PROPAGAÇÃO IN VIVO E INVITRO DE Cissus sicyoides,
UMA PLANTA MEDICINAL
Ilka Nacif de ABREU1
, José Eduardo Brasil Pereira PINTO2
, Suzan Kelly Vilela BERTOLUCCI2
, Augusto Ramalho de M O R A I S2
, Clara GEROMEL2
, Ângela LADEIRA1 , Osmar Alves LAMEIRA3
.
R E S U M O : O estudo da propagação de espécies utilizadas na medicina popular tem sido
intensificado nos últimos anos devido ao crescente investimento em pesquisas para a descoberta de novos fármacos e da utilização da fitoterapia como um meio alternativo. O objetivo do trabalho foi a propagação in vivo e in vitro (estabelecimento e multiplicação) de Cissus sicyoides. Plantas mantidas em casa de vegetação forneceram estacas com 10 e 20 cm de comprimento, as quais foram tratadas com 0, 80 ou 160 mg/l de AIB, com ou sem sacarose + ácido bórico, por duas horas. Para o estabelecimento in vitro, após desinfestação, segmentos nodais com 10 mm de comprimento foram inoculados em meio de cultura sólido (MS), com diferentes concentrações de cinetina, BAP e ANA. Para a multiplicação in vitro, segmentos nodais com 10 mm foram inoculados em meio MS, suplementado com diferentes concentrações de BAP e ANA, e ANA e cinetina. Na propagação in vivo as estacas com 10 cm de comprimento apresentaram maior eficiência no enraizamento quando tratadas com 160 mg/l de AIB. In vitro os explantes foram melhor estabelecidos e multiplicados em meio de cultura suplementado com cinetina e ANA, que proporcionaram maior indução de gemas, crescimento em altura e ausência de calos na base das plântulas.
PALAVRAS-CHAVE: Insulina vegetal, boro, enraizamento, micropropagação, regulador de
crescimento.
IN VIVO AND INVITRO PROPAGATION OF Cissus sicyoides,
A MEDICINAL PLANT
ABSTRACT: The study of the propagation of species used in common medicine has intensified
in the last few years due to the increasing investment in research for the discovery of new pharmaceuticals and utilization of phytotherapy as an alternative. The objective of this study was in vivo and in vitro propagation (establishment and multiplication) of Cissus sicyoides. Greenhouse plants furnished 10 and 20 cm long cuttings which were placed for
two hours in 0, 80 or 160 mg/l of IBA, with or without sucrose and boric acid. For the in vitro establishment, the nodal segments were sterilized, 10 mm sections were inoculated in
a solid culture (MS), and supplemented with kinetin, ANA and BAP. For the multiplication in vitro, 10 mm nodal segments were inoculated in a solid culture (MS), supplemented
1
CIUT,FTí=^rfecteEÍti:^Efl.cfeCÍnpgrES-tMr3ít') Dçt? d=EÍ£ridl!ogia, 33C10-:L93Ca:[piras, SP., Brasil.
2
ÍÜT£iE!Í£3;EfeIècfeiEilcfel£f.iEB-tEi;V DÇtí c f e í g d a i t u r a , Qc P. 37, 3720HXBIíMas, M l , B a s i l .
3
EM3fflytBWJ, Q t P. 48, 6SQ95-100Balárv ffi, Brasil.
with the following interactions: BAP x ANA and ANA x kinetin. The 10 cm long cuttings presented good rooting when treated with 160 mg/l of AIB. In vitro the explants were established and multiplied better in a culture supplemented with 4.64 μ Μ of kinetin and 2.7 μ Μ of ANA, which promoted greater induction of buds, greater height and absence of callus formation at the base of plantlets.
