Avaliação do polimorfismo no gene da metilenotetrahidrofolato redutase e concentração de folato e vitamina B12 em pacientes portadores do HIV-1 em tratamento com anti-retrovirais

Avaliação do polimorfismo no gene da metilenotetrahidrofolato redutase

e concentração de folato e vitamina B1 2 em pacientes portadores

do HIV-1 em tratamento com anti-retrovirais

Evaluation of the polymorphisms in methylenetetrahydrofolate reductase gene

and the levels of folate and B12 in HIV-infected patients

under antiretroviral therapy

Iran Malavazi

_{, Emiliana Pereira Abrão}

_{, Angela Yumico Mikawa}

_,

Sandra Antônia Tagliavini

_{e Paulo Inácio da Costa}

RESUMO

Ne ste tra b a lh o , i n ve sti ga m o s c o n c e n tra ç ã o d a vi ta m i n a B1 2 e f o la to , c o n si d e ra n d o - se a i n f lu ê n c i a d o s ge n ó ti p o s d a m e ti le n o te tra h i d ro f o la to re d u ta se , o p e rf i l i m u n o ló gi c o e a te ra p i a a n ti re tro vi ra l u ti li za d a n a p o p u la ç ã o b ra si le i ra p o rta d o ra d o HIV. Um gru p o d e 8 6 i n d i ví d u o s p o rta d o re s d o HIV- 1 e 2 9 d o a d o re s d e sa n gu e f o ra m re c ru ta d o s p a ra c o m p o r a c a su í sti c a . En tre o s i n f e c ta d o s p e lo HIV- 1 , o b se rvo u - se m e n o r c o n c e n tra ç ã o d e B1 2 n o gru p o c o m m a i o r n ú m e ro d e li n f ó c i to s TCD4 + . Nã o e n c o n tra m o s d i f e re n ç a n a d i stri b u i ç ã o ge n o tí p i c a p a ra a s m u ta ç õ e s MTHFR C6 7 7 T e A1 2 9 8 C e n tre i n f e c ta d o s e n ã o i n f e c ta d o s p e lo HIV- 1 . In d i ví d u o s p o rta d o re s d o HIV, ge n ó ti p o C6 7 7 C, a p re se n ta ra m c o n c e n tra ç õ e s m e n o re s d e B1 2 e m re la ç ã o a o gru p o c o n tro le d e m e sm o ge n ó ti p o . A te ra p i a a n ti re tro vi ra l n ã o m o stro u q u a lq u e r i n f lu ê n c i a n o s va lo re s de f o la to e vi ta m i n a B12. Estu do s a di c i o n a i s sã o n e c e ssá ri o s pa ra re a va li a r a pre va lê n c i a d e m e n o re s c o n c e n tra ç õ e s d e B1 2 e f o la to e d e h i p e rh o m o c i ste i n e m i a n a p o p u la ç ã o p o rta d o ra d o HIV so b a ó ti c a d o u so d e HAART e d a m e lh o ri a n a so b re vi d a d o s p a c i e n te s.

Pal avr as-chave s: HIV. Vi ta m i n a B1 2 . Fo la to . Po li m o rf i sm o s MTHFR. Do e n ç a a rte ri a l c o ro n a ri a n a .

ABSTRACT

In th i s stu d y we so u gh t to i n ve sti ga te th e B1 2 a n d f o la te le ve ls re ga rd i n g th e i n f lu e n c e o f m e th yle n e te tra h yd ro f o la te re d u c ta se ge n o typ e s, i m m u n o lo gi c a l p ro f i le a n d a n ti re tro vi ra l th e ra p y i n th e Bra zi li a n HIV- i n f e c te d p o p u la ti o n . Th e stu d y gro u p c o m p ri se d 8 9 HIV- i n f e c te d i n d i vi d u a ls a n d 2 9 b lo o d d o n o rs. Th e re wa s a d e c re a se i n th e B1 2 le ve ls i n th e HI V- i n f e c t e d gr o u p w i t h h i gh e r TCD4 + lym p h o c yt e c o u n t s . No d i f f e r e n c e s i n t h e ge n o t yp e d i s t r i b u t i o n f o r m e th yle n e te tra h yd ro f o la te re d u c ta se p o lym o rp h i sm s b e twe e n th e HIV- i n f e c te d i n d i vi d u a ls a n d th e c o n tro ls we re f o u n d . HIV- i n f e c te d i n d i vi d u a ls c a rryi n g th e C6 7 7 C ge n o typ e p re se n te d lo we r B1 2 le ve ls ( 3 1 3 .9 1 ± 1 5 4 .0 5 ) th a n th o se wi th th e sa m e ge n o typ e i n th e c o n tro l gro u p ( 4 0 8 .2 7 ± 2 0 7 .6 9 ) . Also , th e a n ti re tro vi ra l th e ra p y wa s n o t a so u rc e o f va ri a ti o n o f th e f o la te a n d B1 2 se ru m le ve ls. Fu rth e r stu d i e s a re n e e d e d to re a n a lyze th e p re va le n c e o f lo w le ve ls o f f o la te a n d B1 2 a n d hype rho m o c i ste i n e m i a a m o n g HIV- i n f e c te d pa ti e n ts wi th re ga rd to the u se o f HAART a n d the i n c re a se d li f e e xpe c ta n c y o f su c h p a ti e n ts.

