me proporcionou fazer o que eu amo, por
ter me incentivado a crescer e ser melhor e por ter me ensinar nesses 5
anos de ReproTox.
À Mariana que esteve comigo esses dois anos e fez com que esse trabalho
fosse realizado de uma forma mais agradável e menos árdua. Minha amiga
e companheira a quem devo esse trabalho. Foram momentos de luta,
aprendizado, derrotas, alegrias e conquista.
À Juliana Perobelli, Marina, Marci e Cibele por estarem presentes em
todas as etapas desse trabalho, por doarem seu tempo para me auxiliar e
ensinar dentro e fora do laboratório.
À Equipe ReproTox (a todas que também já saíram) pelo auxilio nos
tratamentos e nos sacrifícios, por todo suporte profissional.
Aos meus professores de toda a vida, desde a pré-escola até a
Pós-graduação.
estarem sempre dispostos a ajudar e ensinar.Ao Ênio pelo trabalho
durante horas e dedicação a esse trabalho.
À FAPESP (processo 2011/03632-2), CNPq e a CAPES pelo auxílio no
desenvolvimento desse projeto na forma de bolsa.
Ao técnico do Laboratório de Embriologia, José Eduardo, e à secretária
do departamento de Morfologia, Luciana, por sempre me aguentar e
resolver meus problemas.
Ao Dr. Gary Klinefelter, da Environmental Protection Agency (US–EPA),
EUA, pelo auxílio e idéias na elaboração do projeto.
À Drª Janete Aparecida Anselmo-Franci e seus colaboradores da USP –
Ribeirão Preto, pelas colaborações técnicas.
A minha querida professora de Inglês Margarete por toda paciência e
ajuda.
Aos ratos que deram a vida por esse trabalho.
Aos membros titulares e suplentes da Banca, pela disposição e atenção.
À minha amiga Luana que mesmo tão longe me ajudou tanto nessa
pesquisa.
"Toda
arte de viver
está na delicada mistura
de
desistir e insistir
"
Sumário
1. Introdução ... 1
2. Mecanismo de ação das estatinas. ... 1
3. Tipos de estatinas. ... 3
4. Usos clínicos das estatinas ... 5
4.1 Hiperlipidemia primária: Hipercolesterolemia familiar ... 5
4.2 Hiperlipidemias secundárias ... 6
5. Efeitos pleitropicos das estatinas ... 6
6. Efeitos adversos das estatinas ... 7
7. Colesterol e a síntese de testosterona ... 8
8. Estatinas no Sistema Genital Masculino ... 10
9. Efeitos pleiotrópicos da sinvastatina no Sistema Genital Masculino ... 11
10. Relevância do Tema ... 12
11. Capítulo 1……… 13
Abstract……… 15
Introduction……….. 16
Material and Methods………... 17
Results……….. 21
Discussion……… 22
Conclusion……… 25
Acknowledgements……….. 25
References ... 26
Tables and Figures ... 21
12. Capítulo 2... 38
Resultados... 43
Discussão... 45
Agradecimentos... 45
Referências... 46
13. Conclusões ... 48
14. Referências Bibliográficas ... 49
15. Apêndices ... 56
1. Introdução
As dislipidemias são alterações no metabolismo das lipoproteínas plasmáticas. Nos últimos anos um dos principais fatores para o aumento da prevalência desta desordem entre adultos é o crescente índice de obesidade, associado à síndrome metabólica, stress, falta de exercícios físicos regulares e má alimentação (Goldstein et al., 1996; Schachter, 2005).
As dislipidemias são classificadas de acordo com o tipo de lipídio que se encontra alterado no sangue, e desta forma destacam-se quatro principais disfunções: hipercolesterolemia isolada (LDL-c ≥ 160 mg/dL), hipertrigliceridemia isolada (triglicerídeos ≥ 150 mg/dL), dislipidemia mista, correspondente a associação de hipercolesterolemia (LDL-c ≥ 160 mg/dL) e hipertrigliceridemia (triglicerídeos ≥ 150 mg/dL) e a redução dos níveis de HDL-c (níveis séricos < 40 mg/dL para homens e < 50 mg/dL para mulheres) que pode ainda estar associada ao aumento do LDL-colesterol e/ou aumento de triglicerídeos (SBC, 2007).
O aumento nos níveis de colesterol no sangue é considerado um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento da aterosclerose, que frequentemente leva a doenças circulatórias, cerebrovasculares e doenças vasculares periféricas (Alarcon et al., 2003). A partir da década de 70 o tratamento farmacológico mais indicado para dislipidemias foi o uso das estatinas.
As estatinas inibem a síntese de colesterol no organismo o que leva à redução dos níveis de colesterol no sangue, reduzindo o risco de doenças causadas por ele (Endo, 1992). O mecanismo de ação das estatinas para obtenção da redução do colesterol se deve a inibição da enzima HMG-CoA (3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA) redutase, por meio de uma afinidade destes fármacos com o sítio ativo da enzima (Marie et al., 2008). Esta inibição é reversível e competitiva com o substrato HMG-CoA (Vladutiu, 2007). O colesterol é precursor dos hormônios esteroides e, consequentemente, fármacos que diminuem os níveis de colesterol livre, tais como as estatinas, podem influenciar na esteroidogênese (Dobs et al., 2000).
2. Mecanismo de Ação das Estatinas
da síntese de colesterol e, simultaneamente, aumento da síntese do receptor para LDL-c nas células hepáticas, aumentando a depuração do LDL-c (Hamelin & Turgeoun, 1998; Fonseca, 2005).
Figura 1. Mecanismo de ação das estatinas.
As estatinas atuam primariamente no fígado, onde um sistema especial de transporte permite sua incorporação ao tecido hepático para biotransformação, com ampla variação tanto no seu sítio metabólico, quanto na formação de metabólitos ativos, culminando na sua eliminação pela bile (Schachter, 2005; Lecarpentier et al., 2012).
3. Tipos de Estatinas
Diferenças estruturais entre as estatinas podem explicar parcialmente as diferenças no seu potencial de ação (Schachter, 2005) (Figura 2).
Figura 2. Estrutura química das diferentes estatinas. Adaptado de Schachter, 2005.
