Dissertação apresentada à Faculdade de Odontologia, Campus de São
José dos Campos, Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, como parte dos requisitos para obtenção do título de MESTRE,
pelo Programa de Pós+Graduação em BIOPATOLOGIA BUCAL, Área
Biopatologia Bucal.
Orientador: Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso Jorge
São José dos Campos
Apresentação gráfica e normalização de acordo com:
Alvarez S, Coelho DCAG, Couto RAO, Durante APM. Guia prático para Normalização de Trabalhos Acadêmicos da FOSJC. São José dos Campos: FOSJC/UNESP; 2008
P414e Pereira, Cristiane Aparecida.
Efeitos da terapia fotodinâmica em biofilmes formados por
, e / Cristiane Aparecida
Pereira. __ São José dos Campos : [s.n.], 2009 91f. : il.
Dissertação (Mestrado em Biopatologia Bucal) – Faculdade de Odontologia de São Jose dos Campos,Universidade Estadual Paulista, 2009.
Orientador: Prof. Dr.Antonio Olavo Cardoso Jorge
1. Biofilme. 2. . 3. . 4.
. 5. Terapia fotodinâmica. I. Jorge, Antonio Olavo Cardoso. II. Universidade Estadual Paulista. Faculdade de Odontologia de São José dos Campos. III. Título
tD17
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AUTORIZAÇÃO
Autorizo a reprodução e divulgação total ou parcial deste trabalho, por qualquer meio convencional ou eletrônico, desde que citada a fonte.
São José dos Campos, 20 de julho de 2009. Assinatura :
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Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
Universidade Estadual Paulista – UNESP
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Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares – IPEN
Universidade de São Paulo – USP
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Faculdade de Odontologia de São José dos Campos
Universidade Estadual Paulista – UNESP
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À eterna guerreira, minha amada mãe !
(% 0* % % . Mulher de fibra, que sozinha educou e criou os cinco
filhos, nos guiando sempre pelo caminho da honestidade.
Ao meu noivo, % % , pela paciência,
compreensão e dedicação. Minha fortaleza, meu porto+seguro, meu amor,
amigo e companheiro.
Aos meus queridos irmãos , %, +" , " % e
" , . Mesmo tão diferentes vocês são parte de mim, por isso são
essenciais.
Aos meus tesouros, razão da minha vida, meus amados
sobrinhos %! e & .
Àquela que sempre foi o meu maior incentivo, minha
'
Ao meu orientador, Prof. Titular Antonio Olavo Cardoso
Jorge.
Toda minha admiração por sua sabedoria e
profissionalismo acadêmico se torna secundária quando contemplo o seu
lado humano simples, sensato e honesto, que contribui para construir um
mundo bem mais bonito.
Orientar é ajudar a trilhar um caminho até então
desconhecido, e sob sua orientação eu dei os primeiros passos para este
novo mundo.
Muito obrigada pela confiança, amizade e conhecimentos
'
À Deus, por ter me dado o privilégio de concretizar mais
este sonho.
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita
Filho”, na pessoa do diretor Prof. Dr. José Roberto Rodrigues e do vice+
diretor Prof. Dr. Carlos Augusto Pavanelli da Faculdade de Odontologia
de São José dos Campos.
Ao Programa de Pós+graduação em Biopatologia Bucal,
na coordenação da Prof.ª Dra. Cristiane Yumi Koga Ito e Prof.ª Adj.
Rosilene Fernandes da Rocha.
À CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal
de Nível Superior) pela bolsa de estudo concedida.
Às secretárias da Seção de Pós+Graduação Rosemary de
Fátima Salgado, Erena Michie Hasegawa, Lílian Faris das Graças e Maria
Aparecida Consíglio de Souza, por serem sempre solícitas.
Aos docentes do Programa de Pós+graduação em
Biopatologia Bucal.
À querida Prof.ª Dra. Juliana Campos Junqueira, pessoa
sábia, que além de compartilhar todo conhecimento adquirido, sempre foi
À Prof.ª Dra. Luciane Dias de Oliveira, a primeira pessoa
que me acolheu no laboratório, com toda calma e carinho.
À Prof.ª Sônia Khouri, quem me abriu as portas deste
fascinante mundo da Microbiologia.
À Prof.ª Dra Adriana Aigotti Haberbeck Brandão, e toda a
sua família, em especial ao Henrique Haberbeck Brandão, pelo incentivo
e amizade.
À querida Sílvia Scarpel, por toda atenção sempre.
Às minhas adoradas amigas que sempre torceram por
mim e entenderam a minha ausência em muitos momentos: Flávia Villas
Boas Simões Lopes, Flávia Morciani, Aline Carvalho Fava Gomes, Isabel
Chaves Silva Carvalho, Hérica Braga Carneiro, Suzana Costa, Rafaela
Costa, Tábata Bagatim e Bruna Renata Sperandim.
À minha companheira e grande amiga, a aluna de
PROAC Anna Carolina Borges Pereira da Costa. Obrigada seria pouco
para agradecer o quanto você sempre me ajudou e incentivou.
À minha equipe, que sempre me ajudou nos experimentos
e nos demais trabalhos do laboratório, e que se tornaram grandes
amigas, as alunas de Iniciação Científica: Fernanda Freire, Jéssica Mina
Zambrana, Sarah Almeida Coelho Oliveira e Fernanda Silva
Aos meus companheiros do curso de mestrado e do
laboratório de Microbiologia/Imunologia: Joyce da Silva Martins, Bruno
Mello de Matos e Polyana das Graças Figueiredo Vilela. Eu nunca poderia
caminho. Vocês tornaram esta fase muito mais especial, muito obrigada
pela amizade e o carinho.
Às alunas de PROAC, Ana Karina Machado e Vanessa
Maria de Campos Rasteiro, que chegaram recentemente, mas já
enriqueceram a nossa equipe.
À querida Claudia Carreira, por toda sua simpatia e
amizade.
Ao aluno de doutorado Rogério de Lima Romeiro, por
toda ajuda e companheirismo.
Aos alunos de Iniciação Científica, Rodney Rossoni e
Evelyn Santos, pela determinação e amizade.
Às alunas do curso de doutorado Graziella Nuremberg
Back Brito, Marta Majewski e Rosilene Batista de Aguiar Almeida.
Às alunas de mestrado Mary Anne Moreira Bárbara,
Nívea Cristina Sena Costa, Ana Paula Lima e Simone Vilela, muito
obrigada pelo companheirismo sempre.
Ao Prof. Dr. Carlos Eduardo Dias Colombo por ter
participado do meu exame geral de qualificação, contribuindo com
sugestões que foram essenciais para o desenvolvimento desta
dissertação.
Aos funcionários do laboratório: Sérgio, Domingos e Ana
3 4
3 ... 11
5 3 ' 6 ... 12
7 389 ... 14
5 9 3 ... 17
7 ,% !% 2 ... 17
2.1.1 Colonização por ... 19
2.1.2 Colonização por ... 20
2.1.3 Colonização por ... 21
% - ! :, ( ... 23
2.2.1 Fotossensibilizador... 23
2.2.2 Laser... 24
2.2.3 Terapia fotodinâmica antimicrobiana... 25
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4.4.1 Lavagem dos corpos+de+prova... 35
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... 90
PEREIRA CA. Efeitos da terapia fotodinâmica em biofilmes
formados por , e
[dissertação]. São José dos Campos: Faculdade de Odontologia de São José dos Campos, Universidade Estadual Paulista; 2009.
