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PATRICIA VALÉRIA PEREIRA SERAFIM
ESTUDO DO POLIMORFISMO Ile 462 Val DO GENE
CYP1A1 EM PACIENTES COM CÂNCER
COLORRETAL
Tese apresentada à Universidade Federal de
São Paulo - EPM, para obtenção do Título de
Mestre em Ciências.
Orientadora : Profa Dra Nora Manoukian Forones
Co-orientador: Prof. Dr. Ismael Dalle Cotrim Guerreiro da Silva
São Paulo
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III
PATRICIA VALÉRIA PEREIRA SERAFIM
Universidade Federal de São Paulo
Escola Paulista de Medicina
Disciplina de Gastroenterologia Clínica
Chefe do Departamento de Medicina:
Profa Dra Emilia Inoue Sato
Cordenador do Programa de Pós -Graduação:
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IV
PATRICIA VALÉRIA PEREIRA SERAFIM
POLIMORFISMO Ile 462 Val NO GENE
CYP1A1 EM PACIENTES COM CÂNCER COLORRETAL
Presidente da Banca: Profa. Dra. Nora Manoukian Forones
BANCA EXAMINADORA:
Prof. Dr. _________________________________________
Prof. Dr. _________________________________________
Prof. Dr. _________________________________________
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A Deus, pelo dom da vida, pelas grandes dificuldades e imensas conquistas, pois apenas com a superação das dificuldades se conquista as grandes vitórias
Aos meus pais, Cecília e Waldemar, meus melhores e grandes amigos por seu eterno amor e apoio em todos os momentos de minha vida.
Aos meus amados marido Rui e filhos Bruna e Guilherme, pelo incentivo, imenso amor, estando sempre ao meu lado, sem vocês esta conquista não seria possível.
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Agradecimentos
À Profa. Dra Nora Manoukian Forones, chefe da disciplina de Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, orientadora, pelo respeito e confiança depositadas e por sua dedicação à orientação deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Ismael Dale Cotrim Guerreiro da Silva, professor-adjunto e coordenador do Laboratório de Ginecologia Molecular do departamento de Ginecologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, co-orientador, pela oportunidade e co-orientação deste trabalho.
A Prof Dra Maria Lucia Gomes Ferraz, coordenadora do programa de Pós Graduaçãoda disciplina de Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, pela oportunidade de realizar o estudo.
As minhas amigas pós graduandas Jacqueline Miranda de Lima e Lessileia Gomes Souza da disciplina de Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP pela amizade e incentivo e companheirismo sempre presente. Esta vitória também é de vocês.
As amigas pós graduandas Fabíola Elizabeth Vilanova e Audrey Yumi Otsuka e técnica Tatiana dos Santos do Laboratório de Ginecologia Molecular do Departamento de Ginecologia da Medicina da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP pelo carinho e incentivo em todos os momentos.
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À Dra. Celina Tizuko Fujiyama Oshima do Laboratório da Disciplina de Anatomia Patológica da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP pelo interesse e apoio constante durante a execução desta tese.
À Auxiliar de enfermagem Vera Lucia de Souza do Ambulatório
Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP-EPM , por seu carinho e sua disposição em colaborar na execução deste trabalho
Aos secretários Magali Angélica Romano e Valdir Sophia, da disciplina de Gastroenterologia da Universidade Federal de São Paulo UNIFESP, pelo interessee atenção durante a elaboração desta tese
Ao Dr Fabio Tadeu Montesano pela disponibilidade e execução dos métodos de estatísticos deste trabalho
As minhas amigas Maria Enéas Serafim, Márcia Batista Serafim Fillocomo e Shirley de Fátima Serafim Pereira que estiveram sempre presenteincentivado com sua alegria e torcendo por mim.
Aos pacientes que atenciosamente colaboraram para que esse trabalho pudesseter sido realizado.
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VIII
Sumário
Lista de Tabelas---X
Listas de Quadros e Figuras---XII
Abreviaturas---XIII
Resumo---XIV
Abstract
1. Introdução...01
1.1 Objetivos ...
2. Revisão de literatura...
2.1 Câncer ...
2.2 Câncer colorretal...
2.3 Citocromo P 450 ...
2.4 Polimorfismo genético no gene CYP1A1 ...
3. Casuística e Métodos ...
3.1 Casuística ...
3.1.1. Descrição dos Grupos...
3.2 Métodos ...
3.2.1. Extração do DNA genômico ...
3.2.2 Quantificação de DNA...
3.2.3. Reações de amplificação (PCR) ...
3.2.4. Análise do polimorfismo no gene CYP1A1...
3.3. Analise Estatística...
IX
IX
4.1 PCR e Genotipagem por R.F.L.P...
4.2 Comparação entre Controles e Pacientes...
4.3 Análise de correspondência ...
4.4 Estudo entre os Alelos e Variáveis...
4.5 Estudo das Características Ligadas à Doença...
4.6 Analise de Sobrevivência...
5. Discussão ...
6. Conclusão...
X
X
Lista de Tabelas
Tabela 1: Características dos Oncogenes e Genes supressores de
tumor. ... Tabela 2: Distribuição de pacientes e controles quanto ao sexo. ... Tabela 3: Distribuição de pacientes e controles quanto à etnia... Tabela 4: Distribuição de pacientes e controles quanto à história
familiar de câncer. ... Tabela 5: Distribuição de pacientes e controles quanto ao etilismo. ... Tabela 6: Distribuição de pacientes e controles quanto ao tabagismo... Tabela 7: Distribuição de pacientes e controles quanto aos alelos
estudados. ... Tabela 8: Resultados da comparação entre pacientes e controles... Tabela 9: Medidas descritivas da idade dos indivíduos, segundo grupo. ... Tabela 10: Distribuição de variáveis quanto aos alelos ... Tabela 11. Distribuição da amostra quanto ao grau de diferenciação
celular. ... Tabela 12. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Sexo ... Tabela 13. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Etnia... Tabela14. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e História
familiar ... Tabela 15. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Etilismo... Tabela 16. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e
Tabagismo ... Tabela 17. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Alelos... Tabela 18. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Grau de
diferenciação ... Tabela19. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e
XI
XI
Tabela 20. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e
Classificação T... Tabela 21. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e
Classificação N ... Tabela 22. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e
Classificação M... Tabela 23. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e
Estadiamento... Tabela 23. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e
Estadiamento... Tabela 24. Resultados do estudo da associação entre cada variável e a
situação atual, isoladamente... Tabela 25. Resultados do primeiro modelo ajustado. ... Tabela 26. Resultados do modelo ajustado, excluindo-se a variável
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XII
Listas de Quadros e Figuras
Quadro 1: Estádio do câncer colorretal ... Quadro 2 : Classificação das famílias, subfamílias e genes
individuais ... Quadro 3: Substrato e funções da família, sub-família e dos
genes do citocromo humano... Quadro 4. Características das pacientes do grupo I. ... Quadro 5: Características das pacientes do grupo II (grupo
controle)...
Figura1: NADPH-Citocromo redutase... Figura 2: Apresenta a foto da separação eletroforética,
demonstrando amplificação do produto de PCR
com tamanho de 340 pb. ... Figura 3: Apresenta foto de separação eletroforética,
demonstrado os sítios de restrição com tamanhos
de 340bp, 200bp e 140 bp. ... Figura 4: Gráfico da análise de correspondência...
