Daiane Müller de Bem
Análise Histológica em Tecido Epitelial Sadio de
Ratos Wistar (in vivo) Irradiados com Diferentes
Intensidades do Ultra-Som.
Dissertação de Mestrado Apresentada ao Pro-grama de Pós-Graduação Interunidades Bioen-genharia - Escola de EnBioen-genharia de São Carlos/ Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto / Inti-tuto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo, como parte dos requisitos para a obtenção do título de mestre em Bioengenharia.
Orientador:
Prof. Dr. Nivaldo Antonio Parizotto
São Carlos
AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Ficha catalográfica preparada pela Seção de Tratamento da Informação do Serviço de Biblioteca – EESC/USP
Bem, Daiane Müller de
B455a Análise histológica em tecido epitelial sadio de ratos wistar (in vivo) irradiados com diferentes intensidades do ultra-som / Daiane Müller de Bem ; orientador Nivaldo Antonio Pariozotto. –- São Carlos, 2008.
Dissertação (Mestrado-Programa de Pós-Graduação e Área de Concentração : Bioengenharia) –- Escola de Engenharia de São Carlos/Faculdade de Medicina de Ribeirão
Preto/Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo, 2008.
Programa de Pós-Graduação Interunidades em Bioengenharia
.
EESe / FMRP / loseDAIANE MULLER DE BEM
MESTRADO EM BIOENGENHARIA
DISSERTAÇÃO APRESENTADA AO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO INTERUNIDADES BIOENGENHARIA EESC/FMRPIIOSC DA UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO PARA OBTENÇÃO DO TITULO DE MESTRE .
.
ｏｾﾷ＠
PROF. DR. ORIVALDO LOPES A SILVA
Programa de Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia/USP
AI'. Trabalhador São-carlense, 400 -Centro -São Carlos -SP -13566-590
Dedicatória
Agradecimentos
Gostaria de escrever aqui minha gratidão a todos que contribuíram, direta ou
indireta-mente, para elaboração deste trabalho: Em primeiro lugar ao grande mestre Deus que
consegui toda força para vencer todos os obstáculos; Aos meus pais pela força,
confi-ança, por tudo amo voces. Ao Prof Nivaldo Antonio Parizotto, nao tenho palavras para
agradecê-lo, pela disponibilidade que apresentou. O seu apoio profissional e
disponibili-dade que demonstrou foi de uma grande valia para a realização deste trabalho. À equipe
do laboratório de Nutrição e Metabolismo Aplicado ao Exercício da Universidade
Fede-ral de são carlos, pela atenção, ensinamentos (demosntração das técnicas necessárias),
total disponibilidade, em fim palavras nao traduzem todo empenho. Ao professor Luiz
Carlos Lopes (Cacau) da fisiologia, foi uma super ajuda no dia da retirada dos tecidos.
Aos profissionais José Antonio Sampaio Zuanon (cortes histológicos) e Carlos Benatti
Neto laboratório (análise patológica) do Laboratório de Odontologia da Universidade
Es-tadual de São Paulo (UNESP) em Araraquara. Ao Prof Orivaldo Lopes da Silva por
indicá-los. Ao Roberto do biotério da Universaidade Federal de São Carlos, pela atenção
e dedicação. À firma da BIOSET pelo empréstimo do aparelho de ultra-som, obrigada
pela confiança. Ao professor Dr. Jose Marcus pela Balança do Ultra-som. Aos técnicos
do laboratório da Hidrobiologia, Claudinei e Amabili, pela disponibilidade de mostrar o
processo para corar a lâminas. À Professora Marisa Narciso Fernandes do Laboratório
de Zoofisiologia e Bioquímoca Comparativa - (LZBC) por ter liberado o aparelho
micró-tomo digital para eu realizar os cortes e ao aluno Marcelo que passou as técnicas. Teve
um nome que gastou de tantas vezes que precisei chamar, era mais ou menos assim: O
aqui nestes agradecimentos eu digo; o Vinão valeu por tudo e vamos la na sorveteria bêju
comemorar!!! À Eugênia amiga (maravishosa, hermosa) sempre disposta e preocupada
me amparando nos momentos difíceis, dicas técnicas maravilhosas, ficarei para sempre
grata de coração. Para minha amiga Luciana Montanari (Luzão) que também nunca mediu
esforços, apelidei como solução para seus problemas, foram caronas mil, para busacas de
serragens, transporte de materiais e aparelhos, pelos desenhos, sem contar a aula
particu-lar de integral, isso tudo ela diz que é "bico". Quero agradecer a Regina Rios pelo carinho,
atenção e amizade que não mediu esforços para estar aqui.., valeu Re, suas dicas fizeram
Lista de Figuras
2.1 Mudança na Pressão pelo Tempo na Propagação da onda . . . 14
2.2 Representação do Efeito Piezoelétrico . . . 15
2.3 Comportamento do Campo Acústico . . . 16
2.4 Tecido Epitelial . . . 19
3.1 Amostras sem lesões do tecido . . . 21
3.2 Amostras apresentando lesões . . . 21
3.3 Dosímetro de Precisão . . . 22
3.4 Aferição das diferentes intensidades . . . 23
3.5 Cuba Anestésica e Guilhotina . . . 24
3.6 Quadro mostrando a seqüência metodológica utilizada. . . 25
3.7 Animal sendo Anestesiado na Cuba. . . 26
3.8 Processo de adaptação do animal com o transdutor . . . 27
3.9 Região dorsal após a realização da tricotomia e local da área tratada . . . 27
3.10 Retirada do Tecido . . . 28
3.11 Barra do programa image tool . . . 29
4.1 Imagens dos cortes histológicos referentes a todos os grupos (I, II, III, IV e V) com aumento de 200x . . . 31
Sumário
Resumo
Abstract
1 Introdução 10
1.1 Objetivos . . . 12
2 Revisão de Literatura 13 2.1 Ultra-Som . . . 13
2.2 Piezoeletricidade . . . 15
2.3 Campo Acústico do Ultra-Som . . . 16
2.4 Potência Acústica e Intensidade Acústica. . . 17
2.5 Atenuação do Feixe Ultrassônico no Tecido . . . 18
2.6 O Tegumento . . . 18
3 Materiais e Métodos 20 3.1 Estudo Pilotoin vitro . . . 20
3.2 Materiais . . . 22
3.2.1 Animais de Experimentação . . . 22
3.2.2 Balança e Ultra-Som . . . 22
3.2.3 Cuba Anestésica e Guilhotina . . . 23
3.3 Métodos . . . 24
3.3.1 Grupos Experimentais . . . 24
3.3.3 Análise das Imagens . . . 28
4 Resultados e Discussão 30 4.1 Resultados Qualitativos e Quantitativos . . . 30
4.1.1 Resultados Qualitativos . . . 30
4.1.2 Resultados Quantitativos . . . 32
4.2 Discussão . . . 32
5 Conclusão 36 Referências Bibliográficas 37 6 Apêndice 40 6.1 Apêndice (A) . . . 40
6.2 Apêndice(B) . . . 41
Resumo
DE BEM, D.M. Análise Histológica em Tecido Epitelial Sadio de Ratos Wistar(in vivo) Irradia-dos com Diferentes Intensidades do Ultra-Som. (2008) 43p. Dissertação (Mestrado) - Programa de Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia - Escola de Engenharia de São Carlos - Facul-dade de Medicina de Ribeirão Preto - Instituto de Química de São Carlos da UniversiFacul-dade de São Paulo.