Existem consideráveis diferenças farmacocinéticas entre as estatinas, bem como no coeficiente de hidrofilicidade, via hepática de metabolização (especialmente, do citocromo P450 e isoenzimas), meia-vida plasmática e eficácia na redução lipídica. As estatinas também podem diferir na capacidade de interação com outras drogas que utilizam a mesma via de metabolização (Schachter, 2005, Lecarpentier et al., 2012) (Tabela 1)
Tabela 1. Propriedades farmacocinéticas das estatinas. Adaptado deLecarpentier et al.(2012).
pró-fármacos, forma de transporte inativo que in vivo, mediante reação química ou enzimática, libera o princípio ativo no local de ação. Já as estatinas que possuem o anel de lactona aberto são fármacos ativos.
São utilizados três métodos no desenvolvimento dos fármacos hipolipemiantes que caracterizam sua geração: Estatinas de primeira geração que são desenvolvidas através da seleção química de produtos fúngicos (ex.sinvastatina); Segunda geração através da modificação microbiana de compostos fúngicos (ex pravastatina); e finalmente estatinas de terceira geração desenvolvidas através da produção de compostos sintéticos (ex.fluvastatina e atorvastatina) (Bellosta et al., 2004; Lecarpentier et al., 2012).
As estatinas atualmente disponíveis possuem geralmente uma baixa biodisponibilidade sistêmica, indicando extração extensiva de primeira passagem (Lennernas, 2003; Martin et al., 2003). Os tempos de meia-vida da sinvastatina (2 horas), fluvastatina (1,2 horas) e pravastatina (1,8 horas) são curtos quando comparados às estatinas de terceira geração: atorvastatina (14 horas), rosuvastatina (19 horas) e pitavastatina (11 horas). Estatinas cuja meia-vida é menor que 3 horas aumentam sua eficácia quando ingeridas à noite, quando a taxa de síntese de colesterol endógeno é mais elevada. Ao passo que, estatinas de terceira geração que possuem meia vida acima de 10 horas são mais eficazes na diminuição do LDL-colesterol.
Atorvastatina, fluvastatina, lovastatina e sinvastatina são compostos relativamente lipófilos, enquanto a pravastatina e rosuvastatina são mais hidrófilos, como resultado de um grupo hidroxilo polar e grupo sulfonamida de metano, respectivamente (McTavish & Sorkin, 1991; McTaggart et al., 2001). Estatinas lipofílicas são mais susceptíveis ao metabolismo pela via do citocromo P450 (Schachter, 2005; Lecarpentier et al., 2012).
As estatinas são predominantemente metabolizadas pelo citocromo P450, o que aumenta a possibilidade de interação medicamentosa com fármacos que compartilham dessa mesma via. Essa interação pode causar toxicidade no músculo e aumentar a disponibilidade das estatinas no plasma sanguíneo, aumentando o risco de efeitos tóxicos (Schachter, 2005; Lecarpentier et al., 2012).
Todas as estatinas são hepatoseletivas por inibir a ação da HMG-CoA redutase, dado que a maioria da produção endógena do colesterol ocorre no fígado. Os mecanismos que contribuem para esta propriedade de hepatoseletividade são regidos pelo perfil de solubilidade da estatina. Para estatinas lipofílicas, a difusão passiva através das membranas celulares dos hepatócitos é responsável pela eficiente absorção de primeira passagem, enquanto que para as estatinas hidrofílicas, a absorção mediada por proteínas transportadoras é o principal mecanismo (Hamelin & Turgeoun, 1998; Nezasa et al., 2003).
As estatinas são altamente eficazes na redução dos níveis de LDL-C, apesar de existirem
Tabela 2. Doses das estatinas e efeitos sobre o LDL-c. Fonte: Jones et al. (2003).
Redução LDL-c
(%) Aumento HDL-c (%) Redução do Triglicérides (%)
Atorvastatina 50 6 29
Cerivastatina 28 10 13
Fluvastatina 24 8 10
Lovastatina 34 9 16
Pravastatina 34 12 24
Sinvastatina 41 12 18
Rosuvastatina 63 10 28
Pitavastatina 48 - 23
4. Usos Clínicos das Estatinas
A hipercolesterolemia é caracterizada pelo aumento do colesterol total circulante no sangue e pode estar associada à obesidade, alta ingestão de alimentos ricos em colesterol, baixa ingestão de fibras devido à alimentação inadequada ou ainda ser um problema de ordem genética (Lecarpentier et al., 2012).
4.1 Hiperlipidemia Primária: Hipercolesterolemia Familiar
Hipercolesterolemia familiar (HF) é uma desordem do metabolismo lipídico (Goldstein et al., 1996) caracterizada por níveis elevados de colesterol total e LDL-c, xantomas de tendão, histórico familiar de hipercolesterolemia e doenças cardiovasculares prematuras. Pacientes com HF têm um risco aumentado para doenças cardiovasculares, sendo que cerca de 50% dessas pessoas desenvolvem doença coronariana antes dos 50 anos de idade (Slack, 1969; Stone et al., 1974; Dirisamer et al., 2003).
Estudos epidemiológicos têm mostrado alta prevalência de hipercolesterolemia em crianças. A principal causa de dislipidemia genética em crianças é a Hipercolesterolemia Familiar. A segurança e eficácia do tratamento de pacientes pediátricos com estatinas parecem ser similares às observadas em adultos (Charakida et al., 2006). No entanto, pouco se conhece sobre o uso das estatinas em crianças e seus efeitos a longo prazo, manifestados na vida adulta (McCrindle et al, 2007).
4.2 Hiperlipidemias Secundárias
As hiperlipidemias secundárias ocorrem por uma combinação de fatores, incluindo a obesidade, hipertensão, intolerância à glicose, maus hábitos alimentares e estilo de vida sedentário. O aumento nos níveis de colesterol é um dos principais fatores de risco para o surgimento de doenças cardiovasculares.
Nas últimas décadas as estatinas têm se destacado como uma das estratégias mais efetivas para a redução dos riscos de doenças cardiovasculares (Shepherd et al., 2002; Sever et al., 2003; LaRosa et al., 2005). Atualmente, doenças ateroscleróticas estão entre as causas mais importantes de morte no mundo, sendo responsáveis por 38% das mortes na América do Norte. Na Europa, é considerada a causa mais comum de morte em homens com menos de 65 anos e a segunda causa mais comum em mulheres (Murray & Lopez, 1997). Os pacientes tratados com estatinas têm menor mortalidade cardiovascular em comparação com os indivíduos sem terapêutica e concentrações semelhantes de lipoproteínas, como mostrado em estudos epidemiológicos (Massy et al 1996, Sacks et al, 1996, Shepherd et al, 1995).
