MARIA CECILIA BACIL TEIXEIRA
DETECÇÃO DO TCoV (
Turkey Coronavirus
) A PARTIR DE
AMOSTRAS PROVENIENTES DE PERUS (
Meleagris gallopavo
)
COM QUADRO AGUDO DE ENTERITE
ARAÇATUBA - SÃO PAULO
MARIA CECILIA BACIL TEIXEIRA
DETECÇÃO DO TCoV (
Turkey Coronavirus
) A PARTIR DE
AMOSTRAS PROVENIENTES DE PERUS (
Meleagris gallopavo
)
COM QUADRO AGUDO DE ENTERITE
MARIA
CECILIA BACIL TEIXEIRA
DETECÇÃO DO TCoV (
Turkey Coronavirus
) A PARTIR DE
AMOSTRAS PROVENIENTES DE PERUS (
Meleagris gallopavo
)
COM QUADRO AGUDO DE ENTERITE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em Ciência Animal da Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” – UNESP – Câmpus de Araçatuba, como parte dos requisitos para a obtenção do título de Mestre.
Orientadora: Prof Dr Tereza Cristina Cardoso Área de concentração: Medicina Veterinária Preventiva
Araçatuba – SP
Candidata:
MARIA CECILIA BACIL TEIXEIRA
Título da dissertação:
DETECÇÃO DO TCoV (
Turkey Coronavirus
) A PARTIR DE
AMOSTRAS PROVENIENTES DE PERUS (
Meleagris gallopavo
)
COM QUADRO AGUDO DE ENTERITE
COMISSÃO JULGADORA
DISSERTAÇÃO PARA OBTENÇÃO DO TÍTULO DE MESTRE
Presidente e Orientador Prof Dr Tereza Cristina Cardoso – UNESP Câmpus de Araçatuba SP
2 Examinador Prof. Associado.José Antônio Jerez – VPS – FMVZ – USP – SP
3 Examinador Prof. Adjunto Iveraldo dos Santos Dutra – UNESP Campus de Araçatuba SP
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de
Virologia do Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal
da Faculdade de Odontologia, do Curso de Medicina
Veterinária – UNESP – Câmpus de Araçatuba – SP.
Apoio:
Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo –
DADOS CURRICULARES
MARIA CECILIA BACIL TEIXEIRA
NASCIMENTO 17.11.1976 – RIO DE JANEIRO/RJ
FILIAÇÃO Sergio Meira Teixeira Cléa Bacil
1997/2001 Curso de Graduação
AGRADECIMENTOS
A Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP, pela bolsa
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus e a Buda Shakyamuni pela presença diária dentro de mim, e
através de seus ensinamentos darem-me a capacidade de ver a alegria e beleza nas
coisas simples da vida e forças para enfrentar as dificuldades da vida e do dia-a-dia.
Ao meu pai que amo tanto, Sergio, por sempre estar ao meu lado, me apoiando e
orientando em todos os momentos da minha vida, sendo minha referência para tudo.
E a sua esposa Lucy, pela intensa dedicação, cuidado e carinho.
À minha amada mãe, Cléa, por sempre torcer pelo meu sucesso, apoiando-me e
vibrando por cada conquista da minha vida profissional e pessoal.
Aos meus amados irmãos, Paulo e Luiza, minhas almas-gêmeas, pela presença no
coração mesmo quando distantes e por cuidarem do meu Napô e ajudarem com
meu Kevin e Fofiiiinho, durante minha ausência. Ao Dani, meu cunhadinho, pelos
helps, principalmente quando se trata de computador.
À minha orientadora, Tereza Cristina, pela oportunidade, amizade, compreensão
pelas intercorrências durante o caminho, por todos ensinamentos transmitidos, e
À minha amada avó Daisy, meu exemplo de vida, amor, otimismo, sabedoria, força e
fé, que todos os dias, logo pela manhã “atormenta” os santos para que meu caminho
seja muito bem conduzido e trilhado.
A todos os meus animais, mesmo os que já se foram, pelo amor incondicional.
Apenas a lembrança de um olhar, de cada um de vocês, já é o suficiente para fazer
o meu dia e a minha vida mais feliz.
A todos os animais do mundo, de todas as espécies e a natureza, por mostrar sua
sabedoria e dar o exemplo de como se viver em harmonia. A cada novo
aprendizado, minha mais profunda admiração.
À D. Cynira, pela moradia e todo carinho e cuidado durante todo o meu mestrado. E
ao seu filho, Tuca, pela nova grande amizade.
Aos meus especiais amigos Fê, minha prima Rê, Enzo, Câmi, Paulinha, Denise, Ri
Müllenmeister, Ri Rosa, Beta, pela sempre presente amizade ao longo do meu
mestrado.
Ao meu guru, Lama Kalden, por me instruir e colaborar sempre no meu crescimento
pessoal. E a todos do Centro Budista Djampel Pawo.
Aos meus queridos professores, minha xará Maria Cecília, Iveraldo, pela grande
Ao Prof. Jerez, pela oportunidade do estágio junto a seu departamento, pelos
ensinamentos e carinho. Ao Alê Sanches, grande amigo e sempre ajudando no que
for preciso. E a Laura, também por ter me acompanhado e ajudado no estágio.
À Sadia, unidade de Uberlândia.
Ao Sérgio Lemos pela busca das amostras necessárias para a realização do projeto
e a Gilmara pela grande ajuda no laboratório.
À Isabel Pereira de Matos, bibliotecária responsável pela unidade do Câmpus da
Medicina Veterinária, pela correção da dissertação.
A todos os professores que fazem parte do programa de Pós-graduação.
TEIXEIRA, M.C.B. Detecção do TCoV (Turkey Coronavirus) a partir de amostras
provenientes de perus (Meleagris gallopavo) com quadro agudo de enterite. 2006.
86 f. Dissertação de Mestrado – Faculdade de Odontologia, Curso de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2006.
RESUMO
O Complexo de Enterite de Perus (PEC) tem sido incriminado como uma das maiores causas de perdas econômicas em outros países. Neste estudo, foi demonstrado causando diarréia, perda de peso e na maioria das vezes alta mortalidade em perus acometidos de enterite com 30-120 dias de idade de uma determinada região produtora no Brasil. A RT-PCR foi aplicada em suspensões de intestinos (SI) (n=2), respectivos conteúdos intestinais (CI) (n=2), bursa de Fabrícius (BF), fezes (F) (n=5) e swabs cloacais (SC) (n=44), para amplificar a região conservada 3`UTR e gene do nucleocapsídeo de TCoV. Os exames de histopatologia e imunohistoquímica direta foram realizados para detectar o antígeno TCoV a partir de lâminas de intestinos e bursas infectados. Todos os resultados obtidos nos tecidos marcados, revelaram lesões sugestivas de terem sido causadas pela infecção por TCoV. A marcação positiva da imunohistoquímica direta estava presente em todas as lâminas de intestinos, entretanto, todas as BF analisadas foram negativas. Os achados de RT-PCR foram positivos para TCoV em todas as amostras de fezes e 27,27% das amostras de SC foram positivas para a região 3`UTR e região TCoV nucleocapsídeo. As amostras de soro (n=200), foram positivas para TCoV, com títulos variando de 2.0Log a 8.0Log usando o ELISA comercial IDEEX para IBV. Finalmente, o melhor material de campo para o diagnóstico de TCoV foram as fezes (F) e/ou suspensão de intestinos (SI), resultando na primeira descrição de perus com quadro agudo de enterite acometidos por coronavirus Grupo 3 no Brasil.
