DANIELA TEVES NARDI
ESTUDO DOS EFEITOS DA RADIAÇÃO GAMA NA ESTRUTURA
DE ALGUNS PEPTÍDEOS DE RELEVÂNCIA BIOLÓGICA.
Tese apresentada à Universidade Federal de São
Paulo para obtenção do título de Doutor em
Ciências
SÃO PAULO
DANIELA TEVES NARDI
ESTUDO DOS EFEITOS DA RADIAÇÃO GAMA NA ESTRUTURA DE ALGUNS PEPTÍDEOS DE RELEVÂNCIA BIOLÓGICA.
110 pg
Tese (Doutorado) – Universidade Federal de São Paulo.
Tese apresentada à Universidade Federal de São Paulo durante o curso de Pós-Graduação em Biologia Molecular, para obtenção do título de Doutor em Ciências.
“Life is just what happens to you
While you are busy making other plans…”
Ao meu filho Fabrizio, um presente inesperado de Deus que me mostrou o verdadeiro significado da vida.
Ao meu segundo filho, que mesmo ainda tão pequeno dentro de meu ventre, já me manteve no caminho do amor.
AGRADECIMENTOS
A Deus, sem Ele nada é possível;
A minha família, em especial aos meus pais, Domingos e Márcia, e ao meu marido Leonardo. Sem o amor e o apoio deles, certamente esse trabalho não seria concluído;
Ao meu orientador, professor Clóvis R. Nakaie, que nunca deixou de acreditar em mim. Sua confiança e incentivo foram essenciais durante a execução deste trabalho;
Ao professor Cesar José Rosa, pela grande ajuda com os espectros de CID-MS/MS;
A professora Nanci Nascimento, ao colega Murilo e a engenheira Elizabeth pelos experimentos e discussão dos dados de irradiações de peptídeos no Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN);
Aos colegas de pós-graduação do Departamento de Biofísica, Douglas, Gustavo, Alexandre, Elias, Luciana, Érick, Marcos Antônio, Marcus, Lilian, Marta e Marcela, que dividiram alegrias e tristezas durante esses quatro anos de doutorado;
Aos colegas funcionários do Departamento de Biofísica, Kátia, Sinval, Caroline, Marta, Marcelo e Luzia, que sempre estiveram prontos para me ajudar;
Aos professores Guita N. Jubilut e Antônio de Miranda, sempre presentes e prontos para ajudar;
ÍNDICE
RESUMO 1
1. INTRODUÇÃO 3
1.1– Geração de radicais livres por radiólise e efeitos biológicos 3
1.2 - Radiações ionizantes 6
1.2.1 - Partículas 7
1.2.2 - Partículas 7
1.2.3 - Feixe de Elétrons 8
1.2.4 - Radiação Gama 9
1.3 – Peptídeos Estudados 11
1.3.1 – Angiotensina I (Ang I) 11
1.3.2 – Angiotensina II (Ang II) 12
1.3.3 – Bradicinina (BK) 12
1.3.4 - Peptídeos marcados com o spin label TOAC:
(Ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-óxido-4-amino-4-carboxílico) 13 1.3.5 – Hormônio Estimulador de Melanócito (α-MSH) 14
2. OBJETIVOS 16
3. TÓPICOS DESENVOLVIDOS 17
4. MATERIAIS E MÉTODOS 18
4.1 – Síntese de Peptídeos em Fase Sólida (SPFS) 18
4.2 – Irradiação peptídica com raios gama 20
4.3 – Cromatografia Líquida de Alta Performance (HPLC) 20
4.3.1 – Analítica 20
4.3.2 - Preparativa 21
4.4 – Análise de Aminoácidos 21
4.5 – Espectrometria de Massas (LC/ESI-MS) 22
4.6 – Sequenciamento de aminoácidos por espectrometria de massa 23
4.8 – Atividade Biológica 24
4.8.1 – Útero isolado de rata 25
4.8.2 – Íleo isolado de cobaia 25
5. RESULTADOS DE DISCUSSÃO 26
5.1 – Irradiação de soluções de AngII 26
5.1.1 – Monitoramento por análise de aminoácidos 30 5.1.2 – Purificação dos principais sub-produtos formados 34 5.1.3 –Análise de aminoácidos dos análogos purificados 36 5.1.4 – Sequenciamento de aminoácidos por espectrometria de massa 38 5.1.5 – Determinação da estrutura do composto X no análogo AngII – II 44
5.1.6 – Estudo de CD dos análogos purificados 54
5.1.7 – Atividade biológica dos análogos purificados 55
5.2 - Irradiação das soluções de BK 57
5.2.1 – Purificação dos principais sub- produtos formados 61 5.2.2 – Sequenciamento de aminoácidos dos derivados BK-I e BK-II 65 5.2.3 – Estudo de CD dos análogos BK-I e BK-II 69
5.2.4 – Atividade Biológica da BK-I e BK-II 70
5.3 – Irradiação de soluções de AngI 71
5.4 – Irradiação da solução de -MSH 76
5.5 – Irradiação da solução de TOAC1-Ang II 80
5.6 – Irradiação da solução de TOAC3-BK 83
5.7 – Irradiação de Aminoácidos Livres em Solução 85
6. CONCLUSÕES 89
6.1 – Angiotensina II (AngII) - DRVYIHPF 89
6.2 – Bradicinina (BK) - RPPGFSPFR 90
6.3 – Angiotensina I (AngI) - DRVYIHPFHL 90
6.4 – Hormônio estimulador de melanócito ( -MSH) –
Acetil-SYSMEHFRWGKV-amida 91
6.5 – Angiotensina II e Bradicinina contendo marcador de spin TOAC 91
6.5.2 – TOAC3-BK 92
LISTA DE TABELAS
Pg.
Tabela 1 – Principais eventos ocorridos em um material após a absorção de energia
e seus respectivos tempos de ocorrência. 7
Tabela 2 – Resultados da análise de aminoácidos das doses 1, 2, 8 e 10kGy bem
como os valores de referência para a AngII não irradiada. 31
Tabela 3 – Rendimento de cada análogo obtido . 34
Tabela 4 – Massa molecular dos análogos da AngII e diferença em relação à AngII 36
Tabela 5 – Análise de aminoácidos dos análogos obtidos da AngII 37
Tabela 6 – Resultados do ensaio de atividade biológica para os análogos AngII–I, AngII-II e AngII-III em útero de rata e íleo de cobaia (o percentual mostrado é em
relação ao efeito da AngII, tomado como 100%) 55
Tabela 7 – Massa em mg de cada produto formado com a irradiação com
2 kGy da solução de BK e de BK na forma padrão recuperada 63
Tabela 8 –Dados de LC-ESI/MS da BK-I e BK-II e a difereça de massa em relação
à BK padrão 63
Tabela 9 – Resultados do ensaio de atividade biológica para os análogos BK-I e
LISTA DE FIGURAS
Pg.
