Diferentes parâmetros de produção de goma xantana pela fermentação de Xanthomonas campestris pv campestris

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Oliveira, Kassandra Sussi Mustafe.

Diferentes parâmetros de produção e extração de goma xantana pela fermentação de Xanthomonas campestris pv campestris / Kassandra Sussi Mustafe Oliveira. - Rio Claro : [s.n.], 2009

80 f. : il., figs., gráfs., tabs.

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual Paulista, Instituto de Biociências de Rio Claro

Orientador: Pedro de Oliva Neto

1. Microorganismos. 2. Batelada simples. 3. Batelada alimentada. 4. Temperatura. 5. Fermentador. 6. Agitador orbital. I. Título.

576 O48d

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KASSANDRA SUSSI MUSTAFÉ OLIVEIRA

DIFERENTES PARÂMETROS DE PRODUÇÃO E EXTRAÇÃO DE GOMA XANTANA PELA FERMENTAÇÃO DE

Xanthomonas campestris pv campestris

Comissão Examinadora

Professor Dr. Pedro de Oliva Neto Professor Dr. Jonas Contiero Professor Dr. Ranulfo Monte Alegre

Rio Claro, 01 de outubro de 2009

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Agradecimentos

Ao me propor a esse desafio acreditava que no final eu mereceria todos os méritos. No entanto devo ter em mim agora mais gratidão do que o número de células que cultivei em 5 anos no Laboratório de Biotecnologia Industrial!! São muitos aqueles que tenho que agradecer e espero conseguir transmitir meu agradecimento através de palavras.

Agradeço à mamãe. Sua força me surpreende dia após dia e me inspira a ter mais garra, a ser mais forte, a recomeçar, a me superar novamente. Agradeço ao papai. Por acreditar em mim. Também por ter me incentivado tanto a tentar entrar na pós em Microbiologia. Esse estímulo foi imprescindível, pois não imaginava que seria capaz.

Obrigada Kamylle, por ser tão madura. Me dando colo ou bronca sempre que necessário. Obrigada Leonardo, meu pequeno “brother”. Amo vocês e quero o melhor do mundo pra vocês! A força que surge em mim aparece quando penso no futuro da nossa família! Que são vocês!! Já disse e repito: vocês dois são o motivo e fim da minha vida.

À família: meus avós, primos e primas, tios e tias, espalhados por Iturama, Uberaba, Goiânia, Brasília, Guaraí e Uberlândia...

Ao professor Pedro de Oliva Neto. Chefe compreensivo, que acreditou em mim (de novo) e compartilhou comigo (de novo) seu tempo e atenção.

À professora Valéria, por estar sempre receptiva aos alunos do LABI para orientações, correções, ajuda. Muito obrigada! Você me tornou melhor.

Aos professores Jonas Contiero e Denis Cantu Lozano, que me ouviram enquanto aprendia a trabalhar com nosso novo bebê: o fermentador. Vocês merecem os louros desse trabalho, pois me deram suporte para técnicas e força para refazer quando tudo dava errado! Também à professora Sandra que me orientou nos trâmites da pós e me ajudou por estar longe do Campus de Rio Claro.

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Sou mesmo uma pessoa de muita sorte! No Programa conheci pessoas especialíssimas, que me acrescentaram muito em força, otimismo e coragem. Agradeço de coração ao Paulo Lopes, o Chal, que foi até em minha formatura, mas só conheci durante as disciplinas; ao Adriano Uemura, conterrâneo querido que encontrei em Rio Claro, tenho profunda admiração por você; à Kate, doçura personificada, linda, gentil e companheira de compras de cosméticos (a-do-ro!); à Juliana Possato, dedicação e garra puras; ao Fabrício Peão, experiência em pessoa, quebrou o gelo de uma “bixete” no Departamento; ao André Rodrigues, um exemplo, com certeza não há para ele outro caminho senão o sucesso; à Mari Messeti, pelas dicas de uma pessoa experiente, quando eu estava chegando no Programa; à Ariane Bertoletti, também um exemplo; à Roberta Barros Lovaglio , por ouvir e tranqulizar meus choramingos de pavor perante as fases do mestrado que vão passando; ao Alex, companheiro de congresso; ao Paulo Ávila, dedicado e focado, aprendi muito com você; à Paula Sanchez (divertidíssima!); à Sueli, por compartilhar comigo seu tempo e conhecimento em FTIR; à Maira Pereira “Descolada” pelas risadas!! Também a todos os colegas com quem pude dividir experiências de laboratório, de trabalho ou de vida durante todo esse tempo no Programa e também no Simpósio de Micro. Tenho orgulho de fazer parte desse grupo!