Ke y-words: HIV. B1 2 . Fo la te . MTHFR p o lym o rp h i sm s. Co ro n a ry a rte ry d i se a se .

1 . Instituto de Químic a de Araraquara da Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP. 2 . Departamento de Análises Clínic as da Fac uldade de Ciênc ias Farmac êutic as de Araraquara da Universidade Estadual Paulista, Araraquara, SP.

Apo io Financ eiro : Núc leo de Atendimento a Co munidade ( NAC-FCF) e FCFAr/UNESP.

En d e r e ço p a r a Co r r e sp o n d ê n ci a : Pr o f. Pa ulo I ná c io da Co sta . De pto _{de Análise s Clínic as/FCFAr /UNESP. Rua Expe dic io nár io s do B r asil 1 6 2 1 , Ce ntr o ,}

A conduta clínico-terapêutica do portador do HIV tem se modificado amplamente desde a introdução dos inibidores de protease ( IP) como agentes chave da terapia antiretroviral de alta

atividade ( HAART- Highly Active Antiretro vira l Thera py) . A HAART

tem contribuído para a sobrevida dos indivíduos infectados pelo HIV, com melhora da função imunológica e controle da replicação

viral1 1_{. Entretanto, a HAART, aliada ao estado infeccioso pe r se e a}

resposta do hospedeiro perante a infec ç ão, tem levado ao aparec imento de alteraç ões metabólic as nesses indivíduos c ulminando c om novas preoc upaç ões de c aráter relativo ao monitoramento ambulatorial desses pacientes dada sua possível asso c iaç ão c o m o de se nvo lvime nto de do e nç as ar te r iais

coronarianas ( DAC)11 27_{. Nesse sentido, são bem estabelecidas}

alte r aç õ e s no me tab o lismo lipídic o do po r tado r do HIV, decorrentes tanto da ação dislipidêmica da terapia combinada

envolvendo os IP, como do próprio estado infeccioso 9 11 15 27_.

Adicionalmente, a infecção pelo HIV é acompanhada no estágio crônico por um estado de má nutrição que pode conduzir o portador à perda de peso progressiva, o que teve principalmente antes da introduç ão da HAART, c onsiderável influênc ia na

morbimortalidade da AIDS5_{. O estado de má nutrição no portador}

é causado por um conjunto de situações, como a redução da ingestão e má absorção de nutrientes, deficiência calórico-protéica e distúrbios metabólicos. Causas para a redução da ingestão de nutrientes seriam a anorexia induzida por citocinas do curso da

AIDS e/ou os medicamentos antiretrovirais5_{. Esse somatório de}

fatores conduz a estados de carências nutricionais, com destaque para as vitaminas do complexo B. A deficiência de vitamina B12 ocorre comumente nos portadores do HIV em qualquer estágio

da doença1 3 _{e está presente em 10 a 39% dos infectados}2 0_{. Valores}

diminuídos de vitamina B6 ocorrem com prevalência de 1 2 a

52%1 3_{, o mesmo acontecendo com o folato em 57 a 64% dos}

po r tado r e s q ue não faze m suple me ntaç ão alime ntar2 3_{. A}

diminuição dos valores séricos de vitaminas B12, B6 e folato pode conduzir ao aparecimento de hiperhomocistinemia uma vez que essas vitaminas participam dos ciclos metabólicos de remetilação

e transulfuração da metionina7 18 19 22_.