5. Efeitos Pleitropicos das Estatinas
Recentemente tem havido um interesse crescente pelos benefícios clínicos das estatinas, não diretamente relacionados com a sua ação hipolipemiante. São os chamados efeitos pleiotrópicos (Zeichner et al., 2012), tais como ação antioxidante, anti-inflamatória, proteção anti-trombótica e vascular (estabilização da placa de ateroma, melhora da função endotelial), ações imunomoduladoras, aplicação nas doenças reumáticas e aumento da disponibilidade do óxido nítrico (Zeichner et al., 2012). A supra-regulação de óxido nítrico endotelial melhora a função endotelial vascular, reduz a quantidade de espécies oxidantes reativas, melhora a resposta fisiopatológica (Liao, 2002; Endres, 2005), diminui a regulação de citocinas pró-inflamatórias, estabiliza a placa aterosclerótica, normaliza o fluxo simpático, diminui a ativação da cascata de coagulação sanguínea e inibe a agregação de plaquetas (Zeichner et al., 2012).
O potencial terapêutico das estatinas na prevenção e tratamento de doenças malignas também tem sido observado em pacientes com câncer da mama, colo, próstata, pulmão, fígado e câncer hematológico. Embora uma quantidade substancial de evidências sugira função preventiva ou como uma opção de tratamento adjuvante em doentes com câncer, recomendações e diretrizes sobre o seu uso em doenças malignas não estão disponíveis. Vários estudos randomizados controlados estão atualmente em curso para elucidar a relação entre estatinas e neoplasias (Zeichner et al., 2012).
6. Efeitos Adversos das Estatinas
As estatinas são medicamentos utilizados em larga escala e, portanto, há necessidade de conscientização dos benefícios, bem como dos riscos que seu uso pode acarretar, uma vez que seus efeitos adversos podem causar impacto significativo na saúde pública (Cimino et al., 2007).
O colesterol é intermediário de uma variedade de produtos adicionais de fundamental relevância para a saúde e o bem-estar: vitamina D, sais biliares, hormônios produzidos no córtex supra-renal como glicocorticóides, hormônios sexuais, inclusive a testosterona, estrógenos e a progesterona (McClure et al., 2007; Golomb & Evans, 2008). Ele é o precursor da vitamina D, dos sais biliares, funciona como um poderoso antioxidante e é vital para função neurológica. Tem um papel fundamental na formação da memória e na captação de hormônios no cérebro, inclusive a serotonina. Finalmente, colesterol é o precursor de todos os hormônios produzidos no córtex supra-renal, inclusive os glicocorticóides, que regulam os níveis de açúcar no sangue e os mineralocorticóides que regulam o equilíbrio mineral. O córtex supra-renal e as gônadas também produzem os hormônios sexuais, inclusive a testosterona, os estrógenos e a progesterona, a partir do colesterol (McClure et al., 2007).
Todos os agentes hipolipêmicos possuem efeitos adversos cujos riscos devem ser avaliados em relação aos benefícios potenciais do tratamento. Os principais efeitos adversos encontrados em adultos foram: disfunções no sistema gastrointestinal (constipação, diarréia, flatulência, dor abdominal e dispepsia), nos músculos (mialgia, rabdomiólise), fígado (elevação das enzimas hepáticas), dores de cabeça, fadiga, erupções na pele, coceira e distúrbios do sono (Schachter, 2005).
pacientes tratados), e está relacionada à dose utilizada, bem como à combinação com agentes que partilham vias metabólicas comuns (Ballantyne et al., 2003) como a ciclosporina, eritromicina, itraconazol, cetoconazol e os fibratos niacina, particularmente gemfibrozil (Fonseca, 2005).
O colesterol é reagente de partida para a biossíntese de vários hormônios como estrógenos, progesterona e testosterona. Especula-se que as estatinas, por reduzir o colesterol, possam acarretar disfunção na produção dos hormônios supra-renais e gonadais, o que pode conduzir a problemas na disponibilidade de glicose do sangue, edema, deficiências minerais, inflamação crônica, dificuldade nos processos de cura, alergias, asma, bem como redução da libido e infertilidade, dentre outros problemas do sistema genital (Cyrus-David et al., 2005).
7. Colesterol e a Síntese de Testosterona
O colesterol é precursor dos hormônios esteroides e, consequentemente, fármacos que diminuem os níveis de colesterol livre, tais como as estatinas, podem influenciar na esteroidogênese (Dobs et al., 2000). Como o sistema endócrino desempenha um papel crítico no desenvolvimento e função do sistema genital masculino, este deve ser considerado um alvo particularmente vulnerável a potenciais perturbações endócrinas (Johnson et al., 1997).
Figura 6: Representação esquemática do controle hormonal durante a espermatogênese.
A síntese de testosterona ocorre a partir do colesterol através de sequência de cadeias enzimáticas dentro células de Leydig. O colesterol utilizado para a síntese de testosterona pode ser obtido pelas células de Leydig por síntese “DE NOVO” que pode ser obtido através de ésteres de colesterol armazenados na matriz intracelular ou a partir de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) colesterol extracelular (DeGraaf et al., 2004) (Figura 7).
Devido ao aumento da incidência de dislipidemias e aumento da intervenção farmacológica por meio de fármacos, tornam-se relevantes e necessários estudos que proponham investigar as possíveis consequências reprodutivas da exposição às estatinas, fármacos de ampla utilização clínica.
8. Estatinas no Sistema Genital Masculino
Sendo o colesterol necessário para a síntese de testosterona, os efeitos das estatinas sobre os níveis desse hormônio têm sido objeto de várias investigações (De Graaf et al., 2004). Estatinas podem interferir na síntese de testosterona de três maneiras. A primeira, com a diminuição do LDL-colesterol do plasma sanguíneo, culminando na redução da quantidade de LDL-colesterol total oferecido às células de Leydig. Em segundo lugar, ocorre na hipercolesterolemia familiar, onde o LDL-receptor não é funcionante (Jay et al.,1991 & Ginsberg et al., 2001), o que torna a célula de Leydig mais dependente de nova síntese do colesterol. Finalmente, as estatinas podem inibir a síntese de colesterol diretamente nos testículos, apesar de serem drogas seletivas ao fígado (Azzarito et al., 1996).
