Quantificação do número de plaquetas a partir de diferentes métodos de centrifugação em ratos da linhagem SHR.

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rev bras ortop.2015;50(6):729–738

w w w . r b o . o r g . b r

Artigo

original

Quantificac¸ão

do

número

de

plaquetas

a

partir

de

diferentes

métodos

de

centrifugac¸ão

em

ratos

da

linhagem

SHR

夽

João

Alberto

Yazigi

Junior

∗

_,

_João

_Baptista

_Gomes

_dos

_Santos,

_Bruno

_Rodrigues

_Xavier,

Marcela

Fernandes,

Sandra

Gomes

Valente

e

Vilnei

Mattiolli

Leite

UniversidadeFederaldeSãoPaulo(Unifesp),SãoPaulo,SP,Brasil

informações

sobre

o

artigo

Históricodoartigo:

Recebidoem28desetembrode2014 Aceitoem16dedezembrode2014

On-lineem22dejulhode2015

Palavras-chave:

Contagemdeplaquetas Centrifugac¸ão

Plasmaricoemplaquetas

r

e

s

u

m

o

Objetivo:QuantificaraconcentraçãodeplaquetasdosanguederatosSHR,pormeiode dife-rentesprotocolosdecentrifugação,eavaliarqualométodomaiseficazde obtençãode plaquetas.

Métodos:Usamos40ratosmachosdalinhagemisogênicaSHR.Osanimaisforamdivididos emtrêsgrupos:Controle(GCT)-sanguetotalsemcentrifugação;ÚnicaCentrifugação(GUC) -sanguetotalsubmetidoaumaúnicacentrifugação:200ge400g;DuplaCentrifugação (GDC)-sanguetotalsubmetidoaumacentrifugação,seguidodecoletadoplasmatotal,e realizadoumacentrifugação,emdiferentesrotações:200g+200g;200g+400g;200g+800g; 400g+400g;400g+800g.Foramretirados3mldesanguedecadaanimalpormeiodepunção cardíaca.Osanguefoiacondicionadoemtubodecoletavacutainercomcitratodesódio3,2%. Osanguedosanimaisdogrupocontrolenãofoisubmetidoàcentrifugaçãoefoianalisado. Apósacentrifugaçãodosanguedosanimais,submetidoàcentrifugação,oplasmatotalfoi coletadoesubmetidoàcontagemdeplaquetasnoterçoinferiordaamostra.

Resultados: Obtivemos maior enriquecimento de plaquetas no subgrupo de duas centrifugações (400g por 10 minutos+400g por 10 minutos), no qual ocorreu uma concentraçãomédiadeplaquetas11,30vezessuperioremrelaçãoaogrupocontrole.

Conclusão:Foipossívelobterumaaltaconcentraçãoplaquetária,comtécnicasimplese viá-vel,por meiodecentrifugaçãodosanguetotaleusodemateriaisdeusocorriqueiro;e métodomaiseficazdeobtençãodeconcentradodeplaquetasocorreunasamostras subme-tidasaduascentrifugações.

夽

TrabalhofeitonoLaboratóriodeMicrocirurgiadaDisciplinadeCirurgiadaMãoeMembroSuperiordoDepartamentodeOrtopediae Traumatologia(Unifesp),SãoPaulo,SP,Brasil.

∗ _Autor_para_{correspondência.}

E-mail:junioryazigi73@yahoo.com.br(J.A.YazigiJunior). http://dx.doi.org/10.1016/j.rbo.2015.04.018

(2)

Quantification

of

platelets

obtained

by

different

centrifugation

protocols

in

SHR

rats

Keywords:

Plateletcount Centrifugation Platelet-richplasma

a

b

s

t

r

a

c

t

Objective: ToquantifytheplateletconcentrationinthebloodofSHRrats,bymeansof diffe-rentcentrifugationprotocols,andtoevaluatewhatthemosteffectivemethodforobtaining plateletsis.

