ESTUDO DE PARAMYXOVIRUS, Mycoplasma
E DE BACILOS GRAM-NEGATIVOS
NO TRATO RESPIRATÓRIO DE SERPENTES
Crotalus durissus terrificus
Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para a obtenção do Título de Doutor em Medicina Veterinária, Área de Clínica Veterinária.
ESTUDO DE PARAMYXOVIRUS, Mycoplasma
E DE BACILOS GRAM-NEGATIVOS
NO TRATO RESPIRATÓRIO DE SERPENTES
Crotalus durissus terrificus
Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Campus de Botucatu, para a obtenção do Título de Doutor em Medicina Veterinária, Área de Clínica Veterinária.
Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto de Magalhães Lopes
Co-orientador: Prof. Dr. João Pessoa Araújo Jr.
FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: Enilze de Souza Nogueira Volpato
Nogueira, Márcia Furlan.
Estudo de Paramyxovirus, Mycoplasma e de bacilos Gram-negativos no trato respiratório de serpentes Crotalus durissus terrificus / Márcia Furlan Nogueira. – 2004.
Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Botucatu, Universidade Estadual Paulista, 2004.
Orientador: Carlos Alberto de Magalhães Lopes Co-Orientador: João Pessoa Araújo Junior Assunto CAPES: 50501062
1. Microbiologia veterinária.
CDD 636.089601
MUITO OBRIGADA,
Dr. Carlos Alberto de Magalhães Lopes, por abrir todas as portas que
precisei e desejei; Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São
Paulo (FAPESP), pela bolsa e auxílio concedidos que viabilizaram
financeiramente este projeto; Professor João Pessoa Araújo Jr. e
Professora Terue Sadatsune, pela orientação e apoio diários; Professor
Reinaldo José da Silva, pelo incentivo, confiança e amizade, do início ao
fim deste projeto; Professora Regina Kiomi Takahira, por todo o extenso e minucioso trabalho de hematologia e citologia; Professores Daniel R.
Brown e Mary B. Brown, da University of Florida, pelos ensinamentos
em “micoplasmologia”; Ângelo José Magro, colega Médico Veterinário, muito especialmente, pela paciência e dedicação na realização de algumas etapas deste estudo; Thomaz Henrique Barrela, pelo cuidadoso trabalho com as serpentes e inestimável apoio técnico na realização das colheitas; Marcela Cristina Mendes Ribeiro e Vítor Montenegro
Franceschini, então Bolsistas de Iniciação Científica, por toda a ajuda e
companheirismo; Sônia Maria Faraldo, secretária de nosso Departamento, pela presença e auxílio certo em todas as horas; Luciana
Langrafe, Wagner Zoriki, Gustavo Bueno Gregoracci, Benedito
Placidelli, Tatiana Cristina Moço, Fabiana Custódio Vilela, Professor
Luciano Barbosa e Professora Vera Lúcia Mores Rall, pela
LISTA DE TABELAS LISTA DE ANEXOS
Resumo... Summary... 1 INTRODUÇÃO... 2 REVISÃO DE LITERATURA...
2.1 Crotalus durissus terrificus (LAURENTI, 1768)...
2.2 Doenças infecciosas em serpentes...
2.2.1 Doenças infecciosas do trato respiratório... 2.2.1.1 A infecção por Paramyxovirus... 2.2.1.2 Mycoplasma sp como agente de traqueíte e pneumonia... 2.2.1.3 A doença respiratória causada por bacilos
Gram-negativos... 3 OBJETIVOS... 4 MATERIAL E MÉTODOS...
4.1 Seleção dos animais experimentais e freqüência das colheitas...
4.2 Contenção, biometria e marcação das serpentes...
4.3 Colheita de sangue...
4.4 Swab de glote e lavado traqueopulmonar...
4.5 Manejo dos animais durante o período de estudo...
4.5.1 Manejo das serpentes na quarentena... 4.5.2 Manejo das serpentes na baia... 4.6 Necropsia...
4.7 Processamento das amostras...
4.7.1 Hemograma e proteína plasmática total... 4.7.2 Exame citológico do lavado traqueopulmonar... 4.7.3 Prova sorológica para a detecção de anticorpos contra
4.7.4.4 Obtenção do cDNA... 4.7.4.5 PCR e nested PCR... 4.7.5 Pesquisa de Mycoplasma... 4.7.5.1 Isolamento... 4.7.5.2 Extração do DNA das amostras... 4.7.5.3 PCR... 4.7.6 Pesquisa de bacilos Gram-negativos... 4.7.6.1 Isolamento... 4.7.6.2 Identificação por provas bioquímicas... 4.7.6.3 Determinação do perfil de susceptibilidade bacteriana frente a diferentes drogas...
4.8 Fixação e análise morfológica dos helmintos pulmonares
obtidos nos lavados traqueopulmonares...
4.9 Análise dos dados...
5 RESULTADOS...
5.1 Período da coleta, do recebimento, das colheitas de amostras e
proveniência dos animais...
5.2 Sexo e biometria dos animais...
5.3 Períodos de permanência na quarentena e na baia externa,
freqüência de ingestão de alimento, de regurgitação e de ecdise
durante a quarentena, e observações clínicas efetuadas no
decorrer do estudo...
5.4 Óbitos ocorridos na quarentena, na baia e achados das
necropsias...
5.5 Pesquisa de Paramyxovírus Ofídico...
5.6 Pesquisa de Mycoplasma...
5.7 Pesquisa de bacilos Gram-negativos...
5.8 Hemograma e Proteína Plasmática Total...
das serpentes estudadas...
6.2 O período de permanência na quarentena...
6.3 Informações da segunda colheita de amostras das serpentes
estudadas...
6.4 Na baia externa...
6.5 Informações da terceira colheita de amostras das serpentes
estudadas...
6.6 Comentários finais...
7 CONCLUSÕES... 8 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS... ANEXOS...
114 123
127 133
SILVA, R. J. As serpentes. Jaboticabal: Funep, 2000. p.46]...
FIGURA 2 – Exemplar de Crotalus durissus terrificus (foto cedida por
Silva*)...
FIGURA 3 – Contenção, biometria e marcação das serpentes Crotalus durissus terrificus: A) Galões de transporte; B) Retirada com gancho; C) Contenção com laço de couro e injeção do anestésico; D) Perda do reflexo de endireitamento; E) Sexagem; F) Biometria; G) Implantação do microchip; H) Leitura da marcação...
FIGURA 4 – Colheita de sangue, swab de glote e lavado traqueopulmonar
das serpentes Crotalus durissus terrificus: A) Colheita de sangue da veia caudal ventral; B) Filme de PVC ao redor das presas; C) Abertura da glote; D) Swab de glote; E) Introdução da sonda na glote; F) Infusão do PBS estéril; G) Sistema para recuperação do lavado; H) Lavados traqueopulmonares obtidos: (1) de serpente sadia e (2) de serpente com doença respiratória...
FIGURA 5 – Manejo das serpentes Crotalus durissus terrificus na
quarentena e na baia externa: A) Caixa de polipropileno; B) Estante na sala da quarentena; C) Vista geral das baias
externas do criadouro; D) Interior da baia; E) e F) Manejo diário para observação das serpentes; G) Disposição das cascavéis sob os abrigos; H) Retirada de um animal morto...
FIGURA 6 – Necropsia das serpentes Crotalus durissus terrificus que
vieram a óbito durante o estudo: A) Flambagem dos instrumentos e antissepsia da região a ser incisada; B) Abertura da cavidade celomática; C) e D) Retirada do fragmento de traquéia; E) Local onde os anéis traqueais abrem-se (deixam de ser contínuos) e insere-se o tecido pulmonar, razão pela qual alguns autores referem-se a um “traqueopulmão”; F) O coração (seta à esquerda) e o esôfago, divulsionado e afastado (seta à direita); G) Pulmão; H) Secção de fragmento do pulmão...
FIGURA 7 – Exemplares de Crotalus durissus terrificus coletadas em cada
um dos meses do período de fevereiro a junho de 2001 (dados de 43 animais, dos 8 restantes não houve registro)...
FIGURA 8 – Locais da coleta das serpentes C. d. terrificus estudadas...
7
8
24
27
30
31
45
FIGURA 11 – Períodos de permanência das serpentes C. d. terrificus na
quarentena...
FIGURA 12 – Períodos de permanência das serpentes C. d. terrificus na
baia... .
FIGURA 13 – Períodos médios de tempo decorridos entre cada ingestão do
alimento pelas serpentes C. d. terrificus estudadas...