KEYWORDS: Vegetable insulin, boron, rooting, micropropagation, growth regulator
I N T R O D U Ç Ã O M A T E R I A L E M É T O D O S
Cissus sicyoides L.(Vitaceae), também
conhecida como insulina vegetal, cipó-pucá e anil trepador, é uma trepadeira da América Tropical e encontrada na Região Amazτnica. E s t a e s p é c i e é u s a d a p o p u l a r m e n t e no tratamento de diabetes, controle de estados e p i l é p t i c o s , s u d o r í f i c o , h i p o t e n s o r e no t r a t a m e n t o de d o e n ç a s do c o r a ç ã o ( A l b u q u e r q u e , 1989; Costa, 1990; Silva, 1995). Na sua c o m p o s i ç ã o há a l c a l ó i d e s , flavonóides (Moura, 1986; A l b u q u e r q u e , 1989), esteróides, s a p o n i n a s , m u c i l a g e n s , c o m p o s t o s f e n ó l i c o s ( S i l v a , 1 9 9 5 ) , antocianinas (Toledo, 1983) e tem atividade farmacológica comprovada no tratamento de convulsão, doenças do coração (Elizabetsky, 1988; Moura, 1986; Costa, 1990) e controle de diabetes crτnica (Pepato et al., 1998).
O estudo da propagação de espécies u t i l i z a d a s na m e d i c i n a p o p u l a r tem sido intensificado nos últimos anos, devido ao crescente investimento em pesquisas para a descoberta de novos fármacos e da utilização da fitoterapia como um meio alternativo. Neste trabalho foi apresentada metodologia rápida e prática de propagação, in vivo e in vitro, de
Cissus sicyoides.
E n r a i z a m e n t o in vivo de e s t a c a s de C.
sicyoides.
C o m a f i n a l i d a d e de a v a l i a ç ã o do
enraizamento in vivo de estacas de Cissus sicyoides foi conduzido um experimento em
casa de v e g e t a ç ã o , no D e p a r t a m e n t o de
Agricultura, na Universidade Federal de Lavras (UFLA),MG, utilizando-se o delineamento
experimental em blocos casualizados, com cinco repetições, em que cada parcela foi
c o n s t i t u í d a por q u a t r o e s t a c a s , s e n d o os
tratamentos dispostos em esquema fatorial 2 x 3 x 2 , d e f i n i d o s pelas c o m b i n a ç õ e s dos
fatores: comprimento da estaca (10 e 20 cm), soluções de AIB (0, 80 ou 160 mg/l) e sacarose
+ ácido bórico (ausência e presença).
As estacas foram coletadas da região mediana de plantas matrizes com um ano de
idade, sendo que as estacas com 10 cm de comprimento tinham uma gema e as de 20cm
duas gemas. Os dois tipos de estacas foram
colocados, durante 2 horas, em solução de AIB (0; 80; 160 mg/l) acrescidas ou não com 20 g
de sacarose + 150 mg/l de ácido bórico, exceto as estacas controle ( 0 ) que foram colocadas
diretamente no substrato. O pH das soluções
foi ajustado para 5,8. Após a imersão nas soluções, as estacas foram colocadas em saco de polietileno, com capacidade para 500 ml, contendo areia lavada, mantidas sob sombrite, com redução de luz em 5 0 % e irrigação uma vez ao dia.
F o r a m avaliados aos 45 dias após a i n s t a l a ç ã o do e x p e r i m e n t o : o n ú m e r o , comprimento e peso da matéria seca de raízes.
Propagação in vitro de C. sicyoides.
a) Estabelecimento de C. sicyoides in
vitro - Para estabelecimento de C.sicyoides in
vitro utilizou-se plantas com um ano de idade,
mantidas em casa de vegetação, como fonte de explantes. Após retirados, os segmentos nodais foram submetidos ΰs seguintes condições de assepsia: 30 minutos em água corrente, 30 segundos em álcool 70%, 20 minutos em 0,75% de h i p o c l o r i t o de s ó d i o . Em s e g u i d a , os explantes com 10 mm de comprimento foram lavados por seis vezes em água estéril, em câmara de fluxo laminar, e inoculados em meio de cultura sólido (0,7% de ágar) de Murashige e S k o o g ( M S ) , e s u p l e m e n t a d o com os tratamentos: 4,64 mM de cinetina; 4,44 m M de BAP; 4,64 mM de cinetina + 2,7 mM de ANA; 4,44 mM de BAP + 2,7 m M de ANA e o controle. O pH dos meios de cultura foi ajustado para 5,7 ± 0,1 e os explantes foram colocados em tubo de ensaio (25 x 150 mm) e incubados a 26 ± 1°C num fotoperíodo de 16 horas luz, sob 25 mmol.m- 2
.s- 1
de irradiância em sala de crescimento.