TEIXEIRA, M.C.B. Detection of Turkey Coronavirus (TCoV) from poults samples (Meleagris gallopavo) presenting acute enteritis. 2006. 86 f. Dissertação de Mestrado
– Faculdade de Odontologia, Curso de Medicina Veterinária, Universidade Estadual Paulista, Araçatuba, 2006.
ABSTRACT
The Poult Enteritis Complex (PEC) has been incriminated as the major cause of losses in other countries, and especially, in this study, was described causing diarrhea, weight gain and most of the time, high mortality. In this study, it was performed the turkey coronavirus (TCoV) detection from 30-120 day old affected poults from a particular producer region in Brazil. The RT-PCR was applied in intestines suspensions (IS) (n=2), respective intestines contents (IC) (n=2), bursa of Fabrícius (BF), faecal droppings (FD) (n=5) and cloacal swabs (CS) (n=44) to amplify the 3´UTR conserved region and TCoV nucleocapsid gene. The histopathological and direct immunohistochemical examinations were performed to detect the TCoV antigen from infected intestine and bursa slides. All results obtained from stained tissues, revealed lesions described to be caused by TCoV infection. The direct immunohistochemical positive signal was present in all intestine slides, however all BF analysed were negative. RT-PCRs findings were positive for TCoV in all FD samples, and 27,27% of CS analysed were positive for 3´UTR and TCoV nucleocapsid region. The sera samples (n=200) were positive for TCoV, with titers range from ≥ 2.0Log to 8.0Log using the IDEEX commercial ELISA for IBV. Finally, the best field material for TCoV diagnosis was FD and/or intestine suspensions (IS), resulting in a first describe of TCoV affecting poults in Brazil.
SUMÁRIO
REVISÃO DE LITERATURA
Introdução
15
Referências
42
OBJETIVO
Objetivo
52
ARTIGO PARA PUBLICAÇÃO
Abstract
56
Introduction
Materials and Methods
Results
Discussion
References
Figure captions
CONCLUSÃO
Conclusão
78
ANEXO A
LISTA DE FIGURAS E QUADROS
QUADRO 1-
Subdivisão em Grupos dos Coronavirus
18
FIGURA 1-
Esquema da partícula viral dos coronavírus
do Grupo 3, protótipo o IBV, vírus da
bronquite infecciosa das aves (Fonte: Dave
INTRODUÇÃO
A importância econômica e social da avicultura brasileira coloca o setor em
evidência no âmbito nacional e internacional. Nesse sentido, o agronegócio avícola
brasileiro movimenta em torno de 10 bilhões de dólares ao ano, representando
quase 2% do PIB do país, além de empregar milhões de pessoas direta e
indiretamente. A produção de perus vem crescendo nos últimos anos de maneira
acentuada, demonstrando um acréscimo de 23% em 2005 sobre a produção de
2002. Em um estudo econômico mais recente, concluíram que foram destinadas
para o mercado interno 161 mil toneladas de carne de perus do total produzido e
para o mercado externo 110,4 mil toneladas, gerando uma receita cambial de US$
152,3 milhões decorrentes das exportações (AVISITE, 2006).
Em face da não sazonalidade do consumo de seus subprodutos, a oferta,
bem como a demanda de carne de perus são acentuadas ao longo de todo o ano
em nosso país. Além disso, a industrialização da carne de peru tem evoluído com
maior participação na elaboração de produtos prontos, como patês, lasanhas,
pizzas, muito solicitados pelo consumidor brasileiro em virtude da sua praticidade.
Com isso, o Brasil consolidou a posição de segundo maior produtor e exportador
de perus, atrás apenas dos Estados Unidos, sendo responsável por 5,1% da
produção mundial. No aspecto de comercialização internacional, o país abriu
novos e importantes mercados, criando novas perspectivas de crescimento e
O coronavirus dos perus (TCoV - Turkey Coronavirus) ocasiona um doença
entérica aguda e altamente contagiosa nas aves, inicialmente denominada de
“doença da crista azul”, sendo esta primeiramente, identificada em perus em 1951
(BRESLIN et al., 2000). Nas décadas de 1950 e 1960, nos Estados Unidos e
Canadá, as severas perdas econômicas foram atribuídas à “doença da crista azul”,
assim como 23% de toda a mortalidade dos plantéis de perus em Minnesota-USA.
Esforços para identificar a etiologia da “doença da crista azul” se extendeu por um
período de 20 anos, até que em 1973 o coronavirus, finalmente, foi incriminado
como o agente etiológico (GUY, 2003).
Nos últimos anos, TCoV tem sido reconhecido como um importante agente
infeccioso de doenças entéricas nos perus, acarretando quadros de diarréia,
resultando em grandes perdas econômicas por prejudicar o crescimento e a
conversão alimentar (CALIBEO-HAYES et al., 2003; GUY et al., 2002; GUY, 2003;
ISMAIL et al., 2003), além dos gastos com medicamentos (CAVANAGH, 2004).
Segundo o Comitê Internacional para Taxonomia de Vírus (ICTV), os
Coronavirus são classificados na ordem Nidovirales, família Coronaviridae, na qual
compreende os gêneros Coronavirus e Torovirus. O gênero Coronavirus é
subdividido em três grupos definidos de acordo com diferenças antigênicas
identificadas por análises sorológicas, análises nas seqüências de nucleotídeos
(Guy, 2003), epítopos presentes na glicoproteína do envelope e também
espécies de mamíferos, incluindo humanos, suínos, cães, gatos, eqüinos, bovinos e
roedores. Os coronavirus do Grupo 3 podem infectar aves domésticas, incluindo o
vírus da bronquite infecciosa das galinhas (IBV), coronavirus dos perus (TCoV) e
coronavirus dos faisões (PhCoV) (GUY et al., 1997), como ilustra o Quadro 1.
