Utilização do gene codificador da cisteína proteinase de 30 kDa de
Leishmania (Leishmania) chagasi
(
Ldccys1
) e da proteína
recombinante (rLdccys1) em novos esquemas de imunização em
modelo murino
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
JOSIE HAYDÉE LIMA FERREIRA
Utilização do gene codificador da cisteína proteinase de 30 kDa de
Leishmania (Leishmania) chagasi
(
Ldccys1
) e da proteína
recombinante (rLdccys1) em novos esquemas de imunização em
modelo murino
Orientadora: Profa. Dra. Clara Lúcia Barbiéri Mestriner
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo – Escola Paulista de Medicina para a obtenção do título de Mestre em Ciências.
Ferreira, Josie Haydée Lima
Utilização do gene codificador da cisteína proteinase de 30 kDa de Leishmania (Leishmania) chagasi (Ldccys1)
e da proteína recombinante (rLdccys1) em novos esquemas de imunização em modelo murino / Josie Haydée Lima Ferreira. -- São Paulo, 2006.
xvii, 80f.
Tese (Mestrado) – Universidade Federal de São Paulo. Escola Paulista de Medicina. Programa de Pós-Graduação em Microbiologia e Imunologia.
Título em inglês: Use of a recombinant cysteine proteinase from L. (L.) chagasi in new schedules for immunization in murine model.
A vida
” Alegrias e dores,
esperanças,
sonhos realizados.
Maturidade de vida e de pensamento.
Solidez.
Senso do dever
e convite de amor do Alto
a que atende a coerência de nossa vida...”
Ao meu pai, José Paulino, meu maior exemplo e orgulho;
À minha mãe, Haydée Ferreira, uma grande guerreira que me
ensinou a “ousar sonhos”, lutar por eles e acreditar em mim e em
Deus;
Aos meus irmãos Bruno e Diego, que são parte da minha felicidade;
Aos animais de experimentação aos quais dedico meu respeito e
gratidão.
Ao amigo Paulo Henrique da Costa Pinheiro pela oportunidade concedida e pelo apoio ao longo desses anos. Muito obrigada!
Às minhas amigas Suzana Dias e Simone Katz, por tudo que me ensinaram, por terem me recebido no laboratório com tanto carinho e, principalmente, pela amizade.
Aos grandes companheiros de bancada Érico Carmo, Carlos Fedeli e Nathália Moreira por toda ajuda nas tarefas diárias, pela grande amizade e apoio. Vocês foram imprescindíveis nessa batalha!
A Luciana Girotto Gentil e Dra. Márcia Regina dos Santos, não só por me socorrerem sempre nas horas de “desespero” e pelas orientações valiosas, mas principalmente pelos conselhos e a grande amizade.
Aos docentes da disciplina de Parasitologia Dr. José Franco da Silveira, Dr. Michel Rabinovitch, Dr. Maurício Rodrigues, Dra. Nobuko Yoshida e Dr. Renato Mortara pelo excelente convívio e apoio.
À Dra. Ieda Longo-Maugeri pelo fornecimento do adjuvante P. acnes e pelas sugestões e ao Dr. José Daniel Lopes pela ajuda com o “kit” de dosagem de IFN-γ.
Às grandes amizades que pude construir aqui e que tornaram a minha vida em São Paulo bem mais divertida e feliz: Aliny Ayala, Mariane Bandeira, Érika Kioshima, Elisa, Fernando Real, Charles Covarrubias, Vanessa Coimbra, Eloi Rosa Steban, Renata Baida, Cláudio, Gerson, Marjorie Marini e Miriam Dorta. Amigos que guardarei para sempre!
ao longo desses anos.
À Sandrinha, que foi uma “mãezona” para mim todos esses anos. Cidinha, Adilson, Adauto, D. Fátima, Henrique e Lima pelas risadas, pelo convívio e apoio técnico, sem os quais esse trabalho não seria possível.
Às grandes mestras Maria José dos Santos Soares, Dalva Neves da Costa Bento e Lourdes Ferreira que com seus exemplos abriram um caminho para a realização deste sonho.
Aos amigos que foram meu grande suporte e apoio em São Paulo e que estiveram ao meu lado nas horas difíceis: Igor Bento, Taís Bento, Juliana Alves, Karine Tito e Alessandra Tobias. Obrigada por vocês existirem!
Às grandes amigas do Piauí, mas que estiveram presentes durante toda essa jornada: Danyelle Freire, Alexandra Paes Landim, Ana Manuela, Avilnete Mesquita, Carla Adriana, Paloma Reinaldo e Jackellyne Dutra por todo o incentivo, torcida, paciência, ou seja por serem tão importantes para mim.
A todos os familiares e amigos que me acompanharam durante esse tempo e torceram muito para que este sonho fosse realizado.
Abreviaturas...001
Resumo... 003
Introdução...006
1. Aspectos gerais...007
2. A resposta imune nas leishmanioses...009
3. Antígenos de Leishmania utilizados em estudos de vacinação...013
4. Cisteína proteinases de Leishmania...016
Objetivos...021
Materiais e Métodos...023
1. Obtenção de formas amastigotas de L. (L.) chagasi...024
2. Animais de experimentação...024
3. Bactéria e plasmídio...024
3.1. Bactéria...024
3.2. Plasmídio...025
4. Subclonagem do gene Ldccys1 no vetor pHIS e pcDNA3...027
4.1. Transformação de bactérias...027
4.2. Expressão e purificação da proteína recombinante (rLdccys1)...027
4.3. Análise de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (PAGE-SDS)...028
5. Reatividade da proteína Ldccys1 recombinante com o anticorpo monoclonal 2E5D3...029
6. Preparação do extrato protéico de amastigotas de L. (L.) chagasi (PAM)...029
7. Avaliação da resposta imune estimulada pela rLdccys1...029
7.1. Imunização dos animais com a rLdccys1...029
7.2. Ensaios de linfoproliferação...030
7.3. Dosagem de linfocinas...031
8. Imunização ativa...030
8.1. Imunização de camundongos BALB/c com a rLdccys1 e desafio dos animais com L. (L.) chagasi...031
8.2. Imunização de camundongos BALB/c com o gene Ldccys1...032
8.2.3. Imunização com o gene Ldccys1 e desafio dos animais com L. (L.)
chagasi ...033
9. Avaliação da carga parasitária por diluição limitante...033
10. Avaliação da resposta imune.induzida pelo gene Ldccys1...034
10.1. Resposta humoral ...034
10.1.1. Produção dos anticorpos anti-Ldccys1...034
10.1.2. Isotipagem dos anticorpos anti-Ldccys...034
10.2. Dosagem de linfocinas por ELISA de captura...035
10.3. Dosagem de óxido nítrico (NO)...035
11. Análise estatística...035
Resultados...036
1. Clonagem e seqüenciamento do gene Ldccys1 de L. (L.) chagasi...037
2. Subclonagem do gene Ldccys1 de L. (L.) chagasi em vetor de expressão e análise da proteína recombinante...039
3. Avaliação das respostas linfoproliferativas induzidas pela rLdccys1...041
3.1. Respostas linfoproliferativas de camundongos BALB/c imunizados com a rLdccys1 e P.acnes. como adjuvante pelas vias subcutânea e intraperitoneal...041
3.2. Respostas linfoproliferativas de camundongos BALB/c imunizados com a rLdccys1 e BCG.como adjuvante por via subcutânea...044
3.3. Caracterização das linfocinas envolvidas nas respostas linfoproliferativas induzidas pela rLdccys1...046
4. Imunização ativa em camundongos BALB/c...049
4.1. Imunização dos animais com a proteína recombinante rLdccys1...049
4.1.1. Avaliação da carga parasitária dos animais imunizados e desafiados com L. (L.) chagasi...049
4.1.2. Avaliação da produção de linfocinas nos animais imunizados e desafiados com L. (L.) chagasi ...051
4.1.3. Dosagem de óxido nítrico nas culturas de esplenócitos dos animais imunizados e desafiados com L. (L.) chagasi...053
4.2. Imunização de camundongos BALB/c com o gene Ldccys1...055
desafiados com L. (L.) chagasi...057
4.2.3. Avaliação da produção de linfocinas nos animais imunizados e desafiados com L. (L.) chagasi...059
4.2.4. Dosagem de óxido nítrico (NO) nos sobrenadantes das culturas de esplenócitos dos animais imunizados e desafiados com L. (L.) chagasi...061
Discussão...063
Abstract...072
AcMo anticorpo monoclonal
AM amastigota
Amp ampicilina
BSA albumina sérica bovina
Ci Curie (1 Ci = 3,7 x 1010 desintegrações/segundo) CM controle: células + meio
Con A concanavalina A cpm contagens por minuto DMSO dimetilsulfóxido DNA ácido desoxirribonucléico
DO densidade óptica
EDTA ácido etileno diamino tetracético ELISA ensaio imunoenzimático
g grama
g aceleração da gravidade (9,8 m/s2) h hora
IFN interferon
IL interleucina
IPTG isopropil-μ-D-tiogalactopiranosídeo
kDa kilodalton
L litro
LB Luria Bertani
LBamp LB contendo ampicilina 100µg/mL
min minuto
M Molar
mA miliamper
mCi miliCurie
mg miligrama
MHC complexo principal de histocompatibilidade
mL mililitro
ng nanograma
OPD o-fenilenodiamina
ORF open reading frame
PAGE-SDS eletroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS PAM extrato protéico de amastigotas
PBS salina em tampão fosfato 10 mM, pH 7,2 PCR reação de polimerase em cadeia
PHA fitohemaglutinina (mitógeno)
POPOP 1,4,bis 2(4-metil 5-feniloxazolil) benzeno p30ee p30 purificada por eletroeluição
rpm rotações por minuto RNA ácido ribonucléico SDS dodecil sulfato de sódio
seg segundo
[3H]-TdR Metil-[3H]-Timidina (Timidina tritiada) TEMED N, N, N’, N’ - tetrametilenodiamina TH linfócito T “helper”
Tris Tris [hidroximetilaminometano] U unidade
UV luz ultravioleta v volume V volt
µg micrograma µL microlitro
µM micromolar
O enfoque do nosso trabalho foi avaliar as respostas linfoproliferativas protetoras desencadeadas em camundongos BALB/c pela imunização com o gene
Ldccys1 codificador da cisteína proteinase de 30 kDa de Leishmania (L.) chagasi (p30) e comparar essas respostas com as induzidas pela cisteína proteinase recombinante rLdccys1.