A energia ultra-sônica é um dos recursos físicos amplamente utilizado e pesquisado nos trata-mentos de fisioterapia e diagnósticos médicos. Sabe-se que diante de uma escassa literatura dos efeitos do ultra-som em tecidos sadios, muitos profissionais fisioterapeutas acabam realizando aplicações infundadas de métodos e parâmetros. O objetivo desta pesquisa foi avaliar possíveis alterações do tecido sadio in vivo de ratos Wistar irradiados com diferentes intensidades, anal-isando a histologia e morfometria. Foram utilizados 30 ratos da linhagem Wistar, distribuídos aleatoriamente em 5 grupos de 6 animais cada. Foi escolhida a região dorsal do lado direito para tratamento com área de 4 cm2. O lado esquerdo serviu como controle em todos os grupos. O tratamento foi feito durante 4 dias com 2 minutos de irradiação. Para verificar a intensidade de saída, utilizou-se o dosímetro de precisão antes da aplicação do ultra-som em cada animal. Foi realizada uma análise histológica descritiva e morfometria por meio do software Image Tool. Como resultado pode-se observar um discreto infiltrado inflamatório e adelgaçamento das fibras da derme, principalmente dos grupos irradiados com 1.5 e 2 W/cm2. Notou-se também um
au-mento na espessura da epiderme nas amostras dos animais irradiados quando comparado com o controle. Para avaliar os resultados quantitativos, utilizou-se como análise estatística ANOVA "one way"e o teste "pos hoc"de Tukey com nível de significância p < 0,01. Em 120 medidas da espessura da epiderme obtiveram-se diferenças significativas do grupo controle com os grupos irradiados com (1.0, 1.5 e 2.0 W/cm2). Concluímos diante dos resultados que houve alterações no tecido sob ação do US nas doses maiores, o que nos alerta para possíveis implicações do uso do US em estética.
Abstract
DE BEM, D.M. Histological analyses in healthy epithelium tissue irradiated with different ul-trasound intensities in Wistar rats in vivo. (2008) 43p. Dissertation (Master) - Programa de Pós-Graduação Interunidades Bioengenharia - Escola de Engenharia de São Carlos - Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - Instituto de Química de São Carlos da Universidade de São Paulo.
The ultrasound (US) energy is one of the resources widely used and researched in both physio-therapist treatment and in medical diagnosis. In front of a scarce literature about the US effects in healthy tissues, many professionals have carried out unfounded applications of methods and parameters. So, the aim of this research was evaluate, through the histology, possible alter-ations in healthy tissues of Wistar rats in vivo irradiated with different intensity, analyzing the qualitative and quantitative histological slides. We used 30 Wistar rats randomly distributed in 5 groups of 6 animals each. The local chosen for receiving the treatment was the dorsal right side, whose area was 4 cm2. The left side was used as control of the animal itself for all the groups. The rats underwent the treatment during 4 days exposed to 2 minutes of irradiation. In order to check the energy output, the precision dosimeter was used before US application in each animal. The histological slides were evaluated qualitatively in the microscope and quanti-tatively through the Image Tool software. The qualitative result shows a discrete inflammatory process with infiltration and atrophy dermis fibers, mainly in the groups with higher US dosage. In the quantitative aspect, we found epidermis thickness increased in the 1.5 and 2 W/cm2of US, with statistical difference (ANOVA) compared to control. We conclude that US therapy can be dangerous with high dosage applied in the intact skin as applied in esthetics.
1
Introdução
As primeiras pesquisas sobre energia ultra-sônica de baixa intensidade tiveram início com o Professor Luiz Romariz Duarte juntamente com sua equipe da Escola de Engenharia de São Carlos/USP. Os resultados mostraram primeiramente grande eficácia quando aplicado em falhas ósseas, nas peseudoartrose. Verificaram também, que o ultra-som de baixa intensidade acele-rava a formação de osso primário e reparo de fraturas ósseas. Segundo Duarte (1997), relata que o rápido processo de consolidação das fraturas atribui-se principalmnete ao mecanismo piezoelétrico. Os estudos aumentaram cada vez mais e hoje pode-se observar que a energia do ultra-som é um dos recursos físicos amplamente utilizado e pesquisado nos tratamentos de fisioterapia, na estética e diagnósticos médicos (ABNT, 1998);(DYSON, 1987). Afim de com-provar isso, Lindsay (1995), relata em uma pesquisa realizada nas clínicas do Canadá que 94% dos profissionais fisioterapeutas utilizam o ultra-som. Sabe-se que há uma vasta literatura com resultados concisos dos benefícios do ultra-som de baixa intensidade em acelerar a regeneração de tecidos lesados, estimulando a atividade de síntese das estruturas que compõem a matriz extracelular (proteoglicanas, fibras de colágeno tipo I, II e III). Um trabalho analisando esti-mulação do ulta-som em células que produzem colágeno tipo I e II com diferentes intensidade (0, 0.1, 0.5 e 1.0 W/cm2), comprovou um aumento significativo na síntese das mesmas quando comparadas com o grupo controle, demosnstrando também, que de todas as intensidades uti-lizadas a que apresentou maior síntese foi no grupo estimulado com 1.0 W/cm2 (TSAI et al., 2006).