As doenças predominantemente associadas com os coronavirus são
infecções entéricas e respiratórias, entretanto doenças hepáticas e neurológicas
podem ocorrer (MARRA et al., 2003). O IBV causa uma doença respiratória aguda
nas galinhas, enquanto que o TCoV causa enterite nos perus (JONASSEN et al.,
Quadro 1 – Subdivisão em Grupos dos Coronavirus
Um surto atípico de pneumonia em humanos, denominado Síndrome Aguda
Respiratória Severa (SARS – Severe acute respiratory syndrome), foi identificado
pela primeira vez, na Província de Guangdong, na China. A severidade desta
doença foi comprovada pelos altos coeficientes de mortalidade, que chegaram a
3-6%. Com efeito, muitos laboratórios de Referência Mundial empenharam-se em
identificar o agente e foi determinado como “SARS-virus” pelo World Health
Organization em abril de 2003 (MARRA et al., 2003). O vírus foi isolado, purificado e
seu genoma extraído, resultando como o agente etiológico, um coronavírus. Através
de muitos estudos, concluiu-se que SARS-virus é um novo coronavirus, que por
GRUPO 1
TGEV Transmissible Gastroenteritis Virus
FIPV Feline Infectious Peritonitis Virus
FECoV Feline Enteric Coronavirus
CCoV
Canine Coronavirus
HCoV 229 - E Human Coronavirus 229 – E
PRCoV Porcine Respiratory Coronavirus
PEDV Porcine Epidemic Diarrhea Vírus
GRUPO 2
BCoV Bovine Coronavirus
HCoV OC43 Human Coronavirus – OC43
HEV Porcine Hemagglutinating
Encephalomyelitis Virus
MHV Murine Hepatitis Vírus
RtCoV Rat Coronavirus
EqCoV Equine Coronavirus
CRCV Canine Respiratory Coronavirus Puffinosis Vírus
SDAV Sialodracryoadenitis Virus
GRUPO 3
IBV Infectious Bronchitis Virus
PhCoV Pheasant Coronavirus
TCoV Turkey Coronavirus
GRUPO 4
demonstração de árvores filogenéticas, não foi geneticamente relacionado com
nenhum dos outros coronavirus pertencentes aos 3 grupos já existentes e, portanto,
foi considerado como primeiro representante do “grupo 4”, sendo denominado
SARS-CoV. Diante destes fatos, a partir de sequenciamento, uma hipótese foi
criada, de que um vírus animal em seu hospedeiro natural, tenha recentemente
sofrido mutações e, dessa forma desenvolveu a habilidade de infectar humanos e,
conseqüentemente, produzir doença clínica (MARRA et al., 2003).
As partículas virais dos coronavírus são envelopadas, possuem como
genoma uma fita de RNA simples, não segmentada com sentido positivo, e
apresentam-se pleomórficos quando examinados a microscopia eletrônica. O
diâmetro da partícula viral varia entre 50 a 150 nm. O virion possui um envelope
formado por uma bi-camada lipídica, da qual se projetam as proteínas da matrix viral
(M), glicoproteína (Spike protein - S), hemaglutinina estearase (HE – 120-140
kilodaltons [kDa]), dando uma aparência morfológica de coroa solar (do latim
corona). As três maiores proteínas estruturais da partícula viral incluem a S (90-180
kDa), M (20-35 kDa) e a proteína do nucleocapsídeo (N – 45-60 kDa) (GUY, 2002,
2003; LIN et al. 2002a; LOA et al., 2000), como ilustra a Figura 1.
A hemaglutinina estearase (HE) é uma proteína exclusiva dos coronavirus
do grupo 2, sendo este um gene homólogo ao do vírus da Influenza tipo C,
sugerindo que o precursor dos coronavirus do grupo 2 adquiriu HE como resultado
de eventos de recombinação num hospedeiro com dupla infecção (MARRA et al.,
A proteína S (glicoproteína) é a principal proteína estrutural do envelope.
Esta confere a aparência espiculada do virion e é o principal alvo para anticorpos
neutralizantes. Contém epítopos específicos, sendo altamente variáveis entre os
diferentes coronavirus. A subunidade S2 forma a haste da espícula, responsável
pela fusão de membranas e formação de sincícios. A subunidade S1 forma o bulbo
da proteína S, é muito mais variável que a subunidade S2 e apresenta a função
biológica de ligação do vírus às células pela fusão do envelope viral com a superfície
celular (CAVANAGH, 2005). Por formar o bulbo da proteína S, a subunidade S1
contém a maior parte de sítios antigênicos, portanto o segmento do genoma que a
codifica é mais exposto a pressões seletivas imunológicas e, assim, mais propenso
ao encontro de polimorfismo que os demais genes e proteínas dos coronavírus
(Figura 1).
Em contraste, as proteínas M e N são mais conservadas entre os diferentes
grupos antigênicos (LIN et al., 2002b; LOA, et al., 2000). A proteína M tem como
FIGURA 1-Esquema da partícula viral dos coronavírus do Grupo 3, protótipo o IBV,
vírus da bronquite infecciosa das aves (fonte: DAVE CAVANAGH,
2005). M: matrix viral; N: nucleoproteína; S: glicoproteína.
A proteína não-estrutural mais estudada dos coronavírus é a RNA
polimerase RNA-dependente, que é produto do gene 1 (pol). Esta proteína é
responsável pela transcrição e replicação viral, sendo altamente conservada mesmo
entre espécies de grupos diferentes entre os coronavirus (GUY, 2003).
S protein
RNA
S1
S2
M
Estudos envolvendo o emprego das técnicas de imunofluorescência e
imunoperoxidase demonstraram que o TCoV realiza sua replicação primária,
primeiramente nos enterócitos do jejuno e íleo, predominantemente no ápice das
vilosidades intestinais e no epitélio folicular e interfolicular da bursa de Fabrícius. Em
embriões experimentalmente inoculados, a replicação ocorre exclusivamente nas
células do epitélio intestinal e epitélio da bursa de Fabrícius. Neste sentido, o
processo de transcrição viral ocorre no citoplasma celular e o TCoV adquire o
envelope pelo processo de brotamento, adquirindo membranas lipoproteicas do
retículo endoplasmático e aparelho de Golgi (GUY, 2003).
Como conseqüência desta infecção, as lesões macroscópicas são
observadas primariamente nos intestinos e bursa de Fabrícius. Nesse sentido,
duodeno e jejuno geralmente ficam pálidos e flácidos e o ceco distendido e com
conteúdo aquoso, acompanhados de atrofia de bursa, além de emaciação e
desidratação (GUY, 2003).