O gene Ldccys1, previamente clonado em nosso laboratório, foi subclonado e expresso no vetor bacteriano pHis, originando uma proteína recombinante de 47 kDa, rLdccys1. Essa proteína foi reconhecida, em experimentos de “Western blotting”, pelo anticorpo monoclonal 2E5D3 reativo com a p30 nativa do parasita, mostrando que a rLdccys1 corresponde à cisteína proteinase de 30 kDa de L. (L.) chagasi.
A antigenicidade da rLdccys1 foi avaliada pelas respostas linfoproliferativas dos camundongos BALB/c previamente imunizados com a proteína recombinante e Propionibacterium acnes ou BCG como adjuvantes, por via subcutânea ou intraperitoneal, e reestímulo in vitro com a rLdccys1 ou o extrato protéico de amastigotas de L. (L.) chagasi (PAM). O reestímulo com a rLdccys1 resultou em respostas linfoproliferativas superiores às induzidas pelo PAM, independente da via de imunização ou do adjuvante utilizado. Foi demonstrado que P. acnes e BCG representam adjuvantes apropriados para a imunização dos animais com a rLdccys1 pela via subcutânea (índices de estimulação em torno de 4-6), enquanto que os animais imunizados com rLdccys1 + BCG pela via intraperitoneal apresentaram respostas linfoproliferativas muito baixas. Com P. acnes a imunização pela via intraperitoneal induziu respostas significantemente superiores às obtidas com a imunização pela via subcutânea. IFN-γ foi secretado em concentrações semelhantes pelos esplenócitos dos animais imunizados com a rLdccys1 + P. acnes por ambas as vias. IFN-γ foi secretado pelos esplenócitos dos animais imunizados com rLdccys1 + BCG em concentrações cerca de cinco vezes maiores às obtidas nos sobrenadantes dos linfonodos desses animais. IL-4 e IL-10 não foram detectadas nos sobrenadantes dos linfócitos de nenhum dos grupos de camundongos imunizados com a rLdccys1.
quando se utilizou BCG ou P. acnes como adjuvante e levou à secreção de IFN-γ e produção de óxido nítrico nos sobrenadantes das culturas de esplenócitos dos camundongos dois meses e meio após o desafio com amastigotas de L. (L.) chagasi.
A imunização com o gene Ldccys1 e reforço com a rLdccys1 induziu forte resposta humoral nos camundongos BALB/c, com produção de anticorpos IgG2a. Os esplenócitos desses animais apresentaram respostas linfoproliferativas em presença da rLdccys1 mediadas por IFN-γ e produção de óxido nítrico. A imunização gênica levou ao decréscimo de 1.000 vezes da carga parasitária dos camundongos imunizados dois meses e meio após a infecção com amastigotas de L. (L.) chagasi comparada à dos controles que receberam PBS ou o plasmídio pcDNA3 vazio.
1. Aspectos gerais
As leishmanioses compreendem um grupo de parasitoses causadas por várias espécies de protozoários do gênero Leishmania. Estima-se que existam atualmente 12 milhões de casos de leishmanioses, com mortalidade anual de aproximadamente 60.000. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), as leishmanioses ocorrem em 88 países e sua notificação é compulsória em apenas 30 deles. Anualmente surgem 2 milhões de novos casos e 350 milhões de pessoas encontram-se sob o risco de adquirir alguma forma da doença (WHO, 2001). A coinfecção Leishmania/HIV agrava ainda mais esse quadro, considerando-se o número de pessoas HIV positivas (Desjeux e Alvar, 2003).
O gênero Leishmania pertence à ordem Kinetoplastida, família Trypanosomatidae e compreende parasitas digenéticos que se desenvolvem alternadamente em hospedeiros vertebrados mamíferos e insetos vetores. Nos hospedeiros mamíferos, entre eles o homem, os parasitas assumem a forma amastigota, arredondada e imóvel, que se multiplica obrigatoriamente dentro de células do sistema monocítico fagocitário em um vacúolo parasitóforo. À medida que os amastigotas se multiplicam por divisão binária os macrófagos se rompem liberando os parasitas que são fogocitados por outros macrófagos. Os vetores das leishmanioses são representados por insetos dípteros da sub-família Phlebotominae (gênero Lutzomya nas Américas e Phlebotomus no Velho Mundo). Nos flebotomíneos os parasitas vivem no trato digestivo onde as formas amastigotas ingeridas durante o repasto sangüíneo se diferenciam em promastigotas, formas alongadas, móveis e flageladas que são inoculadas juntamente com a saliva na pele dos mamíferos durante a picada, completando o ciclo.
Existem mais de 20 espécies de Leishmania capazes de infectar o homem e sua diferenciação se baseia em características extrínsecas (quadro clínico da doença, distribuição geográfica, epidemiologia) e intrínsecas (tamanho, forma e estrutura molecular).
e L. (V.) braziliensis no Brasil] e ao complexo Leishmania (Leishmania) tropica no Velho Mundo [L. (L.) tropica e L. (L.) major, entre outras]. A forma cutânea difusa, que apresenta lesões crônicas e disseminadas, no Brasil é causada pela L. (L.) amazonensis, enquanto que o agente da leishmaniose mucocutânea, forma invasiva e mutilante, é a L. (V.) braziliensis em nosso país. A forma visceral, também conhecida como calazar, é causada por espécies do complexo Leishmania (Leishmania) donovani [L. (L.) donovani e L. (L.) infantum no Velho Mundo e L. (L.) chagasi nas Américas].
A leishmaniose visceral é uma doença crônica, debilitante, caracterizada pelo tropismo do parasita pelo sistema mononuclear fagocítico do fígado, baço, medula óssea e tecidos linfóides. A infecção causada pelas espécies visceralizantes de Leishmania caracterizam-se por episódios febris, hepatoesplenomegalia grave, emagrecimento, anemia, micropoliadenia, podendo ocorrer manifestações intestinais e fenômenos hemorrágicos (Carvalho et al, 1992). A doença apresenta um caráter consumptivo que pode levar à morte se não tratada precocemente (Badaró et al, 1986).
Os últimos dados epidemiológicos registrados pela Organização Mundial da Saúde (2001) revelam que 90% dos casos de leishmaniose visceral estão concentrados em Bangladesh, Índia, Nepal, Brasil e Sudão. No Brasil 90% dos casos de leishmaniose visceral encontram-se na região Nordeste do país, sendo Lutzomyia longipalpis a espécie vetora dessa parasitose em nosso país. O cão representa um importante reservatório doméstico da leishmaniose visceral no Brasil, enquanto que o principal reservatório silvestre é a raposa, existindo fortes evidências de que o homem possa também contribuir para a transmissão urbana dessa parasitose (Costa et al, 2000). No Nordeste a doença deixou de ser apenas rural, tendo ocorrido um acentuado aumento da transmissão urbana da leishmaniose visceral (Costa, 2005; Werneck et al, 2002). Segundo o Ministério da Saúde, em 19 anos de notificação (1984-2002) ocorreram 48.455 casos da doença, sendo aproximadamente 66% nos estados da Bahia, Maranhão, Ceará e Piauí. Nos últimos anos, a média anual no país foi de 3.156 casos e a incidência de dois casos/100.000 habitantes (Ministério da Saúde, 2003; FUNASA, 2002).
tratamento dos pacientes e no combate aos vetores e reservatórios domésticos da leishmaniose visceral. A eficácia dessas medidas, no entanto, tem esbarrado em vários problemas: a toxicidade dos medicamentos disponíveis para o tratamento da doença; a necessidade de desenvolver inseticidas mais eficazes e menos tóxicos para a eliminação dos vetores; a importância de maior investimento em pesquisa da epidemiologia da leishmaniose visceral para a detecção de outros animais que possam representar fontes de infecção da L. (L.) chagasi; a baixa eficiência dos testes sorológicos para a detecção da doença no cão (Costa e Vieira, 2001). Os problemas apontados quanto à epidemiologia e controle do calazar demonstram a importância da pesquisa em leishmaniose visceral e o desenvolvimento de uma vacina tem sido também preconizado como mais uma medida para prevenir a sua transmissão em áreas de alta endemicidade.