O delineamento experimental utilizado foi o i n t e i r a m e n t e c a s u a l i z a d o , c o m 10 r e p e t i ç õ e s , s e n d o u s a d o 5 e x p l a n t e s por parcela. Os tratamentos foram dispostos em esquema fatorial 2x2+1, sendo constituídos por fitoregulador (4,64 m M cinetina e 4,44 mM BAP) e ANA (ausência e presença) mais
um tratamento controle ( testemunha). Aos 60 dias após a instalação foram avaliados: número de gemas, altura (cm) das plântulas, número de raízes e presença de calos.
b) Multiplicação de C. sicyoides in
vitro - Para multiplicação de C.sicyoides in vitro,
procedeu-se ΰ cultura nodal utilizando explantes com 10 mm de comprimento, obtidos a partir de plântulas estabelecidas in vitro. Os explantes foram inoculados em meio de cultura sólido MS (0,7% de ágar) e suplementado com os tratamentos: 1) BAP 2,22 + ANA 2,7 mM; 2) BAP 2,22 + ANA 5,4 mM; 3) BAP 4,44 + ANA 2,7 mM ; 4) BAP 4,44 + ANA 5,4 mM;
5) Cinetina 2,32 + ANA 2,7 mM; 6) Cinetina
2,32 + ANA 5,4 mM; 7) Cinetina 4,64 + ANA 2,7 mM; 8) Cinetina 4,64 + ANA 5,4 mM. O pH do meio de cultura foi ajustado para 5,7 ± 0,1 e os explantes foram mantidos nas mesmas c o n d i ç õ e s de a m b i e n t e u t i l i z a d a s para o estabelecimento in vitro.
O d e l i n e a m e n t o e x p e r i m e n t a l foi o inteiramente casualizado, com seis repetições, sendo que cada parcela continha 4 tubos.
Aos 60 dias após instalação avaliou-se: número de gemas, altura (cm) da plântula, número de raízes e presença de calos.
As análises de v a r i â n c i a dos d a d o s o b t i d o s foram r e a l i z a d o s de a c o r d o com esquema adaptado de Pimentel Gomes (2000) p a r a os e x p e r i m e n t o s f a t o r i a i s , e as comparações de médias dos tratamentos, foram feitas usando-se o teste de Tukey (5%) ou com o uso de contrastes ortogonais.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Enraizamento de estacas
Analisando o ganho de matéria seca das raízes formadas a partir das estacas controle, o b s e r v o u - s e que e s t a e s p é c i e é de fácil
enraizamento, pois ele ocorreu na ausência de qualquer fator indutor deste processo, para os dois tipos de estacas.
O u s o do A I B foi s i g n i f i c a t i v o , propiciou maiores quantidade de matéria seca do que sem o seu uso (Tabela 1). Nas estacas de 20 cm as concentrações de 80 a 160mg/l proporcionaram matéria seca superiores aos da matéria seca de 0 mg/l, tanto na presença como na ausência de sacarose + ácido bórico. Nas estacas de 10 cm e com sacarose + ácido bórico não houve efeito significativo das concentrações de AIB, mas, na ausência de sacarose +ácido bórico, o uso de 160mg/l proporcionou maiores teores de matéria seca do que com 0 e 80mg/l.
Segundo Jarvis (1983), a adição de boro proporciona um maior desenvolvimento de raízes em estacas de feijão, quando adicionado após a aplicação de auxina, uma vez que este elemento é responsável pelo desenvolvimento dos primórdios radiculares e a auxina pela dife¬ r e n c i a ç ã o das c é l u l a s p a r a i n i c i a r o enraizamento. Portanto, não houve efeito do ácido bórico e sacarose uma vez que a matéria seca das raízes não diferiram dos tratamentos controle para os dois tipos de estacas.
Kersten (1990), observou que a presen¬ ça de boro diminui o teor de AIA livre em raízes de trigo e milho. O boro tem a função de au¬ mentar a atividade da enzima AIA-oxidase, sen¬ do esta enzima responsável pela degradação da principal auxina indutora do enraizamento (AIA) (Jarvis, 1983). Epstein & Lavee (1983) verificaram que, em estacas de videira e olivei¬ ra, o AIB era convertido em AIA durante o processo de enraizamento.
