O EFEITODABMP-2SOBREAS PROPRIEDADESOSTEOCONDUTORASDOΒETA-
TRICÁLCIO FOSFATOEM DEFEITOS DECALVÁRIA DERATOS.
Eloá Rodrigues Luvizuto
O EFEITODABMP-2SOBREAS PROPRIEDADESOSTEOCONDUTORASDOΒETA-
TRICÁLCIO FOSFATOEM DEFEITOS DECALVÁRIA DERATOS.
Tese apresentada à Faculdade de Odontologia do Câmpus de Araçatuba – Unesp, para a obtenção do Grau de “Doutora em Odontologia” – Área de Concentração Clínica Integrada.
Orientadora: Profa. Dra. Roberta Okamoto.
DEDICATÓRIA
A Deus, por me proporcionar paz interior, perseverança, fé, alegria e saúde.
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha orientadora Profa. Dra. Roberta Okamoto pelos ensinamentos durante toda essa jornada, dividindo experiências e oportunidades únicas. Sempre acreditando e investindo em mim, sempre bem disposta a aceitar e complementar minhas idéias dando total liberdade para que eu possa desenvolvê-las. Obrigada pelas experiências e oportunidades únicas, pela alegria, entusiasmo e principalmente pela amizade.
Ao Prof. Dr. Tetuo Okamoto pela disponibilidade de sempre nos ajudar em tudo que é preciso, pela competência como ser humano, professor e pesquisador, pela filha brilhante que tem, pelo carinho, simpatia e amizade. Por toda a sua contribuição científica.
Ao Prof. Dr. Reinhard Gruber, excelente pesquisador e ser humano, por fazer realidade algo tanto desejado, por me disponibilizar todos seus conhecimentos na área da pesquisa, cultura e filosofia de vida. Pela oportunidade única que tive de participar de alguns de alguns de seus projetos de pesquisa e colocando-se disposto a sempre me ajudar.
Aos Prof(s). Dr(s). da Disciplina de Clínica Integrada da FOA-UNESP: Wilson Roberto Poi,
Sônia Regina Panzarini Barioni, Celso Koogi Sonoda, Daniela Atili Brandini, Denise Pedrini Ostini, José Carlos Monteiro de Castro pela amizade, harmonia de trabalho compartilhando conhecimentos e filosofias. Por toda ajuda e apoio. Pela minha formação profissional durante a graduação e durante todos esses anos de pós-graduação. Obrigada por tudo. É um grande prazer poder trabalhar com pessoas tão especiais e inteligentes.
À Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho” - UNESP, na pessoa do seu
Diretor, Prof.Dr. Pedro Felício Estrada Bernabé pela oportunidade de realização do curso de graduação, mestrado e doutorado em odontologia.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo auxílio financeiro ao projeto de pesquisa e pela bolsa de doutoramento.
AGRADECIMENTOS
À Profa. Dra. da Disciplina de Ciências Básicas: Rita Cássia Menegati Dornelles pela co-orientação em meu trabalho de exame geral de qualificação do curso de doutorado.
Aos Prof(s). Dr(s). da Disciplina de Cirurgia e Traumatologia Buco-Maxilo-Facial da FOA-UNESP: Alessandra Marcondes Aranega, Michel Saad Neto, Oswaldo Magro Filho, Ana Paula Bassi, Daniela Ponzoni.
Aos colegas Prof(s). Dr(s). Ana Paula Faloni, Eduardo Hochuli, Daniele Botticelli.
À colega Tânia Madrid pela amizade e todo empenho em me ajudar nas difíceis escolhas da vida.
Aos colegas: Beatriz Oliveira Marques, Carolina Perruzzi, Cristiane Chiantelli Cláudio, Giovana Cyrillo, Maria Fernanda Marques, Milena de Oliveira Xavier, Paola Cicarelli,
Mariana Matos, Renata Marques e Marcelo Oliveira pela amizade.
Às colegas da graduação: Ana Paula Ayala de Macedo, Camyla Alle e Eliana Rodrigues. Às estagiárias: Paula Trevolin, Vanessa Ferreira da Silva.
À colega de especialização em periodontia: Ana Lúcia Roselino.
Às colegas de mestrado e doutorado em Clínica Integrada: Célia Tomiko Matida Hamata Saito, Cláudia Letícia Vendrame dos Santos, Carolina Lunardelli Trevisan, Lithiene
Ribeiro Castilho, Luciene Campoli Alves, Elizane Ferreira Hamanaka, Fernanda Serra. Aos colegas de mestrado e doutorado em Cirurgia: Abraão Cavalcante Gomes de Souza Carvalho, Carolina Chiantelli Cláudio Coutinho, Eduardo F. S. Faco, Flávia Priscila Pereira, Francisley Ávila Souza, Jéssica Lemos Gulinelli, Marcos Heidy Guskuma, Paulo
Marão, Fernando Gastaldi, Leonardo Perez Favelani, Lamis Meorin Nogueira, Gabriel Ramalho Ferreira.
Aos colegas de mestrado e doutorado em Prótese: Amílcar Chagas Freitas Júnior, Érica Alves Gomes, Érika Oliveira de Almeida e Valentim Adelino Ricardo Barão.
À colega de doutorado em pediatria: Nátalia Marique Cursino. À colega de mestrado em periodontia: Nátalia Campos.
À funcionária Cleide Lemes da Silva pelo carinho e alegria.
Aos funcionários do Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada: Antônia Ferreira Artioli, Aparecida Leontina Baiochi de Carvalho, Bernadete Rodrigues Inácio, Claudiomiro Pereira, Dirce C. Boato, Gilmar Martins de Oliveira e Paulo Roberto Gratão.
Aos Profs. Drs. da faculdade de odontologia de Viena/Áustria: Georg Watzek, Hanns Plenk, Stefan Tangl, Ulrike Kuchler.
Aos funcionários do Instituto Ludwig Boltzmann de Viena/Áustria: Prof. Gerald Zanoni, Profa. Dra. Alexandra Meinl, Prof. Dr. Heinz Redl.
Aos colegas: Carina Auzinger, Andrea Tiscler, Elisabeth Gruber, Manuela Pensch, Patrick Heimel, Petra Pokorny, Toni Dobsak, Prof. Dr. Herman Agis, Karoline Reich, Michael Sandholzer, Christian Schuh, Katharina Singer.