FIGURA 14 – Sinais clínicos de dificuldade respiratória observados durante
uma das colheitas: A) Formação do “papo”; B) e C)
Respiração com a boca aberta (observar a abertura da glote, em C); e na inspeção diária das serpentes C. d. terrificus na baia: D) E) e F) Respiração com a boca aberta...
FIGURA 15 – Óbitos das serpentes C. d. terrificus estudadas no decorrer do
tempo...
FIGURA 16 – Fotografias da necropsia do animal 26: A) Traquéia
hemorrágica; B)Pulmão com áreas hemorrágicas (seta); C) Presença de secreção e D)Helmintos pulmonares (setas) em cavidade celomática; E) F) e G) Pulmão repleto de secreção, ao corte...
FIGURA 17 – Pesquisa de Paramyxovírus Ofídico: A) e B) Culturas de
células VERO não inoculadas, de aparência normal (aumento 10X); C) e D) Culturas inoculadas com amostras contendo o vírus, nas quais observam-se efeitos citopáticos como a formação de sincícios, células multinucleadas e a destruição do tapete celular (aumento 10X); E) e F) Fotomicrografias eletrônicas do vírus contido em culturas celulares positivas; G) 1: Padrão; 2: Amostra positiva ao PCR (627 bp); 3:
Amostra positiva ao nested PCR (566 bp)...
FIGURA 18 – Gráfico de dispersão ilustrando a ausência de correlação, na
3a colheita, entre os títulos de P1 à HA com os dos soros à HI...
FIGURA 19A – Médias e Desvios Padrão (Hemácias e Trombócitos) ou
Medianas e Semi-Amplitudes Interquartílicas (VG,
Hemoglobina, Leucócitos e Heterófilos) das colheitas 1, 2 e 3 referentes às 18 serpentes das quais obtiveram-se
amostras na 3a colheita... 53
53
55
57
59
63
67
68
FIGURA 20 – Células observadas na realização do hemograma: A)
Hemácias jovens (40x); B) Hepatozoon sp, um parasita de hemácias (100x); C) Azurófilo e Trombócito (100x); D) Monócito e Azurófilo (100x); E) Heterofilia e resposta a
anemia (40x); F) Linfócito e Trombócito (100x);G) Eosinófilo 1 (40x) e 2 (100x); H) Basófilo 1 (40x) e 2 (100x)...
FIGURA 21A – Freqüências, em classes, das variáveis avaliadas no exame
citológico dos lavados traqueopulmonares das serpentes Crotalus durissus terrificus: HE: hemácias; OU: outras células; OU / HE: no de outras células ; no de hemácias; 1, 2 e 3: 1a, 2a ou 3a colheita...
FIGURA 21B – Freqüências, em classes, das variáveis avaliadas no exame
citológico dos lavados traqueopulmonares das serpentes Crotalus durissus terrificus: TROMB: trombócitos; HET: heterófilos; AZU: azurófilos; 1, 2 e 3: 1a, 2a ou 3a colheita...
FIGURA 21C – Freqüências, em classes, das variáveis avaliadas no exame
citológico dos lavados traqueopulmonares das serpentes Crotalus durissus terrificus: LINF: linfócitos; MON:
monócitos; EOS: eosinófilos; 1, 2 e 3: 1a, 2a ou 3a colheita....
FIGURA 21D – Freqüências, em classes, das variáveis avaliadas no exame
citológico dos lavados traqueopulmonares das serpentes Crotalus durissus terrificus: BAS: basófilos; MAST: mastócitos; MACR: macrófagos; 1, 2 e 3: 1a, 2a ou 3a
colheita...
FIGURA 21E – Freqüências, em classes, das variáveis avaliadas no exame
citológico dos lavados traqueopulmonares das serpentes Crotalus durissus terrificus: EP. CIL.: céls. do epitélio ciliar; EP. DESC.: céls. do epitélio descamativo; 1, 2 e 3: 1a, 2a ou 3a colheita... .
FIGURA 22 – Porcentagem de serpentes C. d. terrificus nas quais
observou-se a presença ou ausência de bactérias no exame citológico do lavado traqueopulmonar, em cada uma das colheitas...
100
102
103
104
105
106
(40x); F) Ovo larvado de helminto (40x); G) e; H) Células epiteliais descamativas, a primeira ainda apresentando o núcleo (100x)...
FIGURA 24 – Rhabdias sp. coletado em pulmão de Crotalus durissus terrificus: A)Fêmea partenogenética; B) Esôfago (E) e anel nervoso (An); C) Abertura anal(A); D) Vulva (Vu); E) Ovo larvado (O)...
108
Quadro 2 – Locais da coleta das serpentes C. d. terrificus estudadas...
Quadro 3 – Observações clínicas efetuadas nas serpentes Crotalus
durissus terrificus no decorrer do estudo...
Quadro 4 – Dados referentes ao óbito e achados das necropsias das
serpentes C. d. terrificus que morreram na sala da quarentena.
Quadro 5 – Dados referentes ao óbito e achados das necropsias das
serpentes C. d. terrificus que morreram na baia...
Quadro 6 – Resultados da HA e nested PCR da pesquisa de
Paramyxovirus Ofídico nos lavados traqueopulmonares das serpentes C. d. terrificus provenientes da 1a colheita...
Quadro 7 – Resultados da HA e nested PCR da pesquisa de
Paramyxovirus Ofídico nos macerados de amostras de pulmão obtidas nas necropsias das serpentes C. d. terrificus que vieram a óbito na quarentena...
Quadro 8 – Resultados da HA e nested PCR da pesquisa de
Paramyxovirus Ofídico nos lavados traqueopulmonares das serpentes C. d. terrificus provenientes da 2a colheita...
Quadro 9 – Resultados da HA e nested PCR da pesquisa de
Paramyxovirus Ofídico nos macerados de amostras de pulmão obtidas nas necropsias das serpentes C. d. terrificus que vieram a óbito na baia...
Quadro 10 – Resultados da HA e nested PCR da pesquisa de
Paramyxovirus Ofídico nos lavados traqueopulmonares das serpentes C. d. terrificus provenientes da 3a colheita...
Quadro 11 – Resultados do teste de inibição da hemaglutinação nas
amostras de soro das serpentes C. d. terrificus obtidos nas três colheitas realizadas...
Quadro 12 – Bacilos Gram-negativos isolados das amostras provenientes
das serpentes Crotalus durissus terrificus nas três colheitas e nas necropsias...
Quadro 13 – Resultados da sorologia e identificação das cepas de
Salmonella sp provenientes das serpentes Crotalus durissus terrificus nas três colheitas e nas necropsias...
47
56
60
61
64
64
65
65
66
69
72
Tabela 2 – Média, mediana e desvio padrão dos pesos iniciais das
serpentes coletadas em cada um dos meses de fevereiro a junho...
Tabela 3 – Valores da estatística descritiva do comprimento total, da cauda
e peso das serpentes C. d. terrificus estudadas, e resultados dos testes de comparação das medidas de tendência central entre machos e fêmeas, entre sobreviventes e óbitos e entre os grupos completos em cada colheita...
Tabela 4 – Dados da alimentação, regurgitação e ecdise das serpentes C. d. terrificus estudadas, durante a quarentena...
Tabela 5 – Comparação dos resultados da pesquisa de Paramyxovirus
Ofídico obtidos pelas técnicas de hemaglutinação (HA) e nested PCR das culturas celulares...
Tabela 6 – Amostras positivas para Salmonella sp provenientes das
serpentes Crotalus durissus terrificus nas três colheitas e nas necropsias...
Tabela 7 – Porcentagens de cepas de Salmonella susceptíveis às
concentrações das drogas testadas, amplitude de variação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), CIM 50% e 90%...
Tabela 8 – Amostras positivas para Pseudomonas sp provenientes das
serpentes Crotalus durissus terrificus nas três colheitas e nas necropsias...
Tabela 9 – Porcentagens de cepas de Pseudomonas aeruginosa
susceptíveis às concentrações das drogas testadas, amplitude de variação da Concentração Inibitória Mínima (CIM), CIM 50% e 90%...
Tabela 10 – Cepas de Aeromonas isoladas das serpentes Crotalus
durissus terrificus nas necropsias e os respectivos valores de Concentração Inibitória Mínima (CIM) das drogas testadas...
Tabela 11 – Número e porcentagem de cepas de outros bacilos Gram
negativos isolados das amostras provenientes das serpentes Crotalus durissus terrificus nas três colheitas e nas necropsias.