2. A resposta imune nas leishmanioses
A resposta imune efetora para a eliminação de Leishmania, assim como para outros patógenos intracelulares, é principalmente mediada por células. Diversas evidências mostram que a resposta específica de linfócitos T é crucial na determinação da cura ou progressão da doença (Preston et al, 1972; Mitchell et al, 1981).
BALB/c infectados com L. (L.) donovani o aumento da secreção de IFN-γ e IL-2 é concomitante à diminuição da carga parasitária e o tratamento com anti-IFN-γ leva à exacerbação da doença (Squires et al, 1989; Kaye et al, 1991; Murray et al, 1992; Melby et al, 2001a). A produção de IFN-γ também está correlacionada com o controle da leishmaniose visceral em humanos, desenvolvendo um papel central na ação microbicida dos macrófagos (Murray, 2000). Em áreas endêmicas de leishmaniose visceral, crianças expostas à infecção por L. (L.) chagasi cujas culturas de linfócitos periféricos produziam IFN-γ eram capazes de controlar a infecção, enquanto havia progressão da doença em crianças cujos linfócitos periféricos apresentavam baixa produção dessa linfocina (Carvalho et al, 1992).
As condições envolvidas no estabelecimento de um perfil Th1 ou Th2 de resposta nas leishmanioses ainda não estão bem definidas. A resposta imune protetora é iniciada com a produção de IFN-γ por células NK por um mecanismo dependente de IL-12 e células dendríticas (Gorak et al, 1998). Dados da literatura mostram que a IL-12 exerce um papel essencial como mediadora da resposta Th1 protetora. Camundongos infectados com L. (L.) donovani apresentam um aumento de IL-12 e IFN-γ concomitantemente à diminuição da carga parasitária e o tratamento desses animais com anti-IL-12 inibe a produção de IFN-γ, levando à exacerbação da doença (Murray, 1997; Melby et al, 2001a). Células de pacientes infectados com L. (L.) chagasi apresentam aumento de resposta linfoproliferativa e produção de IFN-γ quando tratadas com IL-12 (Bacellar et al, 1996). A ineficiência na produção de IL-12, por sua vez, determina a expansão de linfócitos Th2.
Na leishmaniose visceral o papel de mediador da resposta Th2 parece ser exercido principalmente por IL-10. Em pacientes com leishmaniose visceral ativa observa-se forte supressão de resposta Th1 que é revertida pelo tratamento com anti-IL-10 (Ghalib et al, 1993; Ghalib et al, 1995). Em modelos experimentais o mesmo padrão de resposta é observado. Camundongos suscetíveis à infecção por L. (L.) donovani tornam-se resistentes e passam a produzir IL-12 e IFN-γ quando o gene para IL-10 é suprimido por nocaute (Murphy et al, 2001). Esses resultados mostram a importância da IL-10 na “down-regulation” da resposta Th1 e de IL-12 na leishmaniose visceral.
visceral. Em camundongos infectados com L. (L.) donovani o aumento da produção de TGF-β coincide com o pico da carga parasitária, tendo sido o mesmo observado em animais com fenótipo de “cura” e “não-cura” durante o estabelecimento da infecção com L. (L.) infantum (Melby et al, 2001a; Gomes-Pereira et al, 2004). APCs de hamsters infectados com L. (L.) donovani foram incapazes de estimular a proliferação de linfócitos de animais imunizados com extrato do parasita e essa supressão foi revertida com o tratamento com anti-TGF-β (Rodrigues et al, 1998). A produção de TGF-β ativo parece ser mediada pela própria Leishmania, representando um mecanismo de escape contra o sistema imune do hospedeiro e garantindo a sobrevivência do parasita. A forma latente do TGF-β liberada no sobrenadante de macrófagos humanos foi transformada na forma ativa nos macrófagos infectados com L. (L.) chagasi e essa conversão foi suprimida por um inibidor específico de catepsina B, indicando que essa cisteína proteinase, cuja atividade foi previamente demonstrada em L. (L.) chagasi, participa ativamente desse processo (Gantt et al, 2003).
Experimentos realizados com diferentes linhagens suscetíveis a L. (L.) major mostraram que a IL-4 aparece somente nos animais onde há progressão da doença (Scott et al, 1996). A IL-4 está claramente envolvida na infecção por Leishmania (L.)
major em camundongos BALB/c, contudo, o seu papel na leishmaniose visceral ainda não está claro. Alguns trabalhos relatam que IL-4 não é produzida por pacientes com leishmaniose visceral e que essa linfocina não é eficiente no estabelecimento de uma resposta Th2 nessa forma da doença (Carvalho et al, 1994; Cillari et al, 1988; Kemp et al, 1994).
importância tanto dos linfócitos T CD4+ como dos CD8+ na resposta efetora contra as leishmanioses.
3. Antígenos de Leishmania utilizados em estudos de vacinação
O estudo de antígenos de Leishmania utilizando diferentes esquemas de imunização é baseado na capacidade de estimulação de resposta Th1 ou Th2, levando à proteção ou ao agravamento da doença. Vacinas utilizando parasitas atenuados ou mortos, antígenos purificados recombinantes e nativos ou o DNA codificador desses antígenos têm apresentado variado sucesso na proteção contra as diferentes espécies de Leishmania (Handman, 2001).
Um dos antígenos mais utilizados em experimentos de imunização é a gp63, uma metaloproteinase de superfície presente em promastigotas de todas as espécies de Leishmania. A resposta imune desencadeada por esse antígeno em humanos e modelos experimentais é variável, mas quando detectável parece ser mediada por linfócitos Th1 (Handman, 2001). A imunização de camundongos BALB/c com bacilo Calmette-Guerin (BCG) (Connel et al, 1993) ou Salmonella (AroA-) (Yang et al, 1990) expressando a gp63 de L. (L.) major induz proteção contra o desafio homólogo ou na infecção por L. (L.) mexicana. Resultados semelhantes foram obtidos com a gp63 recombinante administrada com IL-12 como adjuvante em animais desafiados com L. (L.) mexicana (Aebischer et al, 2000). A imunização de camundongos por injeção intramuscular de DNA da gp63 também conferiu proteção significante contra o desafio com L. (L.) major e L. (L.) mexicana, caracterizada como Th1 (Xu e Liew, 1995; Walker et al, 1998; Dumonteil et al, 2003; Ahmed et al, 2004).
como com o DNA codificador desse antígeno (Champsi e McMahon-Pratt, 1988; McMahon-Pratt et al, 1993; Dumonteil et al, 2003).
O antígeno LACK (antígeno de Leishmania homólogo ao receptor da quinase C ativada de mamíferos) é uma proteína altamente conservada entre as espécies de Leishmania, sendo expressa tanto em promastigotas como em amastigotas. Dados da literatura mostram que a vacinação com a proteína LACK recombinante e IL-12 como adjuvante ou o DNA do LACK é capaz de proteger camundongos infectados por L. (L.) major e essa proteção está associada à diminuição dos níveis de IL-4 e conseqüentemente ao desenvolvimento de uma resposta Th1 (Wakil et al 1996; Gurunathan et al, 1997; Gurunathan et al, 2000). Por outro lado, a imunização com a LACK recombinante de L. (L.) donovani e IL-12 como adjuvante não conferiu proteção em camundongos desafiados com L. (L.) amazonensis, apesar da forte resposta Th1 desenvolvida antes da infecção (Coelho et al, 2003). Em espécies visceralizantes a vacinação com o DNA do LACK não protegeu camundongos BALB/c infectados com L. (L.) donovani (Melby et al, 2001b) e conferiu baixa proteção em animais que receberam reforço com o vetor Vaccinia expressando o gene LACK após vacinação com o DNA do LACK (Ramiro et al, 2003). Esses resultados indicam que a resposta protetora conferida pelo antígeno LACK é dependente da espécie de Leishmania.
Mais recentemente uma peptidase sinal (SPase) do tipo I, uma serina proteinase de L. (L.) major, e o gene SPase foram utilizados para a vacinação de camundongos BALB/c. A imunização com esse antígeno induziu uma resposta Th1 específica e parcialmente protetora nos animais contra a infecção por L. (L.) major, sendo a proteção mais eficaz a obtida pela imunização com o gene SPase (Rafati et al, 2006a).
et al, 2002). A imunização de cães com a FML também conferiu um efeito protetor significante e de longa duração contra o calazar nesses animais (Borja-Cabrera et al, 2002). Uma glicoproteína majoritária desse complexo, a gp36, foi isolada e utilizada na imunização de camundongos BALB/c, tendo protegido apenas parcialmente esses animais contra a infecção por L. (L.) donovani (Paraguai de Souza et al, 2001). Esses resultados indicam que outras glicoproteínas que fazem parte do complexo FML são importantes na indução de respostas protetoras em modelo experimental.