Figura 1 - Ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-N-óxido-4-amino-4-carboxílico (TOAC) 13
Figura 2 – Perfis de HPLC da solução de AngII não irradiada (a) e irradiada com
(b)1 kGy 27
Figura 3 – Perfis de HPLC da solução de AngII irradiada com (a) 2, (b) 4 e (c) 6 kGy 28
Figura 4 – Perfis de HPLC da solução de AngII irradiada com (a) 8 , (b) 10 e
(c) 15 kGy 29
Figura 5 – Porcentagem de AngII, em sua forma padrão, em função da dose de
irradiação 30
Figura 6 – Proporção de cada aminoácido da sequência de AngII em função da
dose de irradiação 32
Figura 7 – Produtos de oxidação da His. (Xu et al, 2003) 33
Figura 8 – Perfis de HPLC dos análogos: (a) AngII-I; (b) AngII-II e (c) AngII-III 35
Figura 9 – Proporção de aminoácido dos análogos-AngII-I, AngII-II e AngII-III
obtido pela análise de aminoácidos 38
Figura 10 – Espectros de massas do AngII-I: a) íon detectado: m/z 531,9[M+2H+];
b) Após deconvolução, 1063,8 Da 40
Figura 11 – Espectros da varredura da amostra de AngII-I para: a) ion imônio para detecção de Tyr (m/z 136), b) ion imônio para detecção de Phe (m/z 120) e
c) íon imônio para detecção de His (m/z 110) 41
Figura 12 – Espectro de massas de íons fragmentados do pico de m/z 532 da AngII-I, compatível com presença de Tyr na porção C-terminal, indicado pela presença do ion y2 com relação m/z : 279 (Pro-Tyr), e do ion immonium,
com relação m/z 135,9 42
Figura 13 – Espectros de massas do AngII-II a) íon de detectactado:
m/z 531,9 [M+2H+]; b) após deconvolução: 1063.8 Da 45
Figura 14 – Espectros de varredura da amostra de AngII-II para: a) ion imônio para detecção de Tyr (m/z 136), b) ion imônio para detecção de Phe (m/z 120)
Figura 15 – Espectro de massas da AngII-II, mostrando os íons de fragmentação a partir do de m/z 539,1, compatível com presença de Tyr (ou composto X, de mesmo PM) na posição C-terminal indicado pelo íon y2 de relação m/z 279, 3 e
do íon immonium de relação m/z 135,9. 47
Figura 16 – Cromatograma de análise de aminoácidos dos compostos: a) m-Tyr e
b) o-Tyr 48
Figura 17 – Espectros de massas do AngII-III a) íon detectado: m/z 519,4 [M+2H+ ]; b) após deconvolução, obtem-se composto com PM de 1038,8 Da 50
Figura 18 – Espectros de varredura da amostra de AngII-III para: a) ion imônio para detecção de Tyr (m/z 136), b) ion imônio para detecção de Phe (m/z 120)
e c) íon imônio para detecção de His (m/z 110) 51
Figura 19 – Espectro de massas da AngII-III dos componentes de fragmentação a partir do íon com relação m/z 539,1. Nota-se a presença do íon y8 com relação
m/z 755,8, compatível com a sequência Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-Lys 52
Figura 20 – Espectros de CD da AngII padrão e dos análogos AngII-I, Ang-II e
Ang-III em meio aquoso, pH 7 54
Figura 21– Perfis de HPLC da solução de BK não irradiada (a) e irradiada com (b) 1
e (c) 2k Gy 58
Figura 22– Perfis de HPLC da solução de BK irradiada com (a) 4 , (b ) 6 e (c) 8 kGy 59
Figura 23 – Perfis de HPLC da solução de BK irradiada com (a)10 e (b) 15 kGy 60
Figura 24 – Porcentagem de BK, em sua forma padrão, em função da dose
de irradiação 61
Figura 25– Perfil de HPLC: (a) BK recuperada (b) análogo BK-I, e (c) BK- II 62
Figura 26 - Espectros de LC-ESI/MS, indênticos para ambos análogos, indicando o valor de m/z: 539.0 [M+2H+], correspondentes a 1076 Da, após o processo de
deconvulação. a) BK-I; b) BK-II 64
Figura 27 – Espectros de varredura (idênticos para BK-I e BK-II) para: a) ion imônio para detecção de Tyr (m/z 136) e b) ion imônio para detecção de Phe (m/z 120) 67
Figura 28 – Espectros de fragmentação CID-MS/MS de: a) BK-I; b) BK-II 68
Figura 29 – Espectros de CD da BK padrão e dos análogos BK-I e BK- II 69
Figura 33 – Espectros de LC obtidos por LC- ESI/MS das soluções de AngI irradiadas com a)15 kGy; b) 10 kGy; c) 8 kGy; d) 6 kGy; e) 4 kGy; f) 2 kGy
Figura 31 – Espectros de LC obtidos por LC- ESI/MS das soluções de α-MSH
irradiadas com a)15 kGy; b) 10 kGy; c) 8 kGy; d) 6 kGy; e) 4 kGy; f) 2 kGy;
g) 1 kGy e h) não irradiada 77
Figura 32 - Proporção de cada aminoácido da sequência do α-MSH em função da
dose de irradiação 78
Figura 33 – Espectros de LC obtidos por LC- ESI/MS das soluções de TOAC1-AngII irradiadas com a)15 ; b) 10 ; c) 8 ; d) 6 ; e) 4 ; f) 2 ; g) 1 kGy
e h) não irradiada 82
Figura 34 – Espectros de LC obtidos por LC- MS/MS das soluções de
TOAC3-BK, irradiadas com a)15 ; b) 10 ; c) 8 ; d) 6 ; e) 4 ; f) 2 e g) 1 kGy 84
Figura 35 - Espectro de massas de fragmentação do parent íon com relação
m/z 589 do TOAC3-BK, irradiado com 2 kGy 86
Figura 36 – Análise da solução de aminoácidos padrão, submetida à irradiação de
15 kGy 88
Figura 37 - Proporção de cada aminoácido, da solução padrão equimolar concentrada
ABREVIATURAS
ACTH Hormônio adenocorticotrófico. AngI Angiotensina I.
AngII Angiotensina II. ATP Adenosina Trifosfato. Boc Butiloxicarbonila. BK Bradicinina.
CD Dicroísmo Circular.
CID-MS/MS Espectrometria de massa por dissociação por colisão induzida. DCM Diclorometano.
ECA Enzima conversora de angiotensina. EROs Espécies radicalares de oxigênio.
FADH2 Flavina-adenina dinucleótido (forma reduzida).
Fmoc Fluorenilmetiloxicarbonila. GPCR Receptor acoplado a proteína G. HF Ácido fluorídrico.
HPLC cromatografia líquida de alta eficiência.
LC-ESI / MS Espectrometria de massa por ionização por “electrospray” acoplado a cromatografia líquida.
- MSH Hormônio estimulador de melanócito.
NADH Nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida). RP – HPLC Cromatografia líquida de alta performance de fase reversa. SCC Sistema calicreína – cinina.
SPFS Síntese de peptídeos de fase sólida. SRA Sistema renina – angiotensina. TFA Ácido trifluoroacético.
1 RESUMO
Os produtos de reações e os mecanismos envolvidos na radiólise de macromoléculas de relevância fisiológica têm sido objetos de diversos estudos. Este fatores são conhecidos por atuarem em diversos tipos de patologias no organismo humano. Como uma das fontes de geração de radicais livres em solução pode ser obtida pela ação da radiação ionizante, decidiu-se nesta tese, avaliar-se o efeito da irradiação de alguns peptídeos de importância fisiológica. A parte preponderante deste trabalho envolveu o estudo dos peptídeos vasoativos angiotensina II (DRVYIHPF, AngII) e bradicinina (RPPGFSPFR, BK). Foram realizadas irradiações com doses variando entre 1 e 15 kGy, nas quais foram observadas uma progressiva degradação de suas estruturas em função da dose de radiação. Notou-se neste processo, a formação de sub-produtos que foram purificados e caracterizados por diferentes procedimentos experimentais dentre os quais: HPLC, análise de aminoácidos e espectrometria de massa, e sequenciamento de aminoácidos. Além destes, foram também realizados ensaios de dicroísmo circular (CD) e atividade biológica (contrações musculares).
No estudo da AngII, foram isolados três análogos: Tyr8-AngII, m-Tyr8-AngII, e Lys6-AngII. Quanto ao estudo da BK, notou-se novamente a transformação do resíduo de Phe em Tyr e m-Tyr, mas apenas ocorrendo com o resíduo de Phe8 e não Phe5 da estrutura da BK. Este dado, de grande relevância, indica que o efeito da radição é sequência dependente. Vale a pena ressaltar que não se observou alterações simultâneas tanto na AngII quanto na BK. Os produtos isolados sempre contiveram apenas uma destas alterações mencionadas.
Além destes peptídeos, foram estudados em caráter preliminar, a angiotensina I (DRVYIHPFHL, AngI), o hormônio liberador de melanócito (acetil-SYSMEHFRWGKV-amida, α-MSH), e dois análogos marcados com o spin label TOAC (ácido
2 Foi também realizado um estudo com soluções equimolares de L-aminoácidos livres no qual foi observado apenas um decréscimo dose-dependente dos aminoácidos Cys e Met, nas condições estudadas.
3 1. INTRODUÇÃO
1.1 - Geração de radicais livres por radiólise e efeitos biológicos.
Nos últimos anos têm-se desenvolvido muitos estudos relacionados aos mecanismos fisiológicos e não fisiológicos de geração de espécies reativas radicalares de oxigênio e nitrogênio e as modificações por eles causadas em moléculas biológicas.
Tal interesse se deve às demonstrações de que essas espécies reativas radicalares estão relacionadas com mecanismos responsáveis pela degeneração celular tecidual, instalação de processos infecciosos, evolução de quadros inflamatórios e muitos outros processos degenerativos crônicos. (Barros et al, 2006).