De fato, embora não tenha sido comprovado, acredita-se que o uso em longo prazo das estatinas pode causar uma diminuição da libido, devido a uma redução no nível sérico de testosterona, que depende diretamente de colesterol para a sua síntese (Ormiston, 2004). Estudos que relacionam o uso de estatinas com a diminuição nos níveis de testosterona são controversos. De Graaf et al (2004) relataram essa diminuição e chegaram à conclusão que essa condição está relacionada à depleção de colesterol intracelular. Azzarito et al. (1996), encontraram uma diminuição significativa nos níveis de testosterona livre em pacientes hipercolesterolêmicos que receberam tratamento com sinvastatina. Da mesma forma, homens expostos a sinvastatina (80 mg/dia) durante 12 meses apresentaram pequenas quedas de testosterona total, livre e biodisponível, porém não houve aumento compensatório nos níveis séricos de FSH e LH (Dobs et al., 2000). Outros estudos corroboram os resultados mencionados (Gutai et al., 1981; Heller et al., 1983; Dai et al., 1984; Rizvi et al., 2002).
(hCG), índice de testosterona livre, hormônio folículo-estimulante (FSH) , o hormônio luteinizante (LH), ou globulina (SHBG), quando comparado com o grupo placebo.
Uma possível explicação para a ausência de alterações nos níveis de testosterona no sistema genital masculino, após tratamento com estatinas, pode estar na capacidade dos testículos de se adaptarem as estatinas através de mecanismos de compensação, aumentando a produção de colesterol pelas células de Leydig. Tais efeitos foram de fato observados em ratos. A estatina inibiu a produção de testosterona, em curto prazo, enquanto que a exposição prolongada a estatina foi associada com a recuperação da produção de testosterona, em paralelo com a proliferação de retículo endoplasmático liso e peroxissomas (Andreis et al., 1990; Duleba et al, 2006).
Estudos em animais também demonstraram não haver efeitos adversos das estatinas sobre hormônios e parâmetros reprodutivos. Cães machos receberam 0, 10, 40 ou 120 mg/kg de atorvastatina, por via oral, durante 104 semanas, não apresentaram alterações relacionadas com a droga na cor e no volume de sêmen, na contagem, concentração, morfologia, progressividade e motilidade espermática. Também não houve efeitos no peso ou histopatologia dos órgãos reprodutivos (Dostal et al., 2001).
Dostal et al., 1996, em estudo de fertilidade masculina utilizando ratos expostos a atorvastatina nas doses 20, 100 ou 175 mg / kg administrada em ratos, durante 11 semanas, não observaram efeitos na reprodução e fertilidade. Não houve efeitos sobre os testículos, epidídimos, peso dos órgãos acessórios, histopatologia, contagem, motilidade e morfologia de espermatozoides (Dostal et al., 1996).Corroborando resultados anteriores, Dostal et al. (2000), em um estudo com159 pacientes do sexo masculino, expostos a sinvastatina e pravastatina durante 12 e 24 semanas, observaram não haver diferenças entre o grupo tratado e controle em relação a concentração espermática, volume ejaculado, ou motilidade espermática.
9. Efeitos Pleiotrópicos da Sinvastatina no Sistema Genital Masculino
tumoral, fornecendo uma justificativa para futuros estudos sobre o papel dessa classe de medicamentos na prevenção de câncer de próstata.
Recentemente, vários estudos têm revelado que o tratamento com estatinas é eficaz em reverter disfunção erétil em homens com hipercolesterolemia, quando este era o único fator de risco (Saltzman et al., 2004). Doğru et al. (2008) estudaram 74 pacientes com hiperlipidemia tratados com 40 mg de atorvastatina por 12 meses e seus resultados demonstraram que as estatinas reduzem os níveis séricos de lipídios regulamentando por funções autonômicas e função endotelial, os quais têm um efeito sobre a capacidade erétil. Portanto, pode-se dizer que o tratamento com estatinas tem um efeito protetor sobre a função erétil em pacientes com hiperlipidemia.
10. Relevância do Tema
Capítulo 1
Artigo submetido ao periódico
Simvastatin exposure impairs sperm quality and fertility of adult male rats
Thais Petrochelli Banzato1, BSc; Mariana Macedo de Oliveira2; Juliana Elaine Perobelli3, PhD;
Marciana Sanabria1, MSc; Cibele dos Santos Borges1, MSc and Wilma De Grava Kempinas4, PhD
1 Graduate Course in General and Applied Biology, UNESP – Univ Estadual Paulista, Botucatu –
SP, Brazil
2 Undergraduate Course in Biological Sciences, UNESP – Univ Estadual Paulista, Botucatu, SP,
Brazil
3 Graduate Course in Cellular and Structural Biology, UNICAMP – Univ Estadual de Campinas,
Campinas, SP, Brazil
4 Department of Morphology, Institute of Biosciences, UNESP – Univ Estadual Paulista, Botucatu, SP, Brazil
Corresponding Author:
Abstract
Introduction. Statins are lipid lowering agents extensively used in human clinical medical. They
exert their effects through inhibition of HMG-CoA reductase, a crucial enzyme in cholesterol synthesis. Since cholesterol is the precursor of steroid hormones, drugs that decrease cholesterol may damage male reproductive function.
Aim. Investigate the effects of the exposure to different doses of simvastatin on the reproductive
parameters of adult male Wistar rats.
Methods. Thirty rats were randomly assigned into three groups: simvastatin (20 or 40 mg/kg),
control (vehicle - DMSO/oil), and were treated for 30 days orally for evaluation of reproductive parameters after euthanasia.
Main Outcome Measure. Weight of the reproductive organs; sperm counts, motility and
morphology; histopathology; hormonal levels and fertility.
Results. The weight of reproductive organs, sperm motility and histopathology analysis were
similar among groups. There was a decrease in sperm production and epididymis sperm number, uterus weight with fetuses, implant and live fetuses numbers in simvastatin groups. The animals exposed to simvastatin showed an increase in the pre-implantation loss and sperm with abnormal morphology.
Conclusion. The observed effects on reproductive parameters could be associated with toxic effects
of simvastatin on spermatogenesis, causing potential damage to male fertility.
Introduction
Dyslipidemias are defined as changes in the metabolism of plasma lipoproteins. In recent years, one major factor for the increased prevalence of this disorder in adults is the growing rate of obesity associated with metabolic syndrome, stress, lack of regular exercise and poor diet quality [1].