Epígrafe
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Imagens da micro-CT dos defeitos em calvária
de ratos tratados e não tratados. ...34
Figura 1 suplemento - Análise quantitativa de micro-CT dos
defeitos da calvária de ratos...35
Figura 2 - Análise quantitativa da micro-CT do total de
tecido mineralizado (biomaterial + tecido ósseo
neoformado) dos defeitos da calvária de ratos...36
Figura 3 - Imagens histológicas dos defeitos críticos em
calvária de ratos tratados e não tratados...37
Figura 4 - Análise quantitativa do total de volume de
tecido mineralizado (biomaterial + osso neoformado) por unidade de volume de tecido (MV/TV) em defeitos
de calvária de ratos...38
Figura 5- Análise quantitativa de osso neoformado e
biomaterial residual nos defeitos ósseos...39
Figura 6 - Coloração de fluorescência dos defeitos de
calvária de ratos tratados e não tratados...40
Figura 7 - Coloração de fluorescência em alta resolução
nos defeitos ósseos de calvária de ratos tratados com
TCP...41 Figura 8 suplemento – Imagem histológica em maior
Figura 9 suplemento – Imagens histológicas em maior
aumento dos grupos PLA/PGA e PLA/PGA + BMP-2... 43 Figura 10 suplemento – Imagens histológicas em maior
aumento dos grupos CPC e CPC + BMP-2... 44 Figura 11 suplemento – Imagem histológica em maior
aumento do grupo controle sem tratamento...45 Figura 12 suplemento – Imagens histológicas em maior
aumento do grupo osso autógeno particulado...46 Figura 13 suplemento – Imagem histológica em maior
LISTA DE SIGLAS
TCP: β- tricálcio fosfato
BMP-2: proteína óssea morfogenética 2
PLA / PGA ou PL/PG: gel de ácido polilático e poliglicólico
CPC: cimento de fosfato de cálcio
μCT ou micro-CT: micro tomografia computadorizada
pc: peso corporal
ip: intra peritoniana
μCT DC: Medições bidimensionais da micro-tomografia computadorizada do fechamento do defeito ósseo.
μCT MV / TV: quantidade do volume de tecidos mineralizados (osso neoformado + biomaterial) por volume total de tecido das micro-tomografias computadorizadas.
MV / TV: Volume de tecido mineralizado (osso neoformado + biomaterial) por volume total de tecido dos cortes histológicos calcificados.
BV: volume de osso neoformado
BV / TV: volume de osso neoformado por volume total de tecido
LISTA DE SÍMBOLOS
kg – quilograma mg – miligrama μl - microlitro μm – micrômetro
μg - micrograma
ml - mililitro
g - grama
mm - milímetros
mg / kg – miligrama por kilograma
pxl / mm – pixel por milímetro
SUMÁRIO
Resumo 15
Abstract 16
1. Introdução 17
2. Material e métodos 19
3. Resultados 22
4. Discussão 25
5. Conclusão 28
6. Referências 29
7. Figuras 34
O efeitodaBMP-2sobreas propriedadesosteocondutorasdoβ-tricálcio fosfatoem defeitos decalvária
deratos.
Eloá R Luvizuto1,4, Stefan Tangl1,2, Gerald Zanoni3, Tetuo Okamoto4,5, Celso K Sonoda4, Reinhard Gruber1,2, Roberta Okamoto4,5.
1 Departamento de Cirurgia Oral, Universidade de Medicina de Viena, Áustria 2 Sociedade Austríaca de Regeneração Tecidual, Áustria
3 Instituto Ludwig Boltzmann de Traumatologia Clínica e Experimental, Viena, Áustria
4 Departamento de Cirurgia e Clínica Integrada, Faculdade de Odontologia de Araçatuba, UNESP-Universidade Estadual Paulista, Brasil
5 Departamento de Pesquisa e Pós-graduação, Universidade do Sagrado Coração, Bauru, Brasil
Correspondência: Roberta Okamoto
Rua José Bonifácio 1193, CEP: 16015-050 Araçatuba-SP
robertaokamoto@usc.br
* Luvizuto ER, et al., The effect of BMP-2 on the osteoconductive properties of β-tricalcium phosphate in rat calvaria defects, Biomaterials (2011), doi:10.1016/j.biomaterials.2011.01.076
Resumo: A neoformação óssea em defeitos críticos em calvária de ratos depende fortemente das propriedades osteocondutoras dos enxertos e biomateriais. Ainda é controverso se os biomateriais podem substituir os enxertos de osso autógeno e se a suplementação dos biomateriais com Proteínas Ósseas Morfogenéticas (BMPs) é necessária para melhorar a formação óssea. Examinamos defeitos críticos em calvária de ratos (5 mm de diâmetro) tratados com β-tricálcio fosfato (TCP; Cerasorb ® M), gel de ácido polilático e poliglicólico (PLA/PGA; Fisiograft®) e cimento de fosfato de cálcio (CPC; Norian® CRS®), isoladamente ou na presença de 5μg de BMP-2 após 45 dias. Defeitos tratados com enxerto de osso autógeno particulado e defeitos não tratados serviram como controle. A formação óssea foi avaliada com base na análise
de μCT, análise histomorfométrica e análise de fluorescência.Nós relatamos que o TCP apoia a formação óssea de forma mais eficiente do que o enxerto de osso autógeno particulado. Aformação óssea na presença de TCP sozinho atingiu um nível máximo de neoformação óssea, enquanto que a suplementação de BMP-2 falhou em melhorar a neoformação óssea. Em contrapartida, não houve diferença significativa na formação óssea quando o PLA / PGA e o CPC foram comparados ao enxerto autógeno.Além disso, a presença de BMP-2 não alterou substancialmente as propriedades osteocondutoras de PLA/PGA ou de CPC.Conclui-se que as propriedades osteocondutoras do TCP são superiores aos dos enxertos autógenos e que o TCP não exige suplementação de BMP-2.Nossos resultados também mostram que a diminuição da capacidade osteocondutora do PLA/PGA e do CPC não podem ser superadas pela suplementação de BMP-2 em defeitos de calvária de ratos.
Abstract: Bone formation in critical-sized calvaria defects is strongly dependent on the osteoconductive properties of grafts. It remains a matter of controversy whether biomaterials can replace autografts and whether the supplementation of biomaterials with Bone Morphogenetic Proteins (BMPs) is necessary to enhance bone formation. We examined rat calvaria critical-sized
defects (5mm diameter) treated with β-tricalcium phosphate (TCP; Cerasorb® M), polylactic and polyglycolic acid gel (PLA/PGA; Fisiograft®) and calcium phosphate cement (CPC; Norian® CRS®), either alone or in the presence of 5μg of BMP-2 after 45 days. Autografts and untreated defects served as controls. Bone formation was evaluated based on μCT analysis, histomorphometric analysis and fluorescence analysis. We report that TCP supported bone formation more efficiently than did autografts. Bone formation in the presence of TCP alone reached a maximal level, as BMP-2 supplementation failed to enhance bone formation. By contrast, no significant difference in bone formation was observed when PLA/PGA and CPC were compared to autografts. Moreover, the presence of BMP-2 did not substantially change the osteoconductive properties of PLA/PGA or CPC. We conclude that the osteoconductive properties of TCP are superior to those of autografts and that TCP does not require BMP-2 supplementation. Our findings also show that the decreased osteoconductive properties of PLA/PGA and CPC cannot be overcome by BMP-2 supplementation in rat calvaria defects.