Methods: Weused 40maleratsoftheisogenicSHRlineage.Theanimals weredivided intothreegroups:control,usingwholebloodwithoutcentrifugation;singlecentrifugation, usingwholebloodsubjectedtoasinglecentrifugationat200gand400g;anddouble cen-trifugation,usingwholebloodsubjectedonecentrifugationatdifferentrotations,followed bycollectionofwholeplasmasubjectedtoanothercentrifugationatdifferentrotations: 200g+200g;200g+400g;200g+800g;400g+400g;400g+800g.Samplesof3mlofblood weredrawnfromeachanimalbymeansofcardiacpuncture. Thebloodwasstoredin Vacutainer collectiontubescontaining3.2%sodiumcitrate. Thebloodfromthecontrol groupanimalswasanalyzedwithoutbeingsubjectedtocentrifugation.Afterthebloodfrom theothergroupsofanimalshadbeensubjectedtocentrifugation,thewholeplasmawas collectedandsubjectedtoplateletcountinginthelowerthirdofthesample.

Results: Weobtainedgreatestplateletenrichmentinthesubgroupwithtwo centrifuga-tionscomprising400gfor10minutes+400gfor10minutes,inwhichthemeanplatelet concentrationwas11.30timeshigherthanthatofthecontrolgroup.

Conclusion: Itwaspossibletoobtainahighplateletconcentrationusingviablesimple tech-niques,bymeansofcentrifugationofwholebloodanduseofcommonlyusedmaterials.The mosteffectivemethodforobtainingplateletconcentratewasfoundinsamplessubjected totwocentrifugations.

Introduc¸ão

Asplaquetassãofragmentoscitoplasmáticosanucleados pre-sentesnosangueeproduzidosapartirdemegacariócitosna medulaóssea.1,2 _Do_total_das _plaquetas_presentes_no

orga-nismo, 70% estão presentes na circulação e 30% no baço, permanecemnacirculaçãoduranteumamédiadedezdias, quandosãoretiradaspelascélulasreticuloendoteliaisdobaço edofígado.1-3_As_plaquetas_estão_diretamente_envolvidas_em

diversaspatologiasimportantes,sejamemsíndromesou qua-drostrombóticosgravescomoatrombosearterial.4,5

Osistemahemostáticoéintrinsecamenteresponsávelpela manutenc¸ãodo fluxosanguíneo eda integridade vascular, vistoqueécapazdeformarumtampãosobreumasuperfície danificadadoendotéliovascularquandoessesofreuma injú-ria.Dessaforma,ahemostasiaminimizaaperdasanguíneae promovearestaurac¸ãodaarquiteturavascularnormal.6-8

Oplasmaricoemplaquetas(PRP)éaconcentração autó-logadeplaquetasempequenovolumedeplasma,obtidopor centrifugaçãodosanguetotal,consideradaimportantefonte fatoresdecrescimento.Suaconstituiçãobásicasedáportrês componentes:plasma,leucócitoseplaquetas.Afibrina rica emplaquetas(PRF)éumconcentradodeplaquetas,obtidode umamembranadefibrina,comaltopotencialderegeneração tecidual.AssimcomonoPRP,osconcentradosdeplaquetas contidosnaPRFliberamfatoresdecrescimento(FC)que apri-moramo processoderegeneração.Além disso,amatrizde

fibrinapromoveangiogênese,facilitaoacessoaolocal lesio-nado,comimportantepapelnacicatrizac¸ãotecidual.9

DescritapelaprimeiraveznaFranc¸aem20009_a_plaqueta

ricaemfibrina(PRF),conceitonovoeaindapoucodescritona terapêutica com ousodegel defibrina,éumconcentrado deplaquetassobreumamembranadefibrinacomum altís-simopotencialdereparac¸ãodeferidas.Amembranaéobtida apartirdesangueautólogosemadic¸ãodefatoresexternos.10

Sabe-sequeasplaquetasatuamnoprocessode hemos-tasia,nacicatrizaçãodeferidasenareepitelização,liberam diversosfatoresdecrescimentoequepelomenossete diferen-tesFCforamidentificadosnafaseinicialdacicatrização.Por isso,aliberaçãodessesFCpelosgrânulos-␣dasplaquetastem umaspectoimportantenocontroleenaproliferaçãode célu-lasmesenquimais,incluindoosfibroblastos.OPRPéativado pelaadiçãodeíonsdecálcio,comliberaçãodeFCeaexocitose dosgrânulos-␣,etransformaofibrinogênioemfibrina.Por meiodesseprocesso,obtém-se,também,coladefibrina autó-loga,denominadatambémdegeldeplaquetasougeldePRP. AapresentaçãodoPRPemformadegelfacilitasuaaplicação e seu manuseio em diversas áreas cirúrgicas e favorece a integração de retalhos eenxertos, sejam ósseos, cutâneos, cartilaginosos ou de células de gordura. O uso resultaem cicatrizaçãomaisrápidaeeficiente,peloefeitodeaderência dogel,queéproporcionalaofibrinogêniopresente.11-13