Among the classes of drugs available for dyslipidemia treatment, statins are the most prominent. Increased blood levels of cholesterol is considered a major risk factor for the development of atherosclerosis and this class of drugs have emerged as one of the most effective strategies for reducing the risk of cardiovascular disease [2-3].
Statins are inhibitors of the enzyme 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG-CoA reductase), essential for the synthesis of cholesterol and isoprenoid metabolites. Isoprenylation is necessary for the activation and intracellular transport of these proteins that control multiple pathways and cell functions, including cell proliferation, differentiation, cytokine expression and cell shape [4]. The inhibition of HMG-CoA reductase decreases the levels of LDL-C by two mechanisms of action: decrease in cholesterol synthesis and simultaneously increased synthesis of the receptor for LDL-C in the liver cells, elevating the clearance of LDL-C [5].
In this context, the present experimental study is relevant and necessary, since it aims to investigate the possible consequences of statins exposure during adulthood on reproductive parameters and fertility in rats.
Material and Methods
Animals
The experimental procedures were approved by the local Ethics Committee for the Use of Experimental Animals (protocol number 282-CEEA) and are in accordance with the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (National Institutes of Health).
Adult male (70 days old, 340–500 g) and female (60 days old, 200–220 g) Wistar rats were obtained from the Central Biotherium of UNESP – Univ Estadual Paulista, and maintained under controlled conditions (25°C, 30% air humidity, 12/12-h light/dark cycle) with food and water available ad libitum.
Drugs and Solutions
Drugs were obtained from the following sources: simvastatin (Galena, China), and Dimethylsulphoxide (DMSO) from Sigma (St. Louis, MO, USA). simvastatin was diluted in 10% dimethylsulfoxide and 90% corn oil solution.
Experimental Design
Adult male rats (n=10/ simvastatin experimental dose) were treated with 20 or 40 mg/kg/day of simvastatin diluted in dimethylsulfoxide (DMSO) and corn oil (10 % and 90%, respectively), by gavage (oral route) for 30 consecutive days. The respective control animals (n=10) received only vehicle (DMSO and corn oil, in the same rate). The doses of simvastatin (20 or 40mg/Kg of body weight/day) were chosen based on the lowest doses used in humans.
1- Body and Reproductive Organs Weights
The animals were weighed and euthanized by decapitation on the day after the end of treatment. The right testis, epididymis, vas deferens, ventral prostate, and seminal vesicle (without the coagulating gland) were removed, and their weights were determined.
2- Hormonal Levels
After decapitation, blood was collected (between 9:00 and 11:30 AM) and serum was obtained by centrifugation (1236 × g, for 20 min at 4 °C). The concentrations of testosterone, luteinizing hormone (LH) and follicle-stimulating hormone (FSH) were determined by the technique of double antibody radioimmunoassay. Testosterone assay was performed using a TESTOSTERONE MAIA® kit (Biochem Immuno System). The LH and FSH assays were done using specific kits supplied by the National Institute of Arthritis, Diabetes and Kidney Diseases (NIADDK, USA). The testicular fluid was obtained by centrifugation (1236 × g, for 30 min at 4 °C) of the decapsulated testis and destined to testosterone dosage, as described above.
` All samples were assayed in duplicate and in the same assay to avoid inter-assay errors. The intra-assay error was 3.4% for LH, 2.8% for FSH and 4% for testosterone.
3- In Utero Artificial Insemination and Fertility Evaluation
4- Fertility Evaluation
Twenty days later, the artificially inseminated females were euthanized by decapitation to enable evaluation and calculation of the fertility and reproductive performance parameters. After collection of the uterus and ovaries the numbers of corpora lutea, implants, reabsorptions, live and dead fetuses were determined. From these results the following parameters were calculated: fertility potential (efficiency of implantation): implantation sites/corpora lutea × 100, and rate of post-implantation loss: [number of post-implantations - number of live fetuses]/number of post-implantations ×100.
5- Histological Analysis of Testes and Epididymis
The left testis and epididymis were fixed in Bouin solution for 24 hr. The pieces were embedded in paraffin wax and sectioned at 5 µm and subsequently stained with hematoxylin and eosin (H.E). Testis and epididymis sections were examined by light microscopy following specific guidelines for toxicological studies [10].
6- Sperm Motility and Morphology
Sperm motility was evaluated in the sperm sample used for in utero insemination. For this, an aliquot of 10μL of epididymis cauda sperm suspensions used for the artificial insemination was immediately transferred to a Makler chamber maintained at 34oC. Using a phase-contrast
microscope (400 x magnification), 100 sperm were counted and classified as Type A (mobile with progressive movement) Type B (mobile without progressive movement) and Type C (immobile).
i.e., no tail attached) and tail morphology (broken or rolled into a spiral) [12]. Sperm were also classified as to the presence or absence of the cytoplasmic droplet.
7- Sperm counts, Daily Sperm Production, and Sperm Transit Time through the Epididymis
Homogenization-resistant testicular spermatids (stage 19 of spermiogenesis) in the testis were counted as described previously [11], with adaptations adopted by Fernandes et al. [13]. Briefly, the testis, decapsulated and weighed soon after collection, was homogenized in 5 ml of NaCl 0.9% containing Triton X 100 0.5%, followed by sonication for 30 s. After a 10-fold dilution, one sample was transferred to Neubauer chambers (4 fields per animal), and mature spermatids were counted. To calculate the daily sperm production (DSP), the number of spermatids at stage 19 was divided by 6.1, which is the number of days of the seminiferous cycle during which these spermatids are present in the seminiferous epithelium. In the same manner, caput/corpus and cauda epididymidis portions were cut into small fragments with scissors and homogenized, and sperm counted as described for the testis. The sperm transit time through the epididymis was determined by dividing the number of sperm in each portion by DSP.
Statistical analysis
Results
Final body weight and the absolute and relative weights of male reproductive organs were comparable among the three experimental groups (Table 1). The serum levels of testosterone, LH, FSH and the levels of intratesticular testosterone were similar among the studied groups (Figure 1). In the same way, the histopathological analysis of the testis and epididymis (data not shown) did not show significant differences that could be attributed to simvastatin exposure.
There was a statistically significant decrease in sperm production in the testes, sperm counts in the caput corpus epididymis and sperm reserves in the cauda epididymis of treated animals (20 and 40 mg/kg/day) compared with the control group (Table 2). The sperm transit time through the caput / corpus and cauda epididymis (Table 2), as well as the sperm motility (Figure 2), were also similar among control and treated animals.