3
O objetivo do trabalho foi avaliar o efeito antimicrobiano da terapia fotodinâmica (TFD) em biofilmes formados por (GI),
(GII) e (GIII), isolados e em associações (GIV+VII). Os biofilmes foram formados em discos de resina acrílica esterilizados imersos em caldo de infusão cérebro coração com 5% de sacarose, inoculados com a suspensão microbiana e incubados por 5 dias. Após o período de incubação, os discos foram lavados com solução fisiológica esterilizada para remover as células não+aderidas. Foram avaliados os efeitos do fotossensibilizador azul de metileno (AM) na concentração de 0,1 mg/mL por 5 min e laser AsGaAl (660 nm) por 98 s, isolados e em conjunto. Os biofilmes foram desprendidos em solução fisiológica em agitador ultra+ sônico. Foram realizadas diluições e alíquotas semeadas em ágar seletivos e incubadas por 48 h. Os números de UFC/mL em Log10 foram analisados estatisticamente (ANOVA, teste de Tukey, p< 0.05). Também foi realizada a microscopia eletrônica de varredura (MEV) nos discos com biofilmes dos grupos controle e TFD. Foram observadas reduções significativas na viabilidade de todos os biofilmes expostos ao AM e laser. As reduções (log10) foram maiores em biofilmes isolados, com: 40.22% para (GI), 55.91% para (GII) e 47.35% para
(GIII). Nos biofilmes mistos as reduções (log10) foram: 35.08%
para e 43.9% para (GIV); 31.54% para e
38.7% para (GV); 40.12% para e 37.14% para (GVI); 19.56% para , 28.41% para e 24.94% para (GVII). As imagens de MEV demonstraram uma fotossensibilização letal predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes. Conclui+se que a TFD pode ser uma abordagem útil no controle de biofilmes bucais.
PALAVRAS+CHAVES: Biofilme.
5 3 ' 6
%= por cento
`g/mL= microgramas por mililitro
`L= microlitro
`m= micrômetro
AM= azul de metileno
AsGaAl= arseneto gálio alumínio
AT= azul de toluidina
BHI= (infusão cérebro coração)
células/mL= células por mililitro
cm2=centímetro quadrado
CO2= gás carbônico
F= fotossensibilizador
FDA= ftalocianina dissulfonada de alumínio
h= hora
He+Ne= Hélio+Neônio
HILT=
J/cm2 =Joule por centímetro quadrado
J= Joule
kGy= KiloGray
L= laser
L= litro
Laser=
LED= !
LILT= "
Log= logarítmo
mg/L= miligrama por litro
mg/mL= miligrama por mililitro
min= minuto
mL= mililitro
mm= milímetro
MSBS= # bacitracina sacarose
mW/cm2= miliwatts por centímetro quadrado
mW= miliwatts
NaCl= cloreto de sódio
NADH= nicotinamida adenina dinucleotídeo reduzida
nm= nanômetro
ºC= grau Celsius
p/v= peso por volume
s= segundo
TFD= Terapia fotodinâmica
UFC/mL= unidade formadora de colônia por mililitro
UI/mL= unidade internacional por mililitro
A cavidade bucal apresenta diversos nichos ecológicos
que são colonizados por microrganismos, permitindo a sobrevivência de
uma diversidade de bactérias, vírus e fungos (Socransky et al., 1998).
Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de microrganismos já
foram detectadas na cavidade bucal de seres humanos, e grande parte
dessas espécies encontram+se organizadas na forma de biofilme (Wilson,
2004).
O biofilme dentário é formado por uma comunidade
diversificada de microrganismos que se acumula em tecidos duros
(dentes) como um filme, embebidos em uma matriz extracelular de
polímeros do hospedeiro e de origem microbiana (Marsh, 2004).
A colonização da cavidade bucal é influenciada
diretamente pela película adquirida (Marsh, 2004); uma camada acelular
constituída de proteínas, glicoproteínas e lipídios (Marcotte; Lavoie,
1998). A película adquirida é formada pela saliva imediatamente após a
profilaxia dos dentes, e pode favorecer a adsorção de microrganismos à
superfície dentária (Marsh, 2004). Se as condições forem favoráveis, os
colonizadores primários, primeiros microrganismos a aderirem à película
adquirida, podem multiplicar+se no substrato e formar micro+colônias
(Rickard et al., 2003). A seguir, ocorre o aumento da diversidade
microbiana até atingir uma comunidade clímax em duas ou três semanas
(Nyvad; Fejerskov, 1995).
Os estreptococos do grupo , principalmente as
espécies e são os
principais agentes etiológicos do desenvolvimento da cárie de superfície
considerado um fator crítico no desenvolvimento do biofilme cariogênico,
devido à produção de ácidos que proporcionam diminuição do pH do
biofilme, aumentando a possibilidade de desmineralização dos tecidos
dentários (O’Toole et al., 2000).
As leveduras mais freqüentes na cavidade bucal são do
gênero , sendo a espécie considerada um dos
fungos patogênicos normalmente encontrados neste local (O´Sullivan et
al., 2000). As leveduras também podem ser isoladas do biofilme dentário
(Sen et al., 1997) e coagregam+se a espécies bacterianas presentes ou
aderidas diretamente à película adquirida (Arendorf; Walker, 1980;
Nikawa et al., 1998).
Outro microrganismo patogênico oportunista que pode ser
isolado da cavidade bucal é . Esta bactéria pode
atuar como microbiota suplementar, sendo freqüentemente encontrada
em abscessos periapicais e estomatites protéticas (Martins et al., 2002).
possui um plasmídio que codifica para ß+
lactamase e proporciona o desenvolvimento de resistência a antibióticos,
principalmente à penicilina (Machado, 2000). Além disso, tem a
capacidade de produzir enzimas extracelulares, tornando+se uma bactéria
muito agressiva (Sader et al., 1993).
Os antimicrobianos auxiliam a remoção química do
biofilme, porém o uso prolongado de tais agentes pode levar à seleção de
espécies resistentes (Moran et al., 1992). A estrutura do biofilme e as
características das células que o constituem conferem resistência aos
agentes antimicrobianos e às defesas naturais do organismo (Dunne,
2003).
Desta forma, vê+se a necessidade de se desenvolver
tratamentos alternativos com potente atividade antimicrobiana, capazes
de interferir no desenvolvimento do biofilme. Neste contexto, a terapia
O processo de TFD consiste na irradiação de uma luz de
comprimento de onda apropriado que ativa uma substância
fotossensibilizadora, causando a morte celular por meio da produção de
espécies reativas de oxigênio (Machado, 2000).
Em vista do decréscimo da susceptibilidade de
microrganismos aos métodos convencionais de tratamentos, a avaliação
do efeito antimicrobiano da TFD em biofilmes formados por
, , e suas
7 ,% !% 2
A cavidade bucal dos seres humanos apresenta
microbiota complexa, que reflete a diversidade dos habitats e dos
ecossistemas ali localizados (Thylstrup; Fejerskov, 1995). Diferentes
locais na cavidade bucal são colonizados por populações distintas de
microrganismos. Todas as superfícies expostas da boca (dentes, tecidos
periodontais e língua) apresentam microrganismos residentes (Wen;
Brune, 2002). Atualmente, cerca de 1000 diferentes espécies de
microrganismo já foram detectadas na cavidade bucal dos seres humanos
e grande parte delas encontra+se organizada na forma de biofilmes
(Wilson, 2004).