Da mesma forma, as lesões microscópicas são observadas nos intestinos e
bursa dos animais infectados. Nos intestinos ocorre o encurtamento das vilosidades,
o aprofundamento das criptas e diminuição do diâmetro intestinal. Observa-se a
separação da lâmina própria dos enterócitos e sua infiltração por heterófilos e
linfócitos. Mudanças nas células epiteliais também são vistas na bursa de Fabrícius
2 dias pós-infecção, como necrose e hiperplasia, assim como intensa inflamação
Em relação às propriedades biológicas, o TCoV é estável em pH 3 a 22°C
por 30 minutos e resistente a 50°C por uma hora, até mesmo na presença de 1M de
sulfato de magnésio. O vírus é inativado com clorofórmio a 4°C por 10 minutos. O
TCoV tem se mostrado permanecer viável em tecidos intestinais armazenados a -
20°C ou menos, por mais de 5 anos. Cresol e formaldeído são eficientes para
eliminar TCoV de ambientes contaminados (GUY, 2003).
O quadro de enterite ocasionado pela infecção viral afeta perus de todas as
idades e tem período de incubação de 1 a 5 dias (ISMAIL et al., 2003; SELLERS et
al., 2004), com morbidade podendo chegar a 100% (DALTON et al., 2002; HEGGEN
et al., 1998; LOA et al., 2000; SELLERS et al., 2004) e a mortalidade pode estar
associada a aves jovens, variando entre <10 a 50 % ou mais (CAVANAGH, 2004;
HEGGEN et al.,1998; SELLERS et al., 2004) e em aves adultas, a infecção
caracteriza-se como debilitante (CAVANAGH, 2004; 2005). Os perus com enterite
por coronavirus apresentam depressão, anorexia, hipotermia, desidratação, perda de
peso e secreção nasal (CAVANAGH, 2004; GUY, 2003).
O vírus também tem sido associado como um dos agentes causais da
“Síndrome da Enterite e Mortalidade dos Perus” (PEMS - Poults Enteritis and
Mortality Syndrome), uma doença caracterizada por alta mortalidade, severo déficit
no crescimento e imunodisfunção (CALIBEO-HAYES et al., 2003; CAVANAGH et al.,
como timo, bursa e baço, por estes serem alvos dos agentes da PEMS, com
conseqüente redução na resposta primária de anticorpos (HEGGEN et al., 1998).
A etiologia da PEMS, ainda, é desconhecida. Muitos agentes virais,
incluindo Coronavirus, Vírus da doença infecciosa da bursa, Rotavirus (Grupo D),
Reovirus e Adenovirus têm sido identificados em perus com PEMS (GUY, 2003;
HEGGEN et al., 1998; SPACKMAN et al., 2005). Além do coronavirus, outro vírus
fortemente associado a PEMS é um Astrovirus (CAVANAGH, 2004; ISMAIL et al.,
2003; SELLERS et al., 2004; SPACKMAN et al., 2005). Além disso, bactérias podem
exacerbar as conseqüências de uma infecção viral, entre elas a Escherichia coli (YU
et al., 2000). Na Carolina do Norte, aonde se concentram os maiores grupos de
pesquisa na área, o TCoV foi identificado em 63% dos lotes apresentando PEMS
(LOA et al., 2000). Porém, Carver et al. (2001), através de estudos indicam que
TCoV pode estar associado a PEMS ou não necessariamente, assim como somente
a infecção por TCoV não é suficiente para causar a síndrome na sua totalidade.
Segundo Ismail et al. (2003), a PEMS afeta principalmente perus com idade
entre 1 a 4 semanas. Os sinais clínicos (anorexia, perda de peso, secreção nasal,
diarréia, desidratação, déficit no crescimento) podem persistir por mais de duas
semanas. Cavanagh (2004) afirma que, se 40% ou mais das aves com idades entre
7 e 28 dias apresentarem esta sintomatologia e, as mortes excederem 2% neste
período, estas são consideradas acometidas com PEMS. Uma forma mais severa
de PEMS é chamada Spiking Mortality Syndrome of Turkeys (SMT) com mortalidade
ou mais dias consecutivos, a mortalidade pode ser de 1% ou mais. Uma forma
menos severa de PEMS é chamada Excess Mortality Syndrome (EMS) com
mortalidade abaixo de 1% em três dias consecutivos. Tanto a SMT quanto EMS
podem ocorrer concomitantemente no mesmo lote, indicativo de que outros fatores
podem estar presentes exacerbando a infecção viral (CAVANAGH, 2004).
Os TCoV são eliminados nas fezes de aves infectadas, com transmissão
horizontal, a partir de ingestão de fezes contaminadas e de materiais contaminados
com fezes, respectivamente. O TCoV é transmitido rapidamente no plantel ou de um
plantel a outro. Os principais transmissores mecânicos do vírus são o homem,
equipamentos, veículos, assim como aves selvagens, roedores, cães e insetos
(GUY, 2003).
É importante enfatizar que não existe vacina para TCoV (CAVANAGH,
2004; SELLERS et al., 2004), sendo o controle da enfermidade muito importante,
uma vez que o tratamento para a doença geralmente não obtém sucesso e não há
medicamento que previna a infecção. Além disso, a enterite por coronavirus não é
facilmente eliminada em áreas com alta concentração de perus (LOA et al., 2006).
Portanto, deve-se aumentar o monitoramento quanto à presença do vírus nos lotes,
e atuar com medidas preventivas, onde as de higiene são fundamentais. Os animais
devem, preferencialmente, ser separados por idade, pois este é um elemento
essencial para reduzir a incidência da doença. Outras medidas de biossegurança
devem ser tomadas, como remoção de aves mortas, diminuição do tráfico
é excretado em grandes quantidades nas fezes, qualquer indivíduo, inclusive os
humanos podem espalhar a doença, além de outros animais domésticos
(CAVANAGH, 2004). O Coronavirus bovino (BCoV), em infecções experimentais, foi
capaz de causar a doença em perus (ISMAIL et al., 2001), portanto devem-se obter
medidas de segurança quando houver tráfico entre essas duas espécies.
Calibeo-Hayes et al. (2003) relatam que mesmo com medidas de
biossegurança implantadas ocorreram surtos de TCoV na Carolina do Norte que,
coincidentemente, aumentam nos meses de verão, associado ao aumento da
população da mosca doméstica e, através de pesquisas, foi descrito que a mosca
doméstica pode ser um potencial transmissor mecânico. Portanto, um efetivo
controle em áreas endêmicas de TCoV é diretamente dependente do controle da
população desses transmissores mecânicos, por meio do manejo do lixo, remoção
adequada de aves mortas e uso intenso inseticidas.