A proteína A2 é um antígeno expresso especificamente em amastigotas de L. (L.) donovani, importante para a virulência e sobrevivência do parasita no macrófago (Zhang e Matlashewski, 1997). A imunização com o DNA codificador do antígeno A2 ou com a proteína recombinante, utilizando Propionibacterium acnes como adjuvante, conferiu proteção significante em camundongos desafiados com L. (L.) donovani. Essa proteção foi correlacionada com a produção de IFN-γ, proliferação de linfócitos e produção de anticorpos específicos anti-A2 (Ghosh et al, 2001a; Ghosh et al, 2001b).
A imunização de camundongos com várias frações de uma biblioteca de cDNA de amastigotas de L. (L.) donovani levou ao isolamento de alguns antígenos capazes de induzir resposta imune protetora com produção de IFN-γ contra a infecção homóloga. Todos os antígenos identificados são proteínas intracelulares, entre elas as histonas e algumas proteínas ribossomais (Melby et al, 2000). A imunização de cães com uma proteína quimérica formada pela fusão de 5 fragmentos gênicos codificadores de proteínas ribossomais e da histona H2A, utilizando BCG como adjuvante, resultou na proteção de 90% dos cães vacinados e desafiados com L. (L.) infantum (Molano et al, 2003).
Lutzomyia longipalpis utilizado na imunização de hamsters contra a infecção por L. (L.) chagasi (Gomes, 2006).
4. Cisteína proteinases de Leishmania
Nos últimos anos o estudo de enzimas proteolíticas de parasitas tem aumentado consideravelmente pelo fato de essas moléculas constituírem importantes fatores de virulência diretamente relacionados com a interação parasita-hospedeiro e representarem alvos promissores para a imuno e quimioterapia (McKerrow, 1989; Selzer et al, 1999, Das et al, 2001; Sajid e McKerrow, 2002). Entre os protozoários, as principais enzimas proteolíticas caracterizadas pertencem ao grupo das cisteína proteinases, sendo a maioria delas membros da superfamília da papaína. Essa superfamília, por sua vez, é subdividida em duas famílias, a das proteases do tipo catepsina e as do tipo calpaína. As proteases do tipo catepsina são ainda sub-divididas nas sub-famílias das catepsinas dos tipos B e L. Essas guardam grandes semelhanças entre si e apresentam alguns motivos na seqüência de aminoácidos que as diferenciam, sendo ambas sintetizadas como zimogênios inativos que são posteriormente processados pela remoção da pré e pró-região para que se tornem enzimas ativas (Eakin et al, 1992).
Em Leishmania há predominância de cisteína proteinases do tipo catepsina L que são expressas em grande quantidade nas formas amastigotas e estão localizadas preferencialmente em lisossomos diferenciados denominados megassomos, descritos primeiramente em espécies do complexo L. (L.) mexicana (Pupkins et al., 1986) e mais recentemente em L. (L.) chagasi (Alberio et al., 2004).
Em L. (L.) mexicana a maior atividade proteolítica detectada é a das cisteína proteinases expressas pelos genes cpb, arranjados em 19 cópias repetidas em "tandem". Os genes cpb3 a cpb18 codificam proteínas que possuem uma extensão C-terminal (CTE), sendo expressos predominantemente nas formas amastigotas. A proteína codificada pelo gene cpa não possui CTE e também é encontrada no megassomo (Mottram et al, 1997; Brooks et al., 2000).
duas cópias no genoma do parasita, a enzima codificada não possui CTE e é encontrada no megassomo e na bolsa flagelar (Duboise et al., 1994).
Em L. (L.) major foram descritas duas cisteína proteinases, CPb que apresenta alta expressão nos amastigotas, possui uma CTE e é codificada por um gene de múltiplas cópias e CPa que é expressa predominantemente em amastigotas e promastigotas de fase estacionária e é codificada por um gene de cópia única (Sakanari et al., 1997).
Em L. (L.) chagasi dois genes de cisteína proteinase do tipo catepsina L, Ldccys1 e Ldccys2, diferentes quanto à seqüência de aminoácidos codificada e quanto à organização, são expressos nas formas promastigotas e amastigotas. O gene Ldccys2 está presente em cópia única, enquanto que o Ldccys1 está representado em 5 cópias organizadas em "tandem" (Ldccys1A-E). Seqüências correspondentes a esses genes também foram identificadas em L. (L.) infantum (cpa e cpb) e L. (L.) donovani (Lddcys1 e Lddcys2), sendo que nessa última o gene Lddcys1 está presente em 6 cópias (Omara-Opyene e Gedamu, 1997; Mundodi et al, 2002).
Embora não esteja clara a função das cisteína proteinases em Leishmania, seu papel tem sido intensamente estudado e sabe-se que essas moléculas têm grande participação na virulência do parasita. A análise de enzimas proteolíticas em cepas avirulentas e virulentas de promastigotas de L. (L.) amazonensis mostrou que as cisteína proteinases são preferencialmente expressas nas cepas virulentas (Soares et al, 2003). Camundongos suscetíveis infectados com L. (L.) mexicana nocauteada para o gene da cisteína proteinase cpb apresentaram lesões consideravelmente menores comparadas às dos animais infectados com parasitas selvagens e parasitas nulos para ambos os genes, cpa e cpb, foram incapazes de desenvolver lesões nesses animais. Interessantemente, a análise das linfocinas mostrou que houve mudança de uma resposta predominantemente Th2 para Th1, com produção de IFN-γ e IL-2 nesses animais (Alexander et al, 1998). A análise funcional das catepsinas do tipo B de L. (L.) donovani e L. (L.) chagasi mostrou que elas são capazes de clivar a forma latente do TGF-β1, convertendo-o à forma ativa inibidora de macrófago (Somanna et al, 2002). Esses resultados indicam que essas enzimas não só agem como fatores de virulência, mas também como moduladoras da resposta imune do hospedeiro.
metaciclogênese e a transformação do promastigota em amastigota, sustentando a hipótese que a autofagia é necessária para a diferenciação celular (Williams et al, 2006).
As cisteínas proteinases têm representado também um grande alvo para o diagnóstico das leishmanioses visceral e cutânea e o estudo de vacinas. As CPA e CPB de L. (L.) infantum foram utilizadas no Irã para o diagnóstico por ELISA da leishmaniose visceral humana e canina (Rafati et al, 2003). Em relação à antigenicidade para respostas imunes celulares foi demonstrada a capacidade de as cisteína proteinases induzirem resposta do tipo Th1 após a morte dos amastigotas de L. (L.) mexicana no interior de macrófagos peritoneais de camundongos e a apresentação de epítopos dos parasitas na sua superfície (Wolfram et al, 1995). Camundongos BALB/c imunizados com a cisteína proteinase de 24 kDa purificada a partir de amastigotas de L. (L.) major, CPa, desenvolveram resistência à infecção homóloga. Esses camundongos produziram altos níveis de IFN-γ, gerando uma resposta imune Th1 com conseqüente resolução da doença (Rafati et al., 2000). Proteção duradoura contra a infecção homóloga foi observada em camundongos BALB/c imunizados com uma mistura dos genes cpa e cpb de L. (L.) major, assim como com a imunização com as cisteína proteinases recombinantes (rCPb e rCPa) (Rafati et al., 2001). A análise da resposta imune nesses animais mostrou que eles apresentaram predomínio de linfócitos Th1 com produção de IFN-γ. Mais recentemente a imunização de camundongos BALB/c com uma mistura dos genes cpa e cpb codificadores de cisteína proteinases de L. (L.) infantum, seguida por um reforço com as proteínas recombinantes rCPa e rCPb juntamente com CpG ODN e Montanide como adjuvantes, resultou em proteção contra a leishmaniose visceral nos animais imunizados mediada por linfócitos Th1 (Rafati et al., 2006b). Em humanos foi demonstrado que as cisteínas proteinases CPa e CPb de L. (L.) major induziram alta produção de IFN-γ e IL-2 e baixa secreção de IL-10 em culturas de linfócitos periféricos de pacientes com leishmaniose cutânea causada por L. (V.) guyanensis (Pascalis et al, 2003).
alguns antígenos capazes de induzir respostas linfoproliferativas em camundongos BALB/c previamente imunizados com Leishmania foram identificados. Entre eles um, de massa molecular aparente de 30 kDa (p30) presente em amastigotas de L. (L.) amazonensis e L. (L.) chagasi, induz preferencialmente linfócitos T CD4+ da subpopulação Th1 e significante proteção contra a infecção homóloga (Beyrodt et al, 1997; Pinto et al, 2000). A caracterização bioquímica desse antígeno em L. (L.) amazonensis foi feita após a sua purificação em coluna de imunoafinidade com um anticorpo monoclonal dirigido à p30 (AcMo 2E5D3). O antígeno purificado foi submetido à PAGE-SDS em gel copolimerizado com gelatina e utilizando-se o inibidor E-64 demonstrou-se que a p30 de L. (L.) amazonensis apresenta forte atividade de cisteína proteinase. Foi também demonstrado que a p30 de L. (L.) chagasi é reativa com o AcMo 2E5D3, porém, é desprovida de atividade proteolítica em gel de gelatina (Pinto et al, 2000).