A hiperhomoc isteinemia é um c onhec ido fator de risc o in de pe n de n te pa r a DAC e a te r o s c le r o s e n a po pula ç ã o humana, embora a maneira c omo a homoc isteína ( HCys) produza seu efeito noc ivo sobre o endotélio vasc ular não e s te j a b e m e s c la r e c ida2 2 2 4_{. Es tr ita m e n te e m r e la ç ã o à}

populaç ão portadora do HIV, há falta de dados que levem em c onta o efeito da HAART no metabolismo da HCys. A exemplo do que oc orre em inúmeros c ic los metabólic os em humanos, a r e m e tilaç ão e tr ansulfur aç ão da m e tio nina são c ic lo s fo r te m e nte influe nc iado s po r po lim o r fism o s e m dive r sas d e s u a s e n zi m a s e fe to r a s . D e n tr e e s ta s e n zi m a s , a m e tile no te tr ahidr o fo lato r e dutase ( MTHFR) te m gr ande i m p o r tâ n c i a n a r e gu l a ç ã o d a c o n c e n tr a ç ã o d e HCys plasmátic a. Duas princ ipais mutaç ões missense na MTHFR, a mutaç ão C6 7 7 T e a MTHFR A1 2 9 8 C são c apazes de alterar

o montante de HCys plasmátic a ( para revisões ver4 1 0 1 2_{) . A}

primeira mutaç ão c ausa uma substituiç ão de uma alanina por uma valina na c adeia polipeptídic a e c onfere a enzima

te r m o la b ilida de a 4 6o_{C e dim in uiç ã o da s ua a tivida de}

específica em cerca de 35%12_{. Essa diminuição da atividade da enzima}

é responsável pelo aumento de aproximadamente 3,5mmol de HCys

em relação ao fenótipo não mutado4_{. A segunda mutação, MTHFR}

A1298C ( Glu

→

reduz também a atividade específica da enzima embora em menor extensão que a primeira. Consequentemente, o efeito sobre a HCys é atenuado e será importante em indivíduos que carreguem as duas mutações concomitantemente ou com dieta insatisfatória em folato,

B6 ou B122628_{, o que pode ser o caso dos portadores do HIV.}

De posse do conhecimento de que valores aumentados de HCys plasmática constituem-se em um reconhecido fator de risco para DAC, esse trabalho visou: ( i) estabelecer a concentração de folato e vitamina B1 2 na população brasileira portadora do HIV a fim de avaliar se existem carências dessas vitaminas e se sua magnitude poderia refletir em valores aumentados de HCys plasmática nesses indivíduos; ( ii) investigar a relação dos valores séricos de folato e vitamina B1 2 em indivíduos portadores do HIV-1 levando em consideração a influência dos genótipos da MTHFR; ( iii) verificar a relação da concentração destas vitaminas de acordo com o número de linfócitos TCD4 + e a terapia anti-retoviral em uso corrente.

MATERIAL E MÉTODOS

Um grupo de 86 indivíduos portadores do HIV-1 determinados

por ELISA e confirmado por western blo t atendidos pelo Serviço

Especial de Saúde de Araraquara ( SESA) da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo e 29 indivíduos doadores de sangue ( populaç ão c ontrole) atendidos no Hemonúc leo da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara ( UNESP) foram recrutados para compor a casuística do trabalho. O grupo portador do HIV-1 foi constituído por 46 homens e 40 mulheres com média de idade de 34,2 ± 6,7 anos variando de 19 a 45 anos. O critério de exclusão do grupo de estudo foi: idade menor que 19 e maior que 45 anos; pacientes portadores de dislipidemia identificada no período

de 12 meses anteriores ao recrutamento ( colesterol

≥

l e/ou triacilgliceróis

≥

(Pne um o cystis ca rinii, To xo pla sm a go ndii, Myco b a cte rium

tuberculo sis, Ca ndida ssp; co-infecção com vírus da hepatite C e

hepatite B. O recrutamento baseou-se no tipo de terapia utilizada nos três meses que antecederam o recrutamento do grupo de estudo, sendo estabelecido o seguinte critério: ( i) pacientes sem tratamento; ( ii) pacientes recebendo inibidores de transcriptase reversa, análogos nucleosídicos e/ou não análogos nucleosídicos; ( iii) pacientes recebendo terapia HAART com pelo menos um IP. O grupo controle foi composto de 20 homens e 9 mulheres. A média de idade para esse grupo foi 30,2 ± 7,6 anos variando também de 19 a 45 anos. Os indivíduos foram selecionados aleatoriamente de forma a contemplar a variação étnica da população brasileira.

foram obtidos de todos os participantes do estudo. O protocolo de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Araraquara, Unesp.

As amostras de sangue foram obtidas por punção venosa no período entre 7:00 e 9:00 da manhã após 12 horas de jejum. Sangue total colhido em tubos contendo EDTA foi utilizado para a contagem de linfócitos TCD4+ e TCD8+ . A contagem de linfócitos foi realizada por citometria de fluxo ( Beckton-Dickinson Immunocytometry Systems, San Jo se, Califo r nia, USA) c o m dupla c o lo raç ão imunofluorescente ( isotiocianato de fluoresceína e ficoeritrina) . De acordo com a contagem de linfócitos TCD4+ os pacientes foram

divididos em três grupos: ( a) TCD4+ < 200 células/mm3_{; ( b) TCD4+}

201-400 células/mm3 _{( c) TCD4+ > 400 células/mm}3_{. Amostras de}

soro foram utilizados para a determinação quantitativa de folato e B12 por eletroquimioluminescência em aparelho de automação Elecsys 2010 - Roche com reagentes Roche ( Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany) . Na população portadora do HIV, 16 amostras apresentaram-se fortemente hemolisadas e, portanto foram retiradas da análise devido à alta concentração de folato eritrocitária.