50
51
54
68
80
82
83
83
84
Tabela 13 – Medidas da estatística descritiva do hemograma e proteína
plasmática total das serpentes Crotalus durissus terrificus na 2a colheita, e resultados dos testes de comparação das medidas de tendência central entre machos e fêmeas, e entre sobreviventes e óbitos...
Tabela 14 – Medidas da estatística descritiva do hemograma e proteína
plasmática total das serpentes Crotalus durissus terrificus na 3a colheita, e resultados dos testes de comparação das medidas de tendência central entre machos e fêmeas, e entre sobreviventes e óbitos...
Tabela 15 – Medidas da estatística descritiva do hemograma e proteína
plasmática total dos grupos completos de serpentes Crotalus durissus terrificus nas três colheitas, e resultados dos testes de comparação das medidas de tendência central das
variáveis estudadas...
Tabela 16 – Medidas da estatística descritiva do hemograma e proteína
plasmática total do grupo de 18 serpentes Crotalus durissus terrificus das quais obtiveram-se amostras na 3a colheita, e resultados dos testes de comparação das medidas de
tendência central das variáveis estudadas...
Tabela 17 – Valores da estatística do teste utilizado e de “p” para as
variáveis em que houve diferença significativa na comparação entre os grupos...
Tabela 18 – Ocasiões em que a presença de helmintos foi registrada nos
lavados traqueopulmonares das serpentes C. d. terrificus no decorrer do período de estudo...
Tabela 19 – Características morfométricas dos parasitas adultos,
identificados como pertencentes ao gênero Rhabdias, presentes nos lavados traqueopulmonares das serpentes Crotalus durissus terrificus no decorrer do período de estudo....
89
91
93
95
99
110
ANEXO B - FICHA DE ACOMPANHAMENTO NO CRIADOURO...
ANEXO C - TABELA DOS PESOS INDIVIDUAIS DAS SERPENTES C. d. terrificus EM CADA COLHEITA E SUA VARIAÇÃO EM
PORCENTAGEM...
ANEXO D - TABELA DOS PERÍODOS DE PERMANÊNCIA DAS
SERPENTES C. d. terrificus NA QUARENTENA E NA BAIA, No DE VEZES EM QUE O ALIMENTO FOI OFERECIDO E INGERIDO, TEMPO MÉDIO ENTRE AS INGESTÕES E EPISÓDIOS DE REGURGITAÇÃO E ECDISE...
ANEXO E1 - TABELA DOS VALORES INDIVIDUAIS DO HEMOGRAMA E
PROTEÍNA PLASMÁTICA TOTAL PARA CADA SERPENTE NA PRIMEIRA COLHEITA...
ANEXO E2 - TABELA DOS VALORES INDIVIDUAIS DO HEMOGRAMA E
PROTEÍNA PLASMÁTICA TOTAL PARA CADA SERPENTE NA SEGUNDA COLHEITA...
ANEXO E3 - TABELA DOS VALORES INDIVIDUAIS DO HEMOGRAMA E
PROTEÍNA PLASMÁTICA TOTAL PARA CADA SERPENTE NA TERCEIRA COLHEITA...
ANEXO F1 - TABELA DOS VALORES INDIVIDUAIS DAS VARIÁVEIS DO
EXAME CITOLÓGICO DO LAVADO TRAQUEOPULMONAR PARA CADA SERPENTE NA PRIMEIRA COLHEITA...
ANEXO F2 - TABELA DOS VALORES INDIVIDUAIS DAS VARIÁVEIS DO
EXAME CITOLÓGICO DO LAVADO TRAQUEOPULMONAR PARA CADA SERPENTE NA SEGUNDA COLHEITA...
ANEXO F3 - TABELA DOS VALORES INDIVIDUAIS DAS VARIÁVEIS DO
EXAME CITOLÓGICO DO LAVADO TRAQUEOPULMONAR PARA CADA SERPENTE NA TERCEIRA COLHEITA...
170
171
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177
179
180
182
NOGUEIRA, M. F. Estudo de Paramyxovirus, Mycoplasma e de bacilos Gram-negativos no trato respiratório de serpentes Crotalus durissus
terrificus. Botucatu, 2004. 184 p. Tese (Doutorado em Medicina
Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu. 2004. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
RESUMO
Serpentes Crotalus durissus terrificus foram avaliadas em três ocasiões: assim que retiradas da natureza e entregues ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) da UNESP, Campus de Botucatu, após um período de quarentena e depois da permanência por aproximadamente 90 dias em uma baia externa. Foram colhidas amostras de sangue para realização de hemograma e sorologia para Paramyxovirus Ofídico (OPMV), swab de glote e lavado traqueopulmonar, para avaliação citológica e pesquisa de OPMV, Mycoplasma e bacilos Gram-negativos. Nos animais que foram a óbito realizaram-se necropsias e pesquisas dos microrganismos citados em traquéia e pulmão. Cepas de
Salmonella, Pseudomonas e Aeromonas isoladas foram submetidas a
variaram de 160 a 5.120, e amostras de todas as serpentes foram positivas para o OPMV. Na avaliação citológica, estes lavados apresentaram elevada celularidade com características de processo inflamatório de misto a macrofágico. Salmonella e Pseudomonas foram isoladas a partir de todas as colheitas, porém Aeromonas apenas de amostras de órgãos. Dentre as drogas testadas, os três gêneros de interesse foram sensíveis à amicacina, gentamicina e enrofloxacina. Não foi obtido o isolamento de Mycoplasma. Nematóides do gênero Rhabdias foram observados nos lavados traqueopulmonares. O Paramyxovirus Ofídico foi o microrganismo identificado em 82% das serpentes estudadas; destas, 90% foram a óbito, tendo-se verificado, nestes animais, sinais sugestivos de paramixovirose.
NOGUEIRA, M. F. Study of Paramyxovirus, Mycoplasma and Gram-negative bacilli in the respiratory tract of Crotalus durissus terrificus snakes. Botucatu, 2004. 184 p. Tese (Doutorado em Medicina Veterinária) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, Campus de Botucatu. 2004. Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”.
SUMMARY
Crotalus durissus terrificus snakes were evaluated in three occasions: as
soon as they were captured from nature and delivered at the Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) - UNESP, Botucatu, SP, Brazil; after quarantine; and after spent nearly 90 days in an outside enclosure. Blood samples were collected for hematology and Ophidian Paramyxovirus (OPMV) serology, and glottis swabs and tracheal washings for cytological evaluation, OPMV, Mycoplasma and Gram-negative bacilli search. Dead animals were necropsied and the above-mentioned microorganisms investigated in trachea and lung. Salmonella,
Pseudomonas and Aeromonas isolated strains were submitted to
features of mixed cell to macrophagic inflammation. Salmonella and
Pseudomonas strains were isolated in all three samplings, but Aeromonas
only from trachea and lung samples. Among all the tested drugs, the three bacterial genera were susceptible to amikacin, gentamicin and enrofloxacin. The isolation of Mycoplasma was not obtained. Nematodes of the genus Rhabdias were observed in the tracheal washings. OPMV was the microorganism isolated in 82% of the studied snakes; 90% of them died, some presenting signs of paramyxoviroses.
1 INTRODUÇÃO
O Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) é uma Unidade Complementar da Universidade Estadual Paulista (UNESP), Campus de Botucatu, SP, credenciada como criadouro científico junto ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA). Neste Centro, serpentes são mantidas em regime semi-extensivo de criação. Após um período inicial de quarentena, os animais recebidos são encaminhados para baias externas onde permanecem por tempo indefinido. Em 1997, encontravam-se, no criadouro, ao redor de 600 exemplares de Crotalus durissus terrificus distribuídos em oito recintos, cada qual alojando de 60 a 80 serpentes.
Por volta do início do segundo semestre daquele ano, passaram a ocorrer óbitos diários de serpentes nas baias externas do CEVAP. As serpentes morriam com aspecto saudável, exibindo boa quantidade de gordura corporal e pele brilhante. Em alguns exemplares, submetidos à necropsia, encontrou-se material caseoso principalmente no pulmão e também no tubo digestivo. Um lote de animais, os quais apresentavam reflexos diminuídos quando manejados, foi conduzido à sala de quarentena para observação. Notou-se, então, que estes respiravam com a boca aberta ou, em alguns momentos, durante o ato respiratório, a pele da região sob a mandíbula distendia-se, assumindo o aspecto de um “papo” (Figuras 1A e B).
No decorrer de quatro a cinco meses, cerca de 400 serpentes vieram a óbito. Aquelas sobreviventes foram concentradas em algumas baias e o restante das instalações passou por processos de desinfecção, utilizando-se cal e vassoura-de-fogo. As caixas individuais da quarentena foram lavadas e tratadas com microbicidas.