Em Iwashina (2006), também obteve resultados significativos na produção de proteogli-canas nas células do disco intervertebral, quando comparado ao grupo controle. Os autores usaram ultra-som irradiando diferentes intensidades de média espacial e temporal (0, 7.5, 15, 30, 60, 120 mW/cm2), apresentando uma maior síntese nos grupos irradiados com (7.5 e 15
mW/cm2). Um estudo semelhante foi demonstrou o aumento do conteúdo das proteoglicanas e da síntese de colágeno do disco intervertebral em bovinos (MIYAMOTO et al., 2005).
quali-11
dade do tecido cicatrizado (FERREIRA; MENDONÇA, 2007).
Por outro lado, há uma escassa literatura referindo-se sobre os efeitos do ultra-som em teci-dos sadios, condição básica teci-dos tratamentos estéticos (DYSON; DOUGLAS, 1986). Diante deste fator, muitos profissionais fisioterapeutas acabam seguindo métodos infundados para os ajustes da intensidade e duração do tratamento. Essa exposição em alguns casos pode promover danos aos tecidos biolólgicos. Além disso, sabe-se que ainda não conseguiram esclarecer exa-tamente os mecanismos de ação e uma definição para seus parâmetros (HAAR, 2006). Isto pode ser devido a vários fatores que estão envolvidos; grande número de variáveis, a intensi-dade irradiada, o tempo de exposição, calibragem do aparelho e o estado fisiológico da amostra (ARMEN, 1983);(LEIGHTON, 2007). A complexidade do seu campo próximo ser bastante irregular, com presença de picos espaciais e temporais pode ser outro fator. Conforme Valen-tini(2006), estudou a importância da conformidade dos equipamentos de ultra-som terapêutico com a NBR-IEC 1689, obtendo alguns relatos de que os aparelhos de ultra-som no Brasil e no mundo não atendem totalmente as especificações dos parâmetros pedidos pela norma NBR-IEC 1689.
Não obstante, das insuficientes comprovações científicas em estética, um estudo avaliando o risco potencial da utilização do ultra-som vem somar negativamente, diante de uma pesquisa realizada por Gonçalves, 2005 (GONÇALVES et al., 2005) em que utilizou ultra-som com intensidade 1.0W/cm2, freqüência 3 MHz, afim de avaliar o risco potencial da utilização do ultra-som em terapias dermatológicas e estéticas, como também, suas implcações no sistema cardiovascular. Os autores conseguiram mostrar que alterou os parâmetros hemodinâmicos, os níveis de lipídios e glicose séricos. Conforme Yamamoto (2002) um possível fator para a pre-sença de riscos cardiovasculares poderia ser o fato da célula adiposa sintetizar angiotensina II, e no momento da lipólise ocasionada pelo ultra-som esta substância seria liberada na circulação, podendo causar aumento na pressão arterial. Diante destas hipóteses torna-se arriscado estas aplicações para os pacientes, antes de ter-se resultados mais precisos.
12
1.1 Objetivos
O objetivo deste estudo foi investigar a atuação do ultra-som com diferentes intensidades (0, 0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 W/cm2) em tecido sadio de ratas wistarin vitro e posteriormente avaliar
2
Revisão de Literatura
Neste capítulo estão descritos algumas características físicas do ultra-som, o comportamento de seu campo acústico e uma revisão geral sobre o tecido tegumentar, suas funções e camadas (epiderme e derme).
2.1 Ultra-Som
As ondas sonoras são de natureza mecânica que se propagam através de qualquer meio sólido, líquido ou gasoso. O som se propaga com uma freqüência audível, abaixo de 20KHz. A natureza da onda ultra-sônica difere apenas em suas vibrações mecânicas de alta freqüên-cia, acima de 20kHz, tornando-se não audível pelo ser humano. A energia é transmitida através das colisões moleculares do meio, envolvendo uma agitação molecular, alteração de pressão e consequentemente mudança na densidade, ocorrendo assim a propagação da onda (ZAGZEBSKI, 1996). A medida em que ocorre a propagação, as partículas do meio oscilam em torno da posição de equilíbrio, ocorrendo uma perturbação, mas não o deslocamento da matéria (HUMPHREY, 2007).
Devido às alterações de pressão, ocorre no meio regiões de alta concentração molecular, consideradas regiões de alta pressão (maior compressão) e regiões de baixa concentração mo-lecular (rarefação) (HEDRICK; HYKES; STARCHMAN, 2005). As vibrações mecânicas po-dem ser transmitidas principalmente na forma de onda longitudinal ou transversal. No tecido biológico, a forma de propagação predominante é a longitudinal, em que as partículas vibram paralelamente à direção de propagação da onda, enquanto na forma transversal ocorre um deslo-camento perpendicular à direção de propagação (LEIGHTON, 2007).
14
definido como o tempo que uma partícula realiza um ciclo de movimento oscilatório, na Fig.2.1. O comprimento de onda representado pelo símbolo (λ), consiste entre a distância de dois picos,
Figura 2.1: A figura mostra a mudança na pressão pelo tempo em presença da onda sonora, e o período representado como (T). Fonte (ZAGZEBSKI, J. A.Fhysics of Diagnostic Ultrasound. Chapter 1. Ed. Mosby. p.4, 1996.)
vales ou outros pontos corespondentes da onda (ZAGZEBSKI, 1996).
A freqüência (f) é o número de vezes que um ciclo é repetido em cada segundo ou o número de vezes que se repetem as zonas de compressão e rarefação por segundo. Um Hertz (Hz) corresponde a um ciclo por segundo. Geralmente as freqüências usadas na fisioterapia ficam em torno de 1 à 3 MHz. A velocidade de uma onda mecânica (c) que se propaga através do meio, depende tanto da energia inercial deste meio afim de armazenar energia cinética, como também da propriedade elástica para armazenar energia potencial. Quando uma onda sonora atravessa um meio fluido ou mesmo o tecido biológico, a energia potencial fica sujeita às compressões e rarefações periódicas dos pequenos elementos de volume do tecido. Desta forma, a velocidade da onda ultra-sônica não depende da freqüência, mas sim das constantes elásticas do tecido, em que tipo de material esta se propagando, da sua massa, força de atração entre as partículas e da densidade deste meio. Quanto maior esta força de atração entre as partículas, menor a velocidade de propagação (HALLIDAY; RESNICK; MERRILL, 1993). A velocidade de propagação da onda sonora em tecidos moles apresenta uma média de 1540 ms(ZAGZEBSKI, 1996).