Genotipagem da MTHFR. O DNA genômico foi extraído a

partir de leucócitos periféricos utilizando técnica de sa lting

o u t1 6_{. A mutaç ão MTHFR C6 7 7 T fo i de te c tada atr avé s de}

amplificação por PCR da seqüência correspondente a região polimórfic a do éxon 4 do gene da MTHFR flanqueada pelo o ligo nuc leo tídeo s desc rito s po r Fro sst e c o labo rado res e

subseqüente digestão com Hinf I8_{. A mutação MTHFR A1 2 9 8 C}

foi determinada pela amplificação da região polimórfica no éxon 7 do gene com os oligonucleotídeos descritos por van der Put e

colaboradores e digestão do produto de PCR com Mb o II2 6_{. Os}

fragmentos esperados de cada mutação foram visualizados em gel de poliac rilamida não desnaturante 8 % para a mutaç ão MTHFR C6 7 7 T e 1 5 % para a mutação MTHFR A1 2 9 8 C, ambos corados pela prata. Para excluir qualquer possibilidade de má interpretação do padrão de bandas, 3 0 % das amostras escolhidas aleatoriamente tiveram seu genótipo determinado duas vezes.

Análise Estatística. Diferenças na concentração das variáveis c o ntínuas de te r minadas no tr ab alho fo r am apr e se ntadas descritivamente nas tabelas pertinentes contendo média, desvio padrão e intervalo de confiança de 95%. As diferenças estatísticas foram determinadas entre os vários grupos de indivíduos usando o

Teste t de Student não pareado presumindo variâncias populacionais

diferentes. As freqüências genotípicas e alélicas foram estimadas utilizando o método da contagem dos genes. O teste de qui-quadrado

(

χ

entre os grupos portadores e não portadores do HIV-1 e para verificar a concordância com a Hipótese do Equilíbrio de Hard-Weinberg ( EHW) . Correlações entre as variáveis contínuas foram avaliadas pelo coeficiente de correlação de Pearson. O nível de significância

adotado foi

α

RESULTADOS

Em nenhum dos grupos houve diferença significativa em relação ao sexo ou idade. As Figuras 1 A e 1 B mostram o padrão de bandas esperado após clivagem dos produtos de PCR c om

Hinf I e Mb o II para genotipagem da MTHFR, mutações C6 7 7 T e

A1 2 9 8 C respectivamente. A distribuição da freqüência genotípica e alélica da mutação MTHFR C6 7 7 T mostrou concordância com a hipótese do EHW com relação a ambos os grupos. A população não infectada pelo HIV-1 mostrou maior freqüência do genótipo CC ( 7 9 .3 %) e com isso maior freqüência do alelo C ( 0 ,9 0 ) em relação ao grupo portador do HIV-1 ( 5 4 ,7 % do genótipo CC e 0 ,7 4 do alelo C) . Essa diferença não foi significativa conforme

mostra o teste

χ

que as amostras foram representativas da população e estão mostrados na Tabela 1 . A respeito da mutação MTHFR A1 2 9 8 C, nos dois grupos estudados, cerca de 6 5 % dos indivíduos eram portadores do genótipo AA, aproximadamente 2 5 % portadores do genótipo heterozigoto para a mutaç ão AC e c erc a de 7 % da populaç ão apresentou o genótipo CC ( homozigoto mutado) .

PM TT TT CT CC

2 0 0

1 9 8 1 7 5

PM AA AC CC 1 2 5

8 4

5 6

3 1 /3 0 2 8 2 5

Fi gu ra 1 - A) Ge l d e p o li a c ri la m i d a 8 % m o stra n d o o s trê s d i f e re n te s ge n ó ti p o s d a MTHFR m u ta ç ã o C6 7 7 T. TT h o m o zi go to m u ta d o ; CT h e te ro zi go to m u ta d o ; CC h o m o zi go to n ã o m u ta d o . A b a n d a d e 1 7 5 p b o c o rre q u a n d o h á p e lo m e n o s u m a le lo m u ta d o e m d e c o rrê n c i a d a i n se rç ã o d e u m si tí o a ti vo p a ra Hinf I d e n tro d o é x o n 4 d o ge n e .