Figura 5. Funções de sobrevivência estimadas pelo modelo
de Cox, segundo o estadiamento da doença...
Figura 6. Funções de sobrevivência estimadas pelo modelo
XIII
XIII
Abreviaturas
Bp Pares de base
CCR Câncer Colorretal
CEA Antígeno Carcinoembrionário
CYP Citocromo P450
CYP1A1 Citocromo P450 da familia 1 A 1 DNA Acido Desoxirribonucleico GIST Tumor Estromal Gastrointestinal HAA Aminas Aromáticas
HNPCC Câncer colorretal hereditário não polipoide
M Metástase
N Linfonodos
T Tumor
PCR Reação em Cadeia de Polimerase PHAs Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
R.F.L.P. Polimorfismo de tamanho de fragmento de restrição RNA Ácido Ribonucleíco
UICC Union International Against Cancer UV Ultravioleta
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Resumo
Introdução: A enzima Citocromo P450 é integrante de uma superfamília de proteínas organizadas em famílias, subfamílias e genes individuais com base na porcentagem de identidade entre as seqüências de aminoácidos. Essas enzimas desempenham o importante papel de metabolisar e detoxificar diversos compostos. A família do gene CYP1 é induzida pelo receptor aril hidrocarboneto hidroxilase (AHH) que acarretará na ativação dos hidrocarbonetos policíclico aromático (PAHs), presente em vários compostos resultando em um aumento da atividade da enzima. Foram descritos na literatura dois polimorfismos associados ao gene CYP1A1, transição T C na região 3’ não codificadora, e uma outra transição de A G (Ile462 Val, exon 7). Cada uma das alterações dão origem a sítios de restrição MspI . Somente o polimorfismo T C recebe o nome da enzima MspI. Entretanto, apenas o polimorfismo.
A G demonstra ter associação com o aumento da inducibilidade do gene CYP1A1demonstrando um maior significância e de interesse para esse estudo.
Objetivo: investigar a incidência do polimorfimo A G (Ile462 Val, exon 7) e sua associação com câncer colorretal, correlacionando com alguns fatores de risco da doença .
Casuística e Método: Foram selecionados 114 pacientes portadores de câncer colorretal e 114 indivíduos sem câncer que constituíram o grupo controle. Todos foram submetidos à entrevista e a coleta de sangue periférico para extração do DNA genômico. Investigamos a presença do polimorfismo do gene CYP1A1 utilizando técnica de reação em cadeia de polimerase (PCR) e reação de genotipagem por técnica de RFLP. As amostras foram analisadas por meio de corrida eletroforética em gel de agarose e gel Low melting para a identificação da presença do polimorfismo .
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masculino, 99 eram da etnia branca e 15 eram negros , 67 eram etilistas , 53 tabagistas, 40 tinham história de câncer . Em relação ao polimorfismo estudado 81 eram homozigotos selvagem A/A, 33 heterozigoto A/G. O tabagismo, historia familiar de câncer e a presença do alelo G foram mais freqüentes entre os indivíduos com câncer. Não observamos correlação entre a evolução da doença e freqüência dos alelos. Os pacientes de etnia amarela e estádio III tiveram maior índice de recorrência da doença.
XVI
XVI
Abstract
Abstract
Introduction The enzyme Citocromo P450 is an integrant of a super family of proteins organized in families, subfamilies and individual genes based on the percentual of the identity of the amino acid sequences. These enzymes play an important role in the metabolization and detoxification of various compounds. The aril hydro-carbon hidroxilase (AHH) receptor induce the family of the gene CYP1
responsible for the activation of polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs), that are present in high concentration in cigarette smoke, polluted air and foods.
Two polymorphisms of the gene CYP1A1 has been described, one on the transition T C in the 3' noncoding region, and the other one in the A G transition (Ile462 Val, exon 7). Both the polymorphisms generate fragments that are digestion sites of MspI, but only the T C polymorphism receives the name of MspI enzyme. Due to its high inducibility of the CYP1A1 gene polymorphism A G had a bigger interest.
AIM: to investigate the incidence of the polymorphism A G (Ile462 Val, éxon 7) in colorectal cancer patients and the correlation of this polymorphism and others risk factors.
Patients and Method: 114 patients with colorectal cancer and 114 without cancer matched by age with the case group were included in the control group. All of the patients had been submitted to an interview and peripheral blood was drawn for DNA extraction. The presence of the polymorphism in the CYP1A1 gene was determined by a specific polymerase chain reaction (PCR) and RFLP technique. The samples had been analyzed agarosis electrophoresis gel and gel Low melting for the
identification of the presence of the polymorphism.
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history of cancer and the presence of the allele G had been more frequent in the cancer group. The asiatics and stage III patients had higher index of recurrence of the disease.
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XVIII
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XIX
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1. INTRODUÇÃO
O câncer como doença é definido por suas propriedades de proliferação local descontrolada de células, com invasão de estruturas normais adjacentes, e pela disseminação à distância, ou metástase, através da corrente sanguínea dos linfáticos ou em uma cavidade do organismo (Willard, 2002).
Mundialmente, o câncer de cólon e reto somam cerca de 943 mil novos casos a cada ano, ocupando o quinto lugar entre os mais incidentes. Segundo dados do INCA as estimativas para 2005 indicam que o câncer de colón e reto é a quarta neoplasia mais incidente em ambos os sexos. A maior incidência de casos ocorre na faixa etária entre 50 e 70 anos de idade, porém a possibilidade de desenvolvimento já aumenta a partir dos 40 anos de idade (Instituto Nacional do Câncer INCA online, 2005).
Muitos carcinógenos químicos são metabolicamente ativados acarretando efeitos deletérios em nosso organismo (Hayashi et al, 1991). A conversão pelo citocromo P450 (CYP) em derivados hidrofílicos facilita a sua eliminação. A superfamília de genes CYP450 codifica numerosas enzimas que catalizam uma notável variedade de reações químicas e um grande número de substratos. Consequentemente, o CYP450 é considerado o sistema biológico de catalização mais versátil (Conforti, 2004).
Presume-se que no genoma humano existam em torno de 60 a 100 genes codificadores de P450, e cerca de 20 deles estão envolvidos na codifição de enzimas que metabolizam compostos exógenos (Conforti, 2004)
O CYP foi primeiramente descrito na década de 1960, e recebeu esta terminologia pela presença de um pigmento com ação enzimática e pela faixa de absorção no espectro de 450 nanômetros. Ainda em meados de 1960, foi associado ao metabolismo de esteróides e drogas. Em 1970 foram estudadas algumas enzimas associadas à membrana celular e a um sistema de detoxificação de metabólitos (Nebert, Russell, 2002).
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cromossomo 15 no lócus MPl, obtendo muitos resultados a partir da clonagem de diferentes enzimas. De acordo com as seqüências, identificaram similaridade entre o citocromo de humanos e bactérias. As isoenzimas P450 foram divididas em famílias, com base em sua relação evolutiva determinada pelo grau de homologia de genes individuais, e assim, estruturas de aminoácidos nas proteínas (Okey, 1990).
O citocromo P450 é uma enzima que atua principalmente na presença de carcinógenos da dieta e do tabaco. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) gerados pela combustão de alguns carcinógenos, incluindo os existentes no tabaco são metabolizados por esta enzima (Badawi et al , 1996).
Estudos com os genes do citocromo P 450 humanos têm demonstrado que estes são polimórficos e diferem nas populações quanto à origem racial e étnica (Badawi et al, 1996).