Introdução
O uso de biomateriais em vez de enxerto ósseo autógeno é uma esperança à muito tempo em cirurgia reconstrutiva [1]. Os biomateriais podem fornecer uma matriz osteocondutora que guia a formação de tecido ósseo no interior do defeito ou da área enxertada. Melhorar as propriedades osteocondutoras dos biomateriais é uma tarefa importante na pesquisa e na indústria de biomateriais. Não é de surpreender que os biomateriais são suplementados com fatores de crescimentos para aprimorar o processo de formação óssea e, assim, a consolidação do biomaterial. A principal tarefa, no entanto, reside na criação de um biomaterial com propriedades osteocondutoras favoráveis que são semelhantes ou mesmo superiores aos enxertos ósseos evitando a necessidade da suplementação de fatores de crescimento.
Os fatores de crescimento, incluindo as proteínas ósseas morfogenéticas (BMPs), podem apoiar o processo de formação óssea, no entanto, as preocupações sobre a sua utilização têm sido levantadas. Por exemplo, nem sempre é evidente que exista uma melhora do processo de neoformação óssea que justifique os altos custos do biomaterial e também os possíveis efeitos colateriais da associação de fatores de crescimento aos biomateriais. O FDA aprovou a combinação de BMPs ao colágeno para aplicações ortopédicas [2] e odontológicas [3]. No entanto, as combinações de outros biomateriais com BMPs ainda não foram aprovadas [1, 4-5].
da BMP-2. Atualmente ainda não está claro qual dos três biomateriais disponíveis no mercado (TCP, Cerasorb® M; PLA/PGA; Fisiograft®; CPC, Norian® CRS®) permite a máxima formação óssea e se a sua suplementação com BMP-2 provoca um aumento substancial na neoformação óssea no defeito ósseo.
Os modelos animais têm sido a base de estudo do impacto de biomateriais carreagados com BMP-2 na neoformação óssea [13]. Há um consenso de que a prova de estudos deve seguir o princípio da árvore filogenética, começando com modelos roedores [14]. A calota craniana de ratos é exemplar, para uso em modelo de defeitos ósseos de tamanho crítico em que a BMP-2 pode exercer sua capacidade osteoindutora [9, 15-16]. Mesmo que este seja um defeito de modelo ortotópico, as bordas entre o tecido ósseo da calvária e o biomaterial residual prevêem uma situação desafiadora para a neoformação óssea em abranger toda a extensão do defeito. Outra vantagem do modelo de calvária de ratos é a sua reprodutibilidade e a capacidade de avaliar o resultado do estudo com base na análise histomorfométrica de micro tomografia computadorizada (μCT) e análise histomorfométrica padrão, mantendo a variação interna experimental baixa [14]. Estes argumentos suportam a utilização deste modelo em nosso estudo.
Material e Métodos
Desenho de estudo e ética
Vinte ratos Wistar (90 dias de idade) foram adquiridos do Centro de Animais da Universidade Estadual Paulista e mantidos a uma temperatura de 22 ° C em um ciclo de 12 horas claro/12-h escuro com livre acesso à água e ração para roedores. Um total de 40 defeitos críticos em calvária (5 mm de diâmetro) foram divididos aleatoriamente em 8 grupos experimentais, com um total de 5 defeitos por grupo experimental (n = 5). Os grupos experimentais foram os seguintes: [1] 500-1000 μm de β- tricálcio fosfato (TCP) (Cerasorb ® M, Curassan Ltd., Alemanha) [2]; TCP acrescido de 5 μg de BMP-2 (R & D Systems, Inc., Minneapolis , MN, EUA) [3]; gel de ácido polilático e poliglicólico (PLA / PGA) (Fisiograft ®, Ghimas SPA, Itália) [4] PLA / PGA associado a BMP-2 [5]; cimento de fosfato de cálcio (CPC) (Norian® SRC®, Craniofaciais Repair System®, Alemanha), e [6] CPC associado a BMP-2. Os outros dois grupos experimentais foram o controle não tratado [7] e o controle enxerto de osso autógeno particulado [8]. O presente estudo respeitou os princípios de cuidados com animais de laboratório e as leis nacionais sobre o uso de animais. O estudo foi autorizado pelo Comitê de Ética em Pesquisa Animal da Universidade Estadual Paulista, Brasil (protocolo n º 2008-004517).
Procedimentos cirúrgicos e marcações com fluorocromo
retalhos de espessura total foram refletidos. Sob copiosa irrigação com solução salina estéril, dois defeitos ósseos de 5 mm de diâmetro foram preparados com uma broca trefina (3i Implant Innovations, Inc., Palm Beach Gardens, EUA) em cada animal, um defeito em cada região parietal. Os defeitos foram tratados como descrito acima, posteriormente o periósteo foi reposicionado e suturado com fio de sutura de ácido poliláctico (Vycril 5,0, Ethicon, Johnson Prod., São José dos Campos, Brasil). A pele foi suturada com fio de náilon (náilon 5.0, Mononylon, Ethicon). Todos os animais receberam dose única de 20.000 UI de penicilina G benzatina (Pentabiótico, Veterinário Pequeno Porte, a Fort Dodge Saúde Animal Ltda, Campinas, Brasil) por via intramuscular. Os ratos receberam 20 mg / kg de peso corporal de calceína (verde) e alizarina (vermelho) (Sigma Chemical, St. Louis, MO, EUA) nos dias 15 e 30 pós-operatório, respectivamente. Os ratos foram sacrificados por overdose anestésica aos 45 dias após o procedimento cirúrgico.
Processamento das amostras
à sutura sagital e reduzido a uma espessura de cerca de 40 μm, antes de serem corados com corante de Levai-Laczko.
Análise histomorfométrica
Análise Estatística
Os dados foram analisados com comparações múltiplas de médias por contrastes de Tukey. Diferença estatisticamente significativa foi atribuída ao nível de P <0,05.
Resultados
Análise de Micro-CT
Imagens bidimensionais da vista por cima da calvaria fornecem informações sobre o fechamento do defeito ósseo em geral. O fechamento completo do defeito foi observado apenas no grupo β-tricálcio fosfato (TCP) e TCP suplementado com BMP-2. Os grupos de osso autógeno particulado (AG), acido polilático e poliglicólico (PLA/PGA ou PL/PG) e cimento fosfato de cálcio (CPC) não foi observado fechamento completo do defeito. Além disso, nas amostras em que o PLA/PGA e CPC foram suplementadas com BMP-2, também, não observou fechamento completo do defeito ósseo (Figura 1 e Figura 1 supplemento ).