Nas últimas duas décadas, as espécies reativas radicalares têm sido também diretamente correlacionadas a uma série de patologias degenerativas, como diabetes (Opara, 2004; Raza et al 2004), câncer (Moriyama-Gonda et al 2003, Hand et al 2003; Milkkelsen et al 2002)., artrite reumatóide (Henrotin et al 2003; Del Carlo et al 2002), algumas doenças cardiovasculares (Cao e Li 2004; Zimmerman e Davisson 2004), degeneração macular (Sommerburg et al 1999) e principalmente doenças degenerativas como como a esclerose múltipla (Bagasra et al 1995), o mal de Alzheimer (Selkoe 1994) e o de Parkinson (Schapira e Olanow 2004; Tu et al 1997).
De modo semelhante, o gradual acúmulo de produtos oxidados derivados de ácidos nucléicos, proteínas e lipídeos (quadro metabólico normal resultante da ação crônica das espécies reativas radicalares durante a vida de organismos aeróbios) parece ser a base molecular dos processos de degenerescência funcional de células, tecidos e órgãos associados ao envelhecimento (Sohal e Weindruch, 1996; Berlett e Stadtman, 1997; Yin, 1996).
4 que podem potencializar o efeito vasoconstritor da AngII (Romero e Reckelhoff, 1999; 2003).
Define-se como radical livre toda espécie que possui um ou mais elétrons desemparelhados. O elétron livre que caracteriza o radical livre pode estar centrado em um átomo de hidrogênio, oxigênio, nitrogênio, carbono, enxofre ou átomos de metais de transição.
Os radicais livres são subprodutos naturais do metabolismo do oxigênio molecular (O2) nos organismos aeróbios. O O2 é um composto presente na proporção média de 21%
do ar atmosférico e é utilizado nos diversos organismos vivos primordialmente para a re-oxidação de enzimas (NADH, FADH2) na cadeia de transporte de elétrons na mitocôndria.
Este processo celular permite a constante combustão dos nutrientes absorvidos pelo organismo, garantindo o suprimento de energia química (moléculas de ATP) e/ou calor (Barros et al-2006). Essa via de formação de espécies reativas de oxigênio (EROs – oxidantes de maior importância biológica) consiste na redução unieletrônica do oxigênio à água, na qual a entrada de 4 elétrons na molécula de oxigênio promove o aparecimento do radical superóxido (O2- •), peróxido de hidrogênio (H2O2) e do radical hidroxila (HO•),
conforme mostrado na Equação 1 (Rover et al. 2001):
O2 O2- • H2O2 HO• H2O (1)
Estima-se que, em condições normais, cerca de 1-3% do O2 absorvido pela
mitocôndria sejam parcialmente reduzidos a radicais superóxido (O2- •), o principal
percussor de outras espécies radicalares mais reativas (Hoffmann et al, 2004).
O radical superóxido pode ser espontaneamente descomposto a O2, H2O2 ou,
preferencialmente no meio celular, por meio da catálise enzimática pela enzima superóxido desmutase (Barros et al.). O H2O2, embora não seja um radical livre por definição, é um
intermediário responsável pela formação de uma das mais reativas e instáveis ERO no meio biológico - o radical hidroxila (HO•) (Stohs e Bagchi, 1995).
5 a essas características físico-químicas, o radical hidroxila foi identificado como um dos principais sinalizadores celulares de processos intermediados pelas espécies radicalares (Branco et al, 2004).
Portanto, a toxicidade do oxigênio em praticamente todas as células aeróbias, decorre da formação de EROs que podem interagir com diversas macromoléculas, com o objetivo de se estabilizarem lesando deste modo, diferentes estruturas celulares.
Embora sejam muitos os estudos sobre o efeito das reações das EROs com proteínas, peptídeos e aminoácidos (Garrison, 1987; Hawkins e Davies, 2001, Gebicki e Gebicki, 1993; Giulivi et al, 2003; Davies et al, 1987; Stadtman e Levine, 2003; Sharp et al, 2004; Fu et al, 1998; Stadtman, 1993; Simpson et al, 1992), pouco se sabe sobre os mecanismos pelos quais essas reações acontecem. Segundo a literatura (Gaber, 2005; Lee e Song, 2002; Davies et al, 1987; Filali-Mouhim, 1997, Moon e Song, 2001), o ataque dos radicais livres a uma determinada proteína ou peptídeo é dependente de vários fatores, dentre as quais, destacam-se a: conformação da proteína, acessibilidade ao solvente de um aminoácido em particular, e seqüência primária de aminoácidos .Sendo assim, o ataque das EROs em um determinado peptídeo ou proteína não ocorre de maneira específica.
Os radicais livres utilizados em estudos podem ser gerados por inúmeros métodos. Em geral, são formados pela quebra direta de ligações, ou por reações de transferência de elétrons (Hawkins e Davies, 2001). Os radicais oxigenados são gerados pela interação da radiação com a água (radiólise da água) que forma espécies excitadas, que por sua vez, se decompõe, formando espécies reativas. Estas espécies, ao reagirem entre si e com outras moléculas presentes, podem formar outras espécies, tais como, radicais, íons, elétrons aquosos, átomos de hidrogênio, e gases.
6 de alguns aminoácidos livres (Xu e Chance, 2004; Xu et al, 2003; Zegota et al, 2005, Miyahara et al, 2000).
1.2 - Radiações ionizantes
O termo radiação ionizante ou radiação de alta energia abrange um grande número de diferentes tipos de radiação, muitas das quais são feixes de partículas carregadas que ionizam as moléculas do meio irradiado, como por exemplo as partículas α, β, feixes de
elétrons e raios gama.
A radiação ionizante ao atravessar um material provoca uma série de eventos, que tem início com a absorção da energia e cujos efeitos podem ser observados até meses depois. A série de eventos que se segue à absorção da radiação pela matéria pode ser dividida em três estágios temporais (Ito, 1975):
Estágio físico (10-18 – 10-15 s). Ocorre a transferência de energia da radiação para a matéria, levando à formação de íons e provocando excitações moleculares. As três espécies primárias formadas, cátions, elétrons e moléculas excitadas, são bastante instáveis e logo sofrem reações secundárias.
Estágio físico químico (10-14 – 10-11 s). Neste estágio são produzidas as espécies secundárias reativas, como átomos ou radicais livres, com energia.
Estágio químico (> 10-10 s). Este estágio se inicia quando o sistema restabelece o equilíbrio térmico alterado pela absorção de energia e as espécies reativas continuam a reagir entre si e com outras moléculas presentes.
7 Tabela 1 – Principais eventos ocorridos em um material após a absorção de energia e seus respectivos tempos de ocorrência.
Tempo (segundos) Eventos em sólidos a temperatura ambiente
10 –16 E Excitação ou ionização
10 –14 Recaptura de elétrons
10 –13 Dissociação de ligações químicas 10 –12 Relaxação de dielétricos, reorientação da rede 10 –10 Reações do tipo radical – radical
10 –8 Reações de radicais cinéticos ou excitados
< 10 –2 Situação metaestável
1.2.1 - Partículas
α
α
α
α
As partículas α são núcleos de hélio carregadas positivamente, 42He2+. São emitidas
por núcleos radiativos com energias discretas que são características do radioisótopo. Ao atravessarem a matéria perdem energia principalmente por colisões inelásticas com os elétrons que se encontram em seu caminho, promovendo a excitação e a ionização de átomos e moléculas. A grande diferença de massa entre o elétron e a partícula α faz com
que ela perca uma pequena parte de sua energia e praticamente não seja desviada de sua trajetória durante a colisão com o elétron. Como consequência as partículas α são
gradativamente freadas como resultado de um grande número de colisões e percorrem uma pequena trajetória retilínea. Uma folha de papel é suficiente para blindar as partículas α.
(Spinks e Woods, 1964)
1.2.2 - Partículas
β
β
β
β
As partículas β são elétrons rápidos emitidos por um núcleo radioativo. Ao
contrário das partículas α, as partículas β emitidas por um mesmo radioisótopo não
8 decaimento β a energia total (máxima) é dividida entre as partículas β e os antineutrinos,
que também são emitidos. Os antineutrinos não possuem carga, massa e nem sofrem interação significativa com a matéria. Sua existência foi postulada para permitir a conservação de energia, do momento e do spin no decaimento β.
Em sua passagem pela matéria as partículas β perdem energia predominantemente
por colisões inelásticas com os elétrons, da mesma maneira que as partículas α. Entretanto,
devido ao fato da partícula β e o elétron com o qual colide ter a mesma massa, a partícula β
pode perder até a metade de sua energia em uma única colisão e sua trajetória não é linear. O desvio da trajetória também pode ocorrer quando a partícula β passa próximo ao núcleo
atômico. As partículas β não têm um alcance fixo nos materiais, mas sim uma distância
máxima de penetração ou alcance máximo. Também apresentam um baixo poder de penetração (Spinks e Woods, 1964).