The percentage of sperm with abnormal morphology (head and cauda abnormalities) was statistically higher in both groups treated with simvastatin (Table 4). In all experimental groups, the cytoplasmic droplet was localized in the middle region of the sperm tail. However, in the simvastatin groups (20 and 40 mg/kg/day) the percentage of spermatozoa with cytoplasmic droplet was statistically higher when compared to control group (Table 4).
Discussion
Statins are inhibitors of the 3-hydroxy-3-methylglutaryl-coenzyme A reductase (HMG CoA reductase), an essential enzyme for the synthesis of cholesterol. Since these drugs are used in large scale, it is necessary the awareness of the benefits and risks of their use, since their adverse effects may reflect a significant impact on public health [14]. In this context, the present study aimed to investigate the effects of different doses of simvastatin on reproductive parameters, using the rat as experimental model.
The absence of changes in the final body weight of the experimental animals indicates that the simvastatin exposure did not induce systemic toxicity. In the same way, the animals exposed to simvastatin did not show changes in the absolute and relative weights of the reproductive organs, corroborating the results of Dostal et al. [15] in a study with male rats exposed to 20, 100 or 175 mg/kg of atorvastatin orally for 11 weeks. The absolute and relative weights of the reproductive organs are considered important parameters in the evaluation of toxic effects and risks of a chemical on the male reproductive system [16].
The analysis of testis and epididymis histopathology did not reveal injuries that could be attributed to simvastatin treatment. Histopathologic evaluation is generally accepted as the sensitive parameter for the detection of adverse effects of chemicals on male reproductive system [17]. Shalaby et al. [18] observed that the testes of hypercholesterolemic rats were degenerated and present atrophied seminiferous tubules associated with arrest of spermatogenesis. In this previous study, oral administration of alpha-tocopherol (3mg/kg/day) and simvastatin (1mg/Kg/day) concomitantly for 65 days resulted in normal histopathology of the seminiferous tubules.
consequently, the Leydig cell depends on the new cholesterol synthesis. Finally, statins inhibit cholesterol synthesis in the testes directly, although it is a selective drug to the liver [22].
Studies associating the use of statins and modifications in testosterone levels are controversial. Azzarito et al. [22] found a slight decrease in free testosterone levels of hypercholesterolemic patients treated with simvastatin (40 mg/day) for a year. Likewise, Kalo [23] observed a decrease in testosterone levels in rats exposed to simvastatin (25, 50 and 100 mg/day) for 30 or 60 days, corroborating previously reported data [24-28]. In contrast, some studies found no adverse biological effects on steroidogenesis in males exposed to statins [29]. The administration of pravastatin [30] and simvastatin [31] in humans showed no effects on circulating testosterone, LH or FSH. Similarly, the present study did not show changes in serum testosterone, FSH, LH and intratesticular testosterone level after simvastatin administration, corroborating previous studies [27, 32-33].
One possible reason for the absence of changes in testosterone levels after simvastatin exposure could be the testes ability to adapt to statins through compensatory mechanisms that increase cholesterol production by Leydig cells [34]. It is possible that statin inhibit the production of testosterone in short term treatments, while prolonged exposure to statin was associated with recovery of testosterone production associated with proliferation of smooth endoplasmic reticulum and peroxisomes [34-35]. An in vitro study suggested a different mechanism, in which the HDL-C works as a substitute for regular testicular steroidogenesis through a route of apolipoprotein Leydig cell [36].
death and autophagy. Studies indicate that statins can induce autophagy in tumor cells [38-39] as well as stem cells, vascular endothelial cells, cardiac cells and osteoblasts [40].
The sperm transit time through the epididymis, process that exerts an important role in the sperm maturation [9], and sperm motility were not changed, as seen in the study of Dostal et al. [29], in which male dogs were exposed to 0, 10, 40 or 12mg/kg of atorvastatin orally up to 104 weeks. However, the simvastatin-exposed animals showed a significant increase in the amount of sperm presenting cytoplasmic droplets compared to the control group, also indicating an impairment of sperm quality [41]. The presence of spermatozoa with droplets has been suggested to reflect low adhesion to the zona pellucida. Thus, droplet loss at ejaculation is necessary for fertility process [42].
It is known that the presence of sperm morphology abnormalities may be associated with the toxic effects of chemicals on the spermatogenesis or sperm maturation process, and may reflect germ cell mutagenicity [43]. In the present study, there was an increase in the percentage of sperm with morphological abnormalities in the head and tail in the treated groups. The percentage of sperm cells with abnormal morphology may be associated with decreased fertilizing potential [44].
Conclusion
The exposure to simvastatin, in these experimental conditions, compromised sperm production and quality in rats, as shown by the results of sperm count and morphology, besides the fertility test, done by in utero artificial insemination. If simvastatin acts on the reproductive system of man as it does in rats, these results can represent a potential damage to the male fertility, considering the lower reproductive efficiency in the human species compared to that of rodents. Furthermore, additional studies are needed to better investigate possible DNA damage in sperms from animals exposed to simvastatin, and consequent risk to male fertility of animals exposed to the drug, as well as their subsequent generations.
Acknowledgements
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Table 1: Final body weight and absolute and relative reproductive organ weights of male rats from control and simvastatin groups.
Parameters Control
(n=10)
20mg/Kg/day (n=10)
40mg/Kg/day (n=10)
Absolute weights
Body weight (g)
Testis (g)
Epididymis (mg)
Ventral prostate (mg)
Vas deferens (mg)
Seminal vesicle full (mg)
Seminal vesicle empty (mg)
Relative weights
Testis (g/100g)
Epididymis (mg/100g)
Ventral prostate (mg/100g)
Vas deferens (mg/100g)
Seminal vesicle full (mg/100g)
Seminal vesicle empty (mg/100g)
Table 2 - Sperm count parameters of male rats from control and simvastatin groups.