Análise quantitativa e qualitativa da histologia
Para entender melhor as propriedades osteocondutoras dos biomateriais, as análises histológicas foram realizadas. Como esperado a partir da análise de micro-CT, o local do defeito ósseo originalmente tratado com TCP foi totalmente preenchido por um conglomerado de biomateriais e osso neoformado. Remanescentes de TCP eram visíveis e estavam em íntimo contato com o tecido ósseo. Além disso, no grupo TCP combinado com BMP-2, as observações foram semelhantes. Defeitos que foram preenchidos com PLA/PGA não apresentaram biomaterial residual, apenas um tecido conjuntivo fino fechando o defeito ósseo. Neste grupo, a suplementação com BMP-2 pode ter favorecido a formação óssea, o que foi observado em algumas amostras. CPC também apresentou propriedades osteocondutoras, mas os defeitos não foram totalmente preechidos por tecido ósseo. A análise histológica também fornece a impressão de que a suplementação com BMP-2 aumentou a degradação do CPC, o que foi confirmado histomorfometricamente. Como esperado, nenhuma formação óssea substancial foi observada nos defeitos do grupo controle (coagulo), enquanto o grupo osso autógeno particulado resultou no fechamento dos defeitos originais (Figura 3).
O próximo passo foi de distinguir entre tecido ósseo neoformado e biomaterial residual no local do defeito. O grupo TCP apresentou maior volume de tecido ósseo neoformado que os outros grupos (PLA / PGA, CPC, enxerto autógeno particulado e as respectivas combinações com BMP-2). A suplementação com BMP-2 não alterou os valores absolutos (BV) e relativos (BV / TV) da neoformação óssea para todos os biomateriais testados. Eventualmente, uma tendência para um efeito positivo da BMP-2 foi observada com PLA / PGA. Curiosamente, a formação de tecido ósseo neoformado foi semelhante no grupo controle (coagulo – EC) e grupo enxerto ósseo particulado. Assim, o TCP apoia a formação de tecido ósseo neoformado mais eficiente do que os outros biomateriais e mais eficientemente do que o osso autógeno particulado (Figura 5a,b).
Quando se avalia a degradação do biomaterial, um efeito torna-se óbvio, a suplementação do CPC com BMP-2 suporta a degradação do biomaterial, que não foi o caso dos grupos TCP e PLA / PGA. Estes dados sugerem que a BMP-2 não melhorou efetivamente a neoformação óssea, mas aumentou a degradação do CPC (Figura 5c,d).
Coloração por fluorescência
mais fluorocromo foi incorporado em amostras contendo BMP-2. Além disso, o padrão de coloração indica maior remodelação com BMP-2 do que nos respectivos controles CPC. A distribuição da coloração verde e vermelha indica que a formação óssea ocorreu de forma contínua entre os dias 15 e 30 dias pós-cirúrgicos, independente do biomaterial, porém ocorreu de forma mais eficaz nos grupos TCP e TCP + BMP-2 (Figura 6). Imagens de maior aumento destacam o fato de que os achados histológicos e a os achados da coloração com fluorocromos são congruentes. Estas análises detalhadas fornecem uma visão sobre as propriedades osteocondutoras do TCP e da falta de mudanças visíveis após a adição de BMP-2 (Figura 7).
Discussão
Nossos resultados são importantes porque o TCP desempenhou melhor do que os outros dois biomateriais, assim como do que o enxerto de osso autógeno particulado. Se considerarmos que a coleta do enxerto autógeno está associada com morbidade do sítio doador e tem o inconveniente de quantidades limitadas de material disponível, nossos resultados sugerem que o TCP pode servir como uma alternativa ao enxerto de osso autógeno particulado, pelo menos nas condições experimentais propostas. Nossos resultados também são importantes porque as propriedades osteocondutoras do TCP não foram reforçadas com a adição de BMP-2, um fator de crescimento que é caro e que está associado à efeitos colaterais. Assim, nossos dados sugerem que não é necessário ou mesmo útil fazer a complementação do TCP com BMP-2, nas condições experimentais propostas. Estes dois achados importantes apoiam a afirmação de que nós identificamos um biomaterial disponível, que é aprovado para aplicações clínicas específicas e que promove a neofomação óssea em um local de defeito cirúrgico.
suplementação de paratormonio ao TCP não melhora a formação óssea em relação ao TCP sozinho [23].
O CPC por si só não é superior ao enxerto de osso autógeno, que está de acordo com estudos anteriores [24]. Por outro lado, CPC e PLA / PGA carregados com BMP-2 não melhoraram a neoformação óssea, em contraste com estudos anteriores que mostraram melhores resultados após a suplementação com BMP-2, porém, os efeitos observados são dose dependente [08-12]. Estudos anteriores em conjunto com nosso estudo sugerem que o TCP é um biomaterial que pode executar tão bem, ou melhor, do que o enxerto de osso autógeno particulado. A relevância clínica destes resultados é baseada no uso mundial do TCP, do PLA / PGA e do CPC como alternativas ao enxerto autógeno. É provável que as propriedades osteocondutoras desses biomateriais não sejam substancialmente (caso exista) afetadas pelo local do defeito. Este achado sugere que, em um cenário clínico, o TCP pode fornecer favoráveis propriedades de osteocondução. Também, de potencial importância clínica é o fato de que as propriedades osteocondutoras do TCP não puderam ser aprimoradas com a dosagem indicada de BMP-2, sugerindo que não são necessários esforços adicionais para melhorar o parâmetro de evolução clínica da neoformação óssea.
não se pode excluir que a suplementação de TCP e outros biomateriais com BMP-2 podem apresentar um efeito benéfico no processo de consolidação óssea. No nosso modelo experimental a regeneração óssea foi considerada normal. Outra limitação do nosso estudo é o desenho do estudo. Nós selecionamos um período de observação de apenas cinco defeitos por grupo experimental. No entanto, as diferenças entre os grupos foram grandes, permitindo realizar uma análise estatística. As limitações de nosso estudo fornecem uma base para futuros estudos. Baseado em nossos achados, estudos futuros deverão avaliar se o TCP apresenta resultados satisfatórios sem a suplementação de BMP-2 em modelos experimentais com comprometimento da regeneração óssea, por exemplo, os casos de ratas ovarectomizadas, diabetes e os ratos tratados com glicocorticóides. Além disso, os dados sobre a administração da BMP-2 e períodos de observação anterior à 45 dias de pós-operatório pode estender os resultados atuais. Um estudo futuro, também deve determinar as propriedades osteocondutoras do TCP sozinho e com suplementação de BMP-2 em defeitos ósseos maiores, como aqueles que podem ocorrer nos seres humanos.