15
compressibilidade, então (B) irá depender do material do meio.
2.2 Piezoeletricidade
Os cristais piezoelétricos deformam e vibram quando eletricamente estimulados, gerando pulsos sonoros de freqüência referida. O centro de freqüência produzido pelo transdutor é a freqüência ressonante do cristal, que dependerá da sua espessura (MIDDLETON; KURTZ; HERTZBERG, 2004). O efeito piezoelétrico foi descoberto por Pierre e Jacques Currie em 1888. Segundo eles, uma cerâmica piezoelétrica consegue atuar como fonte e receptor, ou seja, quando uma força é aplicada perpendicular à face do cristal, resulta em mudanças elétricas, que podem ser detectadas e amplificadas produzindo um sinal elétrico e ao contrário também, se uma corrente elétrica alternada for aplicada no cristal ele vibrará enviando oscilações mecânicas para o meio (ZAGZEBSKI, 1996), como mostra a Fig.2.2.
Figura 2.2: (a)A partir de um campo elétrico o cristal converte em deformação mecânica; (b)Aplicação de uma pressão ou força no cristal resulta em um campo elétrico.
16
2.3 Campo Acústico do Ultra-Som
O campo acústico de um disco piezoelétrico é considerado complexo, pois o feixe diverge rapidamente pela face do cristal e as regiões de compressão e rarefação a medida que a onda propaga pelas diferentes densidades do tecido biológico gerando um comportamento difícil de medir com exatidão. Na região perto do transdutor, considerada campo próximo (zona Fresnel) apresenta um feixe bem irregular, alterando a pressão acústica entre valores extremos de máxi-mos e mínimáxi-mos (zero), gerando picos de energia. À medida em que o feixe vai se afastando do transdutor, seu padrão vai ficando mais uniforme, o que denominamos de campo distante (zona Fraunhofer) (HEDRICK; HYKES; STARCHMAN, 2005), podemos ver na Fig.2.3.
Figura 2.3: A figura mostra o campo próximo bem irregular e a medida que se afasta do transdutor começa a ficar mais regular. Fonte (ZAGZEBSKI, J. A. Properties of Ultrasound Tranducers.Chapter 2. p.31, 1996)
17
2006), e a complexa composição heterogênea do tecido biológico, pois quando a onda entra em contato com o tecido biológico apresenta um comportamento não-linear difícil de medir.
2.4 Potência Acústica e Intensidade Acústica.
Potência é uma taxa de energia transmitida do transdutor para dentro do meio, ou a quanti-dade de energia gerada em um intervalo de tempo. No aparelho de ultra-som é a enegia total do feixe por unidade de tempo, representada pela medida (W).
P=
E
△t (2.1)
Onde: P=Potência E=Energia
△t=Variação no Tempo
Assim como a potência está relacionada com o tempo, a intensidade está com a área, ou seja, razão média por unidade de área, ou a energia que atravessa uma unidade de área em um certo tempo, representada por W/cm2(ZAGZEBSKI, 1996). Em relação a intensidade acústica, em termos de tecido biológico é preciso tomar cuidado, uma vez que, está associada com a área, pode-se danificar o tecido ao aplicar em área muito pequena.
I= P A (2.2) Em que: I=Intensidade P=Pressão A=Área
18
2.5 Atenuação do Feixe Ultrassônico no Tecido
A medida que a onda sonora se propaga no tecido atingindo camadas mais profundas e com diferentes densidades, acaba sofrendo algumas fontes que causam a atenuação da energia. Pode-se considerar como principais fontes de atenuação a reflexão, difração e espalhamento. Geralmente é expressada como sendo uma mudança na intensidade através do meio em que está propagando. Decibéis (dB) são usados para expressar as diferenças entre as intensidades do ultra-som, fornecendo a comparação de dois sinais, podendo ser para duas amplitudes ou duas intensidades. A metade da atenuação pode ser chamada de coeficiente de atenuação. A atenuação do feixe sonoro no tecido é representado em decibéis por centímetro (dB/cm) (ZAGZEBSKI, 1996).
A impedância acústica representada por (Z) e sua unidade expressa em rayls esta rela-cionada com a resistência ou dificuldade do meio a passagem do som. Corresponde ao produto da densidade do material pela velocidade do som no mesmo. Quando o feixe sonoro atravessa uma interface entre dois meios com a mesma impedância acústica, não há reflexão e a onda é toda transmitida ao segundo meio (ZAGZEBSKI, 1996).
2.6 O Tegumento
A pele constitui o revestimento completo externo do corpo. O sistema tegumentar é for-mado pela epiderme, derme e tecido subcutâneo ou hipoderme. A espessura da pele conforme (GUIRRO; GUIRRO., 2002), fica entre 0,5 à 4 mm e a derme atinge em média 2 mm de es-pessura. Sabe-se que as camadas da pele são avasculares, com isso, a única forma de nutrição é feita por difusão através dos leitos capilares da derme, que apresenta-se bem vascularizada. Este método é suficiente para as células mais próximas da derme, mas na medida em que as células se dividem e são empurradas para as camadas mais externas, vão ficando mais longe da fonte de alimento até que o citoplasma vai sendo gradualmente substituído por queratina e morrem, formando assim, a estrutura típica das camadas mais externas da epidereme, como a camada córnea (SPENCE, 1991). A camada córnea é a mais externa, constituída por células anucleadas e achatadas chamadas de corneócitos. A membrana dos corneócitos apresentam um revestimento de lipídios e uma resistência muito acentuada, oferecendo grande resistência a esta camada, que envolve todo o nosso corpo exteriormente (GARTNER; HIATT, 1998). A camada córnea apresenta uma espessura por volta de 15 µm e a sua dupla camada lipídica oferece uma baixa permiabilidade gerando proteção à pele (KARANDE; JAIN; MITRAGOTRI., 2005).
19
proteção, regulação da temperatura do corpo, excreção, sensação e produção da vitamina D. Devido a estas funções, a pele consegue desenvolver uma importante função na homeostase corporal, assegurando uma atividade normal das próprias células (SPENCE, 1991).