1.2.3 - Feixes de Elétrons
Os elétrons acelerados em aceleradores adquirem alta energia e interagem com a
matéria da mesma maneira que as partículas β. Ao contrário das partículas β, o feixe de
elétrons é monoenergético e por meio da variação do potencial aplicado à aceleração dos elétrons é possível variar a energia cinética aumentando assim seu poder de penetração.
A interação dos elétrons de alta energia com matéria condensada depende tanto da energia cinética dos elétrons como do número atômico do material irradiado. A dose absorvida aumenta à medida que penetra no material, diminuindo a partir de uma dada distância de penetração.
9
1.2.4 - Radiação Gama
Radiação gama é uma radiação eletromagnética de origem nuclear, com pequeno comprimento de onda e portanto com grande poder de penetração, monoenergéticas e características para cada radioisótopo ou com um número pequeno de energias discretas.
Ao contrário das partículas α e β, as quais perdem energia gradativamente, por
meio de consecutivos processos de transferências de energia, a radiação gama perde a maior parte de sua energia em uma única colisão. O resultado é que, enquanto as partículas
α e os elétrons são freados por absorvedores relativamente finos, uma fração da radiação
gama, na mesma situação, é completamente absorvida mas os fótons restantes são transmitidos com sua energia inicial total.
A irradiação de proteínas com raios gama tem sido amplamente estudada por causar fragmentação, intercruzamento (cross-linking), agregação e principalmente, oxidação, via EROs geradas na radiólise da água (Lee e Song, 2002).
Sabe-se que a energia absorvida da radiação ionizante pode afetar os materiais biológicos por dois meios:
• Efeito Direto – observado a própria proteína absorve a energia ionizante durante a irradiação. Esse efeito é randômico e amplamente observado quando a irradiação é feita com a proteína no estado sólido.
• Efeito Indireto – é resultado das reações entre as proteínas e os produtos de interação da radiação com a água ou outros solventes. Esse efeito é observado quando a irradiação é feita em meio aquoso e ao contrário do efeito direto, não é randômico, pois está associado aos sítios preferenciais de reação entre os produtos da radiólise da água e a proteína em estudo.
10 processo é denominado radiólise da água, que ocorre inicialmente de acordo com as Equações 2, 3 e 4.
H2O H2O+ + e- (2)
e- + H2O H2O - (3)
H2O++ H2O H3O+ + OH• (4)
Os produtos H2O+ e H2O- são muito instáveis podendo dissociar-se de acordo com
as Equações 5 e 6.
H2O+ H+ + OH• (5)
H2O- H• + OH- (6)
Os radicais H• e OH• formados apresentam-se extremamente reativos e não reagem de forma homogênea na molécula. Esses produtos primários da radiólise da água reagem com certos grupamentos da molécula alvo.
As reações entre as moléculas-alvo e os produtos da radiólise da água são portanto, resultado do efeito indireto da radiação. O processo indireto é o principal causador de oxidação de macromoléculas em meio extracelular e está relacionado com inúmeras doenças humanas e com o complexo processo de envelhecimento do organismo. Sendo assim, a radiólise da água é um “ato primário”, produzindo radicais livres que possuem alto poder de reação com as moléculas.
As principais espécies formadas, acompanhadas de seus respectivos rendimentos para 100 eV de energia absorvida, estão apresentados na Equação 7.
H2O —ww 2,7 e-aq. + 0,45 H3O+ + 3,2 OH• + 0,6 H+ + 0,45 H2 + 0,7 H2O2 (7)
11 ao grupo carboxílico e de grupos sulfidrilas, além de reagir com anéis aromáticos do Trp, Tyr e Phe, formando radicais altamente reativos (Butler et al, 1984).
Os elétrons aquosos (e-aq. ) reagem com os hidrogênios dos aminoácidos aromáticos
da mesma forma que os radicais hidroxila, além de promoverem a desaminação de outros aminoácidos como Ala, Arg, Gly, His, Cys e os aromáticos (Butler et al, 1984).
Quando proteínas são irradiadas com raios gama, ocorrem alterações químicas como fragmentação, croos-link, agregação e oxidação por EROs gerados na radiólise da água. Estas mudanças dependem da natureza química e do estado físico da proteína, bem como da conformação, da sequência primária de aminoácidos e acessibilidade aos produtos da radiólise da água (Moon e Song, 2001). Alem destes, outros fatores podem influenciar no resultado final na irradiação de proteínas, como a presença ou ausência de oxigênio, o tipo de fonte de radiação, a dose e a taxa da mesma, a temperatura de irradiação, o tipo de solvente, o estado físico, a concentração e o pH.
Utiliza-se principalmente como fonte de raios gama, o 60Co. As fontes de 60Co são fontes seladas que apresentam o núcleo radioativo de cobalto em um compartimento que permanece hermeticamente fechado, não tendo contato direto com os materiais externos da fonte. O 60Co utilizado nas fontes de radiação é produzido em um reator pela irradiação do
59Co, que é um isótopo estável, com um fluxo de nêutrons. Ocorre a reação de captura de
nêutrons [59Co (n,γ) 60Co]. O 60Co é colocado no interior de frascos especiais que são então
reunidos formando as chamadas fontes de radiação. As paredes desse frasco barram os
raios β, que também são emitidos pelo 60Co.
1.3 – Peptídeos Estudados
1.3.1 – Angiotesina I (Ang I)
12 (AngII). A AngI também pode ser hidrolizada pela enzima prolil-endopeptidase e carboxipeptidases produzindo o heptapetideo vasodilatador angiotensina (1-7).
A enzima conversora de angiotensina-2 (ECA-2), uma carboxipeptidase homóloga à ECA, promove uma via alternativa de hidrólise da AngI pela liberação do resíduo de Leu10, gerando a angiotensina (1-9) o qual pode ser hidrolizada pela ECA, gerando agora a angiotensina (1-7) (Oliveira et al, 2007).
1.3.2 – Angiotesina II (Ang II).
A angiotensina II (AngII, Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) é um hormônio octapeptídico, cuja função vasoconstritora é a mais potente dentre os peptídeos nativos descrita na literatura, reponsável por funções regulatórias tais como vasoconstrição, estimulação da secreção adrenal de aldosterona, aumento da absoção renal tubular de sódio, ativação do sistema nervoso simpático e aumento da contração cardíaca (Carpenter et al, 1998).
Além das funções regulatórias, muitas outras funções da AII foram descobertas por meio diferentes receptores nos mais variados tecidos, a maioria deles pertencentes a superfamília dos receptores da proteína G (GPCRs) (Oliveira et al, 2007).
1.3.3 – Bradicinina (BK)
A bradicinina (BK) é um hormônio nonapeptídico linear cuja sequência é Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg, e é produzido pela ação das calicreínas, uma família de enzimas proteolíticas.
A produção da bradicinina se dá tanto sistemática quanto localmente, na parede vascular, e sua função está principalmente relacionada com a regulação renal, cardiovascular e vascular.
Os surgimentos de dor e a hiperalgesia também estão associados à função da BK pela estimulação das fibras A e C no perifério. Além disso, algumas evidências apontam que a bradicinina tem um papel fundamental na resposta inflamatória, asma, sepsis e sintomas associados à infecção retroviral (Young e Hicks, 1994).
13
N C
H2N
O
O
O
1.3.4 – Peptídeos marcados com o spin label TOAC (Ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-óxido-4-amino-4-carboxílico).
A espectroscopia da ressonância paramagnética eletrônica (RPE) é muito empregada para estudos conformacionais para o estudo de peptideos e peptidil-resinas. Entretanto, para a aplicação desse método é ncessário que se introduza um composto radicalar estável (marcador de spin ou “spin label”) no sistema em estudo (Wertz e Bolton,
1972; Smith et al, 1976; Berliner e Reuben, 1989).
O grupamento nitróxido de marcadores de spin em geral, contém um elétron desemparelhado que se localiza entre os átomos de N e de O e que absorve radiação na região de microondas do espectro eletromagnético, o que corresponde a freqüência de movimentos translacionais, rotacionais e/ou segmentais das estruturas em estudo. Esta característica é que permite a estes derivados paramagnéticos estáveis, o emprego para investigação de propriedades conformacionais/estruturais de moléculas ou sistemas onde se encontram acoplados.