Conclusão
Agradecimentos
Os autores agradecem Patrick Heimel por seus cálculos com base no software Definiens Developer. Petra Pokorny pelo apoio estatístico, Toni Dobsak pelo apoio às ilustrações, o Dr. Georg Watzek e o Dr. Hanns Plenk. Esta pesquisa recebeu auxilio da FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo), número do projeto 2008/10516-6.
Referências
[1] Haidar ZS, Hamdy RC, Tabrizian M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part A: Current challenges in BMP delivery. Biotechnol Lett. 2009;31:1817-24.
[2] Axelrad TW, Einhorn TA. Bone morphogenetic proteins in orthopaedic surgery. Cytokine Growth Factor Rev. 2009;20:481-8.
[3] Triplett RG, Nevins M, Marx RE, Spagnoli DB, Oates TW, Moy PK, et al. Pivotal, randomized, parallel evaluation of recombinant human bone morphogenetic protein-2/absorbable collagen sponge and autogenous bone graft for maxillary sinus floor augmentation. J Oral Maxillofac Surg. 2009;67:1947-60.
[4] Haidar ZS, Hamdy RC, Tabrizian M. Delivery of recombinant bone morphogenetic proteins for bone regeneration and repair. Part B: Delivery systems for BMPs in orthopaedic and craniofacial tissue engineering. Biotechnol Lett. 2009;31:1825-35.
[6] Sohier J, Daculsi G, Sourice S, de Groot K, Layrolle P. Porous beta tricalcium phosphate scaffolds used as a BMP-2 delivery system for bone tissue engineering. J Biomed Mater Res A. 2010;92:1105-14.
[7] Dohzono S, Imai Y, Nakamura H, Wakitani S, Takaoka K. Successful spinal fusion by E. coli-derived BMP-2- adsorbed porous beta-TCP granules: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 2009;467:3206-12.
[8] Johnson EE, Urist MR, Finerman GA. Bone morphogenetic protein augmentation grafting of resistant femoral nonunions. A preliminary report. Clin Orthop Relat Res. 1988:257-65.
[9] Schliephake H, Weich HA, Dullin C, Gruber R, Frahse S. Mandibular bone repair by implantation of rhBMP-2 in a slow release carrier of polylactic acid--an experimental study in rats. Biomaterials. 2008;29:103-10.
[10] Bai B, Yin Z, Xu Q, Lew M, Chen Y, Ye J, et al. Histological changes of an injectable rhBMP-2/calcium phosphate cement in vertebroplasty of rhesus monkey. Spine (Phila Pa 1976). 2009;34:1887-92.
[11] Seeherman HJ, Azari K, Bidic S, Rogers L, Li XJ, Hollinger JO, et al. rhBMP-2 delivered in a calcium phosphate cement accelerates bridging of critical-sized defects in rabbit radii. J Bone Joint Surg Am. 2006;88:1553-65.
[12] Sorensen RG, Wikesjo UM, Kinoshita A, Wozney JM. Periodontal repair in dogs: evaluation of a bioresorbable calcium phosphate cement (Ceredex) as a carrier for rhBMP-2. J Clin Periodontol. 2004;31:796-804.
[14] Muschler GF, Raut VP, Patterson TE, Wenke JC, Hollinger JO. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 2010;16:123-45.
[15] Schwarz F, Ferrari D, Sager M, Herten M, Hartig B, Becker J. Guided bone regeneration using rhGDF-5- and rhBMP-2-coated natural bone mineral in rat calvarial defects. Clin Oral Implants Res. 2009;20:1219-30.
[16] Marden LJ, Hollinger JO, Chaudhari A, Turek T, Schaub RG, Ron E. Recombinant human bone morphogenetic protein-2 is superior to demineralized bone matrix in repairing craniotomy defects in rats. J Biomed Mater Res. 1994;28:1127-38.
[17] Donath K. Die Trenn-Dünnschliff-Technik zur Herstellung histologischer Präparate von nicht schneidbaren Geweben und Materialien. Deutsche Zeitschrift fur Mund-, Kiefer- und Gesichts-Chirurgie. 1988;34:197-206.
[18] Schlegel KA, Rupprecht S, Petrovic L, Honert C, Srour S, von Wilmowsky C, et al. Preclinical animal model for de novo bone formation in human maxillary sinus. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2009;108:e37-44.
[19] Weijs WL, Siebers TJ, Kuijpers-Jagtman AM, Berge SJ, Meijer GJ, Borstlap WA. Early secondary closure of alveolar clefts with mandibular symphyseal bone grafts and beta-tri calcium phosphate (beta-TCP). Int J Oral Maxillofac Surg. 2010;39:424-9.
[21] Dai LY, Jiang LS. Single-level instrumented posterolateral fusion of lumbar spine with beta-tricalcium phosphate versus autograft: a prospective, randomized study with 3-year follow-up. Spine (Phila Pa 1976). 2008;33:1299-304.
[22] Zhao J, Hu J, Wang S, Sun X, Xia L, Zhang X, et al. Combination of beta-TCP and BMP-2 gene-modified bMSCs to heal critical size mandibular defects in rats. Oral Dis. 2010;16:46-54. [23] Yun JI, Wikesjo UM, Borke JL, Bisch FC, Lewis JE, Herold RW, et al. Effect of systemic parathyroid hormone (1-34) and a beta-tricalcium phosphate biomaterial on local bone formation in a critical-size rat calvarial defect model. J Clin Periodontol. 2010;37:419-26.
Figuras
Figura 1 - Imagens da micro-CT dos defeitos em calvária de ratos tratados e não tratados:
Figura 1 suplemento - Análise quantitativa de micro-CT dos defeitos da calvária de ratos: O
Figura 2 - Análise quantitativa de micro-CT do total de tecido mineralizado (biomaterial +
Figura 3 - Imagens histológicas dos defeitos criticos em calvária de ratos tratados e não tratados:
Figura 4 - A análise quantitativa do total de volume de tecido mineralizado (biomaterial + osso
Figura 5- Análise quantitativa de osso neoformado e biomaterial residual no local do defeito: as
Figura 6 - Coloração de fluorescência dos defeitos de calvária de ratos tratados e não tratados: de
Figura 7 - Coloração de fluorescência de alta resolução nos defeitos ósseos de calvária de ratos
Figura 9 suplemento – Imagens histológicas em maior aumento dos grupos PLA/PGA e
Figura 10 suplemento – Imagens histológicas em maior aumento dos grupos CPC e CPC +
Figura 11 suplemento – Imagem histológica em maior aumento do grupo controle sem
Figura 12 suplemento – Imagens histológicas em maior aumento do grupo osso autógeno
Figura 13 suplemento – Imagem histológica em maior aumento do grupo osso autógeno
ANEXO C
Biom a t e r ia ls
Gu ide for Au t h or s
I SSN : 0142- 9612
I m pr in t : ELSEVI ER Fact s & Figures
I m pa ct Fa ct or : 7.365
5 - Ye a r I m pa ct Fa ct or : 8.153
I ssu e s pe r ye a r : 36
The peer review subm ission syst em for Biom at erials is locat ed here: ht t p: / / ees.elsev ier.com / biom at / The Elsevier Edit or ial Syst em ( EES) is a w eb- based subm ission and review syst em . Aut hors m ay subm it m anuscript s and t rack t heir progress t hrough t he syst em t o publicat ion. Reviewers can download m anuscript s and subm it t heir opinions t o t he edit or. Edit ors can m anage t he whole
subm ission/ review / revise/ publish process.