A função de proteção ocorre principalmente pelo processo de crescimento e diferenciação dos queratinócitos. Estes apresentam-se de 10-20 camadas e durante sua maturação podem ser distingüidos em quatro estágios conhecidos como; basal, granular, espinhosa e córnea (DUNITZ, 2001).
Na camada basal ocorre uma constante renovação celular, com intensa atividade mitótica. Estas células são empurradas para a camada espinhosa e lúcida, onde fabricam células ima-turas de queratina, apresentando de 4 a 6 camadas sobrepostas de queratinócitos, dando uma capacidade de resistência mecânica à epiderme. Na camada granular estas células sintetizam substâncias que asseguram a coesão ao estrato córeno.
A parte inferior da camada basal prende-se no início da derme. Esta é formada por duas camadas: papilar e reticular. A camada papilar é constituída por tecido conjuntivo frouxo e na reticular por tecido conjuntivo denso. Logo abaixo da derme apresenta-se a hipoderme ou tecido subcutâneo, formado pelo tecido adiposo lobular, com uma intensa vascularização e inervação (GARTNER; HIATT, 1998), Fig.2.4 mostra as camadas da epiderme.
3
Materiais e Métodos
Neste capítulo primeiramente será relatado um estudo piloto in vitro realizado em tecido de suínos que foi irradiados com diferentes intensidades do ultra-som. Posteriormente serão descritos os materiais e métodos utilizados no presente estudo.
3.1 Estudo Piloto
in vitro
Antes de dar início ao tratamento do presente trabalho, foi realizado um experimentoin vitro
com suínos avaliando 8 diferentes intensidades (150 mW/cm2, 500 mW/cm2, 750 mW/cm2, 1.0
W/cm2, 1.5 W/cm2, 2.0 W/cm2, 2.5 W/cm2 e 3.0 W/cm2), apresentando como objetivo analisar algum tipo de alteração na estrutura do tecido biológico em diferentes níveis de intensidades e comparar com o grupo que nao recebeu irradiação.
As amostras foram coletadas em um frigorífico na cidade de São Carlos, no mesmo dia em que o animal foi sacrificado, mantidas resfriadas em 4 0C até a hora da coleta. Foi uti-lizada a parte da região abdominal abrangendo a epiderme, derme e músculo. O tamanho de cada amostra apresentava 16 cm2 com um tempo de aplicação em cada amostra de 5 minu-tos. O aparelho de ultra-som utilizado era da marca Sono Plus, com 1MHz de freqüência no modo contínuo, contendo uma área de radiação efetiva (ERA) de 3.5 cm2. A cada intensidade aplicada era feito a medida no dosímetro de precisão ULTRASOUND POWER METER UPT-1 MODEL. O preparo das lâminas histológicas foram realizadas na Universidade Estadual de São Paulo (UNESP) no departamento de Fisiologia e Patologia do Curso de Odontologia. Pode-se sugerir qualitativamente alterações no tecido a partir de 750 mW/cm2. Estas alterações foram identificadas como queimaduras e conforme as intensidades aumentavam, tornava-se visível maiores áreas de lesões principalmente na epiderme e derme. A Fig.3.1. mostra os cortes histológicos sem lesões. Na Fig.3.2 observa-se que as células das amostras apresentam-se au-mentadas devido ao processo inflamatório, conforme indicado nas setas (regiões mais escuras) principalmente nos grupos irradiados com intensidades mais elevadas de 2.5 e 3.0 W/cm2.
21
(a) (b) (c)
Figura 3.1:As figuras (a), (b) e (c) mostram um epitélio normal sem alteração. A figura (a) representa a
amostra controle; a figura (b) amostra que foi irradiada com 500mW/cm2e a figura (c) amostra irradiada
com 750mW/cm2, todas com um aumento de 100x
(d) (e) (f)
Figura 3.2: As setas na Fig.3.3 mostram lesão do epitélio, percebe-se que as células apresentam-se aumentadas pelo processo inflamatório principalmente nas figuras (e) e (f). A figura (d) representa o
corte histológico da amostra irradiada com 1,5W/cm2; na figura (e) refernete a amostra irradiada com
2,5W/cm2e na figura (f) mostra o corte histológico da amostra irradiada com 3,0W/cm2, todas com um
aumento 100x
22
3.2 Materiais
3.2.1
Animais de ExperimentaçãoO projeto do presente trabalho foi aprovado pelo comitê de ética na Universidade Federal de São Carlos (UFSCar) na Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa. O modelo animal utilizado foi rato da linhagem Wistar, macho, com uma massa corporal (195,06 ±20,9), proveniente do biotério central da (UFSCar), mantido em uma temperatura entre 24 até 260C. Durante todo o processo de tratamento os animais permaneceram no Laboratório de Nutrição Aplicada ao Exercício da (UFSCar). A alimentação era de livre acesso à comida (ração primor) e água, alojados em gaiolas de polipropileno forradas com serragem, sob condições de higiene. Os machos foram pesados e distribuídos aleatoriamente em 5 grupos com um total de 6 animais por grupo. Permaneciam 3 animais por gaiola.
3.2.2
Balança e Ultra-SomPara verificar a intensidade de saída, foi utilizado o dosímetro de precisão, como mostra a Fig.3.3. Através da balança é possível determinar a intensidade média espaço-temporal.
23
O aparelho de ultra-som utilizado foi da marca BIOSET, Sonacel Expert com frequência de 3MHz. A medida da potência de radiação foi feita para as diferentes intensidades utilizadas no trabalho para fins de maior precisão. A Fig.3.4. mostra a aferição que foi realizada para as diferentes intensidades de cada grupo.
Figura 3.4: Testes de aferição das diferentes intensidades utilizadas em cada grupo.
3.2.3
Cuba Anestésica e Guilhotina24
(a) (b)
Figura 3.5:A figura(a) mostra o local da indução anestésica por agentes inalantes; a figura(b) mostra o aparelho utilizado na decapitação;
3.3 Métodos
3.3.1 Grupos Experimentais
Para a análise das diferentes intensidades no tecido biológico sadio de ratos Wistar foram utilizados um total de 30 ratos. Estes foram divididos em 5 grupos com as seguintes intensidades (0.5, 1.0, 1.5 e 2.0 W/cm2) mantendo a mesma freqüência de 3 MHz. O local de aplicação do ultra-som foi escolhido na região dorsal, levando-se em consideração dois fatores principais; apresentar uma dificuldade para o animal coçar e evitar contato do epitélio na maravalha. As amostras foram divididas em duas partes na região dorsal, o Lado Esquerdo (LE) que foi sempre controle e o Lado Direito (LD) experimntal, a tabela 3.1 mostra uma síntese das divisões dos grupos utilizados no experimento e suas respectivas intensidades.