Estas diferenças determinadas geneticamente, são responsáveis pelas diferentes respostas às drogas e carcinógenos (Song et al, 2001).
Estudos caso-controle mostram um aumento do risco relativo para o câncer em indivíduos portadores do genótipo C, (indivíduos homozigotos mutados G/G), em relação aos indivíduos que apresentam os genótipos A, (homozigotos tipo selvagem A/A) e B (heterozigotos A/G), com o consumo do tabaco (Hayashi et al, 1991).
Ensaios foram realizados na pesquisa de alterações genéticas ligadas à presença dos polimorfismos associado a mutações nos alelos da região 3’ no sitio MspI e do exon 7 (Inoue et al, 2000), que acarretará a troca de uma interleucina por valina.
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XXI
1.1 Objetivos
1. Avaliar a eventual correlação entre o polimorfismo Ile 462 Val no gene CYP1A1 com a presença de adenocarcinoma colorretal.
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2. Revisão de Literatura
2.1 Câncer
O termo câncer deriva de Karkinos, palavra grega que significa caranguejo e como uma entidade clínica, está nos primeiros escritos gregos e romanos, e assumiu uma posição de importância especial como doença muito temida e objeto de pesquisa biomédica intensiva (Chanber et al, 1993)
A maioria dos cânceres origina-se de uma célula única, geneticamente alterada. Vários tumores possuem células homozigóticas para certos marcadores, para os quais o hospedeiro é heterozigoto o que sugere sua clonalidade (Chanber et al, 1993). À medida que o tumor cresce e produz metástase, vários subclones celulares emergem, conferindo heterogeneidade à população celular maligna. Instabilidade genética e progressão tumoral, onde as células tumorais passam pelas fases do ciclo celular (G0, G1, MS, G2,) são as características básicas do câncer (Murad, 1996).
O crescimento de uma população celular depende do tempo gasto para a realização do ciclo celular (tempo decorrido entre duas mitoses sucessivas), da fração do crescimento porcentagem de célula que ativamente passam pelo ciclo celular e da taxa de perda celular (Murad,1996).
Existem três formas principais de câncer os sarcomas, nos quais o tumor surgiu em tecido mesenquimal, tal como o tumor de osso, músculos ou tecido conjuntivo; os carcinomas, que se originam no tecido epitelial, tal como as células que revestem o intestino, os brônquios ou os ductos mamários e as malignidades hematopoéticas e linfóides, tais como as leucemias e os linfomas, que se espalham pela medula óssea, pelo sistema linfático e sangue periférico. Dentro de cada um dos grupos principais, os tumores são classificados de acordo com o local, os tipos de tecido, o aspecto histológico e o grau de malignidade (Cooper, 2001).
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por meio de um processo normal de fragmentação do DNA e suicídio celular chamado de apoptose (Willard, 2002).
Os processos de divisão celular são regulados por uma grande gama de genes. Amplas pesquisas realizadas durante as ultimas décadas revelaram que mutações nos genes que controlam a proliferação e a morte são responsáveis pelo câncer. Na maioria dos cânceres, as mutações ocorrem em uma única célula somática, que então se divide e promove o câncer. Quando o câncer ocorre como parte de uma síndrome de câncer hereditário, as mutações iniciais são herdadas por meio da linhagem germinativa e, portanto, estão presentes em cada célula do organismo. Uma vez iniciado, o câncer evolui pelo acúmulo adicional de danos genéticos, por meio de mutação nos genes que codificam a maquinaria celular que repara o DNA danificado e mantém a normalidade citogenética. Os danos a estes genes produzem uma cascata maior de mutações em um número crescente de genes que controlam a proliferação celular e o reparo aos danos no DNA. Deste modo, o clone original da célula neoplásica pode evoluir em várias sublinhagens de graus variados de malignidade, cada uma carreando um conjunto de mutações que são diferentes das mutações de outras sublinhagens (Willard, 2002).
Desta maneira acredita-se que o câncer é o resultado de alterações estruturais e/ou funcionais de alguns genes cuja função é controlar o crescimento normal e a diferenciação das células que compõem o organismo. As alterações genéticas envolvem tanto a amplificação e ativação de proto-oncogenes quanto mutações que levam à perda e/ou à inativação dos alelos de genes supressores de tumor. A tabela 1
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Tabela 1. Características dos Oncogenes eSupressores de tumor.
Características Oncogene Supressores de tumor
Número de eventos mutacionais para o desenvolvimento tumoral
Um Dois
Atividade demonstrada em ensaios de Transfecção
Sim Sim
Função do alelo mutante Dominante (ganho de função)
Recessiva (perda de função) Associação com síndromes de câncer
hereditário
Raramente (proto-oncogene)
Frequentemente
Mutações somáticas contribuem para o desenvolvimento do câncer
Sim Sim
Fonte: Conforti, 2004
Os oncogenes são formas alteradas dos proto-oncogenes, genes envolvidos no controle da proliferação celular, que podem diferir tanto na estrutura quanto na função da proteína codificada pelo seu homólogo normal e que são envolvidos no processo de transformação maligna (Jensen, Hunter, 2001)
O que torna as mutações ocorridas nas células cancerosas diferentes é a seleção positiva para a proliferação celular ou sobrevida da célula. É o fenótipo de uma célula cancerosa, sua proliferação descontrolada e excessiva, permitindo que uma célula mutante se desenvolva em doença. Em contraste, muitas vezes as mutações fazem com que uma célula dentre muitas, perca a função ou morra sem causar efeitos fenotípicos por que a perda da célula é mascarada pela grande maioria das outras saudáveis em um órgão ou tecido (Cooper, 2001).
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XXVI
são altamente heterogêneos. Alguns são verdadeiros supressores tumorais, no sentido de que estão diretamente envolvidos na regulação do ciclo celular ou na inibição do crescimento pelo contato célula-célula (Lodish etal, 2002).
Os supressores tumorais foram chamados de genes protetores, pois regulam diretamente o crescimento celular. Outros genes, chamados de genes de manutenção, estão envolvidos em reparar danos de DNA e manter a integridade genômica. A perda de ambos os alelos dos genes que estão envolvidos em reparar danos no DNA ou quebras cromossômicas leva indiretamente ao câncer, pois permitem que mutações secundárias adicionais se acumulem em proto-oncogenes ou em outros genes supressores tumorais. Os produtos de muitos genes supressores tumorais foram isolados e estes são por natureza protetores contra o câncer. O melhor entendimento destes mecanismos contribuirá na evolução de terapias anticâncer (Lodish et al, 2002).
2.2 Câncer Colorretal
O câncer colorretal é predominantemente uma doença de pessoas com idade superior aos 50 anos de idade. No Brasil, é a 4ª causa de câncer em homens e a 3ª em mulheres, sendo também a 5ª causa de morte por câncer nos homens e a 3ª. entre as mulheres. O câncer colorretal será responsável por 7230 óbitos e 16165 casos dessa doença serão diagnosticados neste ano (Instituto Nacional do Câncer – INCA online, 2005).
Em relação ao sexo, a freqüência entre mulheres foi ligeiramente superior que entre homens (11,73: 10,96 casos novos a cada cem mil habitantes). Há predominância dos cânceres nos segmentos do lado esquerdo (descendente, sigmóide e reto em 70%), seguidos em menor freqüência pelo ascendente e transverso (Forones et al, 2004).