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731

o processo biológico natural da cicatrização e auxiliar na regeneração de diversos tecidos. A diferença básica na obtençãodoPRPedoPRFéqueparaseobterplasmaricoem plaquetaséusadotubocomanticoagulante(citratodesódio 3,2%ouEDTA),enquantoqueparaseobterplaquetaricaem fibrinaosanguedevesercoletadoemtuboseco.

ExistemváriossistemasdepreparodePRPdisponíveis,por meiodecentrífugasdebancada,masemestudospré-clínicos eclínicososresultadosapresentadosparecemcontraditórios. Há umalacuna de estudos maissistemáticos e consisten-tes sobre o assunto, o que fazcom que o preparo do PRP permaneça,ainda,umprocedimentoexperimental,apesarde suapromissoraaplicaçãonaregeneraçãotecidual.

Calixto,14_ao_estudar_o_sangue_de_humanos,_pôde_verificar

queomelhormétododeobtençãodePRPéaquelenoqual éfeitaumaúnicacentrifugação,de200gpor10minutos.Já Pereira,15_com_sete_protocolos_para_a_obtenção_de_PRP_em

equi-nos,pôdeverificarquequantomaioraforçagemaiorotempo decentrifugação,maioréaconcentraçãoplaquetáriatotal.

Umavez que os animais usados emgrandeescala, em laboratóriosdepesquisa,sãoosratosedevidoàescassezde estudosnessemodeloanimal,optamosporfazerestetrabalho paraavaliarqualomelhormétodoparaaobtençãodamelhor concentraçãodeplaquetas,emdiferentesprotocolos, quan-tificaraconcentraçãodeplaquetasdosanguederatosSHR, pormeiodediferentesprotocolosdecentrifugação,eavaliar qualo métodomaiseficazde obtençãode concentradode plaquetas.

Materiais

e

métodos

OtrabalhofoifeitonolaboratóriodeMicrocirurgiada Disci-plinadeCirurgiadaMãoeMembroSuperiordoDepartamento deOrtopedia eTraumatologiaeno laboratóriode Hemato-logiadoDepartamentodeAnálisesClínicaseToxicológicas denossainstituic¸ão.Foiaprovado peloComitêdeÉtica em Pesquisa(CEPn◦_0312/12).

Usamos40ratosmachosdalinhagemisogênicaSHR,entre 280-300g, fornecidos pelo Centro de Desenvolvimento de ModelosExperimentaisparaMedicinaeBiologia.Osanimais forammantidosemgaiolascoletivascomcincoratosemcada, embiotériocomcondic¸õescontroladascomcicloclaro/escuro (12/12h),temperaturade21±2◦_C,_livre_acesso_à_água_e_rac¸ão portodooperíododoexperimento.

Osanimaisforamdivididosemtrêsgrupos:

GrupoControle(GCT)-sanguetotalsemcentrifugac¸ão(n= 5).

GrupoÚnicaCentrifugac¸ão(GUC)-sanguetotalsubmetido aumaúnicacentrifugac¸ão.Esse grupofoidivididoemdois subgrupos:

GUC-I:centrifugac¸ãoa200gpor10minutos(n=5) GUC-II:centrifugac¸ãoa400gpor10minutos(n=5)

GrupoDuplaCentrifugac¸ão(GDC) -sanguetotal subme-tidoaumacentrifugac¸ão,seguidodecoletadoplasmatotale

Figura1–Coletadeplasmanotubotipoeppendorf

de1,5mL.

realizadoumasegundacentrifugac¸ão,emdiferentesrotac¸ões. Essegrupofoidivididoemcincosubgrupos:

GDC-I: centrifugação a 200g por 10 minutos, seguida de segundacentrifugaçãode200gpor10minutos(n=5) GDC-II: centrifugação a200g por 10 minutos, seguida de segundacentrifugaçãode400gpor10minutos(n=5) GDC-III: centrifugação a200gpor10 minutos, seguida de segundacentrifugaçãode800gpor10minutos(n=5) GDC-IV: centrifugação a400gpor 10minutos, seguida de segundacentrifugaçãode400gpor10minutos(n=5) GDC-V: centrifugação a 400gpor 10 minutos, seguida de segundacentrifugaçãode800gpor10minutos(n=5)

Obtenc¸ãodasamostrasdeplasmaesangue

Osanimaisforamanestesiadoscominjec¸ãointraperitoneal, comsoluc¸ãoanestésicacompostaporxilasina1U/100ge keta-mina1U/100g.

Apósseremanestesiados,foramretirados3mldesangue decadaanimalatravésdepunc¸ãocardíaca.Osanguefoi acon-dicionadoemtubodecoletavacutainercomcitratodesódio 3,2%.

Osanguedosanimaisdogrupocontrolenãofoisubmetido àcentrifugaçãoefoianalisadoapósagitaçãodotubopordois minutosa4◦_C,_para_{homogeneização.}

Asamostrasdesanguetotaldosanimaisforam centrifu-gadas deacordocom oprotocolo para cadagrupo descrito acima, em centrífuga de bancada (Eppendorf 5810 R) a 4◦_C.

Apósacentrifugaçãodosanguedosanimais,submetidoa umaúnicacentrifugação,oplasmatotalfoicoletadoemtubo tipoeppendorfde1,5mlesubmetidoàcontagemdeplaquetas noterçoinferiordaamostra.

(4)

r

e

v

b

r

a

s

o

r

t

o

p

.

2

0

1

5;

5

0(6)

:729–738

Tabela1–Descric¸ãodosparâmetroshematológicosresultantes

Variável Grupo Média DP Mediana Mínimo Máximo N p

Leucócitos CTRL 3.060 219,1 3.200 2.700 3.200 5 0,016

200g-10min 420 465,8 200 100 1200 5

400g-10min 420 549,5 200 100 1400 5

200g-10min+200g-10min 1.160 2.260,1 100 100 5200 5

200g-10min+400g-10min 1.860 1.105,9 1.400 500 3100 5

200g-10min+800g-10min 2.700 3.755,7 700 300 9200 5

400g-10min+400g-10min 3.020 2.983,6 1500 400 7800 5

400g-10min+800g-10min 3.160 3.943,7 500 200 8700 5

Eritrócitos CTRL 7.120.000 358.956,8 7.020.000 6.640.000 7530000 5 <0,001

200g-10min 22000 16431,7 20000 10000 50000 5

400g-10min 14000 11401,8 10000 0 30000 5

200g-10min+200g-10min 80000 134721,9 20000 10000 320000 5

200g-10min+400g-10min 262.000 89.554,5 240.000 150.000 380000 5

200g-10min+800g-10min 170.000 101.242,3 150.000 600.00 330000 5

400g-10min+400g-10min 120.000 86.313,4 150.000 20.000 220000 5

400g-10min+800g-10min 188.000 19.9549,5 70.000 100.00 420000 5

Plaquetas CTRL 648.800 30.094,9 648.000 614.000 695000 5 0,013

200g-10min 1.632.400 580.962,4 1.650.000 682.000 2122000 5

400g-10min 939.600 687.417,1 863.000 110.000 1764000 5

200g-10min+200g-10min 3.826.000 4.920.808,4 456.000 29.000 970.0000 5

200g-10min+400g-10min 4.760.000 2.254.550,953 530.0000 130.0000 720.0000 5

200g-10min+800g-10min 4.080.000 1.685.823,241 310.0000 270.0000 6.500.000 5

400g-10min+400g-10min 7.320.000 2.819.929,077 73.00000 28.00000 97.00000 5

400g-10min+800g-10min 5.500.000 1.813.835,715 5.200.000 3.400.000 7.600.000 5

Volumedeplasma(mL) CTRL 0 0 0 0 0 5 <0,001

200g-10min 0,72 0,11 0,8 0,6 0,8 5

400g-10min 1,10 0,10 1,1 1 1,2 5

200g-10min+200g-10min 1,46 0,11 1,5 1,3 1,6 5

200g-10min+400g-10min 1,60 0,10 1,6 1,5 1,7 5

200g-10min+800g-10min 1,62 0,04 1,6 1,6 1,7 5

400g-10min+400g-10min 1,62 0,08 1,6 1,5 1,7 5

400g-10min+800g-10min 1,72 0,08 1,7 1,6 1,8 5

(5)

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Figura2–Contagemdeplaquetasnoanalisador

hematológico.