O plantel foi recomposto com animais supostamente saudáveis, provenientes da natureza, mas até então, em meados de 1998, não se sabia qual havia sido o agente responsável por tal mortalidade. A suspeita maior, de acordo com dados obtidos em literatura, era ter-se tratado de um surto de paramixovirose. Estes fatos, descritos nos parágrafos anteriores conforme relatados por Silva∗, motivaram diretamente a proposição deste projeto de pesquisa.
A criação de serpentes em cativeiro, visando a obtenção de veneno, do início do século passado até nossos dias, tornou-se atividade cada vez mais relevante; primeiramente, para produção dos soros antiofídicos e, nas últimas décadas, para o estudo dos venenos, seus componentes e possíveis aplicações. Nesta modalidade zootécnica, entretanto, têm sido observados problemas que resultam, muitas vezes, em altas taxas de mortalidade destes répteis nos plantéis.
Langlada (1972) afirmou ter verificado que, sob algumas condições impostas pelo cativeiro, a sobrevida média de animais do gênero Crotalus não excedia 70 dias. Belluomini et al. (1976/77) relataram que era “grande” a mortalidade de serpentes dos gêneros
Crotalus e Bothrops nos serpentários e laboratórios do Instituto Butantan,
SP. Leinz et al. (1989) reportaram o óbito de 50% das serpentes
Bothrops jararacussu nos primeiros seis meses de cativeiro, mesma taxa
referida por Serapicos & Merusse (2000 - 2001) com relação a um grupo de Micrurus corallinus, durante o outono.
Dentre os problemas enfrentados na criação de serpentes em cativeiro estão as doenças infecciosas que podem acometer estes animais. Neste contexto, as infecções do trato respiratório assumem posição de destaque, sendo causadas por agentes de diferentes naturezas, muitas vezes pela disseminação de processos infecciosos localizados e podendo levar à condição de sepse do indivíduo.
∗ SILVA, R. J. (Departamento de Parasitologia, Instituto de Biociências, UNESP – Campus de
FIGURA 1 – “Exemplares de cascavel (Crotalus durissus terrificus) com
pneumonia supostamente causada por paramixovírus, evidenciando-se dificuldade na respiração (A) e presença de hemorragia na cavidade oral
(B)”. [Fonte (figuras e legenda): SILVA, R. J. As serpentes. Jaboticabal:
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Crotalus durissus terrificus (LAURENTI, 1768)
FIGURA 2 – Exemplar de Crotalus durissus terrificus (foto cedida por Silva∗).
A classe Reptilia contém 5.141 espécies agrupadas em quatro ordens e três subordens de répteis viventes, sendo as serpentes pertencentes à ordem Squamata, subordem Ophidia (Wallach & Boever, 1983). O gênero Crotalus encontra-se classificado na infra-ordem Alethinophidia, superfamília Colubroidea, família Viperidae. Esta família compreende 17 gêneros, que são divididos em 202 diferentes espécies (McDowell, 1987).
O gênero Crotalus (LINNAEUS, 1758) está, atualmente, subdividido em 27 espécies. São caracterizadas por terem um guizo na extremidade da cauda e numerosas pequenas escamas cobrindo o topo da cabeça. Nenhum outro gênero tem esta combinação de
∗ SILVA, R. J. (Departamento de Parasitologia, Instituto de Biociências, UNESP – Campus de
características. Membros deste gênero ocorrem desde o sul do Canadá até a Argentina e de locais abaixo do nível do mar até altitudes de quatro mil metros. São encontrados em uma grande variedade de habitats e o veneno produzido pelas diferentes espécies apresenta grande variabilidade na sua composição e efeitos (Mattison, 1996).
No Brasil, ocorre apenas uma espécie, a Crotalus durissus (L. 1758), com seis subespécies: C. d. cascavella, C. d. collilineatus, C. d.
marajoensis, C. d. ruruima, C. d. trigonicus e C. d. terrificus. São
conhecidas popularmente como cascavel, cascavel de quatro ventas, cobra de guizo, boicininga, maracá, boiquira ou maracabóia (Soerensen, 1990).
A subespécie C. d. terrificus, objeto de nosso estudo, ocorre em áreas dos Estados do Amazonas, Pará, Mato Grosso, Minas Gerais, Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul e São Paulo. É uma serpente de porte relativamente grande, podendo chegar a um metro ou mais, com alguns machos ocasionalmente excedendo um metro e meio, e distingue-se das outras subespécies por apredistingue-sentar a parte interna das manchas dorsais mais claras do que os bordos. Aparecem em ambientes secos e rochosos, de vegetação baixa, sendo raramente encontradas em florestas, e predominando em campos e plantações, ricas em pequenos roedores, dos quais se alimentam. Com exceção do bote, estas serpentes são de movimentos lentos e pouco agressivas (Soerensen, 1990, Mattison, 1996).
Não foram encontrados, na bibliografia pesquisada, trabalhos relativos à sanidade de serpentes em vida livre, sejam tocantes aos padrões que poderiam ser considerados normais, de animais presumivelmente sadios, sejam relatos de ocorrência de doenças infecciosas ou de outras possíveis etiologias. Jacobson (1993c) afirma que, embora o efeito das doenças tenha sido pobremente estudado e raramente relatado em populações de répteis em vida livre, epizootias são bem documentadas em répteis em cativeiro. Assim como as aves e os mamíferos, os répteis são suscetíveis a infectar-se com uma grande variedade de patógenos, incluindo vírus, bactérias, fungos e parasitas.
2.2 Doenças infecciosas em serpentes
Cowan (1968) conclui que a principal causa de mortalidade de serpentes no Philadelphia Zoological Garden é a "síndrome da má adaptação”, responsável por 80% dos óbitos durante os dois primeiros anos de cativeiro. Esta "síndrome" levaria o animal à inapetência, emagrecimento, fragilidade dos tecidos (resultando em ulcerações da boca, pele, cloaca e mucosa intestinal) e aumento da susceptibilidade à infecção por microrganismos patogênicos e também por aqueles normalmente inócuos. Esta opinião é corroborada por Belluomini et al. (1976/77), após realizarem exames necroscópicos em 907 serpentes dos gêneros Crotalus (n = 455) e Bothrops (n = 452) que morreram no Instituto Butantan em 1969 e 1970. Também concordam com esta afirmação Leinz et al. (1989), em seu trabalho sobre sobrevivência de B. jararacussu já citado anteriormente.
mesmo estudo revelou que as serpentes do gênero Crotalus ocupavam o terceiro lugar entre as espécies mais afetadas e que, das 1300 mortes, 40% haviam ocorrido por doenças do trato respiratório.
2.2.1 Doenças infecciosas do trato respiratório
Jacobson (1978) e Junge & Miller (1992) afirmam que as doenças do sistema respiratório são comuns em répteis e responsáveis por considerável morbidade e mortalidade em zoológicos e coleções particulares. Frye (1991) justifica que o sistema respiratório relativamente simples dos répteis e a falta de um diafragma funcional os tornam particularmente sensíveis às infecções respiratórias severas. Suas características pulmonares morfológicas e fisiológicas tendem a favorecer a retenção de secreções respiratórias e exsudatos nos tecidos do trato respiratório inferior.
Em serpentes, são descritas doenças respiratórias causadas por parasitas, fungos e, principalmente, por bacilos Gram-negativos (Murray, 1996). Nas últimas décadas, foi reconhecido um agente viral de ação devastadora sobre os plantéis de serpentes, um tipo de Paramyxovirus, hoje conhecido como OPMV, Ophidian Paramyxovirus (Foelsch & Leloup, 1976, Clark et al., 1979, Jacobson et al., 1980) e, recentemente, relatou-se um caso de infecção do trato respiratório de uma serpente causado por uma espécie de Mycoplasma (Penner et al., 1997), do qual obteve-se o isolamento.
2.2.1.1 A infecção por Paramyxovirus
do plantel, fosse a bactéria Pseudomonas, isolou-se um tipo de vírus em suspensões de pulmões das serpentes afetadas (Foelsch & Leloup, 1976). Posteriormente, este foi chamado de Fer de Lance virus (FDLV) e identificado como um provável Paramyxovirus (Clark et al., 1979).