GRUPO LADO ESQUERDO LADO DIREITO INTENSIDADES W/cm2
I Controle Placebo 0,0
II Controle Experimental 0,5
III Controle Experimental 1,0
IV Controle Experimental 1,5
V Controle Experimental 2,0
25
3.3.2 Manipulação dos Animais
Sabe-se que os animais são extremamente sensíveis e reagem diferentemente aos estímu-los externos, o que torna-se de suma importância um determinado período para adaptarem-se. Neste processo de adaptação ocorrem níveis de estresse elevados, levando a alterações no metabolismo do animal para compensar as variações do meio, podendo com isso influenciar os dados da pesquisa. Um dos fatores que influenciam, segundo (ANDERSEN et al., 2004), a maioria das espécies animais apresentarem o sentido da audição bem desenvolvidos. Os sons produzidos pelos animais, como cortejo, cuidado materno, agressão e defesa são necessários para sua comunicação, que pode ser frustrada pelo nível de ruídos no ambiente. Desta forma, além das instalações apropriadas, torna-se relevante realizar o processo adaptativo do animal com o pesquisador e também com os procedimentos a serem desenvolvidos na pesquisa.
Prezando-se todos os fatores externos de temperatura adequada, ventilação, ausência de ruídos e adaptação, o pesquisador está assegurando o bem estar do animal e uma confiabilidade nos seus resultados. Diante disso, a seqüência desta pesquisa apresenta-se em tópicos na Fig.3.6. e posteriormente uma explicação mais detalhada de cada ítem.
26
O processo adaptativo homem x animal teve uma duração de uma semana, em que notou-se a diferença do primeiro em relação ao último dia de adaptação. No primeiro contato os animais se refugiavam nos cantos da gaiola quando colocava-se a mão, no terceiro dia, foi perceptível a diferença, era possível passar a mão calmamente e no sétimo dia estavam tão bem adaptados que não urinavam-se e subiam na mão tranqüilamente para cheirar. Após este processo, os animais foram colocados na cuba com anestésico inalante de éter etílico, na Fig.3.7 Verificaram-se os
Figura 3.7: Animal sendo anestesiado para realização da tricotomia digital
27
(a) (b)
Figura 3.8: A figura (a) mostra antes da adaptação do animal com o transdutor do ultra-som; a figura (b) mostra o animal já adaptado ao transdutor, apenas apoiando-se na mão;
O tratamento foi realizado durante 4 dias consecutivos, com duração de 2 minutos em uma área de 4 cm2. Pelo fato da epiderme possuir a camada basal com intensa atividade mitótica e a duração do ciclo da mitose ser em torno de 2h, estipulou-se 4 dias de tratamento, levando-se em consideração a atividade mitótica.
(a) (b)
Figura 3.9: A figura(a) mostra a região dorsal após realizada a tricotomia digital e também a área do tecido que foi retirada, do lado esquerdo; A figura (b)mostra a área da região dorsal do lado direito em
28
No quarto dia, uma hora após a última aplicação, foi realizada a coleta das amostras. Os animais foram anestesiados através da combinação de Ketamina r (35mg/Kg) e xilazina r (4mg/Kg), injetada de forma intramuscular na coxa, utilizando uma seringa de insulina simples de 50 unidades. Após a aplicação da anestesia, deu-se início na retirada do tecido da região dorsal , epiderme e derme, ilustrado na Fig.3.10. Foram retiradas duas amostras, utilizou-se o lado direito do dorso como antímero experimental, e o lado esquerdo serviu de controle do próprio animal.
Figura 3.10: A Fig.3.10, ilustra o momento da coleta do material, epiderme e derme.
Logo após a retirada de cada tecido, foram colocadas nos cassetes com papel filtro e mer-gulhadas em formoldeído 10% (para cada 90ml de água destilada foi colocado 10ml de formol). Após a coleta do material, os animais foram decapitados ainda anestesiados.
3.3.3 Análise das Imagens
A análise das imagens foram realizadas de forma qualitativa juntamente com o patolo-gista Prof Dr. Carlos Benatti Neto do laboratório de Odontologia de Fisiologia e Patolo-gia da Universidade Estatual de São Paulo, (UNESP) de Araraquara. Conforme os resul-tados das análises por microscopia, apresentaram-se algumas modificações no tecido. Afim de tornar a análise mais precisa, viu-se a necessidade de realizar análise quantitativa através de um programa analisador de imagens Image Tool como mostra a Fig.3.11, retirado do site http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html. Com estesoftwareforam realizadas medidas da espes-sura da epiderme, com a finalidade de constatar se realmente as amostras irradiadas apresentavam-se mais espessas.
histológi-29
Figura 3.11: A figura ilustra a barra do programa image tool utilizada para realizar as medidas da espessura da epidereme e calibrar as imagens.
cos, comparando as amostras do lado esquerdo e as do lado direito que receberam tratamento. As fotografias foram obtidas sob microscopia de luz com aumento de 200x. O microscópio utilizado foi um Olympus BX51 e a câmera digital da marca Olympus Camedia C-5060, 5.1 mega pixels. As imagens foram calibradas conforme a régua do microscópio utilizado. Para obtenção das medidas da espessura da epiderme de cada uma das amostras foi realizada uma análise quantitativa das imagens dos cortes histológicos, utilizando o software Image Tool. O
4
Resultados e Discussão
4.1 Resultados Qualitativos e Quantitativos
4.1.1 Resultados Qualitativos
31
(A) (B)
(C) (D)
(E) (F)
Figura 4.1: A figura(A) representa o corte histológico do grupo I da amostra do lado esquerdo que nao recebeu irradiação, referencial para comparar os outros cortes que receberam irradiação; a figura(B) mostra o corte histológico da amostra coletada do lado direito, que foi aplicado ultra-som desligado
(placebo); a figura (C) referente ao grupo II irradiado com 0,5W/cm2; a figura (D) amostra do grupo III
irradiada com 1,0W/cm2; o corte da figura (E) do grupo IV irradiada com 1,5 W/cm2e o corte histológico
da figura (F) do grupo V irradiada com 2,0 W/cm2; Obserava-se nas figuras (D, E e F) dos cortes
32
4.1.2 Resultados Quantitativos
A análise dos dados quantitativos foi realizada com a biblioteca de estatística do Excel do Excel e com o programa Bioestat 3.0. Os testes realizados procuraram diferenciar os exper-imentos, indicando possíveis alterações do tecido biológico. Para isso foi realizada a análise de variância ANOVA e o teste "pos hoc"de Tukey aplicados entre os grupos. Ambos testes indicaram que o grupo I possui a menor média na espessura da epiderme (29,25 µm ±6,53), quando comparado com os grupos III (40,62 µm ±9,49), IV (45,32 µm ±9,43) e V (43,91 µm ±9,55) e as diferenças significativas (p < 0,01). Estes dados mostram que os grupos irradiados com intensidades mais elevadas apresentaram as maiores médias.