Contagemdeplaquetas

Asamostrasobtidasforamsubmetidasàcontagemde plaque-tas,pormeiodeumanalisadorhematológico(AnimalBlood Counter-ABCVet)devidamentecalibradoparaosparâmetros sanguíneosderatos(fig.2).

Métodosestatísticos

Os parâmetroshematológicos resultantes segundo os sub-gruposcomusodemedidasresumo(média,desviopadrão, mediana, mínimo e máximo) foram comparados com os subgrupos com uso de testes Kruskal-Wallis seguidos de comparac¸ões múltiplas nãoparamétricas de Dunn quando necessáriasparacompararossubgruposdoisadois.

Resultados

Osresultadosforamilustradoscomusodetabelasede gráfi-cosdebarrasquerepresentamosvaloresmedianosdecada parâmetrosegundosubgruposeostestesforamfeitoscom níveldesignificânciade5%.

Atabela1mostraquetodososparâmetrosavaliados apre-sentaram diferenc¸a estatisticamente significativa entre os grupos(p<0,05).

Asfiguras3e4sugeremmaioresvaloresdeleucócitose eritrócitosnogrupocontrole.

Afigura5mostraqueomaiorenriquecimentodeplaquetas ocorreunosubgrupodeduascentrifugac¸ões400g+400g.

Osvaloresdevolumedeplasmaobtidoapresentadosna figura6sãomaiorescom duascentrifugac¸ões(400gpor10 minutos+800gpor10minutos).

Atabela2mostra queaquantidadedeleucócitos resul-tantefoiestatisticamentemaiornocontroleemcomparação comossubgruposcomapenasumacentrifugação(p=0,004e p=0,004)ecomrelaçãoaosubgrupocomduascentrifugações de 200ge 10 minutos cada (p=0,007). Já o subgrupo com duas centrifugações de 400g e 10 minutos cada apresen-tou estatisticamente mais leucócitos do que os subgrupos com apenas uma centrifugação (p<0,05) e do que o sub-grupo comduascentrifugaçõesde200ge10minutoscada (p=0,031).

A tabela 3 mostra que a quantidade de eritrócitos foi estatisticamentemaiornocontroledoquenosdemais sub-grupos(p<0,05),comexceçãoapenasdossubgruposdeduas centrifugaçõesde 200g-10min+400g-10minede200g -10min+800g-10min(p=0,192ep=0,056).Esses dois sub-gruposapresentaramestatisticamentemaiseritrócitosdoque ossubgruposdeumacentrifugaçãoeossubgruposdeduas centrifugaçõesde200ge10mincada(p<0,05).

Pelatabela4,tem-sequeaquantidadedeplaquetascom duas centrifugac¸ões foi estatisticamente maior do que o

0

CTRL

200g – 10mi n

400g – 10mi n

200g – 10min + 200g – 10mi n

200g – 10min + 400g – 10mi n

200g – 10min + 800g – 10mi n

400g – 10min + 400g – 10mi n

400g – 10min + 800g – 10mi n

3500

3000

2500

2000

1500

Leucócitos

1000

500

(6)

CTRL

200g – 10mi n

400g – 10mi n

200g – 10min + 200g – 10mi n

200g – 10min + 400g – 10mi n

200g – 10min + 800g – 10min400g – 10min + 400g – 10min400g – 10min + 800g – 10mi n

8000000

7000000

6000000

5000000

4000000

3000000

2000000

1000000

0

Eritr

ó

cito

s

Figura4–Valoresmedianosdeeritrócitossegundosubgrupos.

controle,comapenasumacentrifugac¸ão,edoqueosubgrupo comduascentrifugac¸ões,com200ge10mincada(p<0,05).