No ano seguinte, Jacobson et al. (1980) descreveram o caso de uma Crotalus lepidus com história de doença progressiva do sistema nervoso central que havia sido submetida à necropsia. Os achados histopatológicos evidenciavam pneumonia intersticial, alterações de órgãos do sistema nervoso e, à microscopia eletrônica, constataram-se inúmeras partículas virais no espaço extracelular do tecido do tronco cerebral. Finalmente, um vírus similar a um Paramyxovirus foi isolado a partir de tecido pulmonar, em cultura de células cardíacas de serpente, e este, observado por microscopia eletrônica, era semelhante em tamanho e formato àquelas partículas vistas no tecido nervoso. Os efeitos citopáticos, a sensibilidade ao éter, a capacidade hemaglutinante e a aparência ultraestrutural reforçariam a suposição de que o agente era um Paramyxovirus. Clark & Lunger (1981) afirmaram que o FDLV é um Paramyxovirus por possuir um genoma com RNA de cadeia simples com um valor de sedimentação de 50S, embora comparações sorológicas com outros Paramyxovirus de mamíferos e aves indicassem diferenças antigênicas. Concluíram a importância de verificar se este vírus é altamente patogênico, sendo sozinho capaz de causar severas epizootias, ou um agente de infecções latentes ordinárias levando à doença aguda animais sujeitos a outros fatores de estresse.
títulos positivos variaram de 20 a 2560, com apenas dois animais negativos.
Nos anos seguintes, vírus relacionados aos Paramyxovirus foram isolados de outras espécies de serpentes. Ahne et al. (1987) obtiveram o isolamento de um tipo de vírus semelhante a um Myxovirus a partir de órgãos da serpente Elaphe oxycephala e Potgieter et al. (1987) descreveram uma doença respiratória fatal em Vipera xanthina xanthina associada com a infecção por um Paramyxovirus relacionado ao vírus Parainfluenza-2. Ahne & Scheinert (1989) relataram o isolamento de partículas semelhantes ao Parvovirus a partir de órgãos de uma serpente
Elaphe guttata mostrando sinais de pneumonia.
Jacobson et al. (1991), tentando encontrar uma vacina que protegesse as serpentes contra a doença causada pelo Paramyxovirus dos ofídios, inativaram uma estirpe isolada de uma Dendroaspis polylepis e utilizaram-na para preparar vacinas com e sem adjuvantes. Um conjunto de Crotalus atrox foi então vacinado e, embora diversas serpentes tenham desenvolvido títulos, a resposta entre os indivíduos foi considerada variável e transitória. Em uma outra epizootia ocorrida no zoológico de Nova Orleans (Jacobson et al., 1992), quando vieram a óbito 42 serpentes sendo que 26 pertenciam ao gênero Crotalus, obteve-se o isolamento do vírus e realizaram-se provas sorológicas consecutivas nas serpentes antes que viessem a óbito. Todas as serpentes inicialmente com altos títulos de anticorpos mostraram um declínio destes durante o período avaliado. Em muitos casos, os títulos declinaram em três a sete meses após a colheita das primeiras amostras de sangue. Os autores não concluíram se isto é uma indicação de imunidade por curto período e suscetibilidade à reinfecção e doença ou se talvez o título de anticorpos não seria o melhor indicativo de imunidade em serpentes após infecção pelo OPMV.
Jacobson (1993 a, b) afirmou que certas espécies de
epizootias causadas por este vírus, estando presentes C. durissus e C.
basiliscus, em muitas situações estas seriam as primeiras espécies a
morrer.
Blahak (1995) efetuou a caracterização de estirpes de vírus isolados de serpentes que vieram a óbito em um zoológico da Alemanha, e Richter et al. (1996) a de estirpes isoladas nos Estados Unidos. Ambos concluíram que estes vírus possuíam características de Paramyxovirus. Quanto à relação com Paramyxovirus aviários ou de mamíferos, o primeiro observou reações cruzadas em testes sorológicos com Paramyxovirus aviário tipo 1 e 7, concluindo porém, através de eletroforese, que suas proteínas HN, NP e M apresentavam diferentes pesos moleculares. Richter et al. (1996) não observaram reações cruzadas dos Paramyxovirus isolados de serpentes com os de outras espécies.
Cranfield & Graczyk (1996), descrevendo a "paramixovirose dos ofídios", afirmam não haver sinais patognomônicos para o diagnóstico desta infecção. A doença apresenta-se com uma grande variação de sinais, os quais tornam difícil o diagnóstico para o clínico. Suas apresentações clínicas poderiam ser divididas em três categorias: aguda e superaguda, quando os animais exibem sinais respiratórios e/ou neurológicos por curto período antes de virem a óbito ou, freqüentemente, são apenas encontrados mortos; crônica, quando se observam sinais inespecíficos de doença ao longo de meses, emagrecimento e pneumonias por infecção bacteriana secundária; e a do portador são, que são os animais portadores do vírus, que disseminam o agente, mas não demonstram sinais de doença.
de exames histológicos e obtiveram também o reisolamento do agente a partir dos animais inoculados.
Recentemente, esforços têm sido direcionados na caracterização molecular das estirpes de OPMV anteriormente isoladas. Ahne et al. (1999) desenharam primers para obtenção, pela técnica de PCR, de seqüências de fragmentos dos genes L e HN de 16 estirpes de OPMV isoladas nos Estados Unidos, Alemanha e Suíça, as quais foram objetos de estudos filogenéticos. Franke et al. (2001), a partir de seqüências de fragmentos dos genes L e F, também realizaram análises filogenéticas em 18 estirpes virais de Paramyxovirus isoladas de serpentes, propondo um novo gênero na família Paramyxoviridae para os Paramyxovirus de répteis.
No Brasil, a enfermidade causada pelo OPMV foi, até o momento, relatada em serpentes Bothrops alternatus e C. d. terrificus. Kolesnikovas et al. (2000 - 2001) descreveram um surto ocorrido em B.
alternatus jovens mantidos no Laboratório de Herpetologia do Instituto
Butantan, o qual foi investigado utilizando-se exames histopatológicos, imunohistoquímicos e microbiológicos. Nogueira et al. (2001, 2002) obtiveram o isolamento do OPMV a partir da secreção pulmonar de um exemplar de C. d. terrificus em cativeiro mostrando sinais de pneumonia, tendo a identificação do vírus sido confirmada pela realização de nested PCR das culturas celulares positivas.
2.2.1.2 Mycoplasma sp como agente de traqueíte e pneumonia
Bactérias do gênero Mycoplasma podem causar doença
respiratória em muitos animais, incluindo humanos, roedores, suínos e aves. Brown et al. (1994) afirmaram que este agente é também o principal causador da doença do trato respiratório superior em uma espécie de tartaruga do deserto, Gopherus agassizii, tendo sido este o primeiro trabalho a realmente comprovar o papel deste microrganismo como causador de doença respiratória em répteis. Neste estudo, os autores infectaram experimentalmente uma série de tartarugas com o
Mycoplasma agassizii (nova espécie proposta) isolado anteriormente da
cóana (estrutura no palato) de uma tartaruga clinicamente doente, conseguindo reproduzir o quadro da doença e reisolando novamente o agente dos animais inoculados, a partir de lavados nasais. Observaram, também, devido ao resultado de provas sorológicas, que muitos animais aparentemente normais podem ser portadores do M. agassizii sem apresentar sinais de doença. A enfermidade causada por microrganismos do gênero Mycoplasma é, com freqüência, clinicamente silenciosa, de progressão lenta, e crônica, cuja gravidade pode ser exacerbada por fatores ambientais, estresse e ação sinérgica com outros agentes microbianos. A doença do trato respiratório superior na tartaruga apresentaria um perfil muito similar ao descrito acima, com a presença de animais aparentemente saudáveis os quais apresentam sinais da doença subitamente, depois do estresse provocado por relocações ou pelo adensamento populacional.
Em ofídios, Penner et al. (1997) relataram o isolamento de uma espécie de Mycoplasma do tecido respiratório de uma serpente
Python molurus bivittatus que apresentava, histologicamente, traqueíte e
pulmão e traquéia à microscopia eletrônica de transmissão foi sugestiva de uma doença respiratória causada por este agente, embora seja possível que o microrganismo visualizado e isolado venha a ser não mais do que um habitante normal do sistema respiratório do animal. As alterações patológicas do epitélio respiratório, entretanto, foram típicas de infecção por Mycoplasma, fazendo lembrar aquelas vistas na micoplasmose respiratória de mamíferos e de tartarugas. Comparando-se as seqüências de nucleotídeos dos genes 16S rRNA, observou-se que a cepa de Mycoplasma isolado da traquéia e do pulmão da serpente apresentava 90% de similaridade com o M. agassizii e 86% com o
Mycoplasma H3110, ambos agentes de doença do trato respiratório
superior em tartarugas do deserto. Os autores observaram que doenças respiratórias em serpentes de cativeiro, as quais não são incomuns, têm sido associadas com uma variedade de infecções bacterianas, virais e parasitárias, mas nunca antes com Mycoplasma, possivelmente porque este microrganismo requer meios especiais de crescimento e pode ser difícil de ser isolado.