Biofilme pode ser definido como uma comunidade
estruturada de micro+colônias de células microbianas envolvidas em uma
matriz extracelular de polissacarídeos, aderida a um substrato sólido
úmido ou meio líquido do qual elas podem retirar seus nutrientes
(Costerton et al.,1999; Portera, 1999; Wimpenny et al., 2000).
A colonização microbiana não é um processo passivo e
requer aderência do microrganismo à superfícies dentárias (Nyvad;
Fejerskov, 1995). A adesão inicial ocorre por meio da película adquirida
(Marsh, 1992), uma camada acelular que se deposita no esmalte
superficial dos dentes, tendo como principais constituintes substâncias
originárias da saliva e do fluido gengival, como proteínas, glicoproteínas e
lipídios, além de componentes bacterianos, como as glicosiltransferases
microrganismos com pouca ou nenhuma afinidade à película são
eliminados pelo fluxo salivar. Assim as interações microrganismo/película
são de suma importância nos estágios iniciais de formação do biofilme
dentário (Gibbons et al., 1990).
A película adquirida começa a ser formada poucas horas
após a limpeza profissional (Bowden; Edwardsson, 1995), e atua como
substrato para a primeira população de microrganismos, conhecida como
colonizadores primários. Após a colonização inicial, os microrganismos
primários crescem rapidamente formando micro+colônias que ficam
embebidas em uma matriz extracelular (Thylstrup; Fejerskov, 1995).
Quando ocorrem mudanças nas condições ambientais no interior do
biofilme em formação e o substrato existente apresenta+se coberto por
bactérias responsáveis pela colonização primária, microrganismos
distintos tornam+se capazes de se unirem aos primários, e a partir deste
momento o biofilme começa a se desenvolver com múltiplas espécies
(Rickard et al., 2003), até atingir uma comunidade clímax em duas ou três
semanas (Nyvad; Fejerskov, 1995).
A formação de biofilme tem sido considerada uma
importante estratégia microbiana para a sobrevivência e proliferação no
ambiente bucal. A complexa estrutura do biofilme permite a organização
das populações de microrganismos de modo a oferecer proteção contra
os mecanismos de remoção pela saliva e dificultar a ação de agentes
antimicrobianos (Kirkpatrick et al., 2000).
Por estar intimamente relacionada à formação de
biofilmes, a prevenção da doença cárie baseia+se principalmente na
remoção mecânica desses biofilmes (Marsh; Martin, 1992). No entanto,
muitos indivíduos são incapazes ou desmotivados para realizar esse
procedimento com a regularidade e eficiência necessárias. Outro aspecto
importante foi o aumento nas últimas décadas do uso de agentes anti+
sépticos, o que resultou na seleção de espécies resistentes (Wilson et al.,
Os microrganismos organizados em biofilmes apresentam
características de resistência, principalmente devido a penetração
insuficiente de antimicrobianos, velocidade de crescimento e alteração do
estágio metabólico que garante a sobrevivência de tais células em
ambientes hostis (Stewart; Costerton, 2001). Adicionalmente, os biofilmes
apresentam característica de desenvolvimento e traços fenotípicos
únicos, quando comparados com as mesmas células crescidas em
culturas planctônicas, que os tornam 10 a 1000 vezes mais resistentes a
agentes antimicrobianos e fatores imunes do hospedeiro (Davey; O’Toole,
2000; Zanin et al., 2006).
Frente às limitações dos métodos mecânicos de remoção,
e do decréscimo da susceptibilidade de microrganismos em biofilmes aos
antimicrobianos convencionais, a avaliação da eficácia de novas
alternativas como a TFD, torna+se de interesse científico.
2.1.1 Colonização por
Estreptococos são as bactérias predominantes no biofilme
dentário (Jenkinson; Lamont, 1997), sendo
considerado o principal agente etiológico no desenvolvimento da cárie de
superfície lisa (Shen et al., 2004).
Para aderir à superfície dos dentes no biofilme,
produz enzimas extracelulares, como as glicosiltransferases que atuam
na formação dos polissacarídeos extracelulares da sacarose. Os glucanos
promovem o acúmulo dos estreptococos (e outros microrganismos bucais)
na superfície do dente, sendo um fator crítico para a formação e estrutura
integral do biofilme, com o acúmulo de ácidos que levam a diminuição do
pH e desmineralização do esmalte dos dentes (Ooshima et al., 2000;
O potencial cariogênico de é principalmente
dependente das suas propriedades acidogênicas e da habilidade de se
acumular nos dentes, principalmente devido à síntese de glucanos
extracelulares a partir da sacarose (Gibbons, 1984). A produção de ácidos
e a capacidade de metabolização de substratos em meio ácido, foram os
primeiros fatores de virulência atribuídos a microrganismos específicos
relacionados à etiologia da cárie (Köhler et al., 1995).
Além da tolerância aos ácidos e sua produção,
ainda possuem como mecanismos de virulência, a capacidade de
sobrevivência no biofilme dentário devido à alta capacidade de adaptação
ao ambiente, presença de adesinas na superfície celular, produção de
glicosiltransferases, mutacinas e polissacarídeos extracelulares
(Harrington; Russel, 1994; Jackson et al., 1999).
2.1.2 Colonização por
As leveduras mais comuns na cavidade bucal são as do
gênero $ sendo considerado um dos fungos
patogênicos normalmente encontrados neste local (O’Sullivan et al.,
2000).
são encontradas principalmente no dorso da
língua, onde as papilas filiformes e reentrâncias, como o forame cego e
fissura mediana, servem de sítios que fornecem proteção e favorecem o
desenvolvimento de infecções (Arendorf; Walker, 1980).
A mudança entre a forma de leveduras para hifas
desempenha papel importante no desenvolvimento do biofilme.
Observações realizadas em microscopia demonstraram que as primeiras
camadas do biofilme são formadas pela forma de levedura e em seguida,
exopolissacarídeo (Lamfon et al., 2003; El+Azizi et al., 2004; Jãrvensivu et
al., 2004).
Durante a maturação do biofilme, as leveduras
desenvolvem novas propriedades fisiológicas diferentes dos seus
similares planctônicos, o que torna resistente a vários
componentes antifúngicos que são rotineiramente utilizados no ambiente
clínico. Dados da literatura relatam que já existem biofilmes formados por
resistentes a uma variedade de antifúngicos, incluindo
anfotericina B e fluconazol (Chandra et al., 2001). Os mecanismos
responsáveis pela resistência a antifúngicos podem estar relacionados
com limitações difusionais à passagem do agente pela matriz extracelular,
com as alterações fenotípicas das células no biofilme e ainda com o
desenvolvimento de mecanismos de resistência por alteração do genótipo
das células (Dunne, 2003).