B) Ge l d e p o li a c ri la m i d a 1 5 % m o stra n d o o s ge n ó ti p o s d a MTHFR m u ta ç ã o A1 2 9 8 C. A m u ta ç ã o a b o le u m d o s si ti o d e re stri ç ã o d a

Os dados das freqüências genotípicas e alélicas estão mostrados na Tabela 2 . As duas populações mostraram concordância com a hipótese do EHW.

A Tabela 3 mostra a avaliação da concentração de folato e vitamina B1 2 nas populações portadora e não portadora do HIV-1 evidenc iando que não ho uve alteraç ão signific ativa no s portadores do HIV em relação aos controles. A concentração de folato tendeu a permanecer inalterada entre os diferentes grupos de contagem de linfócitos TCD4 + . Verificou-se uma tendência ao aumento de vitamina B1 2 em direção ao grupo com menor contagem de linfócitos TCD4 + . Os valores de vitamina B1 2 foram significativamente maiores nos grupos CD4 + < 2 0 0 e CD4 + 2 0 1

-4 0 0 células/mm3 _{em comparação ao grupo CD4 + > 4 0 0 células/}

mm3 _{( p= 0 ,0 5 , para ambos os casos) . Entretanto, a correlação}

entre os valores de folato e vitamina B1 2 com o número de linfócitos TCD4 + e TCD8 + não mostrou nenhum coeficiente de correlação ( r) significante entre eles ( dados não mostrados) .

A influência das duas mutações da MTHFR nos valores séricos de folato e B1 2 foi observada dividindo-se os grupos de acordo com seus genótipos encontrados na casuística. Por ser mais freqüente, os genótipo C6 7 7 C e A1 2 9 8 A foram dispostos em grupos isolados. Os genótipos C6 7 7 T e T6 7 7 T, assim c omo A1 2 9 8 C e C1 2 9 8 C foram unidos. A Tabela 4 mostra os valores médios obtidos, desvio padrão e o intervalo de confiança 9 5 % para cada um dos grupos. Apenas vitamina B1 2 no genótipo C6 7 7 C do grupo controle mostrou diferença signific ante em

Ta b e la 1 - Distrib uiçã o da fre q üê ncia ge no típica e a lé lica da MTHFR, m uta ç ã o C677T na po pula ç ã o po rta do ra e nã o po rta do ra do HIV- 1 ( co ntro le) .

População Genótipo ( %)a _{Freqüência dos Alelos}

C677T CC CT TT C T

Portadora ( n = 86) * 54,7 38,4 7,0 0,74 0,26 Controle ( n = 29) * * 79,3 27,6 0,0 0,90 0,10 Total ( n = 115) 60,9 33,9 5,2 0,78 0,22

χ2 _{no EHW = 0,012 ( 1 gl p > 0,05) * *} χ2 _{no EHW = 0,42 ( 1 gl p > 0,05)} a _{portadores x controles} χ2 _{= 4,20 ( 2 gl p > 0,05)}

Ta be la 2 - Distribuiçã o da fre qüê ncia ge no típica e a lé lica da MTHFR, m uta çã o A1298C na po pula çã o po rta do ra do HIV-1 e co ntro le

População Genótipo ( %) a _{Freqüência dos Alelos}

A1298C AA AC CC A C

Portadora ( n = 86) * 68,3 24,4 7,0 0,81 0,19 Controle ( n = 29) * * 65,5 27,6 6,9 0,79 0,21 Total ( n = 115) 67,8 26,1 6,1 0,81 0,19 * χ2 _{no EHW = 2,05 ( 1 gl p > 0,05) * *} χ2 _{no EHW = 0,73 ( 1 gl p > 0,05)} a _{Portadores X Controles} χ2 _{= 0,66 ( 2 gl p > 0,05)}

Ta bela 3 - Co ncentra çã o sérica de vita m ina B12 e fo la to na po pula çã o co ntro le e po rta do ra do HIV-1

Contagem de linfócitos TCD4+ ( celulas/mm3₎

Grupo 1 Grupo 2 Grupo 3 Grupo 4 Grupo 5 Controle HIV > 400 > 201-400 < 200 ( n = 29) ( n = 70) ( n = 30) ( n = 18) ( n = 22) B12 ( pg/ml) 391,8± 153,6 329,7± 159,2 2 8 3 ,6 ± 1 0 5 ,4§ 351,7± 126,1 375,4± 222,3

( 333,4-450,3) ( 2 9 2 ,0 -3 6 7 ,2 ) ( 244,2-323,0) ( 288,9-414,4) ( 276,9-473,9) Folato ( ng/ml) 5,5± 2,8 2,1± 2,1 5,4± 2,6 5,1± 1,6 4,9± 1,6

( 4,5-6,6) ( 4,6-5,6) ( 4,4-6,4) ( 4,2-5,9) ( 4,2-5,6) § Significativamente diferente do grupo 4 e 5 ( p< 0,05)

Valores entre parênteses indicam IC 95%

Ta b e la 4 - Co nce ntra çã o de vita m ina B12 e fo la to de a co rdo co m o s genó tipo s da MTHFR na s po pula çõ es co ntro le e po rta do ra do HIV-1.