Parameters Control
(n=10)
20mg/Kg/day (n=10)
40mg/Kg/day (n=10)
Sperm head count (x 106/testis) 221.26 ± 6.65 a 178.63 ± 8.99 b 178.62 ± 4.63 b
Sperm head count (x106/g testis) 176.87 ± 9.15 a 149.57 ± 3.76 b 142.04 ± 4.89 b
Daily sperm production (x 106/testis) 36.27 ± 1.09 a 29.28 ± 1.47 b 29.28 ± 0.76 b
Daily sperm production (x106/g testis) 28.99 ± 1.50 a 24.51 ± 0.62 b 23.31 ± 0.81 b
Caput/corpus epididymis sperm number
(×106/organ)
108.50 ± 6.29 89.76 ± 5.63 95.45 ± 5.17
Caput/corpus epididymis sperm number
(×106/g organ)
385.57 ± 12.01 a 327.28 ± 13.12 b 334.28 ± 15.67 b
Sperm transit time in the caput ⁄ corpus
epididymis (days)
3.00 ± 0.24 3.11 ± 0.24 3.27 ± 0.20
Cauda epididymis sperm number
(106/organ)
219.24 ± 13.35a 179.03 ± 9.55 b 180.61 ± 7.01 b
Cauda epididymis sperm number (106/g
organ)
1140 ± 35.71 a 954.05 ± 40.29 b 992.43 ± 30.96 b
Sperm transit time in the cauda
epididymis (days)
6.03 ± 0.30 6.21 ± 0.38 6.51 ± 0.45
Values expressed as mean ± S.E.M (ANOVA test with Tukey post-test).
Table 3 - Fertility and reproductive performance of male rats after in utero insemination.
Parameters Control (n=11) 20mg/Kg/Day (n=11) 40mg/Kg/day (n=14)
A Body weight of dams (g) 285.60 ± 15.04 297.5 ±13.14 283.30 ± 13.69 A Uterus weight with fetuses (g) 35.60 ± 2.93 a 26.32 ± 4.19 a 15.33 ± 2.42 b A Number of live fetuses 6.72 ± 0.89 a 5.00± 0.89 ab 3.63 ± 1.05 b A Implant number 8.45 ± 0.51 a 7.36 ± 0.81 ab 4.85 ± 0.80 b A Reabsorption 1.63 ± 0.30 2.27 ± 0.55 2.07 ± 0.54 A Corpora lutea number 11.36 ± 0.71 12.73 ± 0.65 10.93 ± 0.94 A Fetus weight (g) 2.94 ± 0.05 3.11 ± 0.14 3.02 ± 0.07
B Fertility potential (%) 81.82 (57.14-88.89) a 54.55 (46.15-63.64) ab 41.67(22.86-60.63) b B Pre-implantation loss (%) 18.18 (11.11-42.86) a 45.45 (36.36-53.85) ab 58.36 (39.38-77.14) b B Post-implantation loss (%) 25.00 (10.00-25.00) 23.08 (16.67-57.14) 45.00 (10.72-64.39)
A Values expressed as mean + S.E.M (ANOVA test with Tukey post-test).
Table 4- Sperm morphology of rats from control and simvastatin groups.
Parameters Control
n=10
20mg/Kg/day
n=10
40mg/Kg/day
n=10
Normal sperm 97.50
[96.5 – 97.87]a
91.50
[90.62 – 92.87]b
93.50
[91.25 – 94.00]b
Morphological abnormalities
of the sperm head
1.00
[0.50 – 1.37]a
3.25
[2.00 – 4.50]b
3.25
[3.00 – 3.87]b
Morphological abnormalities
of the flagellum
2.00
[1.50 – 2.00]a
4.25
[3.50 – 6.75]b
3.00
[3.00 – 3.87]b
Presence of cytoplasmic
droplet
36.00
[35.12 – 36.50]a
46.50
[45.62 – 46.50]b
46.75
[45.75 – 47.37]b
Values expressed in median and interquartile intervals (Kruskal–Wallis test with Dunn post-test).
Testosterone 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 40mg/Kg 20mg/Kg Control n g /m L FSH 0 2 4 6
Control 20mg/Kg 40mg/Kg
n g /m L LH 0.0 0.5 1.0 1.5
Control 20mg/Kg 40mg/Kg
n g /m L Intratesticular testosterone 0 50 100 150 200
Control 20mg/Kg 40mg/Kg
ng
/m
L
Figure 1: A, C, D: Serum hormone level, B: intratesticular testosterone levels (n=10/group). Values expressed as median and interquartile intervals (Kruskal-Wallis test).
A B
Progressive Movement
Control 20mg/Kg 40mg/Kg
50 60 70 80 90 100 M o ti lit y (% ) Non-Progressive Movement
Control 20mg/Kg 40mg/Kg
0 10 20 30 M o ti lit y(% ) Immotile
Control 20mg/Kg 40mg/Kg
0 10 20 30 M o ti lit y( % )
Figure2: Sperm motility of control and simvastatin groups (n=10/group) .Values expressed as median and interquartile intervals (Kruskal-Wallis test).
A B
Capítulo 2
Resumo
Introdução
A sinvastatina é uma droga largamente usada no tratamento da hipercolesterolemia atuando como um inibidor da enzima determinante na biossíntese de colesterol, a 3-hidroxi-3-metilglutaril-coenzima A redutase (HMG-CoA). Esse fármaco atua na redução da lipoproteína do plasma de baixa densidade (LDL) (Marie et al., 2008) e está envolvido na via de biossíntese de isoprenóides de mevalonato (Thurnher et al., 2012). O colesterol é precursor dos hormônios esteroides e, consequentemente, fármacos que diminuem os níveis de colesterol livre, tais como as estatinas, podem influenciar na esteroidogênese (Dobs et al., 2000). Além disso, as estatinas são capazes de produzir relaxamento vascular, independente da sua propriedade de reduzir lipídios, agindo sobre o músculo liso e endotélio de ratos (Sotomayor et al., 2000). Entretanto, não há estudos que relacionem contração de ductos e glândulas com o uso das estatinas.
O sistema genital masculino é controlado e coordenado pelo sistema nervoso. Esse sistema recebe inervação autônoma simpática e parassimpática, tendo grande influência sobre a integridade estrutural e funcional dos órgãos que o compõe (Ricker, 1997; Nojimoto et al., 2009). Sendo assim, qualquer interferência de agentes físicos e químicos cuja ação esteja ligada direta ou indiretamente no controle nervoso pode implicar em alterações e/ou prejuízos à reprodução.
O sistema genital masculino no rato, assim como na maioria dos mamíferos, é composto por testículos, epidídimos, ductos deferentes, glândulas sexuais e órgão copulador. O epidídimo é um órgão formado por um único ducto altamente enovelado que liga os ductos eferentes ao ducto deferente (Robaire et al., 2006). Sua função está ligada ao transporte dos espermatozoides que chegam do testículo. Além disso, esse órgão está envolvido com a maturação, aquisição da capacidade móvel, habilidade fértil e armazenamento dos espermatozoides (Kempinas & Klinefelter, 2010).