Em L. (L.) chagasi a atividade de cisteína proteinase tem sido pouco explorada, tendo sido clonados dois genes codoficadores dessas enzimas das formas amastigotas (Ldccys1 e Ldccys2). Nesse trabalho, os autores mostraram que promastigotas de L. (L.) chagasi transfectados com os genes Ldccys1 e Ldccys2 passaram a expressar atividade proteolítica muito intensa em torno de 30 e 43 kDa, respectivamente (Omara-Opyene e Gedamu, 1997). Em nosso laboratório foi amplificado por PCR um fragmento de 1,3 kb utilizando-se DNA genômico de L. (L.) chagasi e um par de "primers" correspondendo à ORF do gene Ldccys1. A análise da seqüência de nucleotídeos desse fragmento mostrou que ele apresenta 99,8% de identidade com a seqüência do gene Ldccys1 publicada no GeneBank. Esse fragmento foi clonado no vetor de expressão pHis paralelo 3 contendo uma cauda de seis resíduos de histidina e expresso em Escherichia coli, resultando em uma proteína recombinante de 47 kDa, rLdccys1 (Dias et al, 2005). Mais recentemente demonstrou-se que a rLdccys1 é um antígeno apropriado para o diagnóstico da leishmaniose visceral humana (Dias et al, 2005). Além disso, verificou-se que a rLdccys1 induz respostas proliferativas distintas em linfócitos periféricos humanos e de cães com as várias formas clínicas de leishmniose visceral, com predomínio de respostas Th1 em pacientes e cães assintomáticos, Th2 nos sintomáticos e um padrão misto Th1 e Th2 nos oligossintomáticos (Pinheiro et al, 2005).
camundongos BALB/c imunizando-se os animais com a cisteína proteinase nativa de 30 kDa de Leishmania (L. ) chagasi, Ldccys1, levaram à busca de novos esquemas de imunização capazes de desenvolver respostas mais efetoras contra a infecção homóloga. Assim, os principais objetivos do nosso trabalho foram:
1) Expressão do gene Ldccys1 em sistema bacteriano e purificação da proteína recombinante (rLdccys1).
2) Utilização da rLdccys1 em ensaios de respostas linfoproliferativas de camundongos BALB/c previamente imunizados com esse antígeno e caracterização das linfocinas envolvidas nessas respostas.
3) Utilização da proteína recombinante em ensaios de imunização ativa em camundongos BALB/c, verificando-se a resposta imune dos animais imunizados e o grau de proteção obtido contra a infecção por L. (L.) chagasi.
1. Obtenção de formas amastigotas deL. (L.) chagasi
A cepa MHOM/BR/1972/LD de Leishmania (L.) chagasi utilizada foi caracterizada e gentilmente cedida pelo Dr. J. J. Shaw, Instituto Evandro Chagas, Belém, Pará, Brasil.
As formas amastigotas foram isoladas de hamsters previamente infectados com 1x108 parasitas por injeção intraperitoneal. Dois meses após a infecção, os animais foram sacrificados e o baço homogeneizado, tratado com saponina 0,2% em PBS (NaCl 0,13 M em tampão fosfato de sódio 10 mM, pH 7,2) por 10 min e centrifugado a 1.400 x g por 5 min. O precipitado foi ressuspenso em PBS, centrifugado a 250 x g por 5 min, o sobrenadante novamente centrifugado a 1.400 x g por 5 min e o precipitado resultante ressuspenso em PBS. A suspensão foi mantida sob agitação por 3 h à temperatura ambiente, centrifugada a 1.400 x g por 5 min e o precipitado contendo os amastigotas purificados mantido a -20oC até o uso (Barbiéri et al, 1990).
2. Animais de experimentação
Hamsters Golden machos com 6-10 semanas de idade foram adquiridos do biotério da Universidade de Campinas, São Paulo.
Camundongos BALB/c fêmeas com 6-8 semanas de idade foram adquiridos do biotério de animais isogênicos da Universidade Federal de São Paulo (Unifesp-EPM).
Todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Universidade Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina.
3. Bactéria e plasmídio
3.1. Bactéria
0,5%, bacto-ágar 1,5%) e as colônias isoladas foram repicadas mensalmente. As cepas utilizadas como hospedeiras dos plasmídios foram:
E. coli DH5-α
Genótipo: F- φ80dlacZΔM15 Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1 hdR17(rk-mk+) deoR thi-1 supE44 λ- gyrA96 relA1 (Hanahan, 1985).
Condições de crescimento: uma colônia foi isolada da placa de Petri e inoculada em 10 mL de meio LB líquido (bactotriptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 0,5%). A cultura foi incubada "overnight" (O.N.) a 37oC sob agitação.
Função: manutenção dos plasmídios recombinantes pUC18, pHIS e pcDNA3.
E. coli BL21DE3
Genótipo: B F- dcm ompT hsdS(ra- ma-) gal λ(DE3) (Stratagene)
Condições de crescimento: uma colônia foi isolada da placa de Petri e inoculada em 10 mL de meio LB líquido. A cultura foi incubada O.N. a 37oC sob agitação.
Função: expressão da proteína recombinante.
3.2. Plasmídio
pHIS paralelo 3
Genótipo: promotor T7, operador lac, 6xHis amino-terminal, sítio múltiplo de clonagem (variação do pHIS paralelo 1).
Condições de crescimento: bactérias E. coli BL21DE3 foram transformadas com o plasmídio e plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina 100 μg/mL e incubadas a 37oC durante a noite.
pcDNA3
Genótipo: promotores CMV, T7 (contendo múltiplos sítios de clonagem), Sp6 e SV40, origens de replicação SV40 e ColE1, Ampr e Neor.
Condições de crescimento: bactérias E. coli DH5-α foram transformadas com os plasmídios, plaqueadas em meio LB sólido contendo ampicilina 100 μg/mL e incubadas a 37oC O.N..
4. Subclonagem do gene Ldccys1 no vetor pHIS e pcDNA3
O produto de PCR correspondente à fase de leitura aberta (ORF) do gene Ldccys1 previamente obtido em nosso laboratório (Dias et al, 2005; Dias, 2004) e o plasmídio pHIS paralelo 3 e pcDNA3 foram digeridos com as enzimas de restrição EcoRI e BamHI para a clonagem dirigida. A ligação foi realizada em uma reação contendo inserto:vetor (3:1 em massa de DNA), 1 U de T4 ligase e tampão de ligação (Invitrogen) por 18 h a 16ºC (Ldccys1/pHIS).
4.1. Transformação de bactérias
As bactérias competentes (E. coli DH5-α e BL21DE3) foram preparadas inoculando-se uma colônia em 10 mL de LB líquido (bactotriptona 1%, extrato de levedura 0,5%, NaCl 0,5%) durante a noite a 37oC. Em seguida, foram adicionados 250 mL de LB líquido, a suspensão foi mantida sob agitação a 37oC até DO600nm= 0,6, incubada em gelo por 60 min, centrifugada a 4.000 x g por 15 min e as bactérias secas e ressuspensas em 80 mL de FB (glicerol 10%, KCl 100 mM, CaCl2 50 mM, KC2H3O2 10 mM). As bactérias foram novamente centrifugadas a 4.000 x g por 15 min, ressuspensas em 20 mL de FB e estocadas a -80oC até o uso.
Para a transformação foram utilizados 100 μL da suspensão de bactérias competentes em FB para 200 ng do plasmídio Ldccys1/pHIS e o choque térmico foi feito mantendo-se as bactérias por 1 h no gelo, 3 min a 42oC e 10 min no gelo, acrescentado-se em seguida 400 μL de LB. A suspensão foi mantida sob agitação por 1 h a 37oC, semeada em LB sólido contendo ampicilina 100 μg/mL e incubada durante a noite a 37oC.
4.2. Expressão e purificação da proteína recombinante (rLdccys1)
meio LBamp foram acrescentados 25 mL da cultura de bactérias. A suspensão foi mantida sob agitação a 37oC até a DO600nm= 0,6 e a expressão da proteína foi induzida com IPTG 0,2 mM durante 3 h nas mesmas condições. Após a incubação as bactérias foram centrifugadas a 4.000 x g por 10 min e ressuspensas em 20 mL de tampão de sonicação (NaH2PO4 0,1 M, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, PMSF 2 mM, iodoacetamida 2 mM) contendo 0,75 mg/mL de lisozima. A amostra foi mantida sob agitação por 30 min à temperatura ambiente, sonicada em 3 ciclos de 30 segundos e centrifugada a 12.000 x g por 30 min. O precipitado foi ressuspenso e lavado 3 vezes com 20 mL de CHAPS 1% em Tris-HCl 10 mM, pH 8,0 e solubilizado com 20 mL de tampão de solubilização (NaH2PO4 0,1 M, Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, uréia 8 M).