Durante a década de 1980, análises sorológicas indicavam que o TCoV
possuía propriedades antigênicas próximas ao BCoV, sendo colocado no mesmo
Grupo 2 do coronavirus. Esta classificação permaneceu até o final da década de
1990, quando pesquisas demonstraram que os coronavirus, isolados de casos de
enterite em perus, são geneticamente e antigenicamente similares ao vírus da
bronquite infecciosa das galinhas (IBV - infectious bronchitis virus) (BRESLIN et al.,
1999; CAVANAGH, 2004; 2005; GUY et al., 1997; ISMAIL et al., 2003; LIN et al.,
2002b). Os resultados revelaram a existência de 85 a 90% de similaridade em
codificam as proteínas M e N (ISMAIL et al., 2003), sendo uma porcentagem alta, já
que estirpes de IBV diferem entre si na mesma proporção. Na região do gene que
codifica a glicoproteína (spike gene), recentes estudos revelaram que TCoV e IBV
possuem 34% de similaridade, sendo esta baixa, se comparada entre as estirpes de
IBV que possuem similaridade entre si de 75 a 85% e em alguns sorotipos até 60%.
Por outro lado, a proteína S de três isolados diferentes de TCoV
demonstraram 91% de similaridade na análise de seus aminoácidos, revelando um
alto grau de conservação se comparado ao que ocorre entre as estirpes do IBV
(CAVANAGH, 2005). Diante disto, o TCoV foi classificado no grupo 3 dos
Coronavirus, o mesmo grupo do IBV. Na mesma linha de raciocínio, Akin et al.
(2001), Breslin et al. (1999) e Loa et al. (2004) sequenciaram toda a estrutura
genética da proteína do nucleocapsídeo de TCoV e, constataram que > 90% de toda
a sua extensão compartilha similaridade com a nucleoproteína do IBV. Desde aí
então, esta região é escolhida para desenvolvimento de testes sorológicos que
envolvam a detecção de grupos específicos, por constituir-se de uma porção
conservada e altamente antigênica. É importante enfatizar, que o TCoV e IBV
possuem menos que 21% de similaridade na nucleoproteína com o BCoV (BRESLIN
et al., 1999).
Com efeito, Breslin et al. (1999) demonstraram também que a região 3`UTR
(untranslated region) possui 90,8-96,0% de similaridade entre os tipos de TCoV
quando comparados entre si, 78,5-94,4% de similaridade com o IBV e menos de
Estudos moleculares com IBV têm revelado que novos sorotipos e
genótipos podem surgir como resultado de pequenas alterações, ou mutações na
seqüência de aminoácido, do gene S1, além de poder sofrer recombinação durante
infecções mistas ou concomitantes (LIU et al., 2003).
Em estudos no Brasil, Ito et al. (1991), isolaram Coronavirus de faisões
(Guinea fowl) (PhCoV), a partir de uma ave doméstica adulta. A ave apresentava
emagrecimento, desidratação, enterite, pancreatite e nefrite. O isolamento foi
realizado em ovos embrionados de galinha de 9 - 11 dias de incubação pela via
córion-alantóide, o que originou como alterações embrionárias o nanismo e
enrolamento tipicamente observados na infecção pelo coronavirus. Na microscopia
eletrônica foram evidenciadas partículas virais semelhantes ao coronavirus; na
sorologia realizada em lotes de aves comerciais de postura observaram-se títulos de
anticorpos altos na técnica de inibição da hemaglutinação para o mesmo antígeno
obtido a partir do vírus isolado. Da mesma forma, os vírus de faisões podem replicar
na cavidade cório-alantóide de ovos de galinhas e têm sido associados a quadros de
nefrite (CAVANAGH, 2004).
Na Inglaterra, Cavanagh et al. (2002), em um estudo longitudinal,
demonstraram que coronavirus presentes em faisões (Phasianus colchicus), em
aves de postura e corte (Gallus gallus) e em perus (Meleagris gallopavo) possuem
um alto grau de similaridade genética, entretanto são biologicamente diferentes. Os
TCoV atingem o trato alimentar, incluindo a bursa de Fabricius, causando um quadro
TCoV que resultou em replicação viral, porém com ausência de doença clínica (GUY
et al., 1999 apud CAVANAGH, 2004). Em outro experimento, o TCoV demonstrou
baixa patogenicidade para aves domésticas (CAVANAGH, 2004). Entretanto, o fato
de ocorrer a replicação viral nos intestinos destas respectivas aves pelo TCoV, gera
suposição sobre o potencial papel das galinhas como carreadores transitórios do
vírus a infecção de lotes de perus susceptíveis (ISMAIL et al., 2001). Do mesmo
modo, IBV tem sido incriminado a apresentar replicação em outras aves galináceas
e, algumas não-galináceas, com ausência de sintomas clínicos, podendo, estas
aves, atuarem como transmissor de IBV, visto que as mesmas voam e podem
carrear estirpes de IBV por longas distâncias para outras espécies aviárias
(CAVANAGH, 2004).
A organização genômica do IBV é: 5`-replicase- S-3-M-5-N-3´UTR. Da mesma forma, o coronavirus dos perus e dos faisões apresentam a mesma
estrutura: 5´-replicase-S-3-M-5-N-3´UTR. Conseqüentemente, a classificação ficou mais clara onde tanto o IBV, como o TCoV e PhCoV foram classificados no mesmo
Grupo 3 (CAVANAGH et al., 2002), diferentemente dos coronavirus dos mamíferos,
que por sua vez, são sub-divididos em Grupos 1 e 2 (ENJUANES & CAVANAGH,
2001 apud CAVANAGH et al., 2002). O sequenciamento também demonstrou que
estes três coronavirus, de perus, faisões e galinhas possuem 97% de homologia em
seu genoma, portanto, são muito semelhantes. Entretanto, quando se avaliam seus
aspectos biológicos, pode-se observar diferenças marcantes. Diante das análises
evidenciaram-se no mínimo 5 espécies de aves susceptíveis ao mesmo coronavirus,
semelhantes ao IBV, na Europa e USA (CAVANAGH et al., 2002).
Recentemente, Gough et al. (2006) isolaram um vírus do papagaio
amazônico da face verde (Amazon viridigenalis Cassin) a partir de cultura celular
primária e por microscopia eletrônica foi sugerido ser um coronavirus, confirmado
pela utilização de um pan-coronavírus RT-PCR que amplificou parte do gene 1 que
codifica a proteína não-estrutural RNA-dependente RNA polimerase. A seqüência
obtida de 66 aminoácidos resultou em 66-74% de similaridade com as seqüências
dos coronavirus dos Grupos 1, 2 e 3. Porém, muitos outros pares de primers que
produzem produtos na reação de PCR correspondendo aos genes 3, 5, N e região
3`UTR do IBV, TCoV e PhCoV, não amplificaram nenhum dos genes estudados,
sugerindo haver um novo coronavirus, sendo pela primeira vez descrito em espécie
de psitacídeo.
Um outro estudo feito por Jonassen et al. (2005), identificou um novo
coronavirus isolado a partir de espécies de aves selvagens (Anser anser, Columbia
livia, Anasplatyrhynchos), afirmando pertencer ao Grupo 3 dos coronavirus aviários.