2.2.1.3 A doença respiratória causada por bacilos Gram-negativos
Bactérias são a causa mais comum de infecções respiratórias e doença em répteis. Pneumonias bacterianas em répteis podem ocorrer tanto como doença primária, como secundária a septicemia, a pneumonia viral, ou a doença respiratória parasitária, ou podem resultar de estomatites necróticas, se debris necróticos da cavidade oral forem aspirados. Como nas infecções bacterianas em qualquer outra localização no paciente réptil, patógenos bacterianos na doença do trato respiratório são primariamente Gram-negativos.
Pseudomonas, Aeromonas, Klebsiella, Proteus, Escherichia e Citrobacter
presentes em pneumonias. A predominância de organismos Gram-negativos resistentes a um grande número de antibióticos (Pseudomonas, por exemplo), faz do conhecimento da susceptibilidade a antibióticos um ponto crítico ao sucesso da terapêutica (Junge & Miller, 1992). Antibióticos utilizados na terapêutica respiratória incluem amicacina, ceftazidime, ceftiofur, cefotaxime, cefuroxime, enrofloxacina e piperacilina (Murray, 1996).
De acordo com Murray (1996), os organismos Gram-negativos isolados dos casos de pneumonia bacteriana podem ser identificados em animais clinicamente sadios. A doença seria causada pelo estabelecimento do comensal normal em um local anormal, como o pulmão. Cooper (1981), por sua vez, afirmara que era visível que relativamente pouco se sabia da flora bacteriana normal de répteis e nada sobre o papel ou persistência desta flora, além do que a distinção entre infecção e doença em um réptil não estaria sempre clara.
Page (1961), baseado em limitados inquéritos, sugeriu que
Pseudomonas, Proteus, Klebsiella, Escherichia, Micrococcus e
Corynebacterium spp eram os habitantes normais da cavidade oral de
California king snakes (Lampropeltis getulus californiae) sadias e que
organismos Gram-negativos ultrapassavam em número os Gram-positivos neste local. Draper et al. (1981), ao contrário, realizando cultivos de
swabs tomados do pálato e das laterais da cavidade oral de serpentes de
diversas espécies em cativeiro, concluíram que, em animais saudáveis, bactérias Gram-positivas eram mais freqüentemente encontradas (60,3% do total dos isolamentos), havendo pouca variação na flora da cavidade oral entre as famílias de serpentes; em animais com estomatite infecciosa, as bactérias Gram-negativas predominaram (80,3% do total dos isolamentos, quando foram obtidas principalmente Pseudomonas
aeruginosa, P. maltophilia e Providencia rettgeri). Pseudomonas
aeruginosa foi encontrada em 25% das serpentes saudáveis, porém em
significativos poderiam ser obtidos identificando-se a flora oral e intestinal de serpentes de vida livre para observar-se se estas seriam diferentes daquelas encontradas em serpentes em cativeiro.
Hilf et al. (1990), com a hipótese de que os patógenos bacterianos mais freqüentemente envolvidos em pneumonias de serpentes provavelmente eram aqueles da flora normal da cavidade oral e trato respiratório superior, conduziram um inquérito bacteriológico prospectivo da flora do trato respiratório superior em oito serpentes da família Boidae, no Pittsburgh Zoo, pelo período de um ano. Relataram que o bacilo Gram-negativo mais comumente isolado foi Providencia
rettgeri e que, em serpentes com pneumonia, o número de bacilos
Gram-negativos foi significativamente maior que em serpentes normais. De duas serpentes que vieram a óbito em conseqüência de pneumonia, da primeira isolou-se maciçamente Aeromonas hydrophila e da segunda
Salmonella sp, Citrobacter sp e Enterococcus sp, em ambos os casos a
partir de tecido pulmonar. Salmonella já havia sido anteriormente cultivada de swab de glote do segundo animal, e esta linhagem mostrou-se resistente à gentamicina, in vitro. Estes autores concluíram que a cultura de swab da glote é uma técnica útil no manejo da pneumonia bacteriana em répteis. Organismos isolados da glote são representativos dos agentes causais em serpentes com pneumonia, inclusive por serem os mesmos isolados de lavados bronquiais. Afirmam, ainda, que devemos conhecer a flora normal do trato respiratório superior das serpentes dos plantéis, e a correspondente sensibilidade in vitro destas bactérias a antibióticos.
Em um estudo já citado anteriormente, Jacobson et al. (1992) isolaram, de culturas de pulmão de 12 serpentes (a maioria
Crotalus) com lesões pulmonares compatíveis com infecção por
Paramyxovirus, principalmente: Morganella morganii, Pseudomonas spp e
Salmonella arizonae. Os autores consideram que estas infecções
poderiam ser devidas à imunossupressão, como as constatadas nas paramixoviroses de outros animais, como na infecção pelo vírus Sendai em camundongos.
No Brasil, Mavridis et al. (1993a) pesquisaram a microbiota aeróbica de serpentes Bothrops sp, recém capturadas e aparentemente sadias. Concluíram que houve predominância de bactérias Gram-negativas, tanto nas culturas de material da cavidade bucal como de fragmentos de traquéia e pulmão. Os microrganismos isolados, em ambos os tipos de amostras, foram: E. coli, Pseudomonas sp, Shigella sp,
Aeromonas salmonicida, Vibrio sp e Enterobacter sp. Em outro estudo,
de pulmão e vias aéreas de serpentes doentes de várias espécies, os mesmos autores (Mavridis et al., 1993b) isolaram Salmonella sp, Proteus sp, Enterobacter sp, bacilo Gram-negativo não-fermentador, Edwardsiella
tarda, P. aeruginosa, E. coli, Citrobacter sp, Yersinia pseudotuberculosis,
Aeromonas salmonicida e Klebsiella sp. Kolesnikovas (1997), ao realizar
uma série de exames anátomo-patológicos e microbiológicos de serpentes Crotalus durissus, concluiu que, se consideradas as causas de morte, o principal órgão acometido foi o pulmão e os principais agentes bacterianos isolados foram os bacilos Gram-negativos. Das culturas de amostras de pulmão, a bactéria isolada com maior freqüência foi
Aeromonas hydrophila.
3 OBJETIVOS
Com este estudo, objetivamos:
3.1 Efetuar avaliação clínica das serpentes Crotalus durissus terrificus doadas ao CEVAP - Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos – UNESP – Campus de Botucatu, um criadouro com finalidade científica;
3.2 Verificar a presença de anticorpos contra o Paramyxovirus nestes animais;
3.3 Pesquisar a ocorrência de Paramyxovirus, Mycoplasma e bacilos Gram-negativos (Salmonella spp, Pseudomonas spp e Aeromonas spp) no trato respiratório destas serpentes;
3.4 Avaliar o perfil de sensibilidade das bactérias isoladas frente a diferentes agentes antimicrobianos;
3.5 Reavaliar, quando possível, todos os parâmetros acima nos
4 MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção dos animais experimentais e freqüência das colheitas
Para esta pesquisa foram selecionadas 51 serpentes da espécie Crotalus durissus terrificus de ambos os sexos que, doadas ao Centro de Estudos de Venenos e Animais Peçonhentos (CEVAP) da UNESP, campus de Botucatu, tinham ao menos 0,3 kg de peso corporal, eram provenientes de vida livre e aparentemente hígidas. Estes répteis são trazidos, principalmente, por proprietários rurais da região de Botucatu, sendo transportados em galões de plástico (Figura 3A) portando uma ficha de identificação (Anexo A).
Optou-se por realizar, semanalmente, colheitas de material de, no máximo, cinco animais a cada vez. Assim, as serpentes com peso igual ou superior ao requerido permaneceram nos galões em que foram transportadas, no local destinado à recepção dos mesmos, até o momento da primeira colheita das amostras.
As colheitas foram repetidas após um período de permanência das serpentes de, aproximadamente, noventa dias na quarentena e, posteriormente, noventa dias na baia externa. Caso a serpente viesse a óbito, era então necropsiada e fragmentos de pulmão e traquéia colhidos para pesquisa de microrganismos.