Atabela5mostraqueovolumedeplasmaobtidose asse-melhaestatisticamenteaocomportamentodasplaquetas.Os subgruposcomduascentrifugaçõestêmmaiorvolumedoque osdemais subgrupos,com exceçãodosubgrupo comduas centrifugações,com200ge10mincada.

Pelastabelasefiguras,tem-sequeaquantidadede pla-quetas com duas centrifugações(subgrupo400g+400g) foi estatisticamentemaiordoqueocontrole,comapenasuma centrifugação,edoqueosubgrupocomduascentrifugações, com200ge10mincada(p<0,05);ocorreuconcentraçãomédia deplaquetasnessesubgrupo(400g+400g)11,30vezes supe-rioremrelaçãoaogrupocontrole.

Discussão

Na literaturaencontramos técnicasde obtenc¸ãodeplasma ricoemplaquetas,comoaprimeirausada,quesóeraaplicável emumaestruturahospitalarcommáquinasdeplasmaferese enecessitavadeumtécnicoespecializadoparamanipulá-la.16

Oprocedimentoapresentavamaiormorbidadeenecessitava detecnologiasofisticada.

A busca de técnicas para a obtenc¸ão de PRP com cus-tos menores fez surgir algunsmétodos maissimples, com tubosdeensaioeumacentrífugacomum,quepermitema preparac¸ão do plasmarico emplaquetas com customuito menoreemambienteambulatorial.Porém,essesmétodossão

CTRL

200g – 10mi n

400g – 10mi n

200g – 10min + 200g – 10mi n

200g – 10min + 400g – 10mi n

200g – 10min + 800g – 10mi n

400g – 10min + 400g – 10mi n

400g – 10min + 800g – 10mi n

8000000

7000000

6000000

5000000

4000000

3000000

2000000

1000000

0

Plaquetas

(7)

rev bras ortop.2015;50(6):729–738

735

CTRL

200g – 10min 400g – 10min

200g – 10min + 200g – 10min200g – 10min + 400g – 10min200g – 10min + 800g – 10min400g – 10min + 400g – 10min400g – 10min + 800g – 10min

0,0 1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0,8

0,6

Volume de plasma (mL)

0,4

0,2

Figura6–Valoresmedianosdevolumedeplasma.

Tabela2–Resultadodascomparac¸õesmúltiplasdosleucócitos

Leucócitos

Comparac¸ão ValorZ p

CTRLVS 200g-10min 2,84 0,004

CTRLVS 400g-10min 2,84 0,004

CTRLVS 200g-10min+200g-10min 2,70 0,007

CTRLVS 200g-10min+400g-10min 0,90 0,367

CTRLVS 200g-10min+800g-10min 1,04 0,298

CTRLVS 400g-10min+400g-10min 0,54 0,589

CTRLVS 400g-10min+800g-10min 1,11 0,267

200g-10minVS 400g-10min 0,00 >0,999

200g-10minVS 200g-10min+200g-10min −0,14 0,890

200g-10minVS 200g-10min+400g-10min −1,94 0,052

200g-10minVS 200g-10min+800g-10min −1,80 0,071

200g-10minVS 400g-10min+400g-10min −2,30 0,021

200g-10minVS 400g-10min+800g-10min −1,73 0,083

400g-10minVS 200g-10min+200g-10min −0,14 0,890

400g-10minVS 200g-10min+400g-10min −1,94 0,052

400g-10minVS 200g-10min+800g-10min −1,80 0,071

400g-10minVS 400g-10min+400g-10min −2,30 0,021

400g-10minVS 400g-10min+800g-10min −1,73 0,083

200g-10min+200g-10minVS 200g-10min+400g-10min −1,80 0,071

200g-10min+400g-10minVS 200g-10min+800g-10min 0,14 0,890

Resultadodascomparac¸õesmúltiplasdeDunn.

trabalhososenecessitamdeaprendizagemporpartedequem iráfazeroprocedimento.

Osmétodosexistentesnaliteraturanãoalcançamas mes-masconcentraçõesplaquetárias.Algumassão insuficientes paramelhorar aregeneraçãotecidual. Esses fatorespodem

justificarmuitodocriticismoarespeitodaeficáciaeda apli-cabilidadedoplasmaricoemplaquetas.