As diferentes formas de candidose bucal, superficial ou
sistêmica, são freqüentemente associadas a biofilmes formados por
(Ramage et al., 2005). Porém, existem relatos de isolamento
dessas leveduras em biofilmes dentários (Sen et al., 1997; Nikawa et al.,
1998) coagregadas a espécies bacterianas presentes ou aderidas
diretamente à película adquirida (Arendorf; Walker, 1980; Nikawa et al.,
1998), o que demonstra que os mesmos podem estar correlacionados no
desenvolvimento de cáries e na patogênese de doenças periodontais
(Hannula et al., 2001; Jãrvensivu et al., 2004).
2.1.3 Colonização por
A espécie é uma bactéria
incidência de infecções, desde moderadas infecções de pele até
bacteriemias e septicemias graves (Hardy et al., 2004; Kim et al., 2004).
A presença de como residente da microbiota
bucal ainda é controversa. Porém, estudos relatam a presença da
bactéria na cavidade bucal, sendo neste caso consideradas
pertencentes à microbiota transitória. Dados da literatura revelaram que
94 a 100% dos adultos saudáveis apresentam spp. na
cavidade bucal, e que o predomínio de é de 24 a 36% (Jackson
et al., 1999; Kim et al., 1995).
As infecções bucais causadas por incluem:
infecções endodônticas, osteomielites da mandíbula, infecção da glândula
parótida e, uma forma de mucosite oral em idosos, principalmente em
pacientes recebendo nutrição parenteral (Smith et al., 2001).
O uso de antibióticos para o tratamento de doença
periodontal ou outras infecções pode predispor o aumento do número de
spp. na cavidade bucal, pois estes adquirem facilmente
resistência aos antibióticos podendo resultar em superinfecção.
foi o primeiro microrganismo no qual foi verificado o desenvolvimento de
resistência a antibióticos, através do plasmídio ß+lactamase, que
proporcionou resistência à penicilina (Loberto et al., 2004).
Os biofilmes formados por . são comunidades
embebidas em uma matriz de polímeros extracelulares, composta
principalmente de polissacarídeos de adesão intercelular (Chokr et al.,
2005), que diminuem a penetração de agentes antimicrobianos,
representando uma significante barreira terapêutica para muitos
% - ! :, ( G H
A primeira demonstração dos efeitos da TFD sobre
microrganismos foi realizada por Raab em 1900, que durante um estudo
sobre os efeitos da acridina em % descobriu que a
associação deste corante com a luz era letal para este protozoário
causador da malária. Em 1907, Von Tappeiner e Jodlbauer demonstraram
a necessidade da presença de oxigênio nas reações de
fotossensibilização e introduziram o termo “Ação Fotodinâmica” para
descrever este fenômeno (Ackroyd et al., 2001).
O processo de TFD pode ocorrer por dois mecanismos. No
mecanismo do tipo I ocorrer a transferência de elétron entre o
fotossensibilizador no estado triplete excitado e componentes do sistema,
gerando íons+radicais que tendem a reagir com o oxigênio no estado
fundamental, resultando em produtos oxidados. Já no mecanismo do tipo
II ocorre a transferência de energia do fotossensibilizador no estado
triplete, com a geração de oxigênio singleto, um agente altamente
citotóxico (Machado, 2000).
2.2.1 Fotossensibilizador
Para produzir o efeito fotodinâmico, o fotossensibilizador
precisa ser biologicamente estável, fotoquimicamente eficiente e
minimamente tóxico aos tecidos normais (Garcez et al., 2003). Quanto
menos tóxicos forem os corantes e com bandas de absorção próximas ao
comprimento de onda das luzes utilizadas, a eficácia da TFD é elevada,
Como a maioria das espécies bacterianas não apresenta
componentes fotossensíveis ao comprimento de onda utilizado, é
importante a utilização de um fotossensibilizador que absorva para si esta
luz e inicie a formação de radicais livres (Wilson et al., 1992). Assim,
células desprovidas de componentes fotossensíveis endógenos podem
tornar+se sensíveis a luz, quando coradas com fotossensibilizadores ou
agentes cromóforos exógenos, como o azul de metileno (AM), azul de
toluidina (AT), eosina e hematoporfirinas (Wilson, 1993).
O AM é um corante catiônico da classe das fenotiazinas.
É solúvel tanto em água como em álcool, e tem sido utilizado como
corante indicador bacteriológico. Seu estudo tem despertado interesse por
apresentar propriedade eletrocatalítica em relação ao NADH, uma
coenzima da classe das desidrogenases, que tem participação em várias
reações enzimáticas (Shiavo et al., 2000).
O AM possui alta absorção de luz, com picos de bandas
em 660 nm, é efetivo na TFD, demonstrando habilidade em gerar
espécies reativas de oxigênio sendo constantemente utilizado em
aplicações clínicas contra diversas doenças (Tardivo et al., 2005).
2.2.2 Laser
A palavra “laser” é o acrônimo de “Light Amplification by
Stimulated Emission of Radiation”, ou seja, “amplificação da luz por
emissão estimulada de radiação”. É uma luz monocromática que produz
linhas espectrais estreitas, altamente direcional, coerente, podendo ser
focalizada em região muito pequena com grande precisão, concentrando
alta quantidade da energia luminosa (Halliday et al., 2003). Os lasers são
classificados em duas famílias conforme sua potência e a capacidade de
" ); também chamados de terapêuticos e
lasers de alta intensidade de energia ( &
) conhecidos como cirúrgicos (Neves et al., 2005).
Os lasers de alta intensidade interagem com os tecidos
por reações fototérmicas, nas quais a energia da luz absorvida pelos
tecidos é transformada em calor. Os de baixa potência são baseados em
efeitos onde a radiação absorvida desencadeará reações fotoquímicas ou
fotofísicas intracelulares ou teciduais, não ocorrendo aumento de
temperatura. O comprimento de onda dos lasers pode cobrir do
infravermelho ao ultravioleta, cada tipo emite um determinado
comprimento de onda (Mello et al.,2004; Rosa et al, 2005).
Os lasers de baixa intensidade também denominados
laser mole, laser frio, laser terapêutico ou & , emitem radiação de
baixa potência, sem potencial destrutivo e possuem uma ação
fotoquímica de analgesia, anti+inflamatória e de bioestimulação tecidual,
caracterizados por um comprimento de onda no espectro eletromagnético
geralmente do ultravioleta ao infravermelho, variando de 630 a 940 nm
(Kurachi et al., 2002). Os lasers de baixa potência mais utilizados na TFD
são aqueles com emissão na região vermelha do espectro
eletromagnético, como os lasers de Hélio Neônio (He+Ne) e diodo
Arseneto Gálio Alumínio (AsGaAl). Os lasers de He+Ne estão sendo
substituídos pelos lasers de diodo, que apresentam maior potência, são
mais robustos, não necessitam de espelhos e possuem menor custo
(Garcez et al., 2003).
2.2.3 Terapia fotodinâmica antimicrobiana
Os primeiros trabalhos utilizando a TFD em bactérias
a eficácia de diferentes associados ao laser He+Ne, com 7,3 mW de
potência, na redução de % $ '
e . Os autores
observaram que os fotossensibilizadores AT, AM foram eficazes, pois
possibilitaram a eliminação das quatro espécies, após a exposição a luz
laser por apenas 30 s.