Portadores HIV ( n= 70) Controles ( n= 29) B12 ( pg/ml) Folato ( ng/ml) B12 ( pg/ml) Folato ( ng/ml)

n= 39 n= 23

C677C 313,9± 154,1§ 5,3± 2,4 408,3± 207,7 5,8± 2,3 ( 264,0-363,8) ( 4,5-6,1) ( 318,5-498,1) ( 4,5-7,1)

n= 31 n= 6

C677T* 350,1± 165,8 4,9± 1,7 328,9± 94,8 4,6± 2,1 ( 289,3-411,0) ( 4,3-5,6) ( 229,4-428,3) ( 2,4-6,7)

n= 47 n= 19

A1298A 337,9± 170,8 5,4± 2,3 394,13± 180,0 5,8± 3,0 ( 287,7-388,0) ( 4,7-6,1) ( 307,8-480,4) ( 4,3-7,2)

n= 23 n= 10

A1298C* * 313,8± 134,4 4,6± 1,3 379,13± 98,1 4,9± 2,6 ( 255,6-371,9) ( 4,0-5,2) ( 303,7-454,5) ( 2,8-6,9) * Indivíduos com genótipos C677T + T677T

* * Indivíduos com genótipos A1298C + C1298C

relação ao mesmo genótipo na população portadora ( p= 0 ,0 2 6 ) . Qua n do a s dua s m uta ç õ e s C6 7 7 T e A1 2 9 8 C o c o r r e m c o nc o mitante me nte pr e sume -se q ue há diminuiç ão mais acentuada da atividade da MTHFR, aumento conseqüente de HCys plasmática e possível diminuição de folato sérico. Em virtude dessa premissa, combinações genotípicas das duas mutações da MTHFR fo ram analisadas a fim de verific ar se haviam alteraç ões nas c onc entraç ões de vitaminas. As c ombinaç ões genotípicas possíveis foram executadas de forma a proporcionar um número de representantes pelo menos igual a cinco para aplicação do teste estatístico. Foram encontrados seis dos nove haplótipos possíveis. Do total de indivíduos infectados pelo HIV, cerca de 1 2 % eram heterozigotos para ambas as mutações ( CT/ AC) . Não foram encontrados duplos homozigotos mutados ( TT/ CC) . A análise das concentrações de folato e B1 2 de acordo c om os haplótipos foi realizada tanto inter grupo ( HIV vs. controle) e intragrupos dos infectados e dos doadores. Houve apenas uma tendência de diminuição de vitamina B1 2 no grupo com haplótipo CC/AA dos portadores do HIV-1 ( 3 2 0 ,0 6 ± 1 7 2 ,6 ) em relação ao mesmo haplótipo no grupo controle ( 4 2 3 ,6 6 ± 1 8 8 ,6 5 ) . Finalmente, a Tabela 5 mo stra que não o c o rreu nenhuma alteraç ão signific ante em nenhum dos grupos de acordo com a terapia antiretroviral em uso.

da metionina. Isso se torna virtualmente importante, pois o

indivíduo portador do HIV requer um aporte maior de folato2 3_.

A análise populacional da distribuição alélica para ambos os polimorfismos da MTHFR mostra similaridade com outros dados

dessa natureza obtida da população brasileira1 6_{. As diferenças}

observadas na freqüência do alelo C encontradas na mutação C6 7 7 T do grupo controle podem ser atribuídas ao acaso e à ale ato r ie dade das amo str as, uma ve z q ue a distr ib uiç ão genotípica das mutações MTHFR C6 7 7 T e A1 2 9 8 C apresentam

grande variação étnica1 1 4 1 9_.