À Léia. Nossas diferenças também me fizeram melhor! Agradeço demais a ajuda em experimentos, a carga extra de ânimo quando me faltava, a animação pra fazer “eventos” de confraternização do LABI e os puxões de orelha que tornavam o ambiente do Laboratório tão... (huauhuaha) ... leve (huauhauuha)!!!

Aos dinossauros como eu que me deixam, depois de 6 anos de sertão, mais à vontade e mais saudosa: Ana Carolina Arruda, Fábio Gava, Fernanda Moya, Grazi, Gustavo Loretto, Luiz Francisco, Michelle Coimbra, Milena Nakagawa, Nemailla Bonturi, Raphael José Veroneze, Renato Calabria, Tamaya Castro, Thiago Okubo, Willian Seiti.

Às super-mega-power-ultimate-18 kilates-Xanthomônicas!!! Cintia (eterna superiora, otimista, divertida, alto astral, super incentivadora, amiga pra vida inteira) e Lays (que veio renovar o sangue do grupo com sua “doçura” e “delicadeza” particulares.. ah, análises de açúcares é uma terapia para ela!! Artigos de reologia de 15 páginas em inglês então!! ... ).

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aos companheiros da divertida viagem semanal Assis-Rio Claro: Pablo e Camila. Estou sabendo um pouco mais de massives, História da Argentina, gatos e culinária graças a vocês!

Também aos funcionários da UNESP que sempre estavam dispostos a me atender quando necessário. Muitas vezes me socorreram, muitas vezes me ouviram falar e falar da xantana... Ivan, Sivaldo, Fernando, Pedrinho e tantos outros!

Àquelas que foram ou são companheiras de república. Muito obrigada Alejandra, Ana, Agnes, Nathalia, Tici, Renata, Gabi M. e Gabi A., Polly, Thais, Aline e Carol fofuuura. Minhas fontes de risos, de histórias hilárias e também ombros amigos.

Agradeço especialmente a Eduardo Marcos Balciunas que “morfou” de colega de laboratório para um confidente e, então, para um companheiro. Obrigada por compatilhar comigo a paixão pela micro, obrigada por me ensinar muito, obrigada por me ouvir, por me tornar especial.

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“A muitas cidades do Egito peregrina Para aprender, para aprender dos doutos, Tem todo o tempo Ítaca na mente

Estás predestinado a ali chegar”

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RESUMO

A goma xantana é um biopolímero produzido por Xanthomonas campestris muito utilizado como agente espessante. A síntese do biopolímero pode ocorrer em variadas condições, no entanto a qualidade a goma produzida também muda. Alguns trabalhos sugerem que a produção de goma xantana por batelada alimentada pode resultar num desempenho melhor em concentração de goma, rendimento e produtividade quando comparado à batelada simples. Nesse trabalho foram avaliados a influência de diferentes metodologias de oferta de sacarose na produção de goma xantana e sua qualidade, e também a produtividade e rendimento do processo. As melhores metodologias foram testadas em bioreator de 7,5L. Também foram avaliadas diferentes metodologias de separação do biopolímero (com o acréscimo de sais ao caldo ou ao etanol na etapa de extração da goma), bem como a influência de surfactantes e sais na viscosidade da goma em solução. Em incubadora com agitação orbital a quantidade e qualidade de goma xantana produzida a 25°C foram mais interessantes. Em fermentador, a produção de xantana a 30°C em meio contendo 2% de sacarose pode ter seu tempo reduzido sem que isso afete a concentração e a viscosidade da goma obtida. A viscosidade do biopolímero produzido a 25°C em meio contendo 4% de sacarose foi superior (365,9 cP) quando comparado ao biopolímero produzido a 30°C, em meio contendo 2% de sacarose. A produtividade e concentração de goma obtidos estão entre os encontrados na literatura (0,34 g xantana L-1h-1e 24 g xantana L-1). O uso de sais na extração da goma permite a redução do solvente utilizado e uma goma de melhor qualidade. Destacaram-se a utilização dos sais NaCl na concentração de 0,01% e CaCl2a 0,05%. O tratamento térmico aumenta a quantidade e a viscosidade do biopolímero além de eliminar as células. A adição de 0,01% de SDS e de 0,001% de Tween 80 na solução de goma xantana aumenta sua viscosidade.