A propagação desta espécie a partir de estacas com 10cm é eficaz desde que seja acompanhado da adição de 160 mg/l de AIB, e estacas com 20cm adição a partir de 80mg/l pode ser u s a d o . Em relação ao n ú m e r o e comprimento de raízes não houve diferença entre os tratamentos.
Propagação in vitro:
Estabelecimento:
O explante não apresentou problemas de oxidação ou contaminação, e apresentou um hábito de crescimento com dominância apical e não houve a presença de múltiplas brotações. As plântulas controle desenvolveram um
siste-T a b e l a 1 . Matéria seca (g) de raízes de diferentes t a m a n h o s de estacas de Cissus sicyoides, aos 45 dias,
s u b m e t i d a s a diferentes c o n c e n t r a ç õ e s de A I B , na presença ou não de sacarose e ácido bórico.
Tamanho de
A I B ( m g / l ) e s t a c a s ( c m )
e a c . b ó r i c o C o m s a c a r o s e
e a c . b ó r i c o
8 0 1 6 0
1 0 Se m sacarose
0 , 1 4 b 0 , 1 8 b 0 , 2 4 a 0 , 1 8 6 A
0 , 1 8 3 B
0 , 1 7 a 0 , 1 7 a 0 , 2 0 a 0 , 1 8 0 A
2 0
S e m s a c a r o s e
e a c . b ó r i c o
C o m s a c a r o s e
e a c . b ó r i c o
0 , 2 2 b 0 , 2 8 a 0 , 2 9 a 0 , 2 6 3 A 0 , 2 5 6 A
0 , 2 0 b 0 , 2 9 a 0 , 2 6 a 0 , 2 5 0 A
Médias seguidas da mesma letra minúscula nas colunas não diferem significativamente entre si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
0 X X
ma radicular, fato que sugeriu elevada concen tração endógena de auxina em relação as citocininas, nesta espécie. A Tabela 2 apresen¬ ta os valores dos contrastes usados para avali¬ ar o efeito dos fitoreguladores cinetina e BAP associados ou não com ANA. Foi observado que a presença de reguladores de crescimento no meio de cultura influenciou de modo signi¬ ficativo nos resultados, uma vez que as médi¬ as obtidas no tratamento controle são inferio¬ res ΰs dos outros tratamentos, para altura, número de gemas e de raízes. Os fitoreguladores tiveram uma altura de 3,34cm, 1,3 gemas e 1,12 raízes a mais do que o controle. A cinetina apresentou 0,3cm de altura a menos que BAP e 0,6 gemas e 0,85 raízes a mais que o meio com BAP mas, estas diferenças foram não sig¬ nificativas. Na presença da cinetina o uso de ANA foi significativo em aumentar a altura e o número de raízes. Entretanto, na presença de BAP não houve efeito significativo de ANA. O tratamento que proporcionou um maior nú¬ mero de gemas (4,0), altura (6,5 cm) e número
grande desvantagem para o desenvolvimento das brotações, uma vez que o metabolismo do explante passa a p r o x i m a d a m e n t e 5 0 % do período necessário para o estabelecimento, gastando toda energia produzida na formação de calos, e só depois é que ocorre a formação e crescimento das brotações. Essa proliferação celular pode ter ocorrido em função de um d e s b a l a n ç o h o r m o n a l e n t r e o c o n t e ú d o endógeno do explante e a concentração do regulador de crescimento no meio de cultura, como o b s e r v a d o por B e c k e r ( 1 9 9 7 ) , que utilizou a citocinina T D Z em Phillanthus niruri e também observou a formação de calos
em toda a base do explante.
M u l t i p l i c a ç ã o :
Q u a n d o os s e g m e n t o s nodais foram transferidos para o meio de multiplicação, não houve uma regeneração de multiplobrotos, e sim um alongamento do segmento nodal.
Verificou-se que os tratamentos com as maiores concentrações de cinetina obtiveram
T a b e l a 2. Valores d o s contrastes da altura média e n ú m e r o médio de g e m a s e raízes para c o m p a r a ç ã o
entre controle e fitoregulador, entre fitoreguladores e entre doses de A N A na presença de cinetina e de BAP, das plântulas de Cissus sicyoides estabelecidas aos 60 dias.