XXVII
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O diagnóstico das neoplasias colorretais baseia-se no quadro clínico e em exames complementares. A queixa mais freqüente é alteração de hábito intestinal, diarréia na maioria dos tumores de cólon direito e obstipação nos de cólon esquerdo. No câncer de reto, as queixas principais são afilamento das fezes, eliminação de muco serossangüinolento e dor para evacuar. Perda de peso e astenia leve costuma ocorrer. Parada de eliminação de fezes e flatos há algumas horas, acompanhada de distensão abdominal e dor, caracterizando quadro de abdome agudo obstrutivo podem ser os sintomas iniciais da doença em 10% dos doentes com câncer de cólon esquerdo (Forones et al, 2004).
Laboratorialmente, o paciente poderá apresentar: anemia ferropriva hipocrômico-microcítica, assim como perda de sangue oculto nas fezes. A gamaglutamiltranspeptidase e a fosfatase alcalina poderão apresentar-se elevadas, devido a metástases hepáticas acompanhadas, nesses casos, de discreta elevação das transaminases séricas. O antígeno carcinoembrionário (CEA) é um marcador tumoral que se eleva em aproximadamente 50% dos doentes, principalmente nos estádios avançados (III e IV) e quando elevado, ao diagnóstico da doença, é um fator de pior prognóstico (Minsky, 2002).
A colonoscopia e /ou a retossigmoidoscopia permite a confirmação diagnóstica pelo aspecto da lesão e pelo estudo anatomopatológico da biópsia dirigida. A visualização de todo o cólon é necessária porque podem existir tumores sincrônicos (lesões concomitantes em outra região colônica) em 7 a 10 % dos doentes. Nos tumores obstrutivos que impedem a passagem do aparelho, a colonoscopia deve ser realizada nos primeiros meses de acompanhamento pós-operatório. O enema opaco também permite o diagnóstico da lesão, mas é menos sensível.
A ultra-sonografia endoscópica permite determinar o grau de invasão da parede intestinal pelo tumor e presença de linfonodos, possibilitando melhor estádio pré-operatório dos tumores de reto (Berlin, 2001).
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Dukes ou de Dukes modificada por Aster Coller (Quadro1) (Forones et al, 2004; Astler, Coller, 1954).
Os fatores de prognóstico principais são: níveis séricos dos marcadores tumorais, tamanho do tumor primário, grau de diferenciação histopatológica e estádio (Aster, Coller, 1954).
Quadro1: Estádio do câncer colorretal
Classificação Estadiamento
Dukes Aster-Coller Estádio 0 I II A II B III A III B III C IV
A Tumor limitado á mucosa e muscular
B Tumor invade todas as camadas do intestino
C Tumor com metástase em linfonodo independente da penetração tumoral A Tumor limitado a mucosa
B1 Tumor invade a muscular própria
B2 Tumor invade todas as camadas do intestino B3 Tumor invade órgãos adjacentes
C1 Tumor invade a muscularis própria com metástase linfonodal
C2 Tumor invade todas as camadas do intestino com metástase linfonodal C3 Tumor invade órgãos adjacentes com metástase linfonodal
D Metástase á distância
TNM TisN0M0 T1N0M0 T2N0M0 T3N0M0 T1N0M0 T2N1M0 T3-4N1M0 TqN2M0 TqNqM1 Fonte: Forones et al,2004.
Tis = tumor in situ, T1 = invasão de mucosa, T2 = invasão de muscular principal,. T3 = invasão de serosa
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Os fatores que levam uma pessoa a desenvolver a neoplasia são a predisposição genética associada a fatores ambientais. A associação do consumo excessivo de carnes vermelhas, principalmente preparadas em altas temperaturas, dietas pobres em resíduos e fibras, está relacionada ao aumento significativo do câncer colorretal. Situações onde ocorrem aumentos dos sais biliares ao nível dos intestinos, como alimentação rica em gordura e pacientes que retiraram a vesícula biliar, aumentam a predisposição à doença (Heath et al, 2001)
Fatores de risco para o desenvolvimento do câncer colorretal podem incluir ambos os fatores hereditários e ambientais (Heath et al, 2001). Entre os fatores ambientais, químicos genotóxicos, assim como ingesta de alimentos co-carcinogênicos, podem estar envolvidos no desenvolvimento do câncer colorretal, alguns desses agentes são formados durante o preparo dos alimentos, como aminas heterociclicos aromáticos (HAA) (Terry et al, 2002).
2.3 Citocromo P 450
O citocromo é um termo genérico de uma superfamília de hemoproteínas, formada por uma parte protéica (apoproteína) e outra por um grupo heme monoxigenase em forma de proporfirina IX. Todos os CYPs possuem íons não-covalentes e são classificadas com base nas seqüências de aminoácidos (Pirmohamed, Park, 2003). Os CYPs estão localizados na sua grande maioria nas membranas intracelulares do retículo endoplasmático celular, mas também podem se localizar na membrana da mitocôndria e na membrana citoplasmática. Em seres humanos os CYPs se localizam, principalmente, no fígado, e em menor quantidade no tubo gastrointestinal (Weide, Steijins, 1999).
XXX
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(Weide, Steijins, 1999). As famílias apresentam uma similaridade 55% entre si e as subfamílias apresentam identidade 40% (Gonzalez, Gelboin,1993).
Atualmente existem 270 famílias diferentes, 249 genes são ativos e 24 são não funcionais ou pseudogenes. Em humanos existem 57 genes humanos e 33 pseudogenes, estes são agrupados em 18 famílias e 42 subfamílias (Quadro 2) (Gonzalez, Gelboin,1993).
Quadro 2 :Classificação das famílias, subfamílias e genes individuais
Fonte: Weide et al, 1999
O citocromo p450 atua numa enorme gama de substratos que incluem vitaminas, esteróides, ácidos graxos, prostaglandinas, aminase, xenobióticos, tais como drogas (incluindo antibióticos), carcinógenos ambientais, antioxidantes, solventes, anestésicos, corantes, pesticidas, produtos derivados do petróleo, álcoois, entre outros (Quadro 3).
Família
CYP1
CYP2
CYP3
Subfamília
CYP1A
CYP2E
Gene individual
XXXI
XXXI
Quadro 3: Substrato e funções das sub-famílias e dos genes do citocromo humano
N˚ de subfamília 2 13 1 5 1 2 2 2 1 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1
No. de genes 3 16 4 12 1 2 2 3 1 1 1 1 1 3 3 1 1 1 1 1
Substrato e Funções
Ácidos araquidônico, ecoisanóides Ácidos araquidônico,ecoisanóides Ácidos araquidonico, graxos e ecoisanóides
Ácidos graxos, araquidônicos e ecoisanóides
Tromboxano Sintetase
Colesterol, síntese de ácido biliar Prostaciclina síntese de ácido biliar Esteróides
Esterol 17 hidroxilase Aromatase
Desconhecido
Esterol 21 hidroxilase Vitamina D, 24 hidroxilase Hidroxilação de acido retinoico Biossíntese de ácido biliar, 24 hidroxicolesterol
24 hidroxilase colesterol 14 desmetilase colesterol Fonte: (Nebert, Russell, 2002).