No Brasil, não há nenhum relato da situação desta doença, bem como a
presença deste vírus circulando entre os plantéis de perus comerciais. A extensão
da infecção por coronavirus em perus, além da Inglaterra e América do Norte, é
De acordo com Heggen et al. (1998), as células imunocompetentes
envolvidas na resposta celular da PEMS são os monócitos e macrófagos
(denominadas heterófilos nas aves), demonstrando que a imunedisfunção
relacionada a PEMS é associada à atrofia de órgãos linfóides, reduzindo a resposta
de anticorpos. Neste sentido, a PEMS causa alterações nas células
imunocompetentes, incluindo uma baixa regulação da função dos macrófagos,
redução na expressão da subpopulação de linfócitos no timo e alterações na
proporção de linfócitos CD4+:CD8+ no baço. A imunidade humoral e celular foram
estimuladas em perus, experimentalmente infectados com o TCoV, onde a
proliferação de linfócitos aumentou a partir de 3 dias pós-infecção (PI) em um dos
experimentos. A presença de IgA foi observada nos intestinos até 7 dias PI, com a
resposta declinando de 14 a 28 dias PI, em contrapartida, a resposta de IgG
aumentou a partir de 21 PI e manteve-se alta até 63 PI (LOA et al., 2001).
Entretanto, a mensuração de anticorpos sistêmicos pode não ser um indicador
seguro da imunidade local. A interação entre a cinética e magnitude da resposta de
IgA na mucosa intestinal em perus e em infecções agudas por coronavirus em perus
não são completamente entendidas (LOA et al., 2002).
O diagnóstico da infecção por TCoV geralmente necessita de suporte
laboratorial, uma vez que diversos patógenos, como outros vírus, bactérias e
protozoários de perus podem provocar sinais clínicos e lesões semelhantes, dessa
Os meios diagnósticos laboratoriais são baseados no isolamento viral (IV),
microscopia eletrônica (ME), sorologia, ou identificação de antígenos ou RNA viral
de tecidos ou conteúdos intestinais, bem como da bursa de Fabricius (GUY, 2003).
No que tange ao isolamento destes agentes virais, o IBV e o PhCoV podem
ser propagados em ovos embrionados de galinha livres de patógenos específicos de
9-11 dias de idade, inoculados pela via córion-alantóide. Já o TCoV propaga-se com
sucesso em ovos embrionados de galinhas e perus, quando inoculados na cavidade
aminiótica (GUY, 2003; ISMAIL et al., 2003). Somente são encontrados vírus dos
intestinos, gema e bursa de Fabricius dos embriões de perus inoculados (GUY,
2003).
Entretanto, face à importância de se isolar o patógeno envolvido no quadro
clínico, essencial para estudos fundamentais, análises antigênicas, produção de
vacinas e observação de patogenicidade, este procedimento é demorado e
necessita de fornecimento contínuo de ovos embrionados livres de patógenos
específicos, o que torna esta técnica cara e laboriosa (CAVANAGH et al., 1997).
Muitas tentativas feitas de se propagar TCoV em cultura celular, de aves e
de mamíferos, não obtiveram sucesso, embora Dea et al. (1989) descreveram o
isolamento de TCoV em células HRT-18, uma linhagem derivada de
adenocarcinoma de reto humano. Esta célula, por sua vez, tem sido reportada como
susceptível a estirpes de coronavirus bovino, canino e humano. A susceptibilidade
características normais do enterócito, particularmente, a presença das
microvilosidades, nas quais os receptores virais estão provavelmente localizados.
Uma outra possibilidade seria a presença de receptores específicos nas células
HRT-18 para os coronavirus bovinos e de perus como resultado da transformação
oncogênica. Porém, Guy (2003) não corrobora com a hipótese de isolamento em
células HRT-18, assim como outros pesquisadores. Segundo o autor, as
discrepâncias entre recentes estudos genômicos e antigênicos de TCoV e prévios
estudos que indicavam similaridade entre TCoV e os coronavirus do Grupo 2 são
difíceis de explicar. De acordo com o pesquisador, estes estudos foram baseados na
propagação de TCoV em células HRT-18. Talvez esta propagação tenha ocorrido
por um erro laboratorial e resultou na contaminação do meio de cultura ou das
células HRT-18 com coronavirus do Grupo 2, como um coronavirus bovino,
concomitantemente ao se propagar o TCoV, levando a suposições errôneas que os
efeitos citopáticos e atividades hemaglutinantes produzidas ocorreram em
decorrência da infecção por TCoV.
Por outro lado, quando o isolamento do agente não é essencial e sim a
detecção da sua presença, as técnicas de biologia molecular com sensibilidade,
sensitividade e rapidez, tornam-se ideais para diagnóstico. Aliado à dificuldade de se
isolar o TCoV que, por sua vez, só se propaga em ovos embrionados de perus
quando inoculados na cavidade alantóide ou cório-alantóide, a detecção dos
coronavírus através da técnica de RT-PCR (Reverse Transcriptase Polimerase
Chain Reaction), torna-se uma alternativa ideal. Na Grã-Bretanha, em estudos
2002), a técnica de RT-PCR é a de escolha, tendo sido largamente utilizada para o
diagnóstico de diversos patógenos de amostras clínicas devido a alta sensitividade
(LOA et al., 2006).
Além do isolamento viral, os meios diagnósticos mais freqüentemente
utilizados para detectar infecção por TCoV são a imunofluorescência (IF) direta e
indireta em cortes de congelação, a imunoperoxidase (IP), microscopia eletrônica
(ME), imuno ME, ELISA de captura e a reação de PCR (SPACKMAN et al., 2005).
A IF é mais rápida que o isolamento viral e apesar de ser um dos mais
importantes métodos para medidas de controle de PEMS na indústria de perus (LOA
et al., 2000), requer microscópio com luz ultravioleta, anti-soro específico para o
vírus e cortes de congelação de tecidos sem início de necrose (BRESLIN, et al.,
2000), além de ser altamente laboriosa e demorada, principalmente quando aplicada
a um grande número de amostras clínicas (LOA et al., 2000).
Por outro lado, a ME necessita de grande quantidade de partículas virais
para que seja possível a visualização (SELLERS et al., 2004). Então, a identificação
definitiva do TCoV pode ser realizada pela imuno-microscopia eletrônica, porém é
necessário um anti-soro específico, além do microscópio eletrônico e de
A técnica de imunoperoxidase (IP) tem sido aplicada com sucesso para o
diagnóstico de muitas infecções virais, evidenciando o antígeno viral no tecido, tendo
como vantagem em relação a imunofluorescência o uso do microscópio
convencional e dos detalhes histológicos serem preservados, além da maior
sensibilidade (BRESLIN, et al., 2000; HUSSAIN; NAGAJARA, 1993).
As reações imunoenzimáticas, preservada as suas características
biológicas, têm sido empregadas no diagnóstico de TCoV. A detecção de TCoV por
ELISA de captura foi demonstrado por Loa et al. (2000) usando IBV como antígeno.