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ABSTRACT

Xanthan gum is a biopolymer produced by Xanthomonas campestris, used as a thickener. Its synthesis can happen in different conditions, but quality of xanthan produced also changes. Studies suggest that fed batch xanthan gum production can result in better performance in gum concentration, yield and productivity, when compared to batch. This work evaluates the influence of different methods of sucrose supply on xanthan gum quantity and quality, as well its productivity and process efficiency. The best methods were tested in a bioreactor of 7.5 L. Were also evaluated different separation methods (with the addition of salt in broth or ethanol during the separation phase) and the influence of surfactants on viscosity on xanthan solution. In shaker incubator, the gum produced at 25°C was more interesting. In bioreactor, the xanthan production at 30°C using 2% sucrose can be reduced to 40 hours, without affecting concentration and viscosity of the gum obtained. The viscosity of the biopolymer produced at 25°C using 4% sucrose were higher (365.9 cP) when compared to biopolymer produced at 30°C with 2% sucrose. Concentration and yield are similar than those found in the literature (0.34 g xanthan L-1 h-1 and 24 g xanthan L-1). The use of salts in xanthan extraction reduces the input and a better quality gum. The salts NaCl (concentration of 0.01%) and CaCl2 (0.05%) showed best results. Heat treatment increases the xanthan quantity and viscosity and eliminates cells from broth. The addition of 0.01% SDS and 0.001% Tween 80 in the solution of xanthan gum increases its viscosity. sssssssssssssssssssssssssssssssssssssssssss

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LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1. Figura 1: Eletromicrografia de transmissão de Xanthomonas campestris(x 12000) (GARCIA-OCHOA, et al. 2000)... 18 Figura 2. Figura 2: Estrutura primária da unidade do polímero extracelular goma

xantana. (GARCIA-OCHOA, et al. 2000)... 20 Figura 3. Figura 3: Conformação em hélice da goma xantana vista perpendicular (à

esquerda) e paralelamente (à direita) ao eixo da hélice. (MOORHOUSE,

WALKINSHAW, ARNOTT, 1977)... 21 Figura 4. Figura 4: Via metabólica de síntese de xantana e metabolismo da glicose em

Xanthomonas campestris NRRL-1459. (CHIA-HUA e LO, 2003) ... 23 Figura 5. Figura 5: Fluxograma das etapas de produção e separação da goma xantana.

(Adaptado de GARCIA-OCHOA, et al., 2000)... 27 Figura 6. Figura 6: Esboço do processo de produção de xantana. (URLACHER e

NOBLE, 1999) ... 28 Figura 7. Figura 7: Representação esquemática do efeito do cisalhamento na rede do

polímero goma xantana. (Adaptado de KI-WON, YONG-SEOK e

GAP-SHIK, 2006) ... 39 Figura 8. Figura 8: Esquema do fermentador TECBIO – TECNAL, suas dimensões e

foto do agitador tipo turbina de Rushton... 42 Figura 9. Figura 9: pH em função do tempo de produção de goma xantana a 25°C... 48 Figura 10. Figura 10: pH em função do tempo de produção de goma a 30°C... 49 Figura 11. Figura 11: Média da viscosidade da solução 1% de goma xantana em função

do protocolo de adição de sacarose... 52 Figura 12. Figura 12: Produção de goma xantana por batelada simples a 25°C em meio

contendo 4% de sacarose... 55 Figura 13. Figura 13: Viscosidade do caldo e da goma xantana produzidos em batelada