Para a purificação da proteína recombinante, 5 mL de resina contendo níquel (Ni-NTA Superflow agarose matrix-QIAGEN) foram acrescentados à suspensão de bactérias solubilizada como descrito, mantendo-se sob agitação por 1 h. A mistura foi transferida para coluna de vidro (Bio-Rad) e a resina lavada com 50 mL de tampão de lavagem (NaH2PO4 0,1 M, Tris-HCl 10 mM, uréia 4 M, pH 6,3). A proteína recombinante ligada à resina foi eluída com 20 mL de tampão de eluição (NaH2PO4 0,1 M, Tris-HCl 10 mM, uréia 4 M, imidazol 0,1 M, pH 6,3) e coletada em frações de 2 mL. As frações foram analisadas em gel de poliacrilamida 12% e aquelas que continham a proteína recombinante, visualizada no gel com massa molecular aparente de 47 kDa, foram misturadas e dialisadas por 36 h a 4oC contra Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, contendo uréia 0,5 M (Skeiky et al, 2002).
4.3. Análise de proteínas por eletroforese em gel de poliacrilamida com SDS (PAGE-SDS)
5. Reatividade da proteína Ldccys1 recombinantecom o anticorpo monoclonal 2E5D3
Os experimentos de "Western blotting" foram feitos como descrito por Towbin et al (1979). Extratos de amastigotas de L. (L.) chagasi e de bactérias recombinantes foram submetidos à PAGE-SDS como anteriormente descrito. O gel foi transferido
para membrana de nitrocelulose (Hybond ECL™ Pharmacia) por eletroforese a 250 mA por 2 h em tampão de transferência (Tris-HCl 2,5 mM, glicina 0,192 M, metanol 20%) e as proteínas posteriormente coradas com Ponceau-S 0,1% em ácido acético 10%. As membranas foram bloqueadas com PBS-Molico 5% por 1 h e incubadas com o anticorpo monoclonal anti-cisteína proteinase de L. (L.) amazonensis (AcMo 2E5D3) ou o anticorpo policlonal anti-rLdccys1 (1:100). Em seguida, as membranas foram lavadas por 30 min com PBS-Tween 0,05% e incubadas por 1 h com anticorpo secundário conjugado com peroxidase (1:500). Após esse período, as membranas foram novamente lavadas e a reação revelada com diaminobenzidina (DAB) 0,15 mg/mL e H2O2 0,005% em PBS.
6. Preparação do extrato protéico de amastigotas de L. (L.) chagasi (PAM)
A preparação do extrato protéico de amastigotas (PAM) para a utilização nas culturas de linfócitos esplênicos de camundongos BALB/c foi feita com a extração de 1 x 109 amastigotas de L. (L.) chagasi com 1 mL de acetona 100% e centrifugação por 2 minutos a 11.000 x g. Após descartar o sobrenadante o precipitado foi lavado 2 vezes com 1 mL de etanol absoluto, seco à temperatura ambiente e ressuspenso em 100 µL de PBS, sonicado e o volume completado para 1 mL com PBS.
7. Avaliação da resposta imune estimulada pela rLdccys1
7.1. Imunização dos animais com a rLdccys1
(suspensão de bactérias autoclavadas correspondente a 200 μg de proteína por dose) ou Bacille Calmette-Guérin (BCG) (proveniente do Instituto Pasteur e correspondente a 1x106 CFU por dose). Os animais receberam uma dose do antígeno mais adjuvante, 14 dias após outra dose igual à primeira e 14 dias após os linfonodos e baços eram retirados para o isolamento dos linfócitos.
7.2. Ensaios de linfoproliferação
Os experimentos de proliferação linfoblástica foram feitos utilizando-se 2,5-5 x 105 linfócitos por cavidade em placas de 96 poços (Costar) de camundongos BALB/c e hamsters em um volume final de 200µl em meio completo (MC) [RPMI 1649 contendo NaHCO3 20 mM, HEPES 10 mM, penicilina 100 U/mL, estreptomicina 100 μg/mL, L-glutamina 2 mM, β-mercaptoetanol 50 μM, piruvato de sódio 5 mM, mistura de aminoácidos não essenciais (Sigma) 100 μM e soro humano normal 2% previamente inativado por 1 h a 56oC]. A viabilidade das células foi avaliada por exclusão do corante azul de Tripan 0,1% em MC. As células foram cultivadas em triplicatas na ausência de antígeno, na presença de Concanavalina A (Con A) à concentração de 2,5 µg/ml, PAM (correspondente a 1x107 amastigotas) e rLdccys1 à concentração de 2,5 ou 5,0 μg/ml.
As culturas de linfócitos foram mantidas por 96 horas a 37ºC em estufa incubadora umidificada contendo 5% de CO2. Dezesseis a vinte horas antes da coleta das células em papel de fibra de vidro foi adicionado 1µ Ci de 3H-TdR (metil-3H-timidina, 86 Ci/mmol, Amersham Bioscience) por cavidade. A radioatividade
7.3. Dosagem de linfocinas
A dosagem de linfocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-10) foi feita nos sobrenadantes da culturas de linfócitos de camundongos BALB/c utilizando-se anticorpos da Pharmingen. Foram cultivados 1 x 107 linfócitos por cavidade em placas de 24 poços (Costar) em um volume final de 1 ml em meio completo. Após 72 horas de incubação a 37ºC em estufa contendo 5% de CO2, os linfócitos foram centrifugados a 200 x g por 2 min e os sobrenadantes utilizados para a dosagem de linfocinas.
Placas de 96 poços foram adsorvidas com anticorpo monoclonal primário anti-IFN-γ, anti-IL-4 ou anti-IL-10 (BD) à concentração de 0,2 μg/mL em tampão Na2CO3/NaHCO3 0,05 M, pH 9,6 e incubadas O.N. a 4oC. As placas foram lavadas com PBS-T, bloqueadas com PBS-Molico 5% por 2 h à temperatura ambiente e os sobrenadantes das culturas acrescentados v/v em PBS-Molico (100 μL/poço). Após incubação O.N. a 4oC, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS-T e o anticorpo monoclonal secundário anti-IFN-γ, anti-IL-4 ou anti-IL-10 biotinilado (Pharmingen) foi adicionado à concentração de 2 μg/mL em PBS-Molico e incubado por 3 h à temperatura ambiente. As placas foram lavadas 5 vezes com PBS-T e adicionaram-se 100 μL/poço de estreptavidina-peroxidase (Sigma) 2,5 μg/mL em PBS por 30 min. Após 5 lavagens com PBS-T a reação foi revelada adicionando-se 100 μL/poço de tampão de revelação (Na2HPO4 0,05 M, ácido cítrico 0,05 M, pH 4,5) contendo OPD 0,5 mg/mL e H2O2 0,03% por 15 min. A reação foi interrompida adicionando-se 50 μL/poço de H2SO4 4 N e a absorbância medida a 492 nm em microleitor de ELISA Labsystem Multiskan MS.
8. Imunização ativa
8.1. Imunização de camundongos BALB/c com a rLdccys1 e desafio dos animais com L. (L.) chagasi
três doses semanais do antígeno mais adjuvante. Duas semanas após a última dose os camundongos BALB/c foram desafiados com 1x107 amastigotas de L. (L.) chagasi via endovenosa (i. v.). Dois meses e meio após o desafio os animais foram sacrificados para a avaliação da carga parasitária, produção de linfocinas e óxido nítrico.
8.2. Imunização de camundongos BALB/c com o gene Ldccys1
8.2.1. Extração de DNA plasmidial em larga escala
8.2.2. Purificação do DNA plasmidial por gradiente de CsCl
A 5 mg de DNA plasmidial acrescentaram-se 4 mL de CsCl 1,025 g/mL e 200 μL de brometo de etídio 2 mg/mL. A amostra foi transferida para tubo Beckman de 13 x 51 mm que foi selado por aquecimento. Os tubos foram centrifugados a 45.000 rpm em rotor VTI 65.1 por 16 h a 22oC e a banda de DNA íntegro visualizada por UV foi excisada. Para a retirada do brometo de etídio foram feitas várias lavagens da amostra acrescentando-se 1 v de butanol:água (1:1 v/v) e centrifugando-se a 2.000 x g por 5 min. O DNA foi precipitado acrescentando-se 3 v de etanol absoluto e centrifugando-se a 11.000 x g por 10 min, o precipitado foi lavado com etanol 75%, seco e ressuspenso em PBS.