Este método não pode diferenciar TCoV de IBV devido a reação cruzada de
anticorpos (LOA et al., 2006), por isso, as placas de ELISA comerciais disponíveis
anti-IBV, podem detectar anticorpos anti-TCoV com a mesma eficiência quanto a alta
sensibilidade e especificidade para IBV, não havendo reação cruzada com
anticorpos específicos contra diferentes vírus aviários, como o rotavirus, reovirus,
adenovirus ou enterovirus (LOA et al., 2000). Embora a detecção de anticorpos seja
conveniente e barata, a soroconversão pode demandar tempo e tornar, dessa forma,
o diagnóstico tardio.
A modalidade de ELISA de captura tem se mostrado altamente sensível
(93,1%) e específica (96,7%), quando comparado com a IF indireta (GUY, 2003),
além de não ser necessário o uso de equipamentos caros e cortes de congelação de
intestinos de embriões ou células da bursa de Fabricius de perus infectados
experimentalmente com TCoV. Para tanto, o desenvolvimento de ELISA de captura
qualidade, o que dificulta a sua aplicabilidade. Outro fator preponderante é a
inabilidade de propagar TCoV em cultura celular. Diante disso, os antígenos são
adquiridos a partir de intestinos e conteúdos intestinais, o que limita os ensaios
biológicos obtidos pela inoculação experimental em ovos embrionados de perus
livres de patógenos específicos (GUY et al., 2002; LOA et al., 2000).
Para a realização da sorologia, o ensaio de ELISA bloqueio de fase líquida
(ELISA-BFL) mostrou ser altamente específico (95,3-100%) e sensível para
detecção de anticorpos anti-IBV, demonstrando ser mais eficiente que a técnica de
soroneutralização (SN), sendo uma alternativa para a detecção de anticorpos contra
IBV entre os diagnósticos de rotina (CARDOSO et al., 1999). Da mesma forma, a
técnica de ELISA-BFL demonstrou melhor sensibilidade relativa que as técnicas de
ELISA sanduíche (ELISA) e ELISA indireto (I-ELISA), apesar das técnicas de
S-ELISA e I-S-ELISA apresentarem maior especificidade relativa (CARDOSO et al.,
2001). Vale ressaltar, que a alta especificidade dos testes sorológicos é relevante,
no que tange a sensibilidade em aves domésticas, compensada pela análise de
grande número de amostras de soro (CARDOSO et al., 1999).
A técnica da Reação em Cadeia pela Polimerase (PCR) para detecção de
ácidos nucléicos de amostras clínicas tem a vantagem de ser mais sensível e
específica se comparada com outros métodos diagnósticos convencionais
(BRESLIN, et al., 2000). Entretanto, a sensibilidade e especificidade da PCR podem
ser influenciadas pela natureza das amostras, pois algumas amostras podem conter
da PCR, sendo que para mantê-la alta, pode ser necessária a purificação prévia do
RNA para remover estes inibidores, evitando resultados falso-negativos (LOA et al.,
2006). Segundo revelam Spackman, et al. (2005), as amostras de swabs cloacais se
mostraram adequadas para o diagnóstico de TCoV e obtiveram correlação positiva
para detecção viral por RT-PCR com as amostras de tecidos intestinais,
apresentando as vantagens da facilidade da coleta a partir de um grande número de
animais e do processamento das amostras serem mais fáceis quando comparadas
ao das amostras de tecidos intestinais, economizando tempo e dinheiro, além não
haver necessidade de eutanasiar as aves.
A PCR permite amplificar um segmento específico de uma molécula de DNA
usando dois primers ou iniciadores (seqüências curtas de nucleotídeos)
complementares às extremidades do segmento que se quer amplificar e uma DNA
polimerase. Na reação, a molécula de DNA é inicialmente desnaturada pelo aumento
da temperatura ocorrendo separação da dupla fita. Com a diminuição da
temperatura o primer se pareia ou hibridiza com a seqüência complementar presente
nas extremidades do segmento que será copiado. A partir do primer, a DNA
polimerase sintetiza o trecho de fita complementar a cada uma das fitas originais. Os
ciclos de desnaturação, hibridização e extensão se repetem muitas vezes,
resultando em milhões de cópias do segmento desejado, sendo o primer escolhido
responsável pela definição do segmento de DNA que será amplificado. Outros
fatores que influenciam na especificidade da reação são a temperatura de
anelamento, concentração de magnésio, o conteúdo de bases C e G do primer,
A técnica de RT-PCR permite amplificar trechos codificantes a partir de
moléculas de mRNA, onde após a extração do RNA sintetiza-se uma fita única de
DNA complementar ao mRNA (cDNA) a partir de uma enzima transcriptase reversa
de origem viral. Então, a partir do cDNA emprega-se o método usual de PCR para
amplificação (EÇA et al., 2004).
A reação de multiplex RT-PCR tem sido recentemente descrita para
detectar inúmeros vírus respiratórios aviários e pode também ser incorporada na
rotina diagnóstica de inúmeros organismos e contribuir para um efetivo manejo e
controle de surtos virais (SELLERS et al., 2004).
Para se detectar coronavirus das aves pela técnica de RT-PCR, muitos
isolados de IBV, TCoV e PhCoV foram seqüenciados, principalmente a região da
glicoproteína (S). Em virtude da alta variabilidade deste gene entre estes vírus, não
se apresenta como o mais adequado para selecionar as seqüências com as quais
são feitos os oligonucleotídeos iniciadores (primers) para a detecção dos coronavirus
do grupo 3. A outra região mais seqüenciada é a do gene no nucleocapsídeo N e da
região 3`UTR. Os nucleotídeos da região 3`UTR é uma das partes mais conservadas
do genoma do IBV, sendo essencial para replicação. A partir disto, foram
desenhados primers UTR3-/UTR4+ para detectar 25 isolados diferentes de IBV,
então estes foram modificados com seqüências adicionais dando origem aos primers
UTR11-/ UTR41+ tornando-se viáveis para detecção de TCoV e outras novas
estirpes de IBV. Os primers UTR11-/ UTR41+ têm demonstrado serem efetivos e
confirmando a natureza altamente conservada da região 3`UTR (CAVANAGH,
2005). Devido à similaridade genômica e antigência do IBV e TCoV, a técnica de
RT-PCR para detecção de TCoV em perus foi desenvolvida com primers previamente
utilizados para a detecção do IBV (BRESLIN et al., 2000).
Stephensen et al. (1999) utilizaram os primers 2Bp e 4Bm para amplificar
uma região conservada do gene RNA-dependente de RNA polimerase (gene pol)
entre diferentes coronavirus que, inicialmente, foram utilizados para diagnóstico de
TCoV a partir de amostras intestinais. Entretanto, os resultados dessas reações de
PCR não foram consistentes em muitas triagens. Além do mais, os ciclos utilizados
foram longos e complicados em comparação com a utilização de outros primers
descritos em outros estudos (LOA et al., 2006).