O spin label TOAC (ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-óxido-4-amino-4-carboxílico) cuja estrutura está apresentado na Figura 1, pode ser introduzido em uma sequência peptídica, pelo método de síntese de peptídeos em fase sólida, em qualquer posição (Nakaie et al., 1981, Marchetto et al, 1993).
Figura 1: Ácido 2,2,6,6-tetrametilpiperidina-1-óxido-4-amino-4-carboxílico (TOAC).
Diferente de estratégias opcionais de marcação paramagnética de macromoléculas onde se empregam marcadores de spin mais longos ou mais flexíveis o uso de um do tipo aminoácido como o TOAC é sempre mais conveniente. Isto se deve à estrutura especial
deste marcador e onde o seu Cαque contém os grupamentos amínicos e carboxílicos para a
14
centro paramagnético nitróxido. Deste modo, este marcador de spin é mais sensível a alterações motricionais no sistema em que se encontra ligado, pois não existem tantas ligações simples separando-os, como ocorre com outros marcadores de spin.
Devido a isto e à estratégia introduzida de seu emprego na marcação de cadeias peptídicas, independente da posição, foi possível observar nos anos seguintes, a expansão do uso do TOAC para diferentes tipos de investigações.
Inúmeras publicações existem atualmente no campo de peptídeos empregando-se o marcador de spin TOAC, sendo alguns de nosso próprio grupo ou colaboradores (Barbosa
et al., 1999, Pertinhez et al., 1997, Nakaie et al., 2002, Vieira et al., 2002, Schreier et al.,
2004, Moraes et al., 2007, Teixeira et al., 2007, Lopes et al., 2008, Santos et al., 2008)
mas também de outros laboratórios (Smythe et al., 1995, Toniolo et al., 1998, McNulty et
al., 2000, D’Amore et al., 2003, Marsh, 2006). Se ainda a maior parte destes trabalhos
investiga detalhes conformacionais ou motricionais do peptídeo onde o marcador se encontra acoplado, existem também alternativamente trabalhos que estudam a dinâmica da solvatação de polímeros ou peptídil-polímeros durante a síntese peptídica,via marcação dos
mesmos com TOAC (Cilli et al., 1997, 1999, Oliveira et al., 2002, Marchetto et al., 2005,
Nakaie et al., 2006, Cilli et al., 2007).
1.3.5. – Hormônio estimulador de melanócito ( -MSH)
O hormônio estimulador de melanócito (α-MSH) é produzido pela glândula
pituitária de mamíferos e pelo epitélio de alguns vertebrados e parece estar envolvido não
somente com o controle da coloração da epiderme (Vaudry e Eberle, 1993; Abdel-Malek et
al., 1995) mas também com obesidade (Fan et al., 1997), disfunção erétil (Wessels et al,
1998) e várias outras funções biológicas (Castrucci et al; 1992). A seqüência
tridecapeptídica deste hormônio é acetil-SYSMEHFRWGKV-amida e estudos prévios deste peptídeo, marcados com TOAC forneceram os primeiros análogos peptídicos da literatura, integralmente ativos, mesmo com a introdução desta molécula paramagnética
(Barbosa et al., 1999, Nakaie et al., 2001, Patentes EPM 2 e EPM 3).
Pacientes com vitiligo apresentam acúmulo de peróxido de hidrogênio (H2O2) na
epiderme (Spencer et al, 2007) que pode causar uma série de eventos, inclusive a oxidação
15
fato possivelmente está relacionado com a reduzida expressão do hormônio -MSH em
16 2. OBJETIVOS
Baseado nestas considerações, a presente tese se propôs a investigar especificamente o efeito de radiações agora em macromoléculas do tipo peptídeos. Para tanto, foi utilizada a radiação ionizante gama como fonte de radicais livres e como modelos peptídicos, foram escolhidos alguns de grande relevância fisiológica como os vasoativos angiotensina II (AngII), bradicinina (BK), angiotensina I (AngI), e também o hormônio
liberador de melanócito (α-MSH).
No caso dos dois primeiros (AngII e BK), aproveitou-se também para estudar análogos dos mesmos contendo um derivado especial do tipo aminoácido e denominado marcador de spin. A razão para isto residiu no fato de que esta espécie de composto é um radical livre estável e deste modo, o estudo do efeito da irradiação gama nestes derivados peptídicos poderia também ser de interesse. Informações adicionais, tanto deste marcador de spin do tipo aminoácido, quanto dos peptídeos acima mencionados, serão posteriormente melhor detalhadas. Além destas investigações, foram desenvolvidos também estudos com L-aminoácidos livres em solução, objetivando compararem-se potenciais alterações estruturais nas mesmas, induzidas pela radiação, em comparação com a situação em que estão inseridos em estruturas peptídicas.
A estratégia básica envolveu a fase inicial da irradiação destes compostos por radiação gama, seguida da caracterização dos efeitos produzidos, incluindo-se em alguns casos, a purificação de produtos formados e posterior estudo conformacional e correlação com a atividade farmacológica, via experimentos em íleo de cobaia e útero de rata. Em termos de metodologias aplicadas, listam-se portanto, aparelhos de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), analisador de aminoácidos, espectrometria de massa (determinação de peso molecular e também para seqüenciamento dos produtos formados) e dicroísmo circular.
17 3. TÓPICOS DESENVOLVIDOS
De acordo com as considerações apresentadas, a presente tese de Doutorado procurou desenvolver os seguintes tópicos:
a) Irradiação com fonte de 60Co, dos peptídeos: AngII, BK, AngI, α-MSH, TOAC1
-AngII e TOAC3-BK com doses que variaram entre 1 a 15 kGy.
b) Purificação por HPLC semi-preparativa dos principais sub-produtos formados na
irriadição das soluções de AngII e BK, e caracterização por análise de aminoácidos, espectrometria de massas (CID-MS/MS), dicroísmo circular CD e atividade biológica em íleo de cobaia e útero de rata.
c) Caracterização preliminar por LC-ESI/MS de soluções irradiadas de AngI, α
-MSH, TOAC1-AngII e TOAC3-BK. Avaliação das soluções irradiadas de α-MSH
por análise de aminoácidos.
d) Irradiação e monitoração por análise de aminoácidos de uma solução equimolar de
18 4.MATERIAISEMÉTODOS
A) Materiais
Todos os peptídeos estudados foram provenientes de projetos anteriores do nosso grupo e que foram disponibilizados para o desenvolvimento da presente tese de Doutorado. Os demais reagentes e solventes (grau P.A. ou HPLC) foram adquiridos de diferentes
fontes comerciais. A solução padrão de aminoácidos e os compostos L-o-Tyr e L-m-Tyr
utilizados neste trabalho foram adquiridos da Sigma-Aldrich Co.
B) Métodos
Neste capítulo estão descritos alguns aspectos das metodologias de síntese de peptídeos em fase sólida (SPFS), análise de aminoácidos, espectrometria de massa, dicroísmo circular e seqüenciamento de aminoácidos que foram utilizados nesse trabalho.
4.1 – Síntese de Peptídeos em Fase Sólida (SPFS).
A técnica de síntese de peptídeos em fase sólida, introduzida por Bruce R. Merrifield (1963, prêmio Nobel de Química em 1984) se baseia no crescimento da cadeia peptídica em grãos de resinas poliméricas insolúveis em frascos de síntese de placa porosa, que permite que os reagentes e subprodutos da síntese sejam eliminados por simples filtração, sendo essa uma das grandes vantagens da SPFS em relação a outras estratégias existentes, como por exemplo a síntese em solução.
19
Existem dois tipos de ciclos sintéticos cuja diferença básica entre ambos reside no
fato de que em um o protetor temporário do α-amino grupo dos aminoácidos é removido
em meio ácido (grupo terc-butiloxicarbonila/Boc – Barany e Merrifield, 1980, Stewart e
Young, 1984) e no outro, a remoção ocorre em meio básico (9-fluorenilmetiloxicarbonila/Fmoc – Fields e Noble, 1990). Além desta diferença, o tipo de grupo protetor das cadeias laterais dos aminoácidos empregados nestas duas estratégias de
síntese é do tipo benzila (química Boc) e terc-butila (química Fmoc). Em comum nestas
duas metodologias, tem-se o protocolo químico da reação de acoplamento dos aminoácidos. Existe também a necessidade de uma prévia desproteção do grupamento amínico da seqüência peptídica em crescimento, sendo os grupos protetores Boc e Fmoc remividos respectivamente com soluções de 30% TFA/DCM e 20% piperidina/DMF, respectivamente. A clivagem final do peptídeo da resina é efetuada em meio ácido nestes dois métodos de síntese - HF anidro e ácido trifluoracético (TFA) em cerca de 90% v/v de diclorometano (DCM), respectivamente.