Please regist er at : ht t p: / / ees.elsevier.com / biom at /
Referees, whose nam es are not norm ally disclosed t o t he aut hors, will st udy all cont ribut ions which t he Edit or- in- Chief deem s t o be of sufficient significance and int erest t o be sent for peer review. The crit er ia by which t his init ial assessm ent is m ade include relevance t o t he scope of t he j ournal, t he originalit y of t he work and it s significance t o t he broad developm ent of t he field of biom at erials.
Be for e You Be gin
All aut hors, especially t hose subm it t ing t o t he j ournal for t he first t im e, are encouraged t o read t he following docum ent aut hored by t he Edit or in Chief, which gives an overview of t he j ournal as well as t he writ ing and select ion process of academ ic publishing as it relat es t o Biom at erials: Writ ing Papers for Biom at erials.
Et h ics in Pu blish in g: For inform at ion on Et hics in Publishing and Et hical guidelines for j ournal publicat ion see ht t p: / / www.elsevier.com / aut horet hics and ht t p: / / www.elsevier.com / et hicalguidelines.
Ch a n ge s t o a u t h or sh ip
This policy concerns t he addit ion, delet ion, or rearrangem ent of aut hor nam es in t he aut horship of accept ed m anuscript s:
Before t he accept ed m anuscript is published in an online issue: Request s t o add or rem ove an aut hor, or t o rearrange t he aut hor nam es, m ust be sent t o t he Journal Manager from t he corresponding aut hor of t he accept ed m anuscript and m ust include: ( a) t he reason t he nam e should be added or rem oved, or t he aut hor nam es rearranged and ( b) writ t en confirm at ion ( e- m ail, fax, let t er) from all aut hors t hat t hey agree wit h t he addit ion, rem oval or rearrangem ent . I n t he case of addit ion or rem oval of aut hors, t his includes confirm at ion from t he aut hor being added or rem oved. Request s t hat are not sent by t he corresponding aut hor will be forwarded by t he Journal Manager t o t he corresponding aut hor, who m ust follow t he procedure as described above. Not e t hat : ( 1) Journal Managers will inform t he Journal Edit ors of any such request s and ( 2)
publicat ion of t he accept ed m anuscript in an online issue is suspended unt il aut horship has been agreed.
result in a corrigendum .
M a n da t or y Au t h or D e cla r a t ion : I n addit ion t o uploading m anuscript s and figures, it is required t hat t he corresponding aut hor of each m anuscript uploads a separat e Aut hor Declart ion. All aut hors m ust sign t his declarat ion; t he corresponding aut hor m ay not sign on behalf of ot her aut hors.
This Declarat ion covers a num ber of logist ic and et hical issues. Please use t he t em plat e given above for t his Declarat ion. Aut hors m ay save t his t em plat e, obt ain t he required signat ures and t hen upload it as an int egral part of t heir subm ission. The edit orial process w ill not begin unt il and unless all aut hors have signed t he declarat ion.
N.B.: The Aut hor Declarat ion is independent of, and in addit ion t o, t he " Journal Publishing Agreem ent " agreem ent which is issued on accept ance.
Am e n dm en t s t o M a n u scr ipt s
I n order t o m aint ain t he int egrit y of t he scient ific record, t he version t hat is published in an issue on ScienceDirect and in print MUST be ident ical. One set of page proofs will be sent t o t he corresponding aut hor. Please not e t hat aut hors are urged t o check t heir proofs carefully before r et urn, but correct ions are rest rict ed t o t ypeset t ing err ors only. Proofs are NOT t o be considered as draft s. No changes in, or addit ions t o, t he accept ed ( and subsequent ly edit ed) m anuscript will be allow ed at t his st age. Proofreading is solely t he responsibilit y of t he corr esponding aut hor.
Copyr igh t
All aut hors m ust sign t he " Journal Publishing Agreem ent " before t he art icle can be published. An e- m ail ( or let t er) will be sent t o t he corresponding aut hor confirm ing receipt of t he m anuscript t oget her wit h an agreem ent form or a link t o t he online version of t his agreem ent . This t ransfer agreem ent enables Elsevier Lt d t o prot ect t he copyright ed m at erial for t he aut hors, but does not relinquish t he aut hor's propriet ary right s. As an aut hor you ( or your em ployer or inst it ut ion) ret ain cert ain right s; for det ails you are referred t o: ht t p: / / www.elsevier.com / aut horsright s.
The copyright t ransfer covers t he exclusive right s t o repr oduce and dist ribut e t he art icle. Subscribers m ay reproduce t ables of cont ent s or prepare list s of art icles including abst ract s for int ernal circulat ion wit hin t heir inst it ut ions. Perm ission of t he Publisher is required for resale or dist ribut ion out side t he inst it ut ion and for all ot her derivat ive works, including com pilat ions and t ranslat ions ( please consult
ht t p: / / www.elsevier.com / perm issions) . I f excerpt s from ot her copyright ed works are included, t he aut hor( s) m ust obt ain writ t en perm ission from t he copyright owners and credit t he source( s) in t he art icle. Elsevier has preprint ed form s for use by aut hors in t hese cases: please consult
ht t p: / / www.elsevier.com / perm issions.
Role of t h e Fun din g Sou rce
You are request ed t o ident ify who provided financial support for t he conduct of t he research and/ or preparat ion of t he art icle and t o briefly descr ibe t he role of t he sponsor( s) , if any, in st udy design; in t he collect ion, analysis and int erpret at ion of dat a; in t he writ ing of t he report ; and in t he decision t o subm it t he paper for publicat ion. I f t he funding source( s) had no such involvem ent t hen t his should be st at ed. Please see ht t p: / / www.elsevier.com / funding.