Dobson e Wilson (1992) observaram destruição de
biofilmes formados por , %
, ' e
, sensibilizados por AT e AM seguido da
irradiação pelo laser de baixa potência He+Ne, com 632,8 nm de
comprimento de onda e potência de 7,3 mW. Estes achados sugerem que
a fotossensibilização letal pode ser um meio eficaz de eliminar as
bactérias periodontopatogênicas do biofilme dental.
Sarkar e Wilson (1993) testaram amostras de biofilme
dentário subgengival de pacientes com periodontite crônica utilizando o
laser com 7,3 mW de potência e AT como fotossensibilizador, o que
reduziu significativamente a viabilidade de bactérias aeróbias e
anaeróbias, sendo esta redução de 94,2% para os estreptococos.
Em 1994, Burns et al. aplicaram laser AsGaAl e o
fotossensibilizador ftalocianina dissulfonada de alumínio (FDA) em
algumas espécies de bactérias cariogênicas tal como S
, , e
Os autores relataram que o fotossensibilizador isoladamente
não demonstrou efeito satisfatório na viabilidade dos microrganismos
tratados. Porém, quando o fotossensibilizador foi associado a irradiação
laser foi observada uma redução das bactérias de lesões cariogênicas.
Em estudo realizado para avaliar o potencial bactericida
da TFD na remoção de biofilmes dentários, Wilson (1994) utilizou os
lasers de baixa potência de He+Ne e AsGaAl, conjugados
confirmou como efetivo o uso da TFD na eliminação de bactérias
cariogênicas e periodontopatogênicas.
Wilson e Pratten (1995) estudaram o efeito da TFD sobre
cepas de resistente a meticilina, utilizando um
laser de AsGaAl, de 660 nm de comprimento de onda e 11 mW de
potência, em conjunto com uma FDA por 60 s e 300 s. Os resultados
demonstraram uma redução de 99,6% (60 s) e 99,9% (300 s).
Wood et al. (1999) analisaram, , o uso da TFD na
eliminação de bactérias em biofilmes formados , utilizando
ftalocianina catiônica e luz branca de uma lâmpada de filamento de
tungstênio de 600/700 nm de comprimento de onda. Os autores
observaram redução considerável das bactérias do biofilme. Além disso,
os biofilmes tratados apresentaram+se mais delgados e com estruturas
diferentes daquelas dos biofilmes controles.
Usacheva et al. (2001) avaliaram a eficácia bactericida
dos fotossensibilizadores AM e AT sobre diferentes bactérias, na
presença e na ausência dos lasers de argônio e diodo, com 630 e 664 nm
de comprimento de onda, respectivamente. Foram testados os seguintes
microrganismos: , ,
$ ( , e
% . O aumento da densidade de energia e
potência dos lasers, mantendo a concentração constante de
fotossensibilizador, resultou em uma eliminação maior das bactérias.
Zeina et al. (2001) avaliaram a redução microbiana
através da TFD , utilizando uma combinação de AM e luz visível e
algumas espécies microbianas representativas daquelas encontradas na
pele saudável e doente como: ,
, , ,
% e . Todas as espécies testadas
foram susceptíveis à TFD, porém a redução de foi
pode representar uma alternativa ao tratamento antimicrobiano
convencional.
Com laser de He+Ne, de 632,8 nm de comprimento de
onda e 35 mW de potência, e o fotossensibilizador AT, Komerik e Wilson
(2002) conseguiram redução microbiana das seguintes bactérias Gram+
negativas: % , e )
.
Zanin et al. (2002) observaram que quando um “pool” de
saliva humana era sensibilizado por AT e irradiado pelo laser AsGaAl com
660 nm de comprimento de onda, ocorria um efeito bactericida total sobre
estreptococos do grupo $ e efeito bactericida parcial sobre
estreptococos totais. A relevância desse estudo está na eliminação das
espécies mais patogênicas com a preservação de parte da microbiota
residente, já que a atividade antimicrobiana sobre todos os
microrganismos da cavidade bucal não é recomendada por tornar o
hospedeiro mais susceptível ao aparecimento de infecções oportunistas.
O’Neill et al. (2002) obtiveram redução de 97,4% dos
microrganismos de biofilmes bucais multi+espécies após a aplicação de
AT e irradiação com laser de He+Ne com 632 nm de comprimento de
onda e 35 mW de potência.
Williams et al. (2003) estudaram a ação antibacteriana do
fotossensibilizador AT e do laser de He+Ne, com 632,8 nm de
comprimento de onda, sobre uma matriz de colágeno e dentina cariada,
ambos infectados por . No colágeno a terapia foi
testada por 30 s e 180 s, já na dentina os tempos utilizados foram de 30 s
e 60 s. Os resultados foram mais eficazes quando utilizado o período de
tempo maior (180 s no colágeno e 60 s na dentina).
Lee et al. (2006) demonstraram a ação do laser diodo na
redução de biofilmes de formados em dentina humana com
eliminação de 97,7% das bactérias em dentinas com 500 `m de
espessura. Com o aumento da espessura, a redução bacteriana diminuiu.
Soukos et al. (2006) analisaram os efeitos da TFD em
patógenos endodônticos, como Os
microrganismos foram sensibilizados com azul de metileno e expostos a
irradiação de luz vermelha por 5 min com 665 nm e densidade de energia
de 35 J/cm2. Os autores concluíram que a TFD pode ser um procedimento
complementar para eliminar microrganismos residuais no canal radicular
após tratamento endodôntico convencional.
Wood et al. (2006) compararam a eficácia do corante
eritrosina, azul de metileno e photofrin em biofilme formado por
Os corantes foram utilizados e irradiados por 15
min com 400 W de energia. A eritrosina foi mais efetiva do que o
, que por sua vez foi mais efetivo que o azul de metileno. Os
autores concluíram que a PDT utilizando a eritrosina como
fotossensibilizador é um tratamento eficaz para prevenir a formação do
biofilme dentário.
Garcez et al. (2007) avaliaram o efeito de dois
fotossensibilizadores associados a laser diodo (660 nm) na eliminação de
bactérias em biofilmes crescidos por 3 dias em canais radiculares. A TFD
promoveu uma redução microbiana de 95%, o que, segundo os autores,
pode desempenhar um importante papel na terapia endodôntica.
Fimple et al. (2008) encontraram 80% de redução de
biofilmes multi+espécies do canal radicular, com a aplicação de AM e
irradiação de laser diodo (665 nm), e concluíram que a TFD pode ser um
complemento eficaz ao tratamento endodôntico convencional.