Dentre os problemas mais sérios ainda encontrados na técnica da SPFS, destacam-se a ocorrência de reações incompletas de acoplamento de aminoácidos, racemização durante esta etapa de acilação, clivagem parcial da cadeia peptídica da resina, remoção prematura das cadeias laterais dos aminoácidos durante a síntese e reações colaterais durante a etapa final de clivagem do peptídeo da resina.
Em termos de reação da incorporação de aminoácidos (acoplamento), tem sido
reportado na literatura a ocorrência das denominadas seqüências “difíceis” (Narita et al.,
1989; Hancock et al., 1973; McFerran et al., 1991), devido a problemas conformacionais
da seqüência desejada, agravada possivelmente por algum tipo de interação da cadeia peptídica com a matriz da resina e principalmente entre as próprias cadeias peptídicas. De um modo geral, estas seqüências possuem forte tendência agregante, com estruturas geralmente do tipo beta e que induzem impedimentos espaciais na extremidade amino-terminal do peptídeo, dificultando ou mesmo inviabilizando o acoplamento eficiente do aminoácido seguinte da seqüência desejada.
20 4.2 - Irradiação peptídica com raios gama.
A irradiação dos peptídeos e solução padrão de aminoácidos foi realizada em uma
fonte de Co60 do tipo Gammacell 220 (Atomic Energy Agency of Canadá Ltd.), com taxa
de dose de 3,32 kGy/h, pertencente ao Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares (IPEN). As irradiações foram realizadas em presença de oxigênio e temperatura ambiente.
Os peptídeos foram dissolvidos em água milli-Q para concentração de 1 mg/mL e as soluções divididas em 8 alíquotas de 1mL, que foram irradiadas em doses individuais de 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 15 kGy e uma alíquota que não foi irradiada (branco).
A solução padrão de aminoácidos foi irradiada com doses individuais de 1, 2, 4, 6,
8, 10 e 15 kGy, em alíquotas de 0,5mL da solução comercial e diluída 10 vezes até uma concentração final de 0,25 mM com tampão da Amershan Biosciences (pH 2,2, 0,20 M).
Soluções de concentração 50 mg/50 mL de AngII e BK foram também irradiadas,
com doses de 4 e 2kGy respectivamente, para posterior purificação dos componentes.
4.3. - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
4.3.1 - Analítica
Espectros de HPLC foram obtidos para todas as soluções peptídicas não irradiadas e irradiadas em todas as doses investigadas, assim como para todos os produtos puros obtidos após a irradiação, utilizando-se um sistema de duas bombas, um auto sampler Walters 717 plus e um detector de absorbância Walters 2487. Os solventes utilizados foram de grau HPLC e a água utilizada foi obtida por destilação em vidro e filtração em um sistema milli-Q, da Millipore, equipado com cartuchos para retenção de sais e compostos orgânicos.
As condições experimentais foram:
Coluna: Vydac C18 (4,6 x 150 mm), 300Å, 5 µm.
Sistema de solventes: A – 0,1% TFA/H2O
21
Gradiente: 5% a 95% de solvente B em 30 minutos Fluxo: 1,5mL/min
Comprimento de onda: 220 nm
4.3.2 - Preparativa
As purificações das soluções irradiadas de 50 mg de AngII e BK, foram feitas em um sistema de RP-HPLC da Walters, modelo Delta Prep 4000, ao qual estava acoplado um detector UV-Vis (modelo 486), coletor de frações LKB-Frac-200 da Pharmacia e registrador Servogor 120. Os solventes utilizados foram de grau HPLC e a água utilizada foi obtida por destilação em vidro e filtração em um sistema milli-Q, da Millipore, equipado com cartuchos para retenção de sais e compostos orgânicos.
As condições experimentais foram:
Coluna: Semipreparativa Vydac C18 (10,0 x 250,0 mm), 300Å, 15-20 µm.
Sistema de solventes: A – 0,1% TFA/H2O
B – 0,1% TFA – 60% ACN/H2O
Gradiente: 0,33% de solvente B/min. Fluxo: 10mL/min
Comprimento de onda: 220 nm
4.4 - Análise de Aminoácidos
As análises de aminoácidos foram feitas pelo método de ninidrina em um analisador automático BioChrom 20 Plus (Amersham Biosciences), provido de válvulas injetoras de amostras. A derivação com ninidrina faz com que os aminoácidos passem a absorver energia no comprimento de onda de 570 nm, exceto a prolina cuja medida de absorbância é feita em 440 nm.
22
Os peptídeos (± 1 mg) foram hidrolisados em 1 mL de HCl 6 M, na presença de
0,08 mL de fenol a 5% em água (v/v), a 110ºC por 72 horas em atmosfera de N2. Após a
hidrólise, o material foi concentrado a vácuo, re-suspenso em citrato de sódio 0,2 M, pH 2,2 e filtrado em membrana Millipore, antes de ser injetado no aparelho. Peptidil-resinas foram hidrolisadas em uma mistura de HCl 12 M e de ácido propiônico (1:1) (v/v), a
130ºC, por um período variável de 5 a 50 horas (Jubilut et al., 1997).
A relação molar dos aminoácidos foi estabelecida, considerando-se unitária a concentração do aminoácido mais próximo da média para todos os resíduos. O conteúdo peptídico (CP) em porcentagem foi obtido relacionando-se o valor médio (em mmol) de todos os aminoácidos encontrados na análise em relação à quantidade de peptídeo hidrolisado. O marcador TOAC é degradado irreversivelmente durante esta hidrólise ácida, inviabilizando a determinação quantitativa deste composto paramagnético (Nakaie et al., 1981).
4.5 - Espectrometria de Massas (LC/ESI-MS)
Os espectros de massas das soluções irradiadas ou não foram obtidos em um sistema LC/ESI-MS Waters, constituído por um módulo de separação Alliance modelo 2690, detector photodiode array modelo 996, injetor automático com capacidade de 120 amostras e um espectrômetro de massas Micromass modelo ZMD. O sistema é controlado por uma workstation Compaq modelo AP200. Os peptídeos foram dissolvidos em 5 %
AcOH/H2O (v/v), na concentração de 1 mg/mL.
As condições experimentais utilizadas foram:
Coluna: Waters Nova-Pak C18 (2,1 x 150 mm), 60 Å, 3,5 µm
Solventes: A: 0,1% TFA/H2O
B: 0,1% TFA - 60% ACN/H2O
Gradiente: 5% a 95% de B em 30 minutos
Fluxo: 0,4 mL/min
Comprimento de onda: 190-300 nm
23 4.6. - Seqüenciamento de aminoácidos por espectrometria de massa.
As amostras a serem submetidas ao sequenciamento de aminoácidos foram inicialmente diluídas em água milli-Q e então submetidas à análise de espectrometria de massas por eletrospray em um espectrômetro constituído de três quadrupolos, modelo Quattro II (Micromass, Manchester, UK) por infusão direta (300 nL/min) nas seguintes condições: voltagem capilar mantida em 3.8 kV, voltagem mantida em 45 V, temperatura mantida em 100ºC.
Os parâmetros para a detecção da massa molecular e dos íons-filho foram otimizados com fragmentos do peptídeo sintético (18-39) do ACTH (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) e a Ang II, proveniente do nosso próprio laboratório, ambos, com concentração de 1 pmol/uL, para obtenção de nível do sinal apropriado .
Para a detecção dos íons-filho, a energia de colisão foi mantida em 25 eV, e o gás argônio utilizado como gás de colisão com pressão parcial de 3.0x10-3 mTorr. Para a detecção dos íons percussores, a energia de colisão foi mantida em 60 eV , também com o gás argônio. Os íons immonium, com relação carga massa (m/z) 120 e 136 foram monitorados para detecção dos aminoácidos Phe e Tyr, respectivamente.
Cada espectro foi obtido como uma média de 13-23 corridas (2 a 5 seg/scan) e processados utilizando-se o programa MassLynx v.3.3. (Micromass, Manchester, UK) e as razões carga/massa foram deconvoluídas à massa molecular da amostra por meio do alogarítmo MaxEnt3 (Johnstone e Rose, 1996).