(8)

Tabela3–Resultadodascomparac¸õesmúltiplasdoseritrócitos

Eritrócitos

CTRLVS 200g-10min 3,90 <0,001

CTRLVS 400g-10min 4,27 <0,001

CTRLVS 200g-10min+200g-10min 3,41 0,001

CTRLVS 200g-10min+400g-10min 1,30 0,192

CTRLVS 200g-10min+800g-10min 1,91 0,056

CTRLVS 400g-10min+400g-10min 2,44 0,015

CTRLVS 400g-10min+800g-10min 2,18 0,029

200g-10minVS 400g-10min 0,37 0,708

200g-10minVS 200g-10min+200g-10min −0,49 0,627

200g-10minVS 200g-10min+400g-10min −2,59 0,010

200g-10minVS 200g-10min+800g-10min −1,98 0,047

200g-10minVS 400g-10min+400g-10min −1,46 0,145

200g-10minVS 400g-10min+800g-10min −1,72 0,086

400g-10minVS 200g-10min+200g-10min −0,86 0,390

400g-10minVS 200g-10min+400g-10min −2,97 0,003

400g-10minVS 200g-10min+800g-10min −2,36 0,018

400g-10minVS 400g-10min+400g-10min −1,83 0,067

400g-10minVS 400g-10min+800g-10min −2,09 0,036

Tabela4–Resultadodascomparac¸õesmúltiplasdasplaquetas

Plaquetas

CTRLVS 200g-10min −1,03 0,305

CTRLVS 400g-10min −0,25 0,803

CTRLVS 200g-10min+200g-10min −1,19 0,233

CTRLVS 200g-10min+400g-10min −2,50 0,013

CTRLVS 200g-10min+800g-10min −2,29 0,022

CTRLVS 400g-10min+400g-10min −3,48 0,001

CTRLVS 400g-10min+800g-10min −2,91 0,004

200g-10minVS 400g-10min 0,78 0,437

200g-10minVS 200g-10min+200g-10min −0,17 0,868

200g-10minVS 200g-10min+400g-10min −1,47 0,142

200g-10minVS 200g-10min+800g-10min −1,26 0,207

200g-10minVS 400g-10min+400g-10min −2,45 0,014

200g-10minVS 400g-10min+800g-10min −1,89 0,059

400g-10minVS 200g-10min+200g-10min −0,94 0,346

400g-10minVS 200g-10min+400g-10min −2,25 0,025

400g-10minVS 200g-10min+800g-10min −2,04 0,041

400g-10minVS 400g-10min+400g-10min −3,23 0,001

400g-10minVS 400g-10min+800g-10min −2,66 0,008

(9)

rev bras ortop.2015;50(6):729–738

737

Tabela4–(Continuac¸ão)

Plaquetas

neutralizaeforma umcomposto denominado quelatoque impedeaformaçãodocoágulo.Alémdisso,ocitratodesódio nãoalteraosreceptoresdemembranadasplaquetase conse-quentementeoprocessodequelaçãopodeserrevertidopor meiodaadiçãodocloretodecálcioparaformaçãodogelde plaquetas.17

ArecentetecnologiapermiteousodoPRPcompequenos volumesdesangue,minimizaanecessidadedereinfusãode célulasvermelhaseosriscosassociados.Contudohápouca informac¸ãosobreaquantidade idealdeplaquetasparaum melhorreparotecidual.

Naliteraturaencontramosdiversosprotocolosdeobtenc¸ão doPRP.Onúmerodecentrifugac¸ões(umaouduas)dependerá

dométodo aserusado. Alguns autoressugeremcom ape-nasumacentrifugac¸ão,enquantooutrasreferênciasindicam protocolodeduplacentrifugac¸ão.