XXXII
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desalogenação, bem como redução. A maior parte dos substratos é lipofílico e não há evidências de que as interações de carga contribuam para a união pelo citocromo. Algumas das transformações são essenciais para a vida, como a conversão do colesterol a corticóide e hormônios sexuais; outras particularmente com relação aos xenobióticos, conduzem a formação de compostos mais polares, mais facilmente excretáveis diretamente, ou a conjugação com agentes hidrossolúveis, como o ácido glicurônico e a glutationa. A conjugação representa o processo de detoxificação, contudo grande parte dos compostos estranhos é convertida, mediado pelo CYP450, a produtos com poder aumentado de citotoxicidade, mutagenicidade e carcinogenicidade. Alguns dos CYP450, tais como os envolvidos na transformação de esteróides, são bastante seletivos em suas escolhas para os substratos, enquanto outros CYP450 particularmente os do microssomo hepático, não possuem, comumente ampla especificidade de encaixe (Conforti, 2004)
Figura1: NADPH-Citocromo redutase
Fonte: Google/imagem (online)
NADPH-Cytochrome P450 Oxidoreductase
O DPH-citocromo P450 redutase existe em todos os tecidos mediando reações de substratos endógenos que ocorrem em nosso esteróides, ácidos
XXXIII
XXXIII
De uma forma simplista podemos dizer que a estrutura da enzima possui sítios para atracar duas moléculas constituindo duas fases (Gonzalez, Gelboin, 1993).
Fase I – mediado pelo metabolismo oxidativo que consiste na adição do grupamento hidroxila a um átomo de carbono (Okei,1990). Este pode ser catalisado por uma reação de hidroxilação, onde o Citocromo utiliza o oxigênio como substrato. Desta forma os compostos são convertidos por reação oxidativa em metabolitos eletrofilicos (Nebert, Russell, 2002).
Fase II - o grupamento hidroxila funciona como substrato para a adição de co-substrato hidrofílico, para a conjugação da Glutationa-S-transferase (GST), UDP-Glucuronusiltranferase e N-acetiltransferase (NAT) (Nebert, Russell, 2002). Entre as principais funções podemos citar:
a. Função detoxificadora – elimina substâncias exógenas como drogas, substâncias carcinogênicas, transformando substâncias hidrossolúveis em lipossolúveis (Conforti-Frosis,1998).
b. Função metabolizadora – metabolismo endógeno, participando no metabolismo de esteróides, vitaminas, sais biliares, ácidos graxos saturados ou insaturados, ecosainóides
De uma forma geral, o substrato ativa a produção de enzimas. No citocromo P4501A1 primeiramente o químico tóxico se une a um receptor Aril hidrocarbono hidroxilase (AAH). O complexo penetra no núcleo se une ao DNA e permite através da transcrição para o RNA mensageiro, a produção de novas moléculas de enzima P450 que se dirigem ao retículo endoplasmático para degradação de carcinógenos (Hayashi1991).
XXXIV
XXXIV
2.4 Polimorfismo genético no gene CYP1A1
O polimorfismo genético caracteriza-se pela presença de diferentes versões de uma seqüência de DNA (alelos), em um determinado local cromossômico (locus) e encontram-se em uma freqüência superior a 1% nos cromossomos da população em geral. Diferente do polimorfismo, o termo mutação se refere a qualquer mudança na seqüência de nucleotídeos ou DNA e ocorrem em freqüência inferior a 1% da população (Willard 2002).
O polimorfismo do gene P 450 pode desencadear várias alterações (Pirmohamed, Park, 2003).
1. Abolição da atividade causada por uma deleção do gene, ou alterações splicing, introdução de um stop códon, inativação do sítio trancripcional ou introdução de aminoácido deletério. Determinando geneticamente, uma variação na atividade da enzima resultando em diferentes fenótipos do metabolismo de drogas (Akiyama, Gonzalez, 2002).
2. Alteração da atividade, onde o polimorfismo no sitio ativo, altera a especificidade do substrato com mudanças na proteína ligando-a a diferentes substratos (Akiyama, Gonzalez, 2002).
O CYP1A1 é uma enzima de fase I que atua na presença de carcinógenos da dieta e do tabaco. Os hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (PAHs) gerados pela combustão de alguns carcinógenos, incluindo os existentes no tabaco são metabolizados por esta enzima (Colon et al ,1999).
Dois polimorfismos do CYP1A1 foram estudados em relação a maior suscetibilidade ao câncer (Slattery et al, 2004):
transição T C no exon 7 na região 3’ não transcrita que cria um sítio de clivagem, o local de restrição da enzima MSPI (Slattery et al ,2004).
XXXV
XXXV
Diferenças na posição de uma base como de uma Adenina (tipo A) por uma Guanina (tipoC), este ponto de mutação resulta na substituição de uma Interleucina (Ile) por uma Valina (Val)na região 462.A cistina esta em uma região que pode estar ligada ao tiolato ligando ao grupo heme que é essencial para a atividade catalítica da enzima .Esta posição polimorfica é conservada pela Ile membro da subfamília 1A1, a substituição do aminoácido Val afeta a atividade catalítica da enzima.(Hayashi,1991)
Fonte: Cytochrome P450/Google/imagens online
Estes polimorfismos estão associados a aumento da atividade enzimática, aumento da ativação de carcinógenos e segundo alguns autores, do risco de câncer (Slattery et al, 2004).
Estudos mostram correlação entre este polimorfismo, fumo e risco de câncer de pulmão. As pessoas que têm um alelo de alta “inducibilidade”, particularmente entre os fumantes, parecem correr um maior risco de desenvolver câncer de pulmão. Os dados indicam que o próprio fumo dos cigarros induz a expressão do gene CYP1A1. (Marchand et al, 1998). Por outro lado, os homozigotos para o alelo recessivo de baixa inducibilidade demonstram ser menos propensos a desenvolver câncer de pulmão possivelmente por que sua AHH é menos eficiente, no que diz respeito a converter os hidrocarbonetos em carcinógenos altamente reativos (Cascorbi et al 1996).
XXXVI
XXXVI
Casuística e Método
XXXVII
XXXVII
3.0 Casuística e Método
3.1 Casuística
Neste estudo foram analisados 114 pacientes com câncer colorretal atendidos
no ambulatório de Oncologia da Disciplina de Gastroenterologia da Universidade
Federal de São Paulo - Escola Paulista de Medicina, no período de setembro de
2002 a novembro 2003. Os pacientes do grupo caso foram selecionados de acordo
com o diagnóstico de adenocarcinoma colorretal, independente do estádio da
doença.
Os 114 pacientes incluídos como grupo controle, foram atendidos na
Disciplina de Gastroenterologia e Gastrocirurgia da Universidade Federal de São
Paulo, por outras doenças não neoplásicas – Escola Paulista de Medicina no período
de maio a novembro de 2004.
Todas os pacientes que participaram do estudo tiveram acesso e concordaram
de livre escolha com o termo de consentimento informado livre e esclarecido
aprovado pelo comitê de ética da UNIFESP (Anexo 1 e 2) e responderam a uma
entrevista (Anexos 3 e 4).
3.1.1. Descrição dos Grupos
As pacientes foram distribuídas em dois grupos:
Grupo I: Pacientes que apresentaram adenocarcinoma colorretal
XXXVIII
XXXVIII
Características do Grupo I
Os critérios de inclusão no grupo I foram:
Diagnóstico de câncer colorretal
Confirmação do diagnóstico pelo exame anatomo-patológico
Os critérios de exclusão do grupo I foram:
Não confirmação do diagnóstico de câncer colorretal pelo exame
anatomo-patológico
As características das pacientes inclusas no grupo I estão resumidas no Quadro 1.