Figura 4.2: O gráfico ilustra as duas medidas realizadas separadamente do lado direito e es-querdo das amostras.
4.2 Discussão
33
disportiva. O objetivo dos autores foi investigar o uso e a dosagem do ultra-som terapêutico utilizada pelos fisioterapeutas australianos com interesse direcionado para as lesões no esporte. Distribuíram 355 questionários, divididos em quatro sessões: características terapêuticas, uso do ultra-som, dose do ultra-som e questões finais. Os autores concluíram que apesar da grande freqüência de uso do aparelho nas clínicas, existem poucas diretrizes adequadas sobre o uso e a dose do ultra-som terapêutico na prática clínica.
Percebe-se também, grandes problemas metodológicos dos estudos sobre ultra-som tera-pêutico. Em uma pesquisa investigando 35 artigos, entre 1975 e 1999, sobre os efeito do ultra-som terapêutico baseada em testes controlados randomizados apenas 10 estavam nos padrões metodológicos aceito (BAKER; ROBERTSON., 2001).
Outro fator que dificulta a exatidão das pesquisas esta realcionado com o fator da calibração do aparelho. (GUIRRO et al., 1997) pesquisou a intensidade acústica média temporal e média espacial dos aparelhos de ultra-som utilizados nas clínicas da cidade de Piracicaba, com o ob-jetivo de analisar se haveria alguma diferença entre a intensidade que o painel do equipamento registra com a intensidade distribuída do transdutor. Mostrou que a maioria dos equipamentos emitiam energia acima de 30%, ultrapassando o valor das especificações propostas pela norma. Outro estudo com objetivo de avaliar a calibragem dos equipamentos de ultra-som utilizados nas clínicas, pesquisando nas diferentes intensidades (0.5, 1.0 1.5 e 2.0 W/cm2). Os autores
concluíram que dos 83 aparelhos aferidos, um terço estava fora dos padrões medidos, sendo necessário melhorias nas condições de funcionamento dos aparelhos de US para se ter confia-bilidade na aplicação e nos resultados (ARTHO et al., 2002).
Pode-se observar o quanto é preocupante as altas intensidades, conforme o estudo de (ARA-UJO et al., 2003) sobre o efeito do ultra-som na veia auricular de coelhos, que apresentou como objetivo avaliar o risco potencial do ultra-som no sistema venoso. Foi constatado que com in-tensidade de 3 W/cm2no modo contínuo houve a indução de trombose venosa e um aumento dos linfócitos de forma significativa, podendo ser observada macroscopicamente por apresen-tar edema, eritema e calor. As imagens do trabalho evidenciam lesão na parede vascular com extravasamento de células.
Por outro lado, em certos tratamentos as intensidades mais altas são eficazes. Como no estudo de (NG et al., 2003), que avaliaram os efeitos do ultra-som terapêutico nas propriedades estruturais e funcionais na cicatrização do tendão de aquiles. Foram divididos em 3 grupos: Controle, grupo de baixa dose irradiados com intensidade de 1.0W/cm2 e grupo de alta dose utilizando 2.0W/cm2. Os autores concluíram que houve um aumento significativo das
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grupo controle. Consideraram que baixas doses e altas doses do ultra-som terapêutico aceleram o processo de cicatrização do rompimento de tendão. Diante destes resultados torna-se impor-tante salientar que não foram avaliados os tecidos mais superficiais como epiderme e derme.
Neste sentido, resultados obtidos por (CUNHA; PARIZOTTO; VIDAL, 2001) demon-straram que na comparção de ultra-som contínuo e pulsado em baixa intensidade, o primeiro provocou no tendão pioras na reparação tendínea, enquanto na forma pulsada, houve uma ace-leração na fibrilogênese cerca de 90% superior ao controle. Isso mostra os riscos de se utilizar doses elevadas na forma contínua de ultra-som para tratamento em tecidos profundos. Pode-se imaginar que na trajetória da onda sonora possa ter havido alterações teciduais também, porém não foram avaliados neste trabalho. Os trabalhos (DYSON; POND; WARICK., 1968) e (DYSON, 1987) mostram que uma cicatrização de melhor qualidade e em condições mais adequadas para os tecidos com doses baixas do ultra-som, onde se reduzem os efeitos térmicos mais pronunciados. Os autores sugerem doses abaixo de 0,5 W/cm2.
Diante dos resultados obtidos no presente estudo, sugere-se que a aplicação do ultra-som também gerou alterações no tecido epitelial sadio de ratos Wistar. Obteve-se um notório au-mento na espessura da epiderme conforme a figura 4.1 (C, D, E e F). Isso provavelmente ocorreu por estímulo na mitose das células da camada basal da epiderme. As evidências encontradas nos resultados apresentam uma relação com o trabalho realizado por (SILVA, 2007), que avaliou o efeito do ultra-som pulsado na atividade mitótica androgênica das células de Leydig, levando a um aumento na velocidade do ciclo celular. Estas evidências mostram o papel da camada proli-ferativa da epiderme no processo de renovação celular, que mostrou ser susceptível à influênica da energia do ulta-som.
No estudo de (BOUCAUD et al., 2001) os autores também encontraram alterações no tecido epitelial. Eles pesquisaram o efeito biológico que o ultra-som pode causar com a fonoforese. As amostras de pele in vitro, que foram irradiadas acima de 2,5 W/cm2apresentaram lesão. Realizaram também, em tecido epitelial de ratosin vivoe constataram lesões mais profundas, entre as quais necrose capilar e muscular. Tais dados corroboram os achados deste trabalho.
prin-35
cipalmente na camada mais profunda da derme.