24 4.7 - Dicroísmo Circular (CD)
A espectroscopia de dicroísmo circular é uma técnica utilizada para se obter informações a respeito da estrutura secundária de peptídeos e proteínas em solução. Esta técnica se baseia na propriedade de absorção diferenciada da luz circularmente polarizada a direita ou a esquerda.
A luz circularmente polarizada é gerada por uma fonte de luz que oscila em duas direções perpendiculares com a mesma amplitude e diferentes fases, o que faz com que a trajetória do vetor resultante de propagação da luz seja helicoidal e conseqüentemente que a onda resultante seja polarizada a direta ou a esquerda de acordo com a diferença de fase.
Peptídeos e proteínas podem possuir regiões nas quais os grupos cromóforos apresentam um alto grau de organização devido a presença de -hélices, folhas- e outros arranjos. De acordo com a orientação das ligações peptídicas nesses arranjos, as transições ópticas da ligação amida podem se dividir em múltiplas transições, variando assim os comprimentos de onda e a intensidade das transições. Como conseqüência dessas variações, muitos domínios de estrutura secundária produzem espectros de CD com bandas conhecidas (Chen, 1974, Fasman, 1996).
Os espectros de CD dos produtos puros originados da irradiação das soluções peptídicas foram obtidos em um espectropolarímetro Jasco modelo J-810 na faixa de 190 a 260 nm, utilizando uma cela circular de quartzo com caminho óptico de 0,1mm. Os espectros foram adquiridos à temperatura ambiente, com tempo de integração de 8 segundos por ponto, velocidade de aquisição de 50 nm/min, largura de banda de 1nm,
sensibilidade padrão de 100 mdeg, quatro acumulações e fluxo de N2 de 10 mL/min. Os
valores de [ ] são dados em elipticidade molar residual (deg.cm2.dmol-1).
4.8 – Atividade Biológica
25 4.8.1 - Útero isolado de rata.
Ratas albinas virgens, de 200 a 240 g, receberam 100 µg de dietilestilbestrol por
100 g de peso corporal 24 h antes dos experimentos. Foram mortas por pancada na nuca e sangradas por seção dos vasos cervicais. O abdômen foi aberto e os cornos uterinos foram removidos e montados em câmaras de perfusão de 5 mL de capacidade contendo solução
De Jalon, mantida em 30oC para inibir contrações espontâneas observadas em temperaturas
mais altas. Após um período de equilíbrio de 30 min sob uma carga de 1 g, as contrações foram registradas em cilindros esfumaçados.
4.8.2 - Íleo isolado de cobaia.
Cobaias albinas de sexo feminino, de 220 a 250 g, foram mortas por pancada na nuca e sangradas por seção dos vasos cervicais. Em seguida, 15 cm da porção terminal do íleo foram removidos e, após várias lavagens com solução nutritiva de Tyrode, cujo pH era mantido em 8,0 através do borbulhamento com ar, segmentos de 4 cm foram cortados e montados em câmaras de perfusão de 5 mL de capacidade. Após um período de equilíbrio
de 30 min sob uma carga de 1 g e à temperatura de 37 ± 0,5oC, as contrações isotônicas
foram registradas em cilindros esfumaçados.
26 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Neste capitulo, estão apresentados e discutidos todos os resultados obtidos relacionados com o efeito da irradiação gama nos peptídeos disponíveis resultantes de
estudos anteriores e já publicados pelo nosso grupo. A AngII, BK, TOAC1-AngII e
TOAC3-BK foram peptídeos sintetizados e caracterizados, conforme publicações
anteriores (Nakaie et al., 1983, Nakaie et al., 2002, Schreier et al., 2004, Santos et al.,
2008, Lopes et al., 2008), enquanto que a AngI foi avaliada para estudos enzimáticos em
um trabalho mais recente (Teixeira et al., 2007) e finalmente, o α-MSH fez parte do
conjunto de peptídeos investigados em colaboração com pesquisadores do Instituto de
Física da USP especializados neste hormônio peptídico (Barbosa et al., 1999, Nakaie et al,
2001, Ito et al., 2001, Fernandez et al, 2002a, b). Todos estes peptídeos foram submetidos
a irradiação gama variando na faixa de 1 a 15 kGy, e no caso da AngII e BK, houve avanços também no aspecto de procurar-se purificar os principais produtos produzidos por esta irradiação para posterior estudos conformacionais por CD e determinação da atividade
biológica em experimentos apropriados (Nardi et al., 2008, Nardi et al., em submissão).
5.1 - Irradiação das soluções de AngII.
O primeiro peptídeo investigado foi a AngII e os espectros de HPLC obtidos de soluções deste peptídeo, não irradiado e irradiado (1mg/mL), com doses de 1, 2, 4, 6, 8, 10 e 15 kGy estão apresentados nas Figuras 2, 3 e 4, a seguir apresentados.
A análise desses espectros indica que a radiação promove uma degradação progressiva deste octapeptídeo, com os valores da absorbância do seu pico decaindo de cerca de 0,8 para 0,05 na radiação mais alta, de 15 kGy (Fig. 4c). Concomitantemente, nota-se o surgimento de alguns picos correspondentes a sub-produtos formados durante a irradiação, principalmente após a dose de 2 kGy (Fig. 3a). No geral, este picos possuem tempos de retenção um pouco menores que o da AngII ( ~13 min). A formação de novos produtos induzida pela radiação gama indica portanto que esse processo promove alterações químicas na AngII. Tais alterações químicas podem ocorrer devido a reações de
cross-linking, fragmentação e agregação, ou alterações individuais em aminoácidos,
27 a
b
28 a
b
c
29 a
b
c
30
A quantidade de AngII, em sua forma padrão, observada após a irradiação, calculada em função da área do pico obtido nos perfis de HPLC (Figuras 2, 3 e 4), mostrou que essa diminuição se dá de forma não linear (Figura 5) até um valor mínimo ao redor de 7,% para 15 kGy (Figura 4c). Com dose de 4 kGy, aproximadamente 50% da quantidade inicial da AngII ainda se encontram íntegra. O baixo rendimento do processo observado, com progressiva perda do material de partida, pode ser atribuído a cisões da cadeia principal, produzindo fragmentos de massa molecular reduzida e não detectados pelos ensaios realizados no presente trabalho.
Figura 5 – Porcentagem de AngII, em sua forma padrão, em função da dose de irradiação.
5.1.1 - Monitoramento por análise de aminoácidos.
Para ter-se uma idéia das alterações que possam ter ocorrido na estrutura da AngII durante o processo de irradiação com raios gama, procurou-se inicialmente fazer-se a análise de aminoácidos das soluções tratadas. A Tabela 2 indica preliminarmente que, analisando-se as soluções submetidas a doses de 1, 2, 8 e 10 kGy, houve degradação dos
-2 0 2 4 6 8 10 12 14 16
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resíduos de Phe e His, e com ligeiro aumento na Tyr e o surgimento de uma pequena quantidade do aminoácido Lys, não pertencente à estrutura original da AngII (pela sequência da mesma, DRVYIHPF, esperar-se-ia proporções de 1:1 entre todos os resíduos de aminoácidos)
A Figura 6, obtida com os dados da Tabela 2, mostra estas variações comentadas Pode-se portanto concluir nesta fase inicial que Phe e His são preferencialmente os resíduos modificados pela radiação, com concomitante surgimento de uma pequena quantidade de Tyr e Lys nas soluções irradiadas, principalmente obsevadas em altas doses de rediação.
Tabela 2 – Resultados da análise de aminoácidos das doses 1, 2, 8 e 10 kGy bem como os valores de referência para a AngII não irradiada.
1kGy 2kGy 8kGy 10kGy Proporção
teórica Aminoácidos
Asp 1,02 1,02 1,09 1,10 1
Val 1,01 1,02 1,06 1,08 1
Ile 0,98 1,01 1,05 1,12 1
Tyr 1,08 1,13 1,17 1,22 1
Phe 0,89 0,86 0,60 0,56 1
His 0,98 0,93 0,83 0,71 1
Arg 1,03 1,05 1,06 1,15 1
Pro 1,02 1,03 1,07 1,10 1
Lys* 0 0 0,08 0,10 0
A oxidação do aminoácido Phe pelo radical hidroxila (OH•) é um processo já conhecido e parece envolver a abstração de um átomo de hidrogênio da cadeia principal formando um radical e a posterior adição de uma hidroxila na cadeia aromática lateral do
aminoácido Phe, produzindo Tyr (Garrison, 1987; Hawkins e Davies, 2000; Maleknia et al
1999; Biondi et al, 2001 e 2006).