Quadro 4. Características das pacientes do grupo I.
Idade 20-90 anos
Estádio I II III
Situação atual Com doença/óbto Sem doença
Hábitos Tabagismo Etilismo
Etnia Brancos Negros Amarelos
XXXIX
XXXIX
Caracteristicas do Grupo II-Controle
Os critérios de inclusão no grupo II foram:
Idade pareados com pacientes do grupo I (igual ou com diferença inferior a 5
anos )
Ausência de câncer colorretal por avaliação clínica .
Os critérios de exclusão do grupo II foram:
Diagnóstico de câncer
As características das pacientes do grupo II estão resumidas no Quadro 2.
Quadro 5:. Características das pacientes do grupo II (grupo controle).
Idade Pareados com o grupo II (20-90 anos)
Condição Ausência de adenocarcinoma
Hábitos Tabagismo Etilismo
Etnia Brancos Negros Amarelos
XL
XL
3.2. Método
3.2.1. Extração de DNA
Extração de DNA de sangue periférico
Grupos I e II. Foram coletados 5 ml de sangue periférico através de punção
venosa, com “vacutainer” contendo anticoagulante (EDTA). O DNA genômico foi
isolado com o sistema de extração de DNA GFX (Amersham Biosciences) da
seguinte maneira: em uma coluna de cromatografia foram adicionados 100 l de
sangue e 500 l de tampão de lise. A seguir, esse material foi centrifugado a 8.000
rpm por 1 minuto a 4 C (Eppendorf modelo 5804 R). Em seguida, foram feitas duas
lavagens e centrifugações da coluna com tampão contendo etanol. Após isso, ao
DNA foram adicionados 100 l de H2O (destilada e deionizada) autoclavada e
pré-aquecida a 70 C. O DNA purificado foi armazenado a -20 C até sua utilização.
3.2.2 Quantificação de DNA
A análise da quantidade de DNA obtida nas extrações foi feita através de
espectrofotometria com comprimento de onda de 260 nm (espectrofotômetro
XLI
XLI
3.2.3. Reações de amplificação (PCR)
Amplificação do Exon 7 do gene CYP1A1
Nas reações de amplificação do exon7 do gene do CYP1A1 foram utilizados
os seguintes oligonucleotídeos (Sivarman et al., 1994):
Oligonucleotídeo Seqüência (5’-3’)
Exon7 A/C (senso) 5’- TAGGAGTCTTGTCTCATGCCT - 3’
Exon 7 A/C(anti-senso) 5’- CAGTGAAGAGGTCTAGCCGCT- 3’
Nas reações foram usados 5 l do DNA genômico em um volume final de 30 l
de reação contendo: 0,4 pmol/ l de cada “primer” e 25 l de mix Promega (20 mM de
Tris-HCL pH 8.4, 50 mM de KCL, 5 mM de MgCl2, 200 M de dNTPs e 1,25U de Taq
DNA polimerase). As reações foram incubadas em termociclador (PTC-100 Peltier
Thermal Cicler Elmer) nas seguintes condições: desnaturação a 95 C durante 5 min,
seguida de 40 ciclos a 95 C por 30 seg, 62,2 C por 1min e 72 C por 1min,
finalizados com incubação a 72 C por 10 min Os produtos das amplificações foram
aplicados em um gel de agarose 2,0% (Invitrogen) corado com brometo de etídeo
(1 g/ml) e submetidos à eletroforese por 30 min a 100V numa cuba horizontal
contendo tampão de corrida TBE 1X. A detecção foi feita pela visualização em
transiluminador de luz ultravioleta dos produtos de PCR no gel de agarose. Os géis
foram então fotografados através do sistema de documentação científica EDAS 120
XLII
XLII
Controle positivo. Para obter um controle interno que assegurasse presença
suficiente de DNA bem como para garantir a integridade dos reagentes, foram feitas
reações de PCR para o gene de cópia única -globina. Nestas reações foram usados
os seguintes oligonucleotídeos (“primers”) (Gattas & Soares-Vieira, 2000)
Oligonucleotídeo Seqüência (5’-3’)
-globi globina
(senso)
5´- CAA CTT CAT CCA CGT TCA CC – 3
-globi globina
(anti-senso)
5´- GAA GAG CCA AGG ACA GGT AC – 3’
3.2.4. Análise do polimorfismo no gene CYP1A1
Perfil de restrição do éxon 7 do gene com a enzima Msp I
Para essas reações foram incubados 6,0 l do produto de PCR com 10U de
enzima Msp1, 1,5 l de tampão de digestão (Promega). A incubação ocorreu por 8h
a 37 C, a seguir a enzima sofreu inativação térmica a 80 C por 1 min. Os sítios de
restrição reconhecidos pela enzima MspI têm a seguinte seqüência:
5’ C/CGG 3’
3’ GGC/C 5’
Os produtos das digestões foram aplicados em gel de agarose 2,5 % “low
melting point” (Invitrogen) corado com brometo de etídeo (2 g/ml) e submetidos à
eletroforese por 70 min a 70V numa cuba horizontal contendo tampão de corrida TBE
XLIII
XLIII
visualização em transiluminador de luz ultravioleta. Os géis foram então fotografados
através do sistema de documentação científica EDAS 120 da Kodak.
Estratégia de determinação do SNP do éxon 7 do gene CYP1A1 resíduo 462
A determinação do polimorfismo no éxon 7 do gene CYP1A1 foi feita por
digestão dos produtos das PCRs com a enzima de restrição MspI.
O fragmento do éxon 7 do gene CYP1A1 amplificado, possui sítios (AA GG)
de restrição da enzima MspI, com isso a hidrólise completa do DNA gera os
seguintes fragmentos: 340pb,200pb e 140pb.
Na figura 2 está esquematizado o diagrama metodológico da determinação do
polimorfismo no éxon 7 do gene CYP1A1. O alelo polimórfico possui uma
substituição de nucleotídeo único (SNP) no sítio de restrição do gene do CYP1A1
(Figura 2).
Quando o individuo possui os dois alelos selvagens (genótipo homozigoto
dominante, A/A), ou seja, ausência dos sítios de restrição em ambos os alelos, a
digestão com MspI gera os fragmentos; 340pb.
Por outro lado, quando ocorre o SNP (A G) somente em um alelo (genótipo
heterozigoto, C/N), a digestão gera os fragmentos: 340pb, 200pb e 140pb. (Figura 2
C). Por fim, quando possui dois alelos polimórficos (genótipo homozigoto), a digestão
XLIV
XLIV
3.3 Análise estatística
No presente estudo foram analisadas as correlações entre o desenvolvimento de câncer colorretal e a presença do polimorfismo MspI no exon7 do gene CYP1A1 em associação com fatores de risco tais como tabagismo, etilismo, presença ou ausência de história familiar de câncer colorretal, sexo, etnia, idade e mais as seguintes características localização do tumor, tipo histológico, estadiamento da doença e evolução da mesma.
Para comparar pacientes e controles quanto a cada uma das características, dado o pareamento da amostra, aplicou-se o teste de homogeneidade marginal. No estudo das idades entre os dois grupos foi aplicado o teste t de Student para amostras relacionadas (Kalbfleisch, Prentice 1980).