8.2.3. Imunização com o gene Ldccys1 e desafio dos animais com L. (L.) chagasi
Três grupos de camundongos BALB/c, cada grupo formado por 6 animais, receberam 3 doses de 100 μL de PBS (grupo 1), 100 μg de pcDNA3 vazio (grupo 2) ou 100 μg de Ldccys1/pcDNA3 (grupo 3) juntamente com ODN CPG (5′- TCCATGACGTTCCTGACGTT -3′, ODN CpG 1826 - Invitrogen) por injeção no músculo Tibialis anteriores de ambas as patas, seguidas de uma dose reforço com rLdccys1 (25 μg) mais ODN CPG. As imunizações foram feitas com intervalos de 14 dias e doze dias após cada imunização coletou-se sangue de todos os animais para verificar a presença de anticorpos anti-Ldccys1 nos soros por ELISA, como descrito no item 10.1. Duas semanas após a última dose os camundongos BALB/c foram desafiados com 1x107 amastigotas de L. (L.) chagasi por via i.v. e 2 meses e meio após o desafio os animais foram sacrificados para a avaliação da carga parasitária, produção de linfocinas e óxido nítrico.
9. Avaliação da carga parasitária por diluição limitante
algumas modificações. O baço de cada animal imunizado e desafiado foi isolado, macerado e homogeneizado em 3 ml de meio 199 (Gibco) contendo bicarbonato de sódio 4,2 mM, HEPES 40 mM, adenina 1,0 mM, hemina 5 μg/mL, soro fetal bovino (SFB) 15% e urina humana masculina 2%, em condições assépticas. As diluições seriadas foram preparadas em placas de 96 poços (Costar) e após cinco dias de incubação a 25oC as placas foram examinadas em microscópio invertido (40x) quanto à presença de promastigotas móveis. O número de parasitas viáveis foi determinado pela maior diluição na qual os promastigotas foram observados.
10. Avaliação da resposta imune induzida pelo gene Ldccys1
10.1. Resposta humoral
10.1.1. Produção dos anticorpos anti-Ldccys1
Uma placa de 96 poços (high binding Costar) foi sensibilizada com 100 ng/poço da rLdccys1 diluída em tampão Na2CO3/NaHCO3 0,05 M, pH 9,6. A placa foi incubada durante a noite a 4oC, bloqueada com PBS-Molico 5% por 1 h à temperatura ambiente e os soros foram diluídos 1:200 em PBS-Molico 5%. A placa foi incubada por 1 h à temperatura ambiente, lavada três vezes com PBS-Tween 20 0,05% (PBS-T) e incubada novamente com anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado com peroxidase (Bio-Rad) diluído 1:500 por 1 h à temperatura ambiente. Após três lavagens a reação foi revelada com OPD e H2O2, bloqueada com H2SO4 e a leitura feita a 492 nm em microleitor de ELISA Labsystem Multiskan MS.
10.1.2. Isotipagem dos anticorpos anti-Ldccys1
incubação por 1 h à temperatura ambiente. Os poços foram lavados 3 vezes e adicionou-se anti-IgG de coelho diluída 1:500, incubando-se por mais 1 h. Após 3 lavagens a reação foi revelada com OPD + H2O2, interrompida com H2SO4 e a absorbância medida a 492 nm em microleitor de ELISA Labsystem Multiskan MS.
10.2. Dosagem de linfocinas por ELISA de captura
A dosagem de linfocinas (IFN-γ e IL-4) nos sobrenadantes de cultura de linfócitos dos camundongos BALB/c imunizados com a rLdccys1 e nos vacinados com o gene Ldccys1 foi feita pelo método de ELISA de captura, utilizando-se anticorpos da BD System, conforme descrito no item 7.3.
10.3. Dosagem de óxido nítrico (NO)
A dosagem de óxido nítrico (NO) foi feita nos sobrenadantes das culturas de linfócitos utilizadas para a dosagem de linfocinas, utilizando-se 100 µL dos sobrenadantes das culturas e 100 µL do reagente de Griess (sulfanilamida 1% e naftiletilenodiamina-diHCl 0,1% em H3PO4 2,5%). Após 10 min à temperatura ambiente a absorbância foi lida a 550 nm em microleitor de ELISA. O padrão da dosagem de NO foi feito utilizando-se NaNO2 (10 µM a 100µM).
11. Análise estatística
1. Clonagem e seqüenciamento do gene Ldccys1 de L. (L.) chagasi
Baseando-se na seqüência do gene Ldccys1 de L. (L.) chagasi identificado por Omara-Opyene e Gedamu (1997), o gene p30 foi previamente clonado por amplificação por PCR utilizando "primers" correspondentes à região codificadora completa do gene Ldccys1 e DNA genômico de L. (L.) chagasi. Foi obtido um produto de 1,3 Kb (clone 1.3) que foi clonado em pUC18 e seqüenciado. A análise da seqüência de nucleotídeos do clone mostrou a sua alta identidade com genes de cisteína proteinase de outras espécies de Leishmania depositados no "GeneBank". A comparação da seqüência predita de aminoácidos com outras seqüências de cisteína proteinases de Leishmania mostrou que o clone 1.3 possui todos os resíduos conservados que caracterizam essas proteases (Dias et al, 2005; Dias, 2004). A seqüência predita de aminoácidos do gene Ldccys1 é mostrada na Figura 2. Resíduos de cisteína e histidina estão presentes nas posições 150 e 288, respectivamente, formando o sítio catalítico da enzima; uma glicina envolvida na ligação da papaína ao substrato está presente na posição 148; um sítio de N-glicosilação na posição 228. Além disso, outro aminoácido, asparagina, importante na catálise, encontra-se na posição 308. Assim como nas demais cisteína proteinases, a seqüência de aminoácidos do clone de 1,3 kb mostra que ele possui uma pré-região contendo aminoácidos hidrofóbicos característicos do peptídeo sinal, identificado pelo programa Signal P (http://www.cbs.dtu.dk/services), uma pró-região que é clivada entre os aminoácidos 124 e 125 gerando uma alanina, uma porção madura e uma extensão C-terminal com 10 resíduos de cisteína conservados.
Pré-região Pró-região Proteína
MHC II MHC II
MHC I
EXXXRXXXFXXN
2. Subclonagem do gene Ldccys1 de L. (L.) chagasi em vetor de expressão e
análise da proteína recombinante
Para a obtenção da proteína recombinante de L. (L.) chagasi o fragmento de 1.3 kb, correspondente à ORF completa do gene Ldccys1, foi digerido do plasmídio pUC18 e subclonado no vetor de expressão pHIS paralelo 3 em fase com 6 resíduos de histidina na porção N-terminal da proteína. A expressão do gene Ldccys1 em bactérias competentes BL21DE3 transformadas com o plasmídio Ldccys1/pHIS resultou em uma proteína recombinante de aproximadamente 47 kDa que foi denominada rLdccys1. A sonicação das bactérias seguida de centrifugação mostrou que a rLdccys1 estava contida em corpúsculos de inclusão insolúveis. Assim, a proteína recombinante foi solubilizada em uréia 8 M e purificada por cromatografia de afinidade em coluna de níquel. A expressão e purificação da rLdccys1 foram avaliadas por PAGE-SDS (Figura 2).
kDa A B C D
94 67
47 kDa
45
30
20
14
Para verificar se a proteína rLdccys1 corresponde à p30 de L. (L.) chagasi, o extrato de bactérias recombinantes foi solubilizado com uréia 8 M e submetido à PAGE-SDS e "Western blotting", utilizando-se o anticorpo monoclonal 2E5D3 dirigido à p30 de L. (L.) amazonensis e que apresenta reatividade cruzada com a p30 de L. (L.) chagasi (Lopes, 1999; Pinto et al, 2000). A Figura 3 mostra que o AcMo 2E5D3 reconheceu a proteína recombinante de 47 kDa, demonstrando que a proteína expressa realmente corresponde à p30 de L. (L.) chagasi.
94
67
45
30
20
14
A B C
kDa
47 kDa
3. Avaliação das respostas linfoproliferativas induzidas pela rLdccys1
As respostas proliferativas foram avaliadas nos linfócitos de camundongos BALB/c previamente imunizados com a rLdccy1, utlizando-se P. acnes ou BCG como adjuvantes por via subcutânea ou intraperitoneal e reestímulo in vitro com extrato protéico de L. (L.) chagasi (PAM) e rLdccys1. A viabilidade dos linfócitos em todos os experimentos foi confirmada pela proliferação induzida por Con A à concentração de 2,0 μg/ml que sempre resultou em altos índices de estimulação (IE) (+-15).
Os resultados dos experimentos de proliferação linfoblástica com a rLdccys1 dos camundongos BALB/c imunizados pelos vários esquemas testados são representativos de um experimento de três realizados que apresentaram resultados semelhantes.
3.1. Respostas linfoproliferativas de camundongos BALB/c imunizados com a rLdccys1 e P. acnes como adjuvante pelas vias subcutânea e intraperitoneal
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 10,0 11,0 12,0 13,0 14,0 15,0
P. acnes S.C.
Índic e de E st im ula çã o ( I. E .) PAM rLdccys1 (2,5) rLdccys1 (5,0)
P. acnes S. C. rLdccys-1 + P. acnes S.C.rLdccys1 + P. acnes S. C.
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0
1 2 3 4
Índi
ce de E
st
im
ul
ação (
I. E.
)
PAM
rLdccys1 (2,5)
rLdccys1 (5,0) *
P. acnes
S. C.
P. acnes
I. P.
rLdccys1 +
P. acnes S. C.
rLdccys1 +
P. acnes I. P.
3.2. Respostas linfoproliferativas de camundongos BALB/c imunizados com a rLdccys1 e BCG como adjuvante por via subcutânea
Os resultados de linfoproliferação dos camundongos BALB/c imunizados com
a rLdccys1 e BCG como adjuvante por via subcutânea estão representados nas
Figuras 6 e 7. Pode-se observar que a rLdccys1 induziu índices de estimulação
significantes e semelhantes nos linfócitos de linfonodos e de baço dos animais
imunizados, enquanto foi sempre baixo o reestímulo desencadeado pelo PAM.