Recentemente, Fontana et al. (2009) compararam o efeito
antimicrobiano do AM e luz vermelha tanto em culturas planctônicas como
em biofilmes multi+espécies formados por bactérias isoladas da cavidade
bucal. Os autores alcançaram 64% e 32% de redução para culturas
biofilmes formados por bactérias orais são menos afetados pela TFD do
O objetivo desta dissertação foi avaliar o efeito
antimicrobiano da terapia fotodinâmica, aqui representada pelo
fotossensibilizador azul de metileno e laser de Arseneto Gálio Alumínio
(AsGaAl), na viabilidade de biofilme formados sobre resina acrílica por
, , $
Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Faculdade de Odontologia de São José dos
Campos/UNESP+SJC, conforme protocolo n° 019/2008 – PH/CEP
(Anexo A)
< 7 -
"=!%=-Para o desenvolvimento do presente estudo foram
utilizados como corpos+de+prova 280 discos para confecção de prótese
ocular com pino (Clássico, São Paulo, Brasil), constituídos de resina
acrílica incolor, com 11 mm de diâmetro (figura 1a). Cada corpo+de+prova
recebeu duas camadas de esmalte para unhas (Colorama, São Paulo,
Brasil), no pino (figura 1b) e na base (figura 1c). Desta forma, a área de
aderência do microrganismo para a formação do biofilme foi delimitada
somente para a parte superior do corpo+de+prova. A seguir, os corpos+de+
prova foram embalados e encaminhados para esterilização por radiação
gama (cobalto 60), com dosagem de 20 kGy por 6 h (Embrarad, São
< ( $ ", " % - %- !% "&"-% ">%" - ! ) ! "
Inicialmente foram preparadas suspensões padronizadas
utilizando cepas padrão de (ATCC 18804), (ATCC
6538) e (ATCC 35688). As cepas de (figura 2a)
foram repicadas em ágar Sabouraud dextrose (Difco, Detroit, USA). Já as
cepas de (figura 2b) e (figura 2c) foram repicadas em
ágar infusão cérebro coração + BHI ( , Difco, Detroit,
USA).
Os microrganismos foram incubados em estufa
bacteriológica a 37ºC por 24 h. Todos os ensaios com cepas de
foram incubados em estufa bacteriológica sob condições de
microaerofilia (5% de CO2).
Decorrido o período de incubação, colônias dos
microrganismos foram suspensas em solução fisiológica esterilizada
(NaCl 0,9%), e ajustada em espectrofotômetro (B 582, Micronal, São
Paulo, Brasil), até obtenção de suspensão padronizada contendo 106
células/mL. Os parâmetros de densidade óptica e comprimento de onda
utilizados foram, respectivamente: 0,284 e 530 nm para albicans (figura
3a), 0,374 e 490 nm para (figura 3b), e 0,620 e 398 nm para
(figura 3c).
< ; ' &- " % ( ! 0>%" %?-% ,% "
Após a esterilização, os corpos+de+prova foram divididos
aleatoriamente em 7 grupos, os quais foram submetidos às seguintes
condições experimentais: a) L+F+: biofilmes com a associação de solução
fotossensibilizador; c) L+F+: biofilmes que receberam apenas solução
fisiológica; e, d) L+F+: biofilmes tratados com o fotossensibilizador e
irradiados pelo laser, conforme quadro 1.
Quadro 1 + Grupos de microrganismos e condições experimentais analisadas
Grupos Condições Experimentais
Microrganismos L+F+ L+F+ L+F+ L+F+
I – 10 10 10 10
II – 10 10 10 10
III – 10 10 10 10
IV – e 10 10 10 10
V – e 10 10 10 10
VI – e 10 10 10 10
VII + , e 10 10 10 10
Total 70 70 70 70
< < , 0* ! " @ ,%"
Os corpos+de+prova esterilizados foram colocados, com o
auxílio de pinça estéril (figura 4a), na primeira fileira de placas de 24
poços (Costar Corning, New York, EUA). Em seguida foram adicionados 2
mL de caldo infusão de cérebro coração + BHI ( , Difco,
Detroit, USA) acrescido de 5% de sacarose em cada poço da placa (figura
4b). Para a formação de biofilmes isolados (grupos I, II e III) cada poço da
placa contendo caldo BHI e um corpo+de+prova foi inoculado com 0,1 mL
da suspensão microbiana (figura 4c). Já nos grupos com associações
microbiana referente ao microrganismo utilizado. Por exemplo, para o
grupo IV, foi utilizado 0,1 mL da suspensão de e 0,1 mL da
suspensão de .
As placas foram mantidas incubadas em estufa
bacteriológica à 37ºC por cinco dias.
4.4.1 Lavagem dos corpos+de+prova
A fim de remover as células microbianas não+aderidas
após o período de formação dos biofilmes, foi realizada a lavagem dos
corpos+de+prova.
Os corpos+de+prova foram transferidos para os poços da
segunda fileira contendo 2 mL de solução fisiológica esterilizada (figura
5a), e a placa foi agitada por 5 min (figura 5b) em agitador orbital (Solab,
Piracicaba, Brasil). Este processo de lavagem foi realizado novamente
nos poços da terceira fileira da placa (figura 5c).
< A % - ! :, ( %, @ ,%"
No processo de TFD foi utilizado laser de baixa potência
de Arseneto Gálio Alumínio (figura 6a) + AsGaAl+ (Photon lase III, DMC
Equipamentos, São Carlos, Brasil), com sistema de entrega por fibra
óptica. Como fotossensibilizador foi utilizado azul de metileno (Sigma,
Aldrich, Germany), dissolvido em solução fisiológica esterilizada a uma
concentração de 0,1 mg/mL, seguido de filtração em membrana de
acetato de celulose estéril (figura 6b), com poros de 0,22 `m de diâmetro
A irradiação pelo laser AsGaAl, seguiu o protocolo
demonstrado no quadro 2.
Quadro 2 + Protocolo utilizado para irradiação com laser AsGaAl
nm: nanômetros J/cm2:joules por centímetro quadrado J: joules mW: miliwats cm2: centímetro quadrado min: minutos s: segundos
Após a lavagem todos os corpos+de+prova foram
transferidos para a quarta fileira da placa de 24 poços.
Os corpos+de+prova submetidos às condições
experimentais L+F+ e L+F+ receberam 0,1 mL de azul de metileno (figura
7a), por 5 min. Já os corpos+de+prova das condições experimentais L+F+ e
L+F+ receberam 0,1 mL de solução fisiológica esterilizada, também por 5
min (figura 7b). Decorrido este período, os corpos+de+prova das condições
experimentais L+F+ e L+F+ foram irradiados, com as placas abertas, pelo
laser por 98 s (figura 7c).
Todo o experimento de TFD foi realizado no escuro, em
câmara de fluxo laminar, com o auxílio de um anteparo negro fosco
colocado sob as placas para evitar o espalhamento de luz.
Para avaliar o efeito das diferentes condições
experimentais realizadas foram quantificados os números de unidades
formadoras de colônias por mililitro (UFC/mL) de microrganismos, obtidos
a partir da suspensão de cada biofilme dos corpos+de+prova.
Comprimento de onda 660 nm
Densidade de energia 10,42 J/cm2
Energia 9,8 J
Potência 100 mW
Área irradiada 0,94 cm2
Cada corpo+de+prova foi colocado em um tubo falcon
contendo 10 mL de solução fisiológica esterilizada, e em seguida
homogeneizada por 30 s, utilizando homogeneizador ultra+sônico
(Sonoplus HD 2200 – Bandelin Eletronic) com potência de 50 W (figura
8a), a fim de desprender o biofilme. A suspensão microbiana obtida foi
considerada com fator diluição 10+1, e a partir desta foram realizadas
novas diluições decimais (10+2, 10+3 e 10+4) em solução fisiológica
esterilizada.