O ducto epididimário é revestido externamente por uma camada de células musculares lisas que apresentam espessura e inervação crescente da região proximal para as regiões mais distais do órgão (Ricker et al., 1997). A contratilidade do ducto epididimario é controlada pelo sistema nervoso autônomo e suas diversas funções, como síntese e secreção de moléculas associadas aos processos de maturação e estocagem de gametas, são reguladas por andrógenos (Robaire et al., 2006).
processo de emissão do ejaculado, uma vez que é controlada pelo sistema nervoso autônomo (Hsieh et. al., 1996; Kiguti et al.,2012).
O sistema nervoso simpático tem um papel fundamental na emissão seminal pela liberação de noradrenalina, a qual controla a contratilidade da cauda epididimária, ducto deferente, próstata e vesícula seminal através da ativação de adrenoreceptores α1 (α1-AR’s) (Avellar et al, 2009). Devido ao envolvimento de a1-ARs nas contrações do ducto deferente e da glândula seminal em resposta à noradrenalina e a importância destas contrações nos eventos fisiológicos que levam à fase de emissão de ejaculação, esse estudo visa avaliar os efeitos da sinvastatina na contratilidade do epidídimo, ducto deferente e glândula seminal.
Material e Métodos Animais
Foram utilizados 5 ratos machos da linhagem Wistar com 90 de idade no início dos experimentos, provenientes da colônia do Biotério Central da Universidade Estadual Paulista - UNESP, campus de Botucatu. Os animais foram mantidos no Biotério de Pequenos Mamíferos do Departamento de Morfologia do Instituto de Biociências de Botucatu– UNESP, em gaiolas de polietileno medindo 43x30x15cm, com substrato de maravalha autoclavada, sob condições controladas de luminosidade (12 horas de luz/ 12 horas de escuro) e temperatura (média de 23°C).
Preparação da Sinvastatina
Sinvastatina (Galena, China) foi preparada na forma de alíquota de 4mg/ml. Resumidamente, 4mg foram dissolvidas em 100µl de etanol e 150 µl de 0,1 N de NaOH, incubou-se a 50 ° C durante 2 h, e em incubou-seguida o pH foi ajustado a 7 e o volume corrigido para 1 ml.
Ensaios in vitro de reatividade farmacológica de ductos e glândula seminal
desenvolvimento de tensão isométrica. Todos tecidos foram mantidos sob 1g de tensão basal em solução nutritiva Tyrode modificada (Picarelli et al., 1962) com a seguinte composição (mM): NaCl 119; KCl 4,7; CaCl2 2,5; MgSO4 1,2; KH2PO4 1,2 e glicose 11, pH 7,4 , sob uma temperatura
constante de 30 ºC e continuamente aerada com mistura carbogênica (95% O2, 5% CO2).
Neste ensaio foram utilizados 5 ratos com idade de 100 dias não submetidos a nenhum tratamento prévio. Após 30 minutos de estabilização da preparação, a contração ao KCl 80mM foi observada em duas ocasiões separadas entre si por 30 minutos para a avaliação da viabilidade tecidual e estabilização da contração máxima do tecido. Decorridos os 30 minutos da ultima contração ao KCl uma curva concentração- resposta à noradrenalina foi construída pela adição cumulativa da droga ao banho e foi considerada como curva controle. Após a lavagem e relaxamento dos órgãos a sinvastatina 1µM foi incubada por um período de 45 minutos e então uma nova curva concentração- resposta à noradrenalina foi construída, ainda na presença de sinvastatina. Os tecidos foram lavados e o processo repetido com a sinvastatina nas concentrações 3, 10, 30 e 100 µM.
Parâmetros Avaliados: as contrações induzidas pela noradrenalina foram representadas graficamente como log da concentração de noradrenalina versus contração em gramas de tensão. Foram avaliadas a contratilidade máxima do tecido (Emax, em gramas de tensão) e a potência da
noradrenalina na indução das contrações (expressa como pEC50, o -log da concentração molar de noradrenalina que induz 50% da resposta contrátil máxima do tecido).
Analise Estatística
Resultados
Apenas na maior concentração, a incubação com Sinvastatina diminuiu a sensibilidade e a máxima contração à noradrenalina na glândula seminal (Tabela 1). Esta diminuição pode ser observada pelo deslocamento para direita da curva concentração- resposta à noradrenalina (Figura 1). O ducto deferente e o ducto epididimário não sofreram alterações na sensibilidade à noradrenalina. Houve diminuição na máxima contração induzida pela noradrenalina nas doses de 30 e 100µM no ducto deferente e nas doses de 10, 30 e 100µM no epidídimo (Tabela 1).
Tabela 1 – Sensibilidade e máxima contração à noradrenalina causada pela Sinvastatina
Glândula
Seminal Controle 3 µM 10 µM 30 µM 100 µM
pEC50 5.63 ± 0.09 5.55 ± 0.08 5.58 ± 0.06 5.51 ± 0.07 5.28 ± 0.05* Emax 2,46 ± 0.12 2.75 ± 0.13 2.55 ± 0.10 2.20 ± 0.10 1.38 ± 0.04*
Ducto Deferente
pEC50 5.74 ± 0.10 5.86 ± 0.11 5.95 ± 0.12 5.92 ± 0.13 5.91 ± 0.11 Emax 1.47 ± 0.06 1.54 ± 0.07 1.36 ± 0.06 1.07 ± 0.05* 0.39 ± 0.01*
Cauda
Epididimária
pEC50 5.74 ± 0.09 6.00 ± 0.11 6.08 ± 0.09 6.04 ± 0.09 5.73 ± 0.12 Emax 0.97±0.04 0.88 ± 0.04 0.81 ± 0.03* 0.75 ± 0.03* 0.57 ± 0.03*
Glândula Seminal
-8 -7 -6 -5 -4
0 1 2
3 Sinvastatina µM
log [noradrenalina] M
T e n sã o ( m N ) Ducto Deferente
-8 -7 -6 -5 -4
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 0 3 10 30 100 Sinvastatina µM
log [noradrenalina] M
T e n sã o ( m N ) Cauda Epididimária
-9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0 10 3 30 100 Sinvastatina µM
log [noradrenalina] M
T e n sã o ( m N )