PAM
rLdccys1
BCG Linfonodo rLdccys1 + BCG Linfonodo
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0
BCG BCG + rLdccys1
Ín
d
ic
e d
e E
st
imu
lação
(
I. E
.)
PAM rLdccys1 (2,5) rLdccys1 (5,0)
3.3. Caracterização das linfocinas envolvidas nas respostas linfoproliferativas induzidas pela rLdccys1
A produção de IFN-γ, IL-4 e IL-10 foi avaliada nos sobrenadantes dos linfócitos dos camundongos BALB/c que apresentaram os maiores índices de estimulação previamente determinados. A Tabela 1 refere-se aos experimentos de linfoproliferação ilustrados na Figura 5 e pode-se observar que houve secreção de IFN-γ pelos linfócitos dos camundongos BALB/c imunizados com a rLdccys1 + P. acnes e reestimulados com o antígeno. Apesar de os índices de estimulação dos esplenócitos dos animais imunizados com a rLdccys1 + P. acnes por via i.p. em presença da rLdccys1 terem sido maiores que os dos animais imunizados pela via s.c (Figura 5), a secreção de IFN-γ pelos linfócitos desses animais foi muito semelhante à observada nos sobrenadantes dos linfócitos dos animais imunizados pela via i.p. Pode-se observar também que os linfócitos de nenhum dos grupos de animais secretou quantidades detectáveis de IL-4 e IL-10.
Tabela 1: Dosagem de IFN-γ, IL-4 e IL-10 por ELISA nos sobrenadantes dos esplenócitos dos camundongos BALB/c imunizados com a rLdccys1 + P. acnes e reestimulados in vitro com a rLdccys1.
IFN-γ (ng⁄ml) IL-4 (ng/ml) IL-10 (ng/ml) Esquema de
imunização CM rLdccys1
(5µg⁄ml) CM rLdccys1 (5µg⁄ml) CM rLdccys1 (5µg⁄ml)
P. acnes s.c. 0,007 0,008 <0,050 <0,050 <0,025 <0,025
rLdccys1+P. acnes
s.c. 0,07 0,915 <0,050 <0,050 <0,025 <0,025
P. acnes i.p. 0,06 0,083 <0,050 <0,050 <0,025 <0,025
rLdccys1+P. acnes
i.p. 0,07 0,876 <0,050 <0,050 <0,025 <0,025
Tabela 2: Dosagem de IFN-γ, IL-4 e IL-10 por ELISA nos sobrenadantes dos linfócitos esplênicos e de linfonodos dos camundongos BALB/c imunizados com rLdccys1 + BCG por via s.c. e reestimulados in vitro com a rLdccys1.
IFN-γ (ng⁄ml) IL-4 (ng/ml) IL-10 (ng/ml) Esquema de
imunização CM rLdccys1 (5µg⁄ml) CM rLdccys1 (5µg⁄ml) CM rLdccys1 (5µg⁄ml)
BCG - Baço 0,007 0,008 <0,050 <0,050 <0,025 <0,025
rLdccys1+BCG
Baço 0,009 2,461 <0,050 <0,050 <0,025 <0,025
BCG - Linfonodo 0,006 0,007 <0,050 <0,050 <0,025 <0,025
rLdccys1+BCG
Linfonodo 0,008 0,514 <0,050 <0,050 <0,025 <0,025
4. Imunização ativa em camundongos BALB/c
A antigenicidade da p30 de L. (L.) chagasi foi anteriormente demonstrada pelas respostas linfoproliferativas de camundongos BALB/c in vitro e em ensaios de imunização ativa contra a infecção homóloga. Nesses animais o antígeno p30 desencadeou respostas parcialmente protetoras, caracterizadas por linfócitos CD4+ da subpopulação Th1 (Lopes, 1999; Pinto et al., 2000). Uma vez que a proteína rLdccys1, resultante da subclonagem do gene Ldccys1 em vetor pHis e expressão em sistema bacteriano, é capaz de induzir respostas linfoproliferativas e produção de linfocinas Th1 em camundongos BALB/c in vitro, a rLdccys1 e o gene Ldccys1 foram testados quanto à capacidade proteger camundongos BALB/c contra a infeção por L. (L.) chagasi.
4.1. Imunização dos animais com a proteína recombinante rLdccys1
Os animais foram imunizados três vezes com a rLdccys1, com BCG ou P. acnes como adjuvantes por via subcutânea, em intervalos semanais e desafiados com 1x107 amastigotas de L. (L.) chagasi quatorze dias após a última imunização. Dois meses e meio após o desafio os animais foram sacrificados e avaliaram-se a carga parasitária no baço, a secreção de IFN-γ e IL-4 e a produção de óxido nítrico nos sobrenadantes das culturas dos esplenócitos.
4.1.1. Avaliação da carga parasitária dos animais imunizados e desafiados com
L. (L.) chagasi
imunizados com a proteína recombinante e P.acnes como adjuvante, porém foi semelhante a proteção induzida pela rLdccys1 administrada com P. acnes ou BCG quando comparada à dos respectivos controles.
* * 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012
PBS
BCG
BCG+ rLdccys1
P. acnes
P.acnes
+ rLdccys1
C
arg
a P
ara
sitá
ri
a
* * 104 105 106 107 108 109 1010 1011 1012PBS
BCG
BCG+ rLdccys1
P. acnes
P.acnes
+ rLdccys1
C
arg
a P
ara
sitá
ri
a
4.1.2. Avaliação da produção de linfocinas nos animais imunizados e desafiados com L. (L.) chagasi
O perfil de linfocinas foi determinado pelo ensaio de ELISA de captura, utilizando-se os sobrenadantes das culturas de linfócitos de baço dos animais imunizados com a proteína rLdccys1 juntamente com os adjuvantes P. acnes ou BCG e reestimulados in vitro com a rLdccys1. Na tabela 3 estão representados os resultados das dosagens de IFN-γ e IL-4.
Níveis significantes de IFN-γ foram detectados nos sobrenadantes das culturas de linfócitos dos camundongos imunizados com a proteína recombinante e reestimulados com a rLdccys1, quando BCG (3,85 ng/ml ± 0,35) ou P. acnes (4,06 ng/ml ± 0,21) foram utilizados como adjuvantes. É interessante notar que embora as células reestimuladas com a rLdccys1 tenham produzido concentrações um pouco maiores de IFN-γ, essa linfocina também foi detectada no sobrenadante das células não reestimuladas com o antígeno (CM). Entretanto, os esplenócitos dos animais imunizados apenas com BCG ou que receberam PBS não secretaram concentrações detectáveis de IFN-γ. No grupo dos animais imunizados apenas com a P. acnes foi detectado IFN-γ (0,52 ng/ml ± 0,03), no entanto esses níveis não foram significantes quando comparados aos dos grupos de animais imunizados com a rLdccys1.
Contrariamente à produção de IFN-γ, IL-4 não foi detectada nos sobrenadantes dos animais imunizados com a proteína recombinante em nenhum dos dois grupos (rLdccys1+ BCG e rLdccys1 + P. acnes). Pode-se observar também que, embora em baixas concentrações, IL-4 foi detectada nos grupos dos animais controles injetados apenas com PBS (0,84 ng/ml ± 0,06), BCG (0,86 ng/ml ± 0,07) ou P. acnes (0,63 ng/ml ± 0,02).
Tabela 3: Dosagem de IFN-γ e IL-4 por ELISA nos sobrenadantes das culturas dos esplenócitos dos camundongos BALB/c imunizados com a rLdccys1, desafiados com a L. (L.) chagasi e reestimulados in vitro com a rLdccys1.
IFN-γ (ng/ml) IL-4 (ng/ml)
Grupo CM rLdccys1 CM rLdccys1
PBS < 0,3 < 0,3 0,70 ± 0,03 0,84 ± 0,06
BCG < 0,3 < 0,3 0,85 ± 0,07 0,86 ± 0,07
BCG + rLdccys1 2,58 ± 0,07 3,85 ± 0,35 < 0,3 < 0,3
P. acnes 0,49 ± 0,01 0,52 ± 0,03 0,62 ± 0,01 0,63± 0,02
P.acnes + rLdccys1 3,82 ± 0,02 4,06 ± 0,21 < 0,3 < 0,3
4.1.3. Dosagem de óxido nítrico nas culturas de esplenócitos dos animais imunizados e desafiados com L. (L.) chagasi