C o n t r a s t e A l t u r a ( c m ) N° G e m a s N° R a í z e s
C o n t r o l e v s F i t o r e g u l a d o r 3 , 3 4 * 1,3* 1 , 1 2 *
C i n e t i n a v s B A P - 0 , 3 0 0 , 6 0 , 8 5 A N A d . C i n e t i n a 2 , 8 0 * 0 , 8 3 , 3 *
A N A d . B A P 0 , 6 0 - 1 , 0 0 , 6 •
S i g n i f i c a t i v o pelo t e s t e F
de raízes (4,7) foi o que continha 4,64 m M de cinetina acrescido de 2,7 m M de ANA.
Com exceção dos explantes mantidos em meio de cultura sem a adição de regulador de crescimento, todos os demais apresentaram calos em todo o explante com aproximadamente 30 dias com p o s t e r i o r e m i s s ã o de raiz e formação de b r o t o s . Isso r e p r e s e n t a u m a
as maiores médias no número de gemas (Tabela 3). O b s e r v o u - s e que os tratamentos que apresentaram as maiores médias no número de raízes foram aqueles que continham maior concentração de A N A associado a maior concentração de BAP (Tabela 3). Na presença de BAP ocorreu formação de uma massa celular ao redor do sistema radicular, enquanto
que na presença de cinetina não houve a mesma formação. Nota-se, que a menor concentração de BAP (2,22mM) proporcionou maior altura em relação a maior concentração; em relação a
T a b e l a 3. Valores m é d i o s de altura, número de gem
dias, e m diferentes c o n c e n t r a ç õ e s de BA
1991).
O melhor desenvolvimento e crescimento das p l â n t u l a s m a n t i d a s no m e i o de m u l t i p l i c a ç ã o , ocorreu no meio contendo
s e de raízes de plântulas de Cissus sicyoides aos 60 ; A N A e cinetina.
T r a t . B A P ( m M ) A N A ( m M ) A l t u r a ( c m ) N0
G e m a N0
R a í z e s
~ 2 ; 2 2 2 / 7 TÕ~3ã 4 , 4 a 6 , 0 a b
2 2 , 2 2 5 , 4 8 , 3 a b 3 , 8 a b 7 , 1 a b
3 4 , 4 4 2 , 7 4 , 0 b 2 , 5 b 2 , 5 b
_ 4 4 , 4 4 5 , 4 6 , 2 a b 3 , 6 a b 9 , 6 a
Cinetina ANA
5 2 , 3 2 2 , 7 7 , 2 a b 4 , 0 a b 4 , 0 a b
6 2 , 3 2 5 , 4 7 , 8 a b 4 , 1 a b 7 , 0 a b
7 4 , 6 4 2 , 7 7 , 9 a b 4 , 8 a 5 , 6 a b
8 4 , 6 4 5 , 4 7 , 0 a b 4 , 5 a 4 , 8 a b
M é d i a s s e g u i d a s da m e s m a letra nas c o l u n a s não d i f e r e m s i g n i f i c a t i v a m e n t e e n t r e si a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
cinetina, houve uma maior uniformidade na altura das plântulas (Tabela 3).
Durante o desenvolvimento de plântulas mantidas em meio de cultura contendo BAP, houve a ocorrência de vitrificação nas folhas. Segundo Ziv (1991), a vitrificação é um evento c o m u m na c u l t u r a de t e c i d o s , g e r a n d o anormalidades fisiológicas e morfológicas no tecido v e g e t a l . Estas d e s o r d e n s , ocorrem principalmente nas folhas, afetando os dois principais processos: fotossíntese e trocas gasosas (CO , H O e vapor). Os fatores que
2 2
geralmente provocam estas anormalidades são: e l e v a d a u m i d a d e , e x c e s s o de f a t o r e s nutricionais (mineral e carboidratos), elevados níveis de reguladores de crescimento e baixa intensidade de luz. As plantas quando estão v i t r i f i c a d a s a p r e s e n t a m u m a s p e c t o de hiperidricidade nos tecidos e não são aptas a s e r e m a c l i m a t a d a s . Tal o c o r r ê n c i a só foi v e r i f i c a d a n o s t r a t a m e n t o s com BAP, provavelmente por esta citocinina ser mais ativa do que a cinetina (Gray & Benton,
2 , 7 m M de A N A + 4 , 6 4 m M de cinetina, proporcionando aproximadamente uma taxa de multiplicação de 5 plântulas por segmento nodal e com 6 raízes por plântula, e com altura próxima de 8 cm além de não ocorrer nenhuma calogênese na base do segmento nodal.