XLV
XLV
Resultados
XLVI
XLVI
4. Resultados
4.1 PCR e Genotipagem por R.F.L.P.
Todas as amostras de DNA foram extraídas com sucesso conforme descrito em materiais e métodos, e submetidas à PCR com primers específicos para o segmento de DNA referente à região codificadora do exon 7 do gene CYP1A1, na qual incide o polimorfismo MspI. A reação resultou, na produção de amplicons com tamanho de 340pb, que foram submetidos à separação eletroforética em gel de agarose e fotodocumentados
1 2 3 4 5 6 7
1 - marcador de peso molecular, 100 pares de base. 2 - 7 amostras com produtos de 340 pares de base.
Figura 2. Apresenta a foto da separação eletroforética, demonstrando amplificação do produto de PCR com tamanho de 340 pb.
XLVII
XLVII
Genótipo A - indivíduos homozigotos do tipo selvagem, alelos (A/A) não apresentam o polimorfismo
Genótipo B - indivíduos heterozigotos, alelos (A/G) apresentam um alelo mutante Genótipo C - individuo homozigoto mutante, alelo (G/G) apresentam dois alelos
mutados
Figura 2.
1 2 3 4 5 6 7
1- macador de peso molecular 100bp
2-- Amostra de individuo heterozigoto, genótipo B – (340pb, 200bp, 140 pb) 3-Amostra de individuo homozigoto mutado, genótipo C – ( 200bp, 140 pb) 4- Amostra de individuo homozigoto selvagem , genótipo A – (340 pb) 5- Amostra de individuo homozigoto selvagem, genótipo A – (340bp) 6- Amostra de individuo homozigoto selvagem, genótipo A – (340bp) 7- Amostra de individuo heterozigoto (genótipo B) – (340pb, 200bp, 140 pb)
XLVIII
XLVIII
4.2 Comparação entre Controles e Pacientes
A seguir, apresentam-se as tabelas de 2-7 com informações sobre o comportamento de pacientes e controles quanto às variáveis estudadas (resultados expressos no Anexo 5).
Tabela 2: Distribuição de pacientes e controles quanto ao sexo.
Paciente
Controle Feminino Masculino Total
Feminino 47 6 53
Masculino 3 58 61
Total 50 64 114
Tabela 3 : Distribuição de pacientes e controles quanto à etnia.
Paciente
Controle Branco Negro Amarelo Total
Branco 83 9 7 99
Negro 13 1 1 15
XLIX
XLIX
Tabela 4: Distribuição de pacientes e controles quanto à história familiar de
câncer.
Tabela 5: Distribuição de pacientes e controles quanto ao etilismo.
Paciente
Controle Não Sim Total
Não 35 12 47
Sim 26 41 67
Total 61 53 114
Tabela 6: Distribuição de pacientes e controles quanto ao tabagismo.
Paciente
Controle Não Sim Total
Não 25 36 61
Sim 21 32 53
Total 46 68 114
Paciente
Controle Não Sim Total
Não 36 38 74
Sim 19 21 40
L
L
Tabela 7: Distribuição de pacientes e controles quanto aos alelos estudados.
A presença do alelo G (A/G e G/G) foi encontrado em 33 indivíduos do grupo caso e em 100 indivíduos do grupo controle, evidenciando aumento em três vezes da freqüência destes alelos na população de pacientes.
Para comparar pacientes e controles quanto a cada uma das características: de sexo, historia familiar, etilismo, tabagismo e alelos estudados, descritas nas tabelas acima, dada o pareamento da amostra, aplicou-se o teste de homogeneidade marginal. Tabela 8, a seguir, resume os resultados obtidos sobre o estudo de homogeneidade marginal. Verificou-se que pacientes e controles não diferem quanto a Sexo e Etnia. Com relação às demais características, observamos que a proporção de pacientes fumantes ou com história familiar de câncer foi maior que a mesma proporção entre os controles. Ao contrário, a proporção de etilistas foi maior entre os controles. Entre os controles, predominaram os alelos A/A. Entre os pacientes a maior proporção foi de A/G ou G/A. Apenas entre os pacientes foram encontrados casos G/G.
Paciente
Controle A/A G/A ou A/G G/G Total
A/ A/A
9
7 70
2
81
G/A ou G/A ou A/G
5 27 2 1 33
G/G 0 0 0 0
LI
LI
Tabela 8: Resultados da comparação entre pacientes e controles.
Quanto à idade, a observação da tabela 9 aliada à aplicação do teste t de Student para amostras relacionadas permite afirmar que não há diferenças entre os grupos considerados (p = 0,529).
Tabela 9:
Medidas descritivas da idade dos indivíduos, segundo grupo.
Variável Nível descritivo
Sexo 0,317
Etnia 0,123
História Familiar 0,012
Etilismo 0,023
Tabagismo 0,047
Alelos 0,001
Grupo Média Desvio-padrão
Paciente 58,82 13,76
LII
LII
4.3 Análise de correspondência
Para estudar a associação conjunta dos fatores estudados com a presença ou ausência da doença, utilizou-se a Análise de correspondência (Greenacre, 1984). Verificou-se que as características mais ligadas à doença são, nessa ordem: a presença do alelo G, a história familiar de doença e o tabagismo. A inércia acumulada foi de 67%. O gráfico a seguir ilustra o resultado obtido. (figura 4)
Figura 4: Gráfico da análise de correspondência.
G/? A/A Fum Não Fum Com HF Sem HF Paciente Controle -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
-1,5 -1 -0,5 0 0,5 1
Componente 1 C o m p o n en te 2 Paciente Controle Tabagista Não tabagista Com história familiar
Com história familiar
Individuo homozigotoselvagem -alelo A/A
LIII
LIII
4.4 Comportamento das amostras de pacientes e controle quanto as variáveis
e a freqüência dos alelos
Tabela10: Distribuição de variáveis quanto aos alelos
Variáveis de risco Alelos Freqüência controle
Freqüência paciente Tabagismo A/A 42 11
A/G ou G/A 11 55
G/G 0 2
Etilismo A/A 51 8 A/G ou G/A 17 43
G/G 0 2
Historia Familiar A/A 31 7 A/G ou G/A 10 50
G/G 0 2
Etnia:
Branca A/A 70 11 A/G ou G/A 29 82
G/G 0 3
Negra A/A 11 2
A/G ou G/A 4 8
G/G 0 0
Amarela A/A 0 1
A/G ou G/A 0 7
LIV
LIV
4.5 Estudo das Características Ligadas à Doença
A tabela 11, a seguir, descreve o comportamento da amostra quanto a determinadas características da doença.
Tabela 11. Distribuição da amostra quanto à localização, grau de diferenciação celular, estadiamento e evolução.
Parâmetro Porcentagem Localização Cólon Dir 25 21,9
Cólon Esq 19 16,7 Reto 70 61,4
G de diferenciação Pouco diferenciado 9 7,9
Mod. Diferenciado 77 67,5
Bem diferenciado 28 24,6
T 1 1 0,9
2 18 15,8
3 76 66,7
4 19 16,7
N 0 58 50,9
1 41 36,0
2 15 13,2
M 0 107 93,9
1 7 6,1
I 9 7,9
Estádio II 52 45,6
III 37 32,5
IV 16 14,0
LV
LV
4.6 Análise de sobrevivência
As tabelas (12 e 23) a seguir descrevem a associação de cada característica estudada e a situação atual do doente (com doença ou óbito e sem doença). Não observamos significância entre as variáveis e evolução da doença.