Outra alteração presente neste estudo foi a observação de um discreto infiltrado inflamatório abaixo da epiderme das amostras irradiadas acima de 1 W/cm2, o que pode estar relacionado com o aumento da temperatura tecidual local. Este aumento de temperatura pode se relacionar ao comportamento do campo acústico do ultra-som que apresenta-se de forma irregular. Devido a isso, pode acontecer picos de intensidade gerando maior aquecimento em algumas regiões do tecido.
Neste trabalho, a coleta do material foi realizada no mesmo dia após a última aplicação do US. Com isso pode-se considerar que as alterações obtidas no tecido epitelial sejam de um caráter mais agudo. No entanto é importante salientar que estas alterações ocorreram com apenas 4 dias de aplicação. Já nos tratamentos estéticos, geralmente são realizados mais de 20 sesssões com intensidades bastante altas (nas faixas entre 2.5 à 3.0 W/cm2), maiores do que as utilizadas neste trabalho.
Conforme os resultados morfométricos apresentados na figura 4.2, observou-se um aumento linear em relação às medidas da espessura da epiderme até a intensidade de 1.0 W/cm2. Nos grupos irradiados com 1.5 e 2.0 W/cm2, este aumento foi mantido. Aparentemente houve uma
resposta máxima de mitose nas células da camada basal, resultando em espessuras semelhantes ao final dos 4 dias de tratamento. Em um trabalho de revisão de literatura sobre dosimetria do ultra-som (BLUME et al., 2005), relatam que as altas dosagens como 1.5 e 2.0 W/cm2, podem ser menos efetivas do que as doses baixas. Além disso, os autores chamam a atenção que nas aplicações clínicas se observa evidências de que as altas intensidades não são tão eficientes. Diante disso, sugerem que os profissionais preferencialmente utilizem subdoses do que super-doses, por serem mais efetivas e correrem menor risco de lesão.
5
Conclusão
37
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6
Apêndice
6.1 Apêndice (A)
Rotina Histológica e Coloração
As amostras saem do formal 10% e são lavadas durante 24h em água corrente. São então mantidaas em álcool 70%. Para se realizar a inclusão em parafina as peças são desidratadas em uma seqüência de banhos em álcool. Alguns protocolos costumam passar por um banho de 1 hora em álcool 80%, outros de 1 hora em álcool 90% e depois uma seqüência de banhos em álcool absoluto. Nas amostras foram utilizadas álcool 70% para o absoluto diretamente. Foram feitos de 7 a 8 banhos de 1 hora cada em álcool absoluto, posteriormente mais 1 hora em álcool (xilol), mais 1 hora no primeiro banho de xilol e um absoluto finalmente um último banho em xilol por mais 1h.
Retira-se o excesso de xilol das peças com a ajuda de papel absorvente e imediatamente as peças são colocadas no primeiro banho de parafina derretida 60o C. As peças permaneceram nesse banho por pelo menos 2 horas, depois foram transferidas para um segundo banho em parafina de boa qualidade e colocadas numa estufa a vácuo por mais 2 horas. Só então foram confeccionados os blocos. Depois de solidificada e fria estão prontos para se obter os cortes.
41
6.2 Apêndice(B)
Tabelas com as medidas da espessura da epiderme do lado esquerdo e direito das amostras.
Medidas Epiderme (LE)
(GI) (GII) (GIII) (GIV) (GV) 14,27 7,07 14,13 9,51 12,37 12,49 9,01 12,37 14,57 12,74 16,00 8,83 15,9 12,86 14,24 14,3 9,99 14,29 12,49 11,85 12,86 11,31 8,83 12,57 19,43 17,87 12,37 14,57 17,67 15,2 16,29 10,6 18,02 15,2 15,2
16 11,85 17,67 14,24 21,27
12,86 10,6 17,67 7,07 12,37 11,31 5,30 18,45 9,01 19,51
10,6 9,51 22,97 9,01 16
12,49 10,6 10,6 10,3 15,8
12,37 7,07 19,75 14,13 14,57 10,6 8,83 14,13 14,24 17,76
10,6 9,51 17,67 16 13,8
8,83 10,6 16 15,9 17,4
12,49 9,51 10,6 12,49 22,97
12,37 7,07 10,6 10,3 19,43
13,8 8,83 10,6 12,74 22,59
12,37 10,6 12,49 10,6 18,02 12,49 10,6 14,24 18,45 17,76 9,01 12,37 11,31 15,1 16,29 12,74 12,49 13,84 10,75 15,8 14,13 9,51 16,29 12,37 15,8
Média 12,88 9,68 14,70 12,9 16,6
Desvio Padrão 2,21 1,82 3,47 2,9 3,12
42
Medidas Epiderme (LD)
(GI) (GII) (GIII) (GIV) (GV) 38,91 38,91 60,48 44,6 44,17 31,85 33,75 43,74 40,64 58,33 17,76 39,03 46,07 49,47 37,14 23,04 31,46 34,12 35,51 44,47 32,16 34,98 37,14 37,48 64,21 21,27 35,8 28,27 54,8 55,87 36,38 29,98 29,25 53,27 55,6 33,19 26,06 31,85 42,64 55,56 30,09 28,32 40,30 37,1 32,58 26,5 32,58 42,28 54,77 41,09 30,03 33,19 48,09 35,38 35,2 26,91 36,25 41,02 42,73 34,3 34,12 39,98 36,76 29,91 30,03 42,73 32,58 53,03 33,75 33,57
26,5 42,4 52,71 39,7 39,7
31,46 36,38 47,83 34,71 56,15 17,67 40,29 33,75 56,54 38,14 29,25 40,67 26,5 47,74 50,59 26,56 23,7 53,03 47,83 31,85 38,91 37,81 42,48 57,03 44,2 30,03 44,7 46,64 46,38 39,23 19,43 40,98 42,44 40,64 44,49
30,86 32 22,86 59,78 44,2
26,5 30,09 34,3 65,39 43,31
Média 29,25 34,87 40,62 45,37 43,91
Desvio Padrão 6,53 5,62 9,49 9,42 9,55