simples a 25°C em meio contendo 4% de sacarose... 56 Figura 14. Figura 14: Produtividade (g xantana L-1ǜh-1) na produção de goma xantana

em batelada simples a 25°C em meio contendo 4% de sacarose... 57 Figura 15. Figura 15: Produção de goma xantana por batelada simples a 30°C em meio

contendo 2% de sacarose... 59 Figura 16. Figura 16: Viscosidade do caldo e da goma xantana produzidos por batelada

simples a 30°C em meio contendo 2% de sacarose... 60 Figura 17. Figura 17: Produtividade (g L-1ǜh-1) na produção de goma xantana por

batelada simples a 30°C em meio contendo 2% de sacarose... 61 Figura 18. Figura: 18: Viscosidade da goma xantana extraída com a adição de sais ao

etanol... 63 Figura 19. Figura 19: Quantidade e viscosidade de goma xantana extraída em função

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LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Tabela 1: Estratégias de alimentação de sacarose durante a fase de produção de goma xantana... 41 Tabela 2. Tabela 2: Biomassa seca do tempo 72h de produção em função do

tratamento de adição de sacarose e em diferentes temperaturas... 50 Tabela 3. Tabela 3: Goma xantana do tempo 72h de produção em função do

tratamento de adição de sacarose e em diferentes temperaturas... 51 Tabela 4. Tabela 4: Rendimento de goma xantana em função do tratamento de adição

de sacarose e em diferentes temperaturas... 53 Tabela 5. Tabela 5: Concentração da goma xantana extraída com adição de sais ao

etanol... 62 Tabela 6. Tabela 6: Concentração da goma xantana extraída com adição de sais no

caldo fermentativo... 64 Tabela 7. Tabela 7: Viscosidade da goma xantana extraída com a adição de sais no

caldo... 64 Tabela 8. Tabela 8: Viscosidade em função da adição de sais ou surfactantes à solução

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SUMÁRIO

Página

1. INTRODUÇÃO... 13

2. REVISÃO... 16

2.1. Biopolímeros... 16

2.2. Histórico... 17

2.3. Caracterização de Xanthomonas campestris... 17

2.4. Goma Xantana... 19

2.4.1. Estrutura... 19

2.4.2. Biosíntese... 22

2.4.3. Propriedades, Aplicações e Mercado... 24

2.4.4. Produção do biopolímero... 26

2.4.4.1. Matéria prima e aspectos nutricionais... 26

2.4.4.2. Condições de produção... 28

2.4.5. Extração do biopolímero... 33

2.4.6. Influência dos eletrólitos na viscosidade da goma xantana... 36

2.4.7. Reologia... 37

3. MATERIAIS E MÉTODOS... 40

3.1. Estudo comparativo da produção de goma xantana por batelada simples e batelada alimentada com dois pulsos de sacarose em incubadora com agitação orbital... 40

3.2. Estudo comparativo da produção de goma xantana por batelada simples e batelada alimentada com dois pulsos de sacarose em fermentador de 7,5 litros (escala piloto) ... 41

3.3. Estudo da extração de goma xantana... 43

3.3.1. Efeito do acréscimo de sais no etanol ou caldo para extração de xantana. 43 3.3.2. Estudo da concentração e viscosidade da goma em função do tratamento térmico do caldo... 44

3.4. Estudo da adição de sais ou surfactantes na ressuspensão da goma... 44

3.5. Procedimentos analíticos... 44

3.6. Análises estatísticas... 45

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO... 47

4.1. Estudo em agitador orbital da produção de goma xantana por batelada simples e batelada alimentada com dois pulsos de sacarose... 47

4.2. Estudo da produção de goma xantana por batelada simples em fermentador de 7,5 litros (escala piloto de bancada)... 53

4.3. Estudo da extração de goma xantana... 62

4.3.1. Efeito do acréscimo de sais ao etanol utilizado para extração da goma xantana... 62

4.3.2. Efeito da adição de sais no caldo fermentativo na extração da goma xantana 62 4.3.3. Efeito do tratamento térmico do caldo fermentativo na extração de goma xantana... 65

4.4. Efeito da adição de sais ou surfactantes na solução aquosa de goma xantana a 1% ... 66

5. CONCLUSÕES... 67

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