A análise dos dados totalizados ( Tabela 2 ) , mostrou que a determinação de folato encontra-se próxima do limite inferior do valor de referência adotado no trabalho ( 4,20 - 19,90 ng/ml) . Os valores de vitamina B1 2 , por sua vez apresentaram-se um pouco mais distantes do valor limítrofe inferior ( 2 4 0 - 9 0 0 pg/ ml) , também dentro do intervalo de normalidade. Com isso, as c o nc e ntr a ç õ e s de fo la to e B 1 2 nã o tive r a m dife r e nç a s significativas entre portadores e controles o que indica que ambas as populaç ões aparentemente apresentam o mesmo perfil nutricional, característica anteriormente demonstrada para uma

po pulaç ão se m e lhante2_{. Esse r e sultado dife r e daq ue le s}

observados previamente, nos quais valores diminuídos de vitamina B1 2 ocorreriam em qualquer estágio da infecção pelo HIV sendo esta causada principalmente por anormalidades das

pr o teínas ligantes de B 1 2 c o mo a tr ansc o balamina1 3 1 7 2 0_.

Entr e tanto , um impo r tante po nto ne sse se ntido de ve se r considerado, a maioria dos trabalhos que indicaram valores diminuídos tanto de vitamina B1 2 quanto de folato no portador do HIV, decorriam unicamente da própria infecção e/ou do seu perfil nutricional alterado pelo curso da infecção, não fazendo, portanto nenhuma alusão a um possível efeito da terapia HAART nesse panorama. A maioria desses trabalhos foi publicada em momentos nos quais os modelos terapêutic os eram menos eficazes, ( terapia dupla com inibidores de transcriptase reversa apenas) ou no início da introdução dos consensos terapêuticos com inibidores de protease ( HAART) . Em razão disso, em estudos mais antigos ocorria uma maior prevalência de alterações nas

concentrações dessas vitaminas2 1_{. Decorrente disso, e como as}

alterações nutricionais do portador podem ser explicadas em

parte pela progressão da doença2 0_{, pode-se inferir a razão destas}

alteraç ões não estarem presentes em indivíduos portadores tratados ambulatorialmente c omo ac ontec eu nesse estudo. Quando o grupo portador foi dividido de acordo com a contagem de linfócitos TCD4 + , foi verificada diminuição de vitamina B1 2

no grupo com CD4 + > 4 0 0 células/mm3 _{em relação ao grupo}

com contagens de linfócitos TCD4 + intermediária e mais baixa. Entretanto, concentrações diminuídas de vitamina B1 2 sempre estiveram c orrelac ionadas c om a progressão da doenç a e, portanto os menores valores deveriam ter sido encontrados no

grupo com contagem de TCD4 + mais baixa2 0 2 3 2 5_{. O resultado}

oposto enc ontrado em nosso trabalho poderia ter oc orrido devido ao tamanho amostral e por variáveis confusionais não

analisadas nessa c oorte. Adic ionalmente, ec onc ordando c om

dados obtidos na “era HAART” não houve qualquer alteraç ão nas c onc entraç ões de folato e B 1 2 quando os pac ientes foram divididos de ac ordo c om a terapia em uso, o que sugere que

Ta bela 5 - Co ncentra çã o de vita m ina B12 e fo la to na po pula çã o po rta do ra do HIV-1de a co rdo co m a tera pia a ntiretro vira l.

Sem Terapia Terapia com ITR HAART ( n = 22) ( n = 27) ( n = 21) Folato ( ng/ml) 4,7± 2,1 5,6± 2,5 4,8± 1,4 ( 3,9-5,8) ( 4,6-6,6) ( 4,2-5,5) B12 ( pg/ml) 309,4± 130,2 346,4± 153,7 334,3± 195,4

( 251,6-367,1) ( 282,5-404,2) ( 245,4-423,3) ITR: terapia contendo exclusivamente inibidores de transcripatase reversa ( análogos e/ ou não análogos nucleosídicos

HAART: terapia antiretroviral de alta atividade; inclui os inibidores de protease.

DISCUSSÃO

O pr e s e n te tr a b a lh o c e n tr o u- s e n a ve r ific a ç ã o da s concentrações de folato e vitamina B1 2 , em relação ao perfil imunológico, a terapia antiretroviral, e os genótipos da MTHFR na população brasileira infectada pelo HIV-1 , o que poderia constituir-se nesses indivíduos como um pré-requisito para o estabelecimento de um processo aterosclerótico derivado de um preditivo aumento plasmático de HCys. Ambas as doenças, AIDS e DAC guardam consigo um componente comum de cronicidade sendo que nesse sentido, o estado infec c ioso c ontínuo do portador do HIV e a terapia antiretroviral poderiam ser fatores para alterações no metabolismo da metionina/homocisteína, já que o estímulo bio químic o para desenc adear o pro c esso aterosc lerótic o estará presente durante todo o longo c urso insidioso da AIDS.

as classes terapêuticas não causam influência nas concentrações dessas vitaminas e, portanto, indiretamente, nos valores de HCys total plasmática. Embora ainda existam poucos trabalhos que estabeleç am análises nutric ionais e de mic ronutrientes nos

po r tado r e s do HI V- 1 e m r e laç ão a HAART2 1_{, ho uve um}

decréscimo na prevalência de diminuição de vitamina B1 2 com

esse esquema terapêutico2 1_{. Contrariamente às alterações do}

metabolismo lipídico no portador do HIV, as anormalidades quantitativas de micronutrientes podem não ser efetivamente persistentes no curso da epidemia e das modificações nesta tr a j e tó r ia pe lo tr a ta m e nto a ntir e tr o vir a l q ue pa ssa po r modificação a cada introdução de nova classe terapêutica.