Alíquotas de 0,1 mL de cada diluição foram semeadas em
duplicatas em placas de Petri com meio de cultura sólido (figura 8b). No
grupo I, as diluições obtidas do biofilme isolado de foram
semeadas em ágar Sabouraud dextrose. Nos biofilmes isolados de
e (grupos II e III, respectivamente) as diluições foram
semeados em ágar BHI. Já nos grupos mistos, as diluições dos biofilmes
foram semeadas em meios de cultura seletivos para cada microrganismo,
como segue: a) em ágar Sabouraud dextrose com 50 mg/L de
cloranfenicol (União Química, São Paulo, Brasil&; b) em ágar
manitol (Difco, Detroit, USA); e, c) em ágar Mitis Salivarius
(Difco, Detroit, USA) acrescido de 0,2 UI/mL de bacitracina (União
Química, São Paulo, Brasil& e 15% de sacarose (MSBS).
As placas foram incubadas em estufa a 37 ºC por 48 h.
Após o período de incubação, as placas contendo de 30 a 300 colônias
foram contadas e o número UFC/mL transformado em logarítmo de base
10 (Log10).
Os resultados obtidos foram avaliados estatisticamente
pela análise de variância ANOVA, teste Tukey, considerando+se diferença
< B ( "( - % % C ( !% %!&
Com o objetivo de ilustrar os efeitos da TFD sobre os
biofilmes formados nos corpos+de+prova foi realizada a microscopia
eletrônica de varredura (MEV) no Instituto Nacional de Pesquisas
Espaciais (INPE) de São José dos Campos/SP.
Para a MEV os biofilmes foram crescidos conforme
mencionado anteriormente, sendo dois corpos+de+prova por grupo,
(quadro 3) submetidos as condições experimentais L+F+ e L+F+.
Quadro 3 + Corpos+de+prova submetidos a microscopia eletrônica de varredura
Grupos Condições Experimentais
Microrganismos L+F+ L+F+
I – 01 01
II – 01 01
III – 01 01
IV – e 01 01
V – e 01 01
VI – e 01 01
VII + , e 01 01
Em seguida, os corpos+de+prova transferidos para placas
de 24 poços e fixados em 2 mL de glutaraldeído a 2,5% por 1 h.
Posteriormente os corpos+de+prova foram submersos por 20 min em cada
uma das seguintes concentrações de álcool: 10%, 25%, 50%, 75% e
90%. E finalmente, por 1 h em álcool a 100%. As placas foram incubadas
em estufa bacteriológica por 24 h para a secagem completa dos corpos+
Após a secagem os corpos+de+prova foram transferidos
para metálicos (figura 9a) e submetidos ao processo de metalização
por (Denton Vacuum Desk II, Denton Vacuum, USA) com 10+9
m de espessura de fio de ouro (figuras 9b e 9c). Posteriormente, os
corpos+de+prova foram examinados e fotografados em microscópico
eletrônico de varredura (JSM+5310, JEOL, Japão), operando em 15 kV
A B C
Figura 1 – Preparo do corpo+de+prova utilizado para formação de biofilme. a) corpo+de+ prova sem pintura; b) corpo+de+prova com o pino pintado; c) corpo+de+prova pronto para esterilização, com pino e base pintados com esmalte para unhas.
A B C
Figura 2 + Placas com crescimentos de 24 h em meio de cultura sólido, dos microrganismos utilizados para a formação dos biofilmes. a) em ágar Sabouraud dextrose; b) em ágar BHI; c) em ágar BHI.
A B C
Figura 3 + Parâmetros de densidade óptica e comprimento de onda, em espectrofotômetro, utilizados para os diferentes microrganismos. a) parâmetros utilizados para ; b) parâmetros utilizados para
A
Figura 4 + Processo de form a primeira fileira c) inoculação da
A
Figura 5 + Lavagem dos co com solução fisio agitador orbital o processo de rem lavagem dos corp
Figura 6 + Laser e fotosse b) filtração do fot
A B
e formação do biofilme. a) transferência dos corpos+de+ fileira da placa de 24 poços; b) adição do caldo BHI sa
o da suspensão microbiana.
B
os corpos+de+prova. a) lavagem dos corpos+de+prova o fisiológica esterilizada nos poços da segunda fileira da bital onde as placas permaneceram por 5 minutos para e remoção das células microbianas não+aderidas; c) rep
s corpos+de+prova na terceira fileira da placa.
A
otossensibilizador utilizados na TFD. a) aparelho de lase do fotossensibilizador azul de metileno.
C
+prova para HI sacarosado;
C
prova realizada ira da placa; b) para auxiliar o c) repetição da
B
A B C
Figura 7 + Processo de TFD. a) aplicação do fotossensibilizador azul de metileno, por 5 minutos, nos corpos+de+prova submetidos às condições experimentais L+F+ e L+F+; B) aplicação de solução fisiológica, por 5 minutos, nos corpos+de+prova submetidos às condições experimentais L+F+ e L+F+; c) irradiação pelo laser AsGaAl, por 1 minuto e 38 segundos, nos corpos+de+prova submetidos às condições experimentais L+F+ e L+F+.
A B
A B
C D
As médias obtidas através dos ensaios realizados e
as análises estatísticas de UFC/mL (Log10) para os biofilmes isolados de
, e , grupos GI, GII e GIII, estão
apresentadas na tabela 1. Através destes resultados foi possível
visualizar os efeitos produzidos pela TFD nos biofilmes isolados.
Tabela 1 + Médias e desvio+padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, nos seguintes grupos: GI + biofilmes de
* GII + biofilmes de ; e, GIII + biofilmes de
Condição
Experimental
GI – Biofilme de GII – Biofilme de GIII + Biofilme de
L+F+ 5,69±0,03A 5,75±0,04A 5,85±0,02A
L+F+ 5,71±0,04A 5,81±0,04AB 5,87±0,02A
L+F+ 5,77±0,03A 5,89±0,03B 5,93±0,04A
L+F+ 3,45±0,12B 2,60±0,21C 3,12±0,13B
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F+: biofilme irradiado somente com laser L+F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L+F+: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
Na tabela 2 estão os valores de p obtidos quando as
Tabela 2 + Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais nos seguintes grupos: GI + biofilmes de
*GII + biofilmes de ; e, GIII + biofilmes de
Comparação GI – Biofilme de GII – Biofilme de GIII + Biofilme de
L+F+ e L+F+ 0,267 0,371 0,295
L+F+ e L+F+ 0,052 0,036 0,061
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,854 0,636 0,848
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F+: biofilme irradiado somente com laser L+F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L+F+: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser.