Fu n din g Bodie s Agr e e m en t s a n d Policie s
Elsevier has est ablished agr eem ent s and developed policies t o allow aut hors whose art icles appear in j ournals published by Elsev ier, t o com ply wit h pot ent ial m anuscript archiving requir em ent s as specified as condit ions of t heir grant awards. To learn m ore about exist ing agreem ent s and policies please visit
ht t p: / / www.elsevier.com / fundingbodies.
M a n u scr ipt Pr e pa r a t ion
Ge n e r a l: Manuscript s m ust be word processed ( preferably in Word form at ) , double- spaced wit h wide m argins and a font size of 12 or 10 pt . Files prepared in LaTEX are not support ed. Figure capt ions should be in Arial font 9pt . Please check t he current st yle of t he j ournal, part icularly t he reference st yle ( Vancouver) , and avoid excessive layout st yling as m ost form at t ing codes will be rem oved or r eplaced during t he
right t o adj ust st yle t o cert ain st andards of uniform it y. The preferred st yle is: Surnam e, I nit ials,
Depart m ent , I nst it ut ion, Cit y/ St at e, Post al Code, Count ry. Aut hors should ret ain copies of all versions of t heir m anuscript subm it t ed t o t he j ournal. Aut hors are especially request ed t o be vigilant over t he subm ission of t he correct version of t he m anuscript at t he various st ages of t he edit orial process.
English La n gu a ge : Manuscript s should be proof- r ead and have English language errors correct ed befor e subm ission as we m ay have t o ret urn papers due t o poor language usage. Aut hors who require inform at ion about language edit ing and copyedit ing serv ices pre- and post - subm ission please visit
ht t p: / / www.elsevier.com / languagepolishing or cont act aut horsupport @elsevier.com for m ore inform at ion.
Pa pe r Le n gt h : Aut hors are urged t o writ e as concisely as possible.
Abst r a ct s: All m anuscript s are t o be supplied wit h an Abst ract of about 100- 200 words in lengt h.
Ke yw or ds: Aut hors m ust provide 4- 6 keywords for indexing purposes. A keyword list can be found at t he end of t hese inst ruct ions. (click here) .
Te x t : Follow t his order when t yping m anuscript s: Tit le, Aut hors, Affiliat ions, Abst ract , Keyw ords, I nt roduct ion, Mat erials and Met hods, Result s, Discussion, Conclusions, Acknowledgem ent s, References, Appendix ( where necessary) , Figures, Figure Capt ions and Tables, Supplem ent ary Dat a. The corresponding aut hor should be ident ified wit h an ast erisk and foot not e. All ot her foot not es ( except for t able foot not es) should be ident ified wit h superscript Arabic num bers. An abbreviat ed t it le for use as a running headline should also be supplied. Aut hors are request ed t o acknowledge funding sources for t he work.
Un it s: The SI syst em should be used for all scient ific and laborat ory dat a; if, in cert ain inst ances, it is necessary t o quot e ot her unit s, t hese should be added in parent heses. Tem perat ures should be given in degrees Celsius. The unit 'billion' ( 109 in Am erica, 1012 in Europe) is am biguous and m ust not be used. I f a large num ber of sym bols are used it is helpful if aut hors subm it a list of t hese sym bols and t heir m eanings.
Re fe r e n ce s: All publicat ions cit ed in t he t ext should be present ed in a list of refer ences following t he t ext of t he m anuscript . I n t he t ext refer t o references by a num ber in square bracket s on t he line ( e.g. Since Pet erson[ 1] ) , and t he full reference should be form at t ed according t o t he perm ut at ion of t he Vancouver reference syst em wit h num bers in t he t ext . I t is suggest ed t hat aut hors refer t o t he following link for a com prehensive overview of t he Vancouver reference st yles: Vancouver Reference St yles
Exam ples of form at t ing follow:
1. Driessens FCM, Bolt ong MG, Berm udez O, Planell JA. Form ulat ion and set t ing t im es of som e calcium ort hophosphat e cem ent s: a pilot st udy. J Mat er Sci: Mat er Med 1993; 4: 503- 508.
2. Nancollas H. I n vit ro st udies of calcium phosphat e cryst allisat ion. I n: Mann S, Webb J, William s RJP, edit ors. Biom ineralizat ion. Chem ical and biochem ical per spect ives. New Yor k: VCH, 1989. p. 157- 182. 3. Brown W, Chow LC. Com binat ions of sparingly soluble calcium phosphat es in slurries and past e as m ineralizers and cem ent s. US Pat ent No. 4612053, 1986.
N.B.: ?Et al? m ust be used aft er t he first 6 aut hors have been nam ed. Biom at erials does not use t he publicat ion m ont h or day.
On lin e Sou r ce s: References t o online sources should cont ain at a m inim um t he full URL and year t he source was accessed. Furt herm ore, if known, t he follow ing inform at ion should be giv en: aut hor nam es, dat es, reference t o a source publicat ion. Web references can be list ed separat ely ( e.g., aft er t he reference list ) under a different heading if desired, or can be included in t he reference list .
Exam ples of form at t ing follow:
1. UK House of Com m ons Science and Technology Com m it t ee. Scient ific Publicat ions: Free for All? Tent h Report of Session 2003- 4 Volum e 1. London: The St at ionary Office Lt d. Online. 2004 July. Available from URL: ht t p: / / www.publicat ions.parliam ent .uk/ pa/ cm 200304/ cm select / cm sct ech/ 399/ 39902.ht m l
2. Wellcom e Trust . Econom ic Analysis of Scient ific Research Publishing. Hist on, UK: Wellcom e Trust . Online. 2003. Available from URL: ht t p: / / www.wellcom e.ac.uk/ doc_wt d003181.ht m l
Ele ct r on ic a r t w ork
General point s
• Make sure you use uniform let t ering and sizing of your original art work. • Save t ext in illust rat ions as " graphics" or enclose t he font .
• Only use t he following font s in your illust rat ions: Arial, Courier, Tim es, Sym bol. • Num ber t he illust rat ions according t o t heir sequence in t he t ext .
• Use a logical nam ing convent ion for your art w ork files. • Provide capt ions t o illust rat ions separat ely.
• Produce im ages near t o t he desired size of t he print ed version. • Subm it each figure as a separat e file.
A det ailed guide on elect ronic art work is available on our websit e:
ht t p: / / www.elsevier.com / art workinst ruct ions
You are urged t o visit t his sit e; som e excerpt s from t he det ailed inform at ion are giv en here.
Form at s
Regardless of t he applicat ion used, when your elect ronic art w ork is finalised, please " save as" or convert t he im ages t o one of t he following form at s ( not e t he resolut ion requirem ent s for line draw ings, halft ones, and line/ halft one com binat ions given below ) :
EPS: Vect or drawings. Em bed t he font or save t he t ext as " graphics" .