4.2 Contenção, biometria e marcação das serpentes
aplicar uma injeção contendo o anestésico (Figura 3C). Todo o procedimento de contenção física foi realizado por um técnico experiente no manuseio de serpentes peçonhentas.
A anestesia foi efetuada com o cloridrato de quetamina, via intramuscular, na dose de 40 mg/kg, obtendo-se a prostração do animal, com a perda do reflexo de endireitamento (Figura 3D), em períodos que variaram de 20 a 30 minutos após a injeção do fármaco.
Já prostradas, as serpentes eram medidas – comprimento total e da cauda - (Figura 3F), sexadas (Figura 3E) e marcadas pela implantação subcutânea de microchips (Figuras 3G e 3H). O exame físico foi realizado conforme preconiza Jacobson (1993a), quando então procurou-se observar, principalmente, a aparência da pele e a presença de parasitas, ferimentos e aumentos de volume. Todos os dados referentes a cada animal foram anotados em uma ficha individual (Anexo B) que acompanhou sua permanência no criadouro.
4.3 Colheita de sangue
A colheita de sangue foi realizada pela punção da veia caudal ventral (Figura 4A).
FIGURA 3 – Contenção, biometria e marcação das serpentes Crotalus durissus terrificus: A) Galões de transporte; B) Retirada com gancho; C) Contenção com laço de couro e
injeção do anestésico; D) Perda do reflexo de endireitamento; E) Sexagem; F) Biometria;
4.4 Swab de glote e lavado traqueopulmonar
Antes da manipulação da cabeça e cavidade oral das serpentes para a colheita do swab de glote e do lavado traqueopulmonar, uma fita de filme de PVC era, cuidadosamente, enrolada ao redor das presas do animal (Figura 4B), prevenindo-se assim inoculações acidentais de veneno. A glote, localizada no assoalho da cavidade oral, era exposta sem ser tocada, evitando-se sua contaminação por microrganismos exógenos, e aguardava-se sua abertura (Figura 4C) para a colheita do material.
Os swabs, por serem diminutos, foram confeccionados com agulhas hipodérmicas comuns 25x7 ou 30x10 e algodão hidrófilo, esterilizados em tubos de ensaio e manejados utilizando-se uma pinça previamente flambada. Estes eram previamente umedecidos com uma gota de PBS estéril, introduzidos na glote aberta e friccionados com delicadeza na mucosa para obtenção de amostras de secreções e células (Figura 4D). Imediatamente após sua retirada da glote eram colocados em tubos contendo 50 µL de PBS estéril para evitar a dessecação da amostra, e então mantidos em gelo picado até seu processamento laboratorial para pesquisa de bacilos Gram-negativos.
Para obtenção do lavado traqueopulmonar, introduziu-se uma sonda uretral no 4 através da glote pela traquéia das serpentes, utilizando-se uma pinça estéril para movimentá-la (Figura 4E), e injetou-se, lentamente, um volume de PBS estéril equivalente a 1% do peso do animal (Figura 4F).
Desta forma, criou-se um “sistema fechado” que impedia a contaminação da amostra por microrganismos do ambiente.
O tubo de ensaio contendo o lavado (Figura 4H) era colocado em gelo picado e encaminhado, juntamente com o swab, ao Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências (IB) da UNESP, campus de Botucatu, onde foram realizadas as determinações microbiológicas. Imediatamente uma alíquota do lavado era, em câmara de fluxo laminar, colocada em microtubo estéril e encaminhada em gelo picado ao Laboratório Clínico Veterinário da FMVZ para realização do exame citológico.
4.5 Manejo dos animais durante o período de estudo
4.5.1 Manejo das serpentes na quarentena
Realizadas as colheitas das amostras após sua chegada ao criadouro, as serpentes eram submetidas a um banho profilático contra ectoparasitas com uma solução de triclorfon (Neguvon®) a 0,2% e conduzidas à sala de quarentena, de acesso restrito ao pessoal encarregado da manutenção dos animais. Esta sala tem iluminação artificial, a umidade não é controlada e a temperatura é de 25oC ± 3oC, utilizando-se aquecedor elétrico para manter o ambiente aquecido nos dias mais frios de inverno. Na quarentena, alojou-se cada animal em uma caixa de polipropileno de 30 cm de altura, 40 cm de largura e 60 cm de comprimento, com tampo de vidro, dotada de um recipiente de alumínio destinado ao fornecimento de água e forrada com um substrato de papel jornal (Figura 5A). As caixas foram numeradas e dispostas em uma estante de metal (Figura 5B).
dos bebedouros com água e detergente, e à troca do substrato, após remoção e colocação da serpente em uma caixa de espera.
A alimentação das serpentes consistiu de um camundongo (Mus musculus) adulto, fornecido a intervalos de 15 dias. Caso o animal não se alimentasse dentro de um período de 24 horas, o camundongo era retirado para evitar possíveis lesões na serpente em decorrência de mordeduras do roedor.
A freqüência de alimentação e limpeza das caixas, assim como a observação de mudas de pele (ecdise), regurgitação do alimento, alterações no estado geral das serpentes e óbitos, ou outras observações dignas de nota, foram registradas nas fichas de acompanhamento de rotina (Anexo B).
Os camundongos utilizados para a alimentação das serpentes são exemplares adultos fornecidos pelo Biotério Central da UNESP, campus de Botucatu. Antes de serem oferecidos aos répteis, é fornecida aos roedores, ad libitum, como água de bebida, uma solução composta por 250 mg de metronidazol (Flagyl®) e 15 mg de cloridrato de oxitetraciclina (Terramicina®) para cada 10 litros de água, durante sete dias. Este é um procedimento padrão do criadouro, com o intuito de evitar a infecção das serpentes com bactérias e parasitas eventualmente carreados pelos roedores. A ração também é oferecida ad libitum e a limpeza das caixas de camundongos (troca da cama, lavagem das caixas e bebedouros) é executada três vezes por semana.
4.5.2 Manejo das serpentes na baia
A alimentação das serpentes passou a ser fornecida na proporção de dois camundongos adultos por animal alojado, a cada 15 dias. Após 24 horas, os camundongos vivos e os mortos que não tivessem sido ingeridos eram retirados.
Todos os animais foram observados diariamente (Figuras 5E, 5F e 5G) e quaisquer eventos ocorridos anotados nas respectivas fichas (Anexo B).
4.6 Necropsia
Dos animais que vinham a óbito (Figura 5H) eram, primeiramente, colhidas, de forma asséptica, amostras de traquéia e pulmão (Figura 6A a 6H), as quais eram imediatamente levadas, sob refrigeração, aos laboratórios do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biociências (IB) da UNESP, campus de Botucatu, para seu processamento laboratorial. A seguir, estas serpentes eram necropsiadas de acordo com Mader (1996), para verificação de alterações em outros órgãos.
4.7 Processamento das amostras
4.7.1 Hemograma e proteína plasmática total
Com as amostras de sangue foram efetuadas a contagem total de células sangüíneas (hemácias, leucócitos e trombócitos), a diferenciação dos leucócitos, a determinação dos valores do volume globular, da hemoglobina e da proteína plasmática total.
FIGURA 5 – Manejo das serpentes Crotalus durissus terrificus na quarentena e na baia
FIGURA 6 – Necropsia das serpentes Crotalus durissus terrificus que vieram a óbito
durante o estudo: A) Flambagem dos instrumentos e antissepsia da região a ser incisada; B) Abertura da cavidade celomática; C) e D) Retirada do fragmento de traquéia;
E) Local onde os anéis traqueais abrem-se (deixam de ser contínuos) e insere-se o
corados com Leishman, em 100 células (Raskin, 2000). A dosagem de hemoglobina pelo método da cianometahemoglobina foi efetuada centrifugando-se a solução de células lisadas durante dois a três minutos, antes de se proceder a leitura colorimétrica. A determinação da proteína plasmática total foi realizada por refratometria (Jain, 1986).
4.7.2 Exame citológico do lavado traqueopulmonar
Para o exame citológico do lavado foram centrifugadas três gotas da amostra a 800 rpm, por cinco minutos, em citocentrífuga. Após secagem completa das lâminas obtidas, estas foram coradas com Leishman e observadas ao microscópio óptico, onde foram identificados os tipos celulares (células sangüíneas, macrófagos e células epiteliais) e a eventual presença de bactérias e ovos ou larvas de parasitas.
Além disso, foi feita a contagem total das células presentes na amostra, em câmara de Neubauer, diferenciando-se as hemácias dos demais tipos celulares.