A G R A D E C I M E N T O S
Os a u t o r e s a g r a d e c e m a F I N E P -Projeto número 6496072400 - Biotecbologia em Plantas M e d i c i n a i s e C N P q - Projeto 462293 - Cultivo in vitro e in vivo de Plantas Medicinais, pelo apoio financeiro.
B I B L I O G R A F I A CITADA
Albuquerque, J.M.D. 1989. Plantas medicinais de uso popular,. Programa de agricultura nos
Trópicos, 6, ABEAS Brasília, 96p.
Becker, L. 1997. Propagação vegetativa in vivo e in vitro, indução de calos, nutrição,
extração e quantificação de alcalóides nas
espécies Phyllanthus niruri L. e
Phyllanthus corcovadensis Muell. Arg.
(Quebra-Pedras). D i s s e r t a ç ã o de
Mestrado, Universidade Federal de Lavras, Lavras, Minas Gerais, 96p.
C o s t a , C . M . M . 1 9 9 0 . C i p ó - p u c á (Cissus sycioides). A p o s t i l a do c u r s o de
e s p e c i a l i z a ç ã o e m m e d i c a m e n t o s da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Rio de Janeiro, 109p.
Elizabetsky, E. 1988. Ação anticonvulsivante de Cissus sycioides, cipó-pucá. Ciência e
Cultura, 40 (Suplemento): 985 (resumo).
Epstein, E.: Lavee, S. 1983. Conversion of AIB to AIA by cuttings of grapevine and olive. Plant Physiology, 72 (Supplement): 116.
Gray, D.J.; B e n t o n , C.M. 1 9 9 1 . In vitro micropropagation and plant establishment of m u s c a d i n e g r a p e c u l t i v a r s ( Vitis rotundifolia). Plant Cell, Tissue and Organ
Culture, 27(1):7-14.
Jarvis, B.C. 1983. Auxin and boron in relation to the rooting response and ageing of mung bean cuttings. The New Phytologist, 95:509-518.
Kersten, E. 1990. Efeito do boro, zinco e ácido indolbutírico no enraizamento de estacas
de dois cultivares de ameixeira (Prunus
salicina Lindl.). Tese de Doutorado, Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Piracicaba, São Paulo, 109p.
M o u r a , B . A . S . 1 9 8 6 . E s t u d o q u í m i c o e farmacológico de espécie vegetal Cissus
sycioides L i n n . A p o s t i l a do curso de
especialização em química de produtos naturais Universidade do Pará, Belém, 98p.
Pimentel Gomes, F. 2000. Curso de estatísti¬ ca experimental. 14 ed. Nobel Piracicaba,
467p.
P e p a t o , M . T ; Keller, E.H; Silva, M . P . M ; B a v i e r a , A . M . 1 9 9 8 . E f e i t o da administração crτnica de Cissus sicyoides no metabolismo de carboidratos. In: Anais do Simpósio Brasileiro de Plantas
Medicinais. Sociedade Brasileira de Plantas
Medicinais, Αguas de Lindóia, SP, p.78.
S i l v a , G . A . 1 9 9 5 . Caracterização e padronização farmacológica da droga e
extrato fluído de Cissus s y c i o i d e s L.
Dissertação de Doutorado, Universidade Estadual de São Paulo, São Paulo, 98p.
Toledo, M.C.F. 1983. Anthocyanins from anil trepador (Cissus sycioides). Journal Food Science, 48:1368-1369.
Ziv, M. 1991. Vitrification: morphological and physiological disorders of in vitro plants. In: D e b e r g h , P.C.; Z i m m e r m a n , R . H .
(Eds.) Micropropagation - Technology and Application. K l u w e r A c a d e m i c
Publishers, London, p.45-69.
Submetido à publicação: 16/12/1998.
Aceito : 09/11/2002.