A im po r tâ nc ia de se ve r ific a r se há o u nã o hiperhomocisteinemia durante a HAART advém do seu efeito multiplicativo com a hiperlipidemia induzida pelos IP a qual é altame nte pr e vale nte e tamb é m o b se r vada na po pulaç ão

b r asile ir a1 1 1 5 2 7_{. Em trabalho s no s quais se determino u a}

c o nc entr aç ão de HCys to tal plasmátic a, esta par ec e estar ligeiramente aumentada na infeção pelo HIV, porém ainda aquém do limite superior de normalidade. Mesmo nos pacientes com concentrações menores de B12, a HCys ainda estava dentro da faixa

de referênc ia, porém c om tendênc ia ao aumento1 7 2 0_{. Essas}

observações podem ser comprovadas com o observado em estudos mais detalhados que levaram em conta a influencia dos IP. Verificou-se que menos de 30% dos indivíduos com baixa concentração de vitamina B12 apresentaram hiperhomocisteinemia real, indicando que somente a concentração de B12 é insuficiente para determinar possível presença de hiperhomocisteinemia. Em nossa casuística, a análise dos dados totalizados mostra que concentração de vitamina B12 variou de 135,60 a 934,40pg/ml nos portadores do HIV, sendo que 3 4 % desses indivíduos mostraram queda de vitamina B1 2 abaixo do intervalo de referencia com média de 1 8 9 ,1 0 pg/ml, mediana de 1 8 9 pg/ml, enquanto que no grupo controle, apenas 7% dos indivíduos apresentaram valores abaixo do valor de referência. O estabelecimento das concentrações de vitamina B1 2 e folato no portador da infecção pelo HIV pode auxiliar na verificação de que a HCys requer importância especial nos portadores do HIV em relação à população não portadora e se será nec essário instaurar medidas preventivas c ontra um potencial aumento de HCys plasmática. Uma vez que a agressão vascular ocasionada pela HCys é devido mais a um efeito gradual do aumento da sua concentração, ao invés de unicamente um mero valor limite referenc ial, qualquer c ontribuiç ão para o aumento plasmático deste metabólito pode ser significante. Os dados obtidos nesse trabalho parec em mostrar que não há qualquer discrepância em termos de valores médios de folato e B1 2 entre a população portadora e da população controle. É possível inferir que os valores de HCys plasmátic a total não a pr e se nta r ia m a lte r a ç ã o signific a tiva e m dir e ç ã o a hiperhomocisteinemia em termos de valores médios. Todavia para aqueles cerca de 3 4 % de portadores com diminuição de B1 2 poderia não ser adequado inferir a mesma proposição. Bernasconi e colaboradores encontraram aumento de HCys no grupo tratado

com IP em indivíduos do sexo masculino3_{. Entretanto o estudo}

de Bernasconi e colaboradores 3 _{não trazia informações sobre as}

concentrações de vitamina B12 e folato em seu grupo de estudo o que

impossibilita concluir se esse aumento observado foi devido a diminuição desses elementos. Estudos adicionais na população brasileira são necessários para reavaliar a prevalência da diminuição de vitamina B12 e folato na população portadora do HIV sob a ótica do uso de HAART e da melhoria na sobrevida dos pacientes. Estudos dessa natureza deverão primar na diferenciação entre uma real deficiência dessas vitaminas que contribuiriam para o aumento plasmático de HCys de uma mera diminuição sérica comum uma vez

que os resultados permitem a priori concluir que nem os IP nem a

variação genotípica da MTHFR mostraram diferenças relevantes nas concentrações de vitamina B12 e folato.

AGRADECIMENTOS

Ao Serviç o Espec ial de Saúde de Araraquara ( SESA) pelo auxílio na obtenç ão das amostras biológic as dos pac ientes. Ao s func io nár io s do lab o r ató r io de Imuno lo gia Clínic a e Biologia Molec ular da FCF/UNESP, Maria Eugênia Coelho Silva, Keila Alves Pinto e Ana Paula Munhoz. A CAPES pela bolsa de Mestrado c onc edida ( Malavazi, I) .

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