TI FF: color or grayscale phot ographs ( halft ones) : always use a m inim um of 300 dpi. TI FF: Bit m apped line drawings: use a m inim um of 1000 dpi.
TI FF: Com binat ions bit m apped line/ half- t one ( color or gr ayscale) : a m inim um of 500 dpi is required. DOC, XLS or PPT: I f your elect ronic art work is creat ed in any of t hese Microsoft Office applicat ions please supply " as is" .
Ple a se do n ot :
• Supply em bedded graphics in your wordprocessor ( spr eadsheet , present at ion) docum ent ;
• Supply files t hat are opt im ised for screen use ( like GI F, BMP, PI CT, WPG) ; t he resolut ion is t oo low; • Supply files t hat are t oo low in resolut ion;
• Subm it graphics t hat are disproport ionat ely large for t he cont ent .
Color a r t w or k
Please m ake sure t hat art work files are in an accept able form at ( TI FF, EPS or MS Office files) and w it h t he correct resolut ion. I f, t oget her wit h your accept ed art icle, you subm it usable color figures t hen Elsevier will ensure, at no addit ional charge, t hat t hese figures will appear in color on t he Web ( e.g., ScienceDirect and ot her sit es) regardless of whet her or not t hese illust rat ions are reproduced in color in t he print ed version.
For color r e pr odu ct ion in pr in t , you w ill r e ce ive in for m a t ion r e ga r din g t h e cost s fr om Else vie r a ft e r r e ce ipt of you r a cce pt e d a r t icle . Please indicat e your preference for color in print or on t he Web only. For furt her inform at ion on t he preparat ion of elect ronic art work, please see
ht t p: / / www.elsevier.com / art workinst ruct ions. Please not e: Because of t echnical com plicat ions which can arise by convert ing color figures t o " gray scale" ( for t he print ed version should you not opt for color in print ) please subm it in addit ion usable black and whit e versions of all t he color illust rat ions.
Vide o D a t a
Elsevier accept s video m at er ial and anim at ion sequences t o support and enhance your scient ific research. Aut hors who have video or anim at ion files t hat t hey wish t o subm it wit h t heir art icle are st rongly
encouraged t o include t hese wit hin t he body of t he art icle. This can be done in t he sam e w ay as a figure or t able by referr ing t o t he video or anim at ion cont ent and not ing in t he body t ext where it should be placed. All subm it t ed files should be properly labeled so t hat t hey direct ly relat e t o t he video file's cont ent . I n order t o ensure t hat your video or anim at ion m at erial is direct ly usable, please provide t he files in one of our recom m ended file form at s wit h a m axim um size of 30 MB and running t im e of 5 m inut es. Video and anim at ion files supplied w ill be published online in t he elect ronic version of your art icle in Elsevier Web product s, including ScienceDirect : ht t p: / / www.sciencedirect .com. Please supply 'st ills' w it h your files: you can choose any fram e from t he video or anim at ion or m ake a separat e im age. These will be used inst ead of st andard icons and will personalize t he link t o your video dat a. For m ore det ailed inst ruct ions please visit our video inst ruct ion pages at ht t p: / / www.elsevier.com / art workinst ruct ions. Not e: since video and anim at ion cannot be em bedded in t he print version of t he j ournal, please provide t ext for bot h t he elect ronic and t he print version for t he port ions of t he art icle t hat refer t o t his cont ent . Files can be st ored on disket t e, ZI P- disk or CD ( eit her MS- DOS or Macint osh) .
Aft e r Acce pt a n ce
be ret urned wit hin 48 hours of receipt . The average am ount of t im e bet ween accept ance and receipt of t ypeset proof is 6 working days. Papers are published in print wit hin anot her 8 weeks upon receipt of aut hor correct ions. Correct ions should be rest rict ed t o t ypeset t ing errors. Any queries should be answered in full. Please not e t hat aut hors are urged t o check t heir proofs carefully before ret urn.
Elsevier now sends PDF proofs which can be annot at ed; for t his you will need t o download Adobe Reader© version 7 ( or higher) available free from ht t p: / / www.adobe.com / product s/ acrobat / readst ep2.ht m l. I nst ruct ions on how t o annot at e PDF files w ill accom pany t he proofs. The exact syst em requirem ent s are given at t he Adobe sit e: ht t p: / / www.adobe.com / product s/ acrobat / acrrsyst em reqs.ht m l# 70win. I f you do not wish t o use t he PDF annot at ions funct ion, you m ay list t he correct ions ( including replies t o t he Query Form ) and ret urn t o Elsevier in an e- m ail. Please list your correct ions quot ing line num ber. I f, for any reason, t his is not possible, t hen m ark t he correct ions and any ot her com m ent s ( including replies t o t he Query Form ) on a print out of your proof and ret urn by fax, or scan t he pages and e- m ail, or by post . Please use t his proof only for checking t he t ypeset t ing, edit ing, com plet eness and correct ness of t he t ext , t ables and figures. Significant changes t o t he art icle as accept ed for publicat ion will only be considered at t his st age wit h perm ission from t he Edit or. We will do everyt hing possible t o get your art icle published quick ly and accurat ely. Therefore, it is im port ant t o ensure t hat all of your correct ions are sent back t o us in one com m unicat ion: please check carefully before replying, as inclusion of any subsequent correct ions cannot be guarant eed. Proofreading is solely your responsibilit y. Not e t hat Elsevier m ay proceed wit h t he publicat ion of your art icle if no response is received.
Tr a ck a Pa pe r : Aut hors can t rack t heir paper st at us online aft er t he paper has been accept ed and forwarded t o t he Publisher. Ent er your Elsevier reference num ber ( JBMT xxx) and t he Corresponding aut hor's fam ily nam e at t he following web page: ht t p: / / www.elsevier.com / t rackart icle. Corresponding aut hors will receive an acknowledgem ent em ail from Elsevier wit h t he reference num ber and t he fam ily nam e on it . Aut hors can also go t o t he 't rack a paper' page by clicking ont o t he 't rack a paper' but t on on t he left hand side of t he j ournal hom e page. .
Offpr in t s: The corresponding aut hor will be provided wit h a PDF of t he art icle via em ail. The PDF is a wat erm arked version of t he published art icle and includes a cover sheet wit h t he j ournal cover im age and a disclaim er out lining t he t er m s of use. Addit ional paper offprint s can be ordered by t he aut hors. An order form wit h prices will be sent t o t he corresponding aut hor.
Au t h or En qu ir ie s: For enquiries relat ing t o t he subm ission of art icles ( including elect ronic subm ission where available) please visit t his j ournal?s hom epage. You can t rack accept ed art icles at