Qualquer protocolo de obtenção do PRP deve concen-trar plaquetas noseu nívelmáximo paraque corresponda aos resultados clínicos relatados na literatura. Mas além deumaaltaconcentraçãoplaquetáriacomgrandeliberação de fatores de crescimento, é muito importante que seja mantida a integridade da plaqueta. Os fatores de cresci-mento devem serliberados de plaquetas viáveis, umavez que no ato de exocitose granular a plaqueta complete a estrutura terciária das proteínas do fator de crescimento. As plaquetas fragmentadas podem desgranular grandes

Tabela5–Resultadodascomparac¸õesdovolumedeplasma

Volumedeplasma

CTRLVS 200g-10min −0,69 0,488

CTRLVS 400g-10min −1,39 0,166

CTRLVS 200g-10min+200g-10min −2,36 0,018

CTRLVS 200g-10min+400g-10min −3,38 0,001

CTRLVS 200g-10min+800g-10min −3,55 <0,001

CTRLVS 400g-10min+400g-10min −3,58 <0,001

CTRLVS 400g-10min+800g-10min −4,47 <0,001

200g-10minVS 400g-10min −0,69 0,488

200g-10minVS 200g-10min+200g-10min −1,66 0,096

200g-10minVS 200g-10min+400g-10min −2,69 0,007

200g-10minVS 200g-10min+800g-10min −2,86 0,004

200g-10minVS 400g-10min+400g-10min −2,88 0,004

200g-10minVS 400g-10min+800g-10min −3,77 <0,001

400g-10minVS 200g-10min+200g-10min −0,97 0,332

400g-10minVS 200g-10min+400g-10min −2,00 0,046

400g-10minVS 200g-10min+800g-10min −2,16 0,031

400g-10minVS 400g-10min+400g-10min −2,19 0,028

400g-10minVS 400g-10min+800g-10min −3,08 0,002

(10)

quantidadedefatoresdecrescimento,mascomefetividade diminuída.18

No presente estudo comparamos o número de plaque-tasobtidosemsangueperiféricosubmetidosaumaeduas centrifugac¸ões; o maior enriquecimento ocorreu no grupo de duascentrifugac¸ões, Os resultados seconfrontam, con-frontandoosresultadoscomalgunstrabalhospublicadosna literatura,comoodoCalixto.14

NoestudodeCalixto,14_feito_em_seres_humanos,_foram

usa-dostubosdeensaiocomanticoagulantecitratodesódioa3,2% eEDTA,quemostraramdiferenc¸anaconcentrac¸ãode plaque-tas,maiorquandoseusavaocitrato.Combasenessefato, escolhemossomenteocitratocomoanticoagulantedostubos coletores.

Vendramin et al.19 _obtiveram _plasma _rico _em

plaque-tasdemelhorqualidadepormeiodeduascentrifugaçõesa 400gpor 10min+800g por 10min. No nosso estudo, obti-vemosumaaltaconcentraçãoplaquetáriaa400g+800g;no entanto,amaiorquantidadedeplaquetasfoiobtidaa400g por10min+400gpor10min.Issomostraqueapartirdessa forçapodeocorreralisedeplaquetas,queinfluenciamsua concentraçãofinal.

Diversosestudosforamfeitosemhumanos,coelhose equi-nos;noentanto,nãoencontramosprotocolosdecentrifugação emratos.Comoestabelecimentodeumprotocolodeobtenção dePRPemratos,quealcançouumaaltaconcentração plaque-tária,proporcionamosestudosfuturosparaavaliaraeficácia clínicadesseplasmaricoemplaquetas.Novosestudospodem aparecerapartirdesseprotocoloquefizemoseexpandirseu usonaregeneraçãonervosa,cicatricialedeenxertosósseose ligamentares.

Conclusão

Foipossívelobterumaaltaconcentraçãoplaquetária,com téc-nicasimpleseviável,pormeiodecentrifugaçãodosangue totaleuso demateriaiscorriqueiro, comotubosde coleta, seringaseagulhas.Ométodomaiseficazdeobtençãode con-centradode plaquetas ocorreunas amostras submetidas a duascentrifugações(400gpor10minutos+400gpor10 minu-tos),nasquaisocorreuumaconcentraçãomédiadeplaquetas 11,30vezessuperioremrelaçãoaogrupocontrole.

Conflitos

de

interesse

Osautoresdeclaramnãohaverconflitosdeinteresse.

Agradecimentos

ÀDra.PrimaveraBorelliGarciaeaotécnicoEdsondo Labora-tóriodeHematologiadoDepartamentodeAnálisesClínicase ToxicológicasdaFaculdadedeCiênciasFarmacêuticasdaUSP peloauxílioeapoiotécnicoàpesquisa.

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