Tabela 12. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Sexo.
Situação atual
Sexo Sem doença
Com
doença/óbito Total
Feminino 17 33 50
Masculino 23 41 64
Total 40 74 114
Tabela 13. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Etnia
Situação atual
Etnia Sem doença
Com
doença/óbito Total
Branco 35 61 96
Negro 3 7 10
Amarelo 2 6 8
LVI
LVI
Tabela14. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e História familiar.
Situação atual
Hist. Familiar Sem doença
Com
doença/óbito Total
Não 22 33 55
Sim 18 41 59
Total 40 74 114
Tabela 15. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Etilismo.
Situação atual
Etilismo Sem doença
Com
doença/óbito Total
Não 21 40 61
Sim 19 34 53
LVII
LVII
Tabela 16. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Tabagismo.
Situação atual
Tabagismo Sem doença
Com
doença/óbito Total
Não 18 28 46
Sim 22 46 68
Total 40 74 114
Tabela 17. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Alelos.
Situação atual
Alelos Sem doença
Com
doença/óbito Total
A/A 8 6 14
G/A ou A/G 31 66 97
G/G 0 3 3
LVIII
LVIII
Tabela 18. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Grau de diferenciação.
Situação atual
Grau de diferenciação Sem doença
Com
doença/óbito Total
Pouco diferenciado 2 7 9
Mod. Diferenciado 27 50 77
Bem diferenciado 11 17 28
Total 40 74 114
Tabela19. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Localização.
Situação atual
Localização Sem doença
Com
doença/óbito Total
Reto 22 48 70
Cólon Esq 7 12 19
Cólon Dir 11 14 25
LIX
LIX
Tabela 20. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Classificação T.
Situação atual
T Sem doença
Com
doença/óbito Total
1 1 0 1
2 7 11 18
3 27 49 76
4 5 14 19
Total 40 74 114
Tabela 21. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Classificação N.
Situação atual
N Sem doença
Com
doença/óbito Total
0 21 37 58
1 15 26 41
2 4 11 15
LX
LX
Tabela 22. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Classificação M.
Situação atual
M Sem doença
Com
doença/óbito Total
0 40 67 107
1 0 7 7
Total 40 74 114
Tabela 23. Distribuição dos pacientes quanto a Situação atual e Estadiamento.
Situação atual
Estadiamento Sem doença
Com
doença/óbito Total
I 1 2 3
II 19 33 52
III 20 32 52
IV 0 7 7
LXI
LXI
Tabela 24. Resultados do estudo da associação entre cada variável e a
situação atual, isoladamente.
Variável Nível descritivo
Sexo 0,830
Etnia 0,759
História familiar 0,289
Etilismo 0,874
Tabagismo 0,457
Alelos 0,145
Grau de diferenciação 0,664
Localização 0,686
T 0,483
N 0,764
M 0,094
Estadiamento 0,495
LXII
LXII
Tabela 25. Resultados do primeiro modelo ajustado.
Estadiamento Coeficiente
Nível descritivo Risco relativo Intervalo de confiança
II -0,802 0,107 0,449 0,169 1,190
III -0,935 0,066 0,392 0,145 1,063
IV 0,314 0,554 1,369 0,484 3,870
Figura 5. Funções de sobrevivência estimadas pelo modelo de Cox, segundo o
estadiamento da doença.
Tempo de acompanhamento (meses)
120 108 96 84 72 60 48 36 24 12 0 Fu nç ão de so bre viv ên cia 1,0 ,9 ,8 ,7 ,6 ,5 ,4 ,3 ,2 ,1 0,0 Estadiamento IV III II I
LXIII
LXIII
Tabela 26. Resultados do modelo ajustado, excluindo-se a variável estadiamento.
Estadiamento Coeficiente
Nível descritivo Risco relativo Intervalo de confiança
Negro -0,683 0,158 0,505 0,195 1,305
Amarelo 0,958 0,031 2,608 1,091 6,231
Figura 6. Funções de sobrevivência estimadas pelo modelo de Cox, segundo a
etnia dos pacientes.
Tempo de acompanhamento (meses)
LXIV
LXIV
LXV
LXV
Discussão
LXVI
LXVI
5. Discussão
O câncer colorretal é uma doença multifatorial, contribuem para o seu desenvolvimento os hábitos alimentares, sociais como o tabagismo, e a predisposição genética (Jong et al, 2002).
Estudos recentes demonstraram associação entre o tabaco e a dieta com o risco de desenvolvimento de câncer colorretal gerando a formação de substratos carcinógenos que são metabolicamente ativadores da enzima CYP. O gene CYP1A1 é induzido pela enzima aril hidrocarbono hidroxilase (AHH) responsável pela ativação de hidrocarbonetos policiclicos aromáticos (PAHs), carcinógeno presente no cigarro (Terry et al, 2002; Inoue et al, 2000; Persson et al, 1997; Colon et al; 1999).
Existem dois polimorfismos associados ao gene CYP1A1, a transição de T C na região 3’ na região não transcrita, no sitio de restrição MspI e outra na transição de A G gerando a substituição de uma valina por uma isoleucina, no códon (Ile462Val, exon 7) (Slattery et al, 2004). O polimorfismo da variante Ile462Val tem maior importância devido a sua associação com o aumento da indução do gene CYP1A1 e posterior ativação de carcinógenos. Person et.al (1997) destacaram as diferenças funcionais entre os dois polimorfismos. A substituição da Ile para Val seria acompanhada de diferenças no metabolismo e bioativação de carcinógenos, com maior potencial de desenvolvimento do câncer.
LXVII
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O objetivo central deste estudo foi analisar a relação entre os fatores de risco para o desenvolvimento do câncer colorretal e o polimorfismo do gene CYP1A1. Para tanto foram aplicadas ferramentas moleculares, técnicas de reação em cadeia de polimerase (PCR) e análise do polimorfismo por enzima de restrição (RFLP) e posterior eletroforese para a analise dos resultados.
Na primeira parte do trabalho, realizamos um processo de seleção de pacientes e coleta de dados, que foi relevante para caracterizar o grupo de estudo e o grupo controle, tornando possível relacionar o perfil social dos indivíduos com as características da doença. Com esta finalidade, todos os pacientes foram entrevistados e os prontuários foram consultados para obtenção das informações relativas ao estadiamento da doença, grau de diferenciação, data do diagnóstico e situação atual na última consulta (com doença, sem doença). O grupo controle, constituído de pacientes ambulatoriais sem câncer foram selecionados e submetidos à entrevista de forma semelhante ao do grupo caso.
Entre os 114 indivíduos com câncer estudados, a prevalência foi semelhante em ambos os sexos, sendo mais comum após a 5ª. década assim como já foi descrito por outros autores (Greenlee et al, 2000), sendo que setenta e seis por cento tinham mais que 50 anos. Estudos de estimativa publicados pelo INCA descrevem que a maioria dos doentes tem entre 50 e 70 anos (INCA.gov.br, 2005). Quanto ao estádio clínico, a maioria dos doentes era estádio II ou III (91%), sendo que os demais eram estádio I, doença inicial ou IV, doença metastática. Estes percentuais também são descritos por outros estudos (Greenlee et al, 2000), o mesmo se verificando quando avaliamos o grau de diferenciação do tumor, a grande maioria dos tumores era bem ou moderadamente diferenciado (92%) (Huban,1998).