4.7.3 Prova sorológica para a detecção de anticorpos contra
Paramyxovirus
As amostras de plasma, anteriormente congeladas a -20°C, foram submetidas à prova de inibição da hemaglutinação, utilizando-se hemácias de galinha e o vírus isolado no criadouro (Nogueira et al., 2001, 2002) como padrão e controle positivo. Esta prova foi realizada como um teste de inibição de hemaglutinação padrão, observando-se:
i) a utilização da solução de Alsever como anticoagulante do sangue de
galinha;
ii) a inativação do complemento das amostras;
iii) a adsorção prévia, às hemácias de galinha, de anticorpos inespecíficos
presentes nas amostras;
Tendo-se em vista as determinações microbiológicas, foram tomados todos os cuidados para que os procedimentos de colheita, inclusive na necropsia, não trouxessem qualquer prejuízo à representatividade das amostras. Todo o material não descartável utilizado foi cuidadosamente preparado seguindo-se protocolos de lavagem e esterilização. Após colhidas, as amostras foram mantidas sempre em gelo picado e processadas o mais rapidamente possível, objetivando-se a preservação dos microrganismos eventualmente presentes.
As amostras de traquéia e pulmão, provenientes dos animais que vinham a óbito, eram, em câmara de fluxo laminar, maceradas em PBS (1:10 v:v) e utilizadas nas determinações microbiológicas.
4.7.4 Pesquisa de Paramyxovirus
4.7.4.1 Isolamento em cultura de células VERO
As tentativas de isolamento do Paramyxovirus ofídico foram realizadas em culturas de células VERO provenientes do banco de células do Instituto Adolfo Lutz, SP (ATCC CCL-81). Como controle positivo, foi utilizado o vírus isolado no criadouro (Nogueira et al., 2001, 2002).
Inicialmente, as células eram cultivadas em garrafas de plástico (25 cm2) em Solução Essencial Mínima de Eagle suplementada com 10% de soro fetal bovino, as quais permaneciam por 48 horas a 37°C, quando a monocamada apresentava-se completa.
do cultivo celular (da qual havia sido retirado o meio de cultura com soro fetal sendo, em seguida, lavada apenas com o meio de cultura). A solução contendo a amostra era deixada em contato com o tapete celular por 30 minutos, sob agitação de 40 rpm. Decorrido este intervalo, acrescentava-se à garrafa mais 9 mL de solução de Eagle e incubava-se a 30°C, sob a mesma agitação, por 5 dias.
Devido a problemas com as culturas celulares, os lavados traqueopulmonares provenientes das segundas e terceiras colheitas, e os macerados de órgãos, não puderam ser inoculados no mesmo dia em que foram obtidas; assim, alíquotas destas amostras foram congeladas a -74°C até que pudessem ser processadas. Para inoculação destas amostras, passou-se a adicionar 250µL do material a 750µL de meio de cultura e então a filtrar este inóculo em filtro com porosidade de 0,45 µm, diretamente na garrafa da cultura celular, não mais utilizando os antimicrobianos, pois estes exerceram efeitos tóxicos sobre as culturas celulares. Estas garrafas permaneceram sob incubação por 10 dias, prazo mais adequado a evolução dos possíveis efeitos citopáticos.
Observando-se ou não efeitos citopáticos, após este tempo de incubação as garrafas inoculadas eram submetidas a congelação e descongelação por três vezes. Uma alíquota deste material era utilizada para a inoculação em uma segunda cultura celular, efetuando-se assim uma “passagem cega”.
4.7.4.2 Prova de hemaglutinação
4.7.4.3 Extração do RNA das amostras
Para a extração do RNA viral das amostras foi utilizado o seguinte protocolo:
i) adiciona-se 250 µL do lavado traqueopulmonar, do macerado de
pulmão, ou das culturas submetidas a congelação e descongelação por três vezes, a 750 µL de TRIZOL, e deixa-se esta solução em temperatura ambiente por, no mínimo, 10 minutos;
ii) acrescenta-se 200 µL de clorofórmio a cada amostra, homogeiniza-se,
e deixa-se em temperatura ambiente por mais 10 minutos;
iii) centrifuga-se a 4°C, a 12.000 x g, por 15 minutos; em seguida, é
retirado o sobrenadante, de aproximadamente 450 µL, onde estará o RNA, o qual é colocado em microtubos apoiados em gelo picado;
iv) a este sobrenadante são acrescentados 10 µg de glicogênio livre de RNAse e 500 µL de isopropanol, homogeniniza-se e deixa-se em temperatura ambiente por 15 minutos;
v) centrifuga-se nas mesmas condições anteriores e aspira-se a vácuo o
sobrenadante para que permaneça apenas o pellet de RNA no fundo do microtubo;
vi) este pellet será lavado pela adição de 1 mL de etanol a 75% em água
tratada com 0,1% de dietil pirocarbonato (DEPC) e centrifugação a 4°C, a 7.500 x g, por 5 minutos;
vii) aspira-se o sobrenadante, e deixa-se que o pellet seque à temperatura
ambiente por 10 minutos;
viii) ressuspende-se o pellet em 50 µL da água tratada com DEPC
contendo 0,1 U/µL de inibidor de RNAse e coloca-se esta suspensão em banho-maria a 56°C por 10 minutos para completa dissolução do RNA.
4.7.4.4 Obtenção do cDNA
Para obtenção do cDNA foi utilizada a enzima Superscript RT II (Gibco, BRL), conforme protocolo recomendado pelo fabricante, e como iniciador da reação de transcrição reversa foi utilizado o random
primer (hexâmeros ao acaso).
4.7.4.5 PCR e nested PCR
Para a realização do PCR e do nested PCR foi utilizada a metodologia proposta por Ahne et al. (1999), com algumas modificações. Utilizaram-se quatro primers (FDLV PCR sense: 5’-GCA GAG ATT TTC TCT TTC TT-3’; FDLV PCR antisense: 5’-AGC TCT CAT TTT GTA TGT CAT-3’; FDLV nested sense: 5’-TGA AGG CTG TTA CTG CTG C-3’ e FDLV nested antisense: 5’-CAT CTT GGC AAA TAA TCT GCC-3’) capazes de amplificar fragmentos de 627 (PCR) e 566 (nested) pares de bases (bp), do gene L (posições 9618 – 10244 e 9661 – 10226, respectivamente, de acordo com a seqüência da estirpe Sendai-Z, Genebank M30202).
Para amplificação do cDNA e do produto do PCR foram realizadas duas reações. Na primeira, utilizaram-se os oligonucleotídeos FDLV PCR antisense, FDLV PCR sense e o cDNA obtido a partir do RNA extraído das amostras e, na segunda, os oligonucleotídeos internos FDLV
nested antisense, FDLV nested sense e o produto da primeira reação.
Ambas foram realizadas em um volume final de 25 µL, contendo: 1,5 U de
Taq DNA Polimerase (Biotools), 75 mmol/L Tris HCl (pH 9,0), 2 mmol/L
MgCl2, 50 mmol/L KCl, 20 mmol/L (NH4)SO4, 5 ρmol de cada primer, 0,25
µL de dNTPs (20 mmol/L), 5 µL (PCR) ou 1 µL (nested PCR) da amostra
A amplificação foi realizada em termociclador automático (MJResearch). Numa etapa inicial, as amostras foram incubadas a 94ºC por 3 minutos para as desnaturações, seguindo-se 35 ciclos de 94ºC por 1 minuto para desnaturação da fita de DNA, 52ºC por 1 minuto para hibridação dos primers – sendo que, a cada ciclo, esta temperatura caia em 1ºC, chegando a 44ºC no nono ciclo, e permanecendo assim até o final -, e 72ºC por 1 minuto e 30 segundos, para extensão das fitas. Ao final, realizou-se uma incubação a 72ºC por 4 minutos, para garantir a presença dos DNAs amplificados em fitas duplas.
Os produtos obtidos na amplificação pela técnica de nested PCR foram analisados em gel de agarose a 1,5%, corado com brometo de etídio (0,5 µg/mL) e examinados comparativamente com marcadores de peso molecular de 123 bp (Gibco-BRL), com auxílio de transiluminador UV, sendo considerados positivos aqueles com peso molecular aproximado de 627 bp para o PCR e 566 bp para o nested PCR.
4.7.5 Pesquisa de Mycoplasma
4.7.5.1 Isolamento
A pesquisa de Mycoplasma nas alíquotas do lavado e do macerado de traquéia e de pulmão congelados a -74°C foi realizada utilizando-se o meio de cultura SP4, líquido e sólido (Tully et al., 1979) suplementado com glicose.