Para os ensaios realizados com biofilmes dos grupos GIV,
GV, GVI e GVII formados pela associação de microrganismos, as médias
e as análises estatísticas, bem como os valores de p obtidos quando as
diferentes condições experimentais foram comparadas estatisticamente,
Tabela 3 + Médias e desvio+padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GIV: biofilme associado de
e
Condição
Experimental
GIV – Biofilme de
L+F+ 5,38±0,03A 5,45±0,06A
L+F+ 5,41±0,04A 5,50±0,07AB
L+F+ 5,43±0,04A 5,55±0,07B
L+F+ 3,52±0,11B 3,11±0,10C
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F+: biofilme irradiado somente com laser L+F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L+F+: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser
Tabela 4 + Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GIV: biofilme associado de
e
Comparação GIV – Biofilme de
L+F+ e L+F+ 0,874 0,555
L+F+ e L+F+ 0,386 0,056
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,827 0,555
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
Tabela 5 + Médias e desvio+padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GV: biofilme associado de
e
Condição
Experimental
GV – Biofilme de
L+F+ 5,42±0,06A 5,63±0,04A
L+F+ 5,43±0,05A 5,66±0,02A
L+F+ 5,48±0,05A 5,71±0,04A
L+F+ 3,75±0,14B 3,50±0,15B
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F+: biofilme irradiado somente com laser L+F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L+F+: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser
Tabela 6 + Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GV: biofilme associado de
e
Comparação GV – Biofilme de
L+F+ e L+F+ 0,569 0,421
L+F+ e L+F+ 0,474 0,156
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,998 0,929
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
Tabela 7 + Médias e desvio+padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVI: biofilme associado de
e
Condição
Experimental
GVI – Biofilme de
L+F+ 5,44±0,06A 5,57±0,06A
L+F+ 5,48±0,06A 5,60±0,06A
L+F+ 5,53±0,06A 5,65±0,07A
L+F+ 3,31±0,14B 3,55±0,12B
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F+: biofilme irradiado somente com laser L+F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L+F+: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser
Tabela 8 + Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GVI: biofilme associado de
e
Comparação GVI – Biofilme de
L+F+ e L+F+ 0,672 0,514
L+F+ e L+F+ 0,107 0,149
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,624 0,858
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
Tabela 9 + Médias e desvio+padrão dos números de UFC/mL (Log10) obtidos nos ensaios realizados, nas diferentes condições experimentais, no grupo GVII: biofilme associado de
, e
Condição
Experimental
GVII – Biofilme de
L+F+ 5,07±0,07A 5,08±0,08A 5,14±0,06A
L+F+ 5,08±0,07A 5,13±0,07A 5,15±0,06A
L+F+ 5,12±0,07A 5,18±0,06A 5,21±0,06A
L+F+ 4,12±0,11B 3,71±0,20B 3,96±0,10B
Letras diferentes indicam diferença estatisticamente significante entre as condições experimentais (p<0,05, Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
G: Grupo L+F+: biofilme irradiado somente com laser L+F+: biofilme tratado somente com fotossensibilizador L+F+: biofilme não irradiado pelo laser e sem fotossensibilizador L+F+: biofilme tratado com o fotossensibilizador e irradiado pelo laser
Tabela 10 + Valores de p obtidos entre as diferentes condições experimentais no grupo GVI: biofilme associado de
$ e
Comparação GVII – Biofilme de
L+F+ e L+F+ 0,704 0,741 0,358
L+F+ e L+F+ 0,637 0,272 0,161
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,999 0,842 0,964
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000
L+F+ e L+F+ 0,000 0,000 0,000
Valor de p estatisticamente significante quando <0,05 (Análise de variância ANOVA, teste Tukey).
A aplica
minutos, seguida pela ir
redução significativa no
organizados em tod
comparados com os gr
(L+F+). Os percentuais
analisados estão ilustr
percentuais de reduçã
para. (GII)
mistos os percentuais
(GIV); 31,54%
40,12% para
$ 28,41% par
Figura 10 – Médias e desvi grupos sem a (L+F+) e, com ap por 98 s (L+F+) 7 ; < A B ' % ! & 0 * % ( % & GI H ! % 3 J,
licação do fotossensibilizador azul de metilen
pela irradiação do laser AsGaAl por 98 s, promov
iva no número de UFC/mL (Log10) dos microrga
todos os biofilmes dos grupos testados,
os grupos que receberam somente solução fis
tuais de redução de UFC/mL em Log10 dos b
ilustrados na figura 10. Nos biofilmes isola
dução foram: 40,22% para (GI)
(GII); e, 47,35% para (GIII). Nos b
tuais foram: 35,08% para e 43,9%
,54% para e 38,7% para
e 37,14% (GVI); 19,56
% para 24,94% para (GVII)
desvio+padrão das reduções de UFC/mL (Log10) obtidas
em aplicação do fotossensibilizador e não+irradiado om aplicação do fotossensibilizador por 5 min e irradiaçã L+F+).
' ' ' 5 '5 '5
' &- "
etileno por 5
romoveu uma
icrorganismos
dos, quando
ão fisiológica
dos biofilmes
isolados os
(GI); 55,91%
Nos biofilmes
3,9% para
(GV);
19,56% para
GVII).
btidas entre os iado pelo laser diação do laser
Pela análise das imagens produzidas por MEV foi
possível visualizar a aderência dos microrganismos apresentadas pelos
diferentes grupos, condição controle (L+F+), bem como compará+las com
os mesmos submetidos ao processo de TFD (L+F+). Através desta
comparação, observou+se que as reduções ocorreram
predominantemente nas camadas superiores dos biofilmes (figuras 11 a
A B
C D
A B
C D
A B
C D
Figura 14 – MEV de biofilm formados em co
A) MEV do
fotossensibiliza MEV do corpo irradiação do de+prova com b pelo laser (L aplicação do fo (L+F+), aument
A
C
biofilmes de associados de e
em corpos+de+prova de resina acrílica após 5 dias de cre do corpo+de+prova com biofilme sem aplica ibilizador e não+irradiado pelo laser (L+F+), aumento de corpo+de+prova com aplicação do fotossensibilizador po do laser por 98 s (L+F+), aumento de 1000x; C) MEV com biofilme sem aplicação do fotossensibilizador e não (L+F+), aumento de 5000x; D) MEV do corpo+de+ do fotossensibilizador por 5 min e irradiação do laser umento de 5000x.
B
D
(grupo IV) de crescimento. aplicação do o de 1000x; B) or por 5 min e MEV do corpo+
A B
C D
A B
C D
A B
C D
Figura 17 – MEV de biofilmes de associados de , e
A análise macroscópica dos biofilmes formados nos
corpos+de+prova de resina acrílica, após 5 dias de crescimento, revelou
padrões diferenciados para os grupos com microrganismos isolados em
relação aqueles onde houve associação microbiana.
Nos grupos com microrganismos isolados, observou+se
no GI ausência de biofilme visível a olho nu, formado pela levedura
. Já no grupo GII, o biofilme formado por foi mais
visível. Entretanto, o grupo GIII de foi aquele onde se obteve
biofilme mais aparente.
Nas associações de microrganismos, a análise
macroscópica mostrou aumento da espessura dos biofilmes formados. Tal
característica ficou mais evidente quando os microrganismos
e foram inoculados juntos, o que produziu um biofilme mais
espesso. Resultado semelhante foi obtido por Barbieri et al. (2007), que
ao analisarem a aderência, , de na superfície dentária
verificaram que a mesma foi mais extensa quando esta bactéria foi
cultivada com . Esses dados indicam que a interação de
e em biofilmes pode ter uma característica
mutualística, onde ambos os microrganismos são favorecidos.
Corroborando com esta afirmação, Branting et al. (1989), ao estudarem
a aderência de em associação com em
superfícies acrílicas, sugeriram que a presença de glucanos insolúveis
produzidos pela bactéria podem aumentar a capacidade adesiva da
levedura. Ainda sobre tal característica, Barbieri et al. (2007) concluíram
que as células de poderiam ser usadas pela bactéria S