Neste sentido, Breslin et al. (2000) demonstraram através de estudos que
RT-PCR é um método eficiente para detectar TCoV de conteúdos intestinais, sendo
mais sensível que a imunohistoquímica, menos laboriosa e menos dispendiosa em
relação ao tempo, que o isolamento viral, pois a RT-PCR pode ser concluída num
período de 24 horas, sendo portanto uma alternativa para os procedimentos
convencionais de diagnóstico.
Da mesma maneira, Velayudhan et al. (2003) confirmam a alta
especificidade, sensibilidade e rapidez da técnica de RT-PCR se comparado com
concentrações do RNA viral mensurados através de espectofotometria, foi também
testada a especificidade dos primers utilizados no trabalho para detecção de TCoV
com outros RNA e DNA vírus aviários. Os autores também demonstraram que os
primers desenhados com base na proteína S do genoma do IBV amplificaram
somente IBV e não TCoV, nas mesmas condições dos primers para TCoV. As
amostras positivas e negativas haviam sido previamente testadas pela IF,
obtendo-se os mesmos resultados.
Segundo os mesmos autores, as amostras oriundas de conteúdos
intestinais, o que pode acarretar inibições enzimáticas da reação de RT-PCR. Um
procedimento muito comumente adotado é a centrifugação do material clínico,
gerando um sobrenadante utilizado para a detecção de TCoV. Os resultados
falso-negativos das 16 amostras positivas testadas pela IF e RT-PCR foram nulos,
indicando que este procedimento foi simples e altamente eficiente, principalmente
quando se tem grande número de amostras a serem processadas. Porém, quando a
mesma RT-PCR foi usada pra testar BCoV e TGEV dos suínos, produtos foram
amplificados com temperatura de anelamento de 55°C, mas não a 60°C, fato que
pode ser atribuído pela amplificação não-específica a baixa temperatura de
anelamento. Outra hipótese deve-se a similaridade genômica entre TCoV e BcoV,
descritas em diversos estudos anteriores (VELAYUDHAN et al., 2003).
Diante de todo exposto e, face aos escassos trabalhos existentes com
TCoV no Brasil, aliado ao crescimento acentuado da produção de perus no mercado
investigação científica. O objetivo principal está alicerçado na detecção da presença
de TCoV em perus acometidos por quadros agudos de enterite. Em virtude da
literatura consultada, incriminando o vírus como um dos agentes etiológicos de
enterite e diarréia nos plantéis de perus, acarretando sérias perdas econômicas nos
Estados Unidos e Canadá, a detecção precoce do vírus por meio de métodos de
diagnóstico rápidos, específicos e sensíveis, pode colaborar para que sejam
tomadas medidas adequadas de biossegurança no controle e profilaxia desta
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OBJETIVO
- Detectar a presença de Coronavirus de perus (TCoV) em aves comerciais de
30-100 dias, acometidas de quadros agudos de enterite, a partir de diferentes
materiais;
- Testar diferentes condições de RT-PCR na detecção de TCoV de materiais
provenientes de swabs cloacais, suspensão de intestinos com conteúdo
intestinal, sem conteúdo intestinal, suspensão de bursa de Fabrícius, fezes
individuais e pool de fezes de lotes de perus, apresentando quadros de
enterite;
- Aplicar a RT-PCR nestes diferentes materiais visando a amplificação da
região 3´UTR e nucleocapsideo do TCoV, e comparar os resultados positivos
e negativos com os achados da histopatologia e imunohistoquímica.
- Avaliar as lesões histopatológicas em cortes de intestinos e bursa de
Fabricius.
- Aplicar a técnica de imunohistoquímica em cortes de tecidos de intestinos
para detecção de coronavirus.
- Detecção de anticorpos contra TCoV, com a utilização do Kit comercial IDEXX
Turkey
Coronavirus
(TCoV) detection from field samples of
affected poults in Brazil.
Maria Cecília B. Teixeira
1, Maria Cecília R. Luvizotto
2, Heitor F. Ferrari
2,
Analy R. Mendes
3, Sérgio E.L. da Silva
4, Tereza C. Cardoso
1*1*Departamento de Apoio, Produção e Saúde Animal, da Faculdade de Odontologia,
Curso de Medicina Veterinária, Rua Clóvis Pestana, 793, Universidade Estadual
Paulista, Araçatuba, SP, CEP 16.050-680, Brasil, 1PhD student Mestrado em
Ciência Animal, Curso de Medicina Veterinária, UNESP-Araçatuba, SP, Brasil. 2
Laboratório de Patologia, Departamento de Clínica, Cirurgia e Reprodução Animal,
Curso de Medicina Veterinária, Rua Clóvis Pestana, 793, Universidade Estadual
Paulista, Araçatuba, SP, CEP 16.050-680, Brasil.
3 Fellowship by Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo-FAPESP,
Brasil 4
PhD student Universidade Federal de Uberlândia-MG, Brasil
Corresponding author 1* Tereza. C. Cardoso
Departamento de Apoio, Produção e Saude Animal Curso de Medicina Veterinária
Rua Clóvis Pestana, 793.
16.050-680 Araçatuba, SP, Brasil. Fax: +55-18-622 6487
Abstract
The Poult Enteritis Complex (PEC) has been incriminated as the major cause of
losses in other countries, and especially, in this study, was described causing
diarrhea, weight gain and most of the time, high mortality. In this study, it was
performed the turkey coronavirus (TCoV) detection from 30-120 day old affected
poults from a particular producer region in Brazil. The RT-PCR was applied in
intestines suspensions (IS), respective intestines contents (IC), bursa of Fabrícius
(BF), faecal droppings (FD) and cloacal swabs (CS) to amplify the 3´UTR conserved
region and TCoV nucleocapsid gene. The histopathological and direct
immunohistochemical examinations were performed to detect the TCoV antigen from
infected intestine and bursa slides. All results obtained from stained tissues, revealed
lesions described to be caused by TCoV infection. The direct immunohistochemical
positive signal was present in all intestine slides, however all BF analysed were
negative. RT-PCRs findings were positive for TCoV in all FD samples, and 27,27% of
CS analysed were positive for 3´UTR and TCoV nucleocapsid region. From the total
sera samples analysed (n=200), 157 were positive for TCoV (78,5%), with titers
higher than ≥ 0.18 OD (optical density), and 43 were negative (21,5%), however
respective birds were described as having clinical symptoms. Finally, the best field
material for TCoV diagnosis was FD and/or intestine suspensions (IS), resulting in a
first description of TCoV affecting poults in Brazil.