O ataque do radical hidroxila ao aminoácido Phe em solução já foi descrito na
32
0 2 4 6 8 10
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 P ro p o rç ã o d e c a d a a m in o á c id o Dose (kGy) Asp Val Ile Tyr Phe His Arg Pro Lys
benzênico, originando respectivamente o-Tyr, m-Tyr ou p-Tyr (Tyr) (Stadtman e Levine,
2003; Zegota et al 2005; Berlett e Stadtman, 1997; Leeuwenburgh et al 1997). Vale a pena
ressaltar que esses estudos são todos referentes aos aminoácidos livres em solução, em uma determinada condição de radiação e não de aminoácidos inseridos em cadeias peptídicas conforme o presente item discutido.
Figura 6 – Proporção de cada aminoácido da sequência de AngII em função da dose de irradiação.
Por outro lado, a oxidação da His é complexa e dependente tanto das condições em que ocorre a irradiação como da sequência e estrutura, peptídica ou protéica, em que a His se encontra. A literatura propõe cinco produtos para a oxidação da His que estão
apresentados na Figura 7 (Xu et al, 2003; Stadtman e Levine, 2003; Berlett e Stadtman,
33
De acordo com os resultados obtidos pela análise de aminoácidos das soluções irradiadas de AngII é possível concluir ainda que os demais aminoácidos da estrutura da AngII não foram modificados pela ação da radiação ionizante, independente da dose de irradiação e nas condições experimentais aqui empregadas.
Nota-se de interessante que, exceptuando-se o resíduo de Pro, os dois aminoácidos mais significativamente modificados se localizam na porção C-terminal do peptídeo, sugerindo algum efeito estrutural/conformacional do efeito da radiação gama, no caso deste peptídeo.
Figura 7 – Produtos de oxidação da His. (Xu et al, 2003).
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5.1.2 - Purificação dos principais sub-produtos formados.
Com o objetivo de avançar-se nesta investigação, decidiu-se purificar os principais sub-produtos formados, visíveis nas irradiações com doses principalmente de 2 a 10 kGy (picos com tempos de retenção ao redor de 11 a 12 min. Para isto, uma quantidade maior (50 mg) deste peptídeo foi irradiada, escolhendo-se a dose de 4 kGy pois nota-se que neste caso, ainda existem cerca de 50% do AngII na solução, o que poderia sugerir a possibilidade de obteção de quantidades mensuráveis dos três sub-produtos formados e visíveis na Figura 3b.
Após fracionamento por HPLC, conforme protocolo experimental detalhado em Métodos, obtiveram-se 3 sub-produtos da irradiação gama, e doravante, denominados de análogos AngII-I, AngII-II e AngII-III. A tabela 3 abaixo apresenta os valores de rendimento destes compostos purificados.
Tabela 3 – Rendimento de cada análogo obtido.
Análogo Massa (mg)
AngII 19,0
AngII I 2,3
AngII II 2,1
AngII III 1,9
35 a
b
c
36 Tabela 4 – Massa molecular dos análogos da AngII e diferença em relação à AngII.
Produtos Massa Molecular (Da) Diferença em relação à AngII
AngII 1046,58 -
AngII I 1062,82 + 16,24
AngII II 1062,70 + 16,12
AngII III 1037,53 - 9,05
De acordo com os resultados apresentados na Tabela 4 os análogos-AngII-I e AngII-II apresentam um acréscimo de massa da ordem de 16 Da em relação a AngII, indicando uma possível oxidação (entrada de hidroxila) sofrida por estes dois análogos. Diferentemente, o derivado AngII-III apresentou um decréscimo de 9 Da em relação a AngII, o que pode indicar perda de prótons e/ou cisão de cadeias laterais.
5.1.3 - Análise de aminoácidos dos análogos purificados.
A Tabela 5 apresenta os resultados da análise de aminoácidos dos peptídeo AngII-I, AngII-II e AngII-III. Os valores apresentados em negrito se referem aos valores que se distanciam do valor de referência da AngII padrão.
a) Análogo AngII-I
Na Figura 10, obtida a partir dos dados da Tabela 5, pode-se perceber para o
derivado AngII-I, o desaparecimento do resíduo de Phe e concomitante surgimento de um resíduo a mais de Tyr. Esses dados sugerem nitidamente uma oxidação da Phe em Tyr.
Nesse caso temos a entrada do grupamento OH na posição para do anel aromático da Phe e
tal reação está concordante com o valor de massa obtido para o AngII-I (Tabela 4).
b) Análogo AngII-II
37
aminoácidos comuns que compõe a solução comercial de padrão de aminoácidos utilizado como referência para o cálculo de cada peptídeo. Este pico elui ao redor de 28 minutos no cromatograma enquanto que a Tyr normal possui tempo de retenção de cerca de 29 minutos nas mesmas condições de análise.
c) AngII-III
Diferentemente dos compostos AngII-I e AngII-II, o derivado AngII-III apresentou o desaparecimento do resíduo básico de His e o aparecimento da Lys (Tabela 5 e Figura 9).
De acordo com os resultados de espectrometria de massa, apresentados na Tabela 4, foi detectado uma diminuição de 9,05Da, em relação a AngII padrão, para o AngII-III, que é compatível com a substituição do aminoácido His (MM: 155,16) pelo aminoácido Lys (MM: 146,19). Neste contexto, já foi anteriormente aventado que tal transformação ainda não foi reportado na literatura, não se conhecendo portanto, o mecanismo de reação que viabilizada esta transformação de um aminoácido básico aromático em um outro, também básico mas alifático.
Tabela 5 – Análise de aminoácidos dos análogos obtidos da AngII. Análogos
Aminoácidos AngII – I AngII – II AngII – III
Proporção Relativa (teórica)
Asp 0,96 1,02 1,04 1
Val 1,03 0,98 0,98 1
Ile 0,98 1,01 1,04 1
Tyr 1,95 1,01 1,01 1
Phe 0,02 0,00 1,04 1
His 0,95 0,97 0,01 1
Arg 1,02 1,01 0,99 1
Pro 1,03 1,02 0,96 1
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AngII - I AngII - II AngII - III
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4 1,6 1,8 2,0 P ro p o rç ã o d e A m in o á c id o s Asp Val Ile Tyr Phe His Arg Pro Lys
Figura 9 – Proporção de aminoácido dos análogos-AngII-I, AngII-II e AngII-III obtido pela análise de aminoácidos.
5.1.4 - Seqüenciamento de aminoácidos por espectrometria de massa.
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a) AngII - I
O espectro de massas do AngII-I, realizado previamente ao sequenciamento de aminoácidos, está apresentado na Figura 10, e indicou um valor de carga por massa (m/z) de 531,9 [M + 2H+], que após deconvolução, resultou no peso molecular de 1063,8 Da para este peptídeo. Este valor está concordante com o previamente obtido por LC/ESI-MS e indica um acréscimo de 16 Da em relação a massa da AngII padrão que é 1046 Da. Esse incremento de massa parece ser indicativo da adição de um átomo de oxigênio no aminoácido Phe produzindo Tyr, como já mencionamos anteriormente.
Essa conversão oxidativa do aminoácido Phe no aminoácido Tyr foi também confirmada pela varredura dos íons para detecção do aminoácido His (m/z 110), Tyr (m/z 136) e Phe (m/z 120) na amostra de AngII – I (m/z 533). Os espectros apresentados na Figura 11 mostram que a varredura dos íons de m/z 110 e 136 na amostra de AngII-I foi positiva (Fig. 11 a e c), e a varredura do íon m/z 120 foi negativa (Fig. 11b).
Foi também realizado o acompanhamento dos fragmentos moleculares efetuados pela metodologia da CID-MS/MS. Esta técnica valiosa permite a análise dos dados relativos à seqüência de aminoácidos do peptídeo, via dados dos íons do tipo y ou b e dedução de qual é a seqüência de aminoácidos na seqüência investigada.
Os dados de fragmentação, apresentados agora na Figura 12, estão bastante claros e são compatíveis com a presença de Tyr na posição C-terminal do AngII-I, indicado pelo
íon y2 m/z 279.3 (Pro-Tyr) e reforçado pela presença de íon imônio para Tyr (m/z 136). O
restante do peptídeo parece sem alteração pela presença dos íons b6, correspondente exatamente à sequencia (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His), complementar ao íon m/z 279.3 (Pro-Tyr) na estrutura do peptídeo.
Em conjunto, os dados obtidos no sequenciamento do AngII-I, indicam portanto
que sua sequência é dada por: Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Tyr (Tyr8-AngII),
40 a
b
