RESSALVA
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tese
Ariane Zanchetta
Efeito dos compostos fenólicos e lignina sobre a ação de β
-glicosidase
São José do Rio Preto
Ariane Zanchetta
Efeito dos compostos fenólicos e lignina sobre a ação de β
-glicosidase
Orientadora: Prof.ª Dr.ª Eleni Gomes Co-orientador: Prof. Dr. Eduardo de A. Ximenes
UNESP – São José do Rio Preto
São José do Rio Preto - SP 2016
Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da
Zanchetta, Ariane.
Efeito dos compostos fenólicos e lignina sobre a ação de β-glicosidase / Ariane Zanchetta. – São José do Rio Preto, 2016
111 f. : il., tabs.
Orientador: Eleni Gomes
Tese (doutorado) – Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas
1. Microbiologia industrial. 2. Enzimas de fungos - Aplicações industriais. 3. Adsorção. 4. Fenóis. 5. Lignina. 6. Celulase. 7. Biomassa. I. Gomes, Eleni. II. Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho". Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas. III. Título.
CDU – 663.15
Ariane Zanchetta
Efeito dos compostos fenólicos e lignina sobre a ação de β
-glicosidase
BANCA EXAMINADORA
Profa. Dra. Eleni Gomes
UNESP – São José do Rio Preto Orientadora
Profa. Dra. Cristiane Sanchez Farinas
Embrapa Instrumentação / UFSCAR – São Carlos
Prof. Dr. George Jackson Moraes Rocha CTBE – Campinas
Prof. Dr. Gustavo Orlando Bonilla Rodriguez UNESP – São José do Rio Preto
Prof. Dr. João Cláudio Thoméo UNESP – São José do Rio Preto
São José do Rio Preto, 15 de abril de 2016
Tese apresentada como requisito parcial para obtenção do título de Doutora em Microbiologia, junto ao Programa de Pós-graduação em Microbiologia do Instituto de Biociências, Letras e Ciências Exatas da
Universidade Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”, campus de São José do Rio
Dedico este trabalho:
Aos meus pais, Vilma e José Luis por todo amor e incentivo em todos os momentos da minha vida.
Agradecimentos
À Deus e aos amigos espirituais que sempre me ampararam;
À minha orientadora, Profa. Dra. Eleni Gomes, pelo privilégio e oportunidade concedidos, sobretudo, pela confiança, orientação e apoio para realização deste trabalho;
Ao Prof. Roberto da Silva pelas contribuições durante a realização do trabalho;
Ao Prof. Maurício Boscolo pelos esclarecimentos a respeito das análises físico-químicas, principalmente no que diz respeito ao FTIR;
Ao Prof. Gustavo Bonilla pelo uso do laboratório e esclarecimentos a respeito das purificações;
Aos membros da banca, os Profs George Jackson, Cristiane Farinas, Gustavo Bonilla e João Claúdio Thoméo pela atenção e disponibilidade em compartilhar seus conhecimentos;
A Gabi e Gisele, pela sincera amizade e companheirismo em nossa casa;
As minhas BFF que me escutaram e aconselharam com muita paciência nos últimos anos;
Aos meus colegas e amigos dentro e fora do laboratório, Ana Lúcia, Andréia, Ariane, Bárbara, Carol Bezerra, Fabiana, Gisele, Josiane Pereira, Josiane Scarpassa, Isabel, Pedro, Maitê, Erik Messias, Erik Galindo, Carol Santos, Rafaela, Fernanda, Bruna Lima, Emily, Cissa, Angélica, George, Fernando e Tássia e pela ajuda, incentivo e momentos felizes nos últimos anos. Em especial ao Sidnei pelo auxílio com os ensaios de adsorção, envio de materiais e informações sobre a especificação técnica de alguns equipamentos, ao Diego e Janaína que me ajudaram na adaptação do equipamento para os ensaios de adsorção, à Chris pelas microscopias e à Márcia a quem eu tive a sorte de acompanhar quando cheguei ao lab ;
To Dr. Michael Ladisch and Dr. Eduardo Ximenes for opportunity and all support.
Thanks for making one my dreams come true!
To Eduardo’s family for being very nice and helpful to me. Thanks for amazing dinners
and great time.
To LORRE team and all friends from Purdue who made my days in USA. A special
thank you to David Orrego, Daehwan Kim,Leyu Zhang, Neal Hengge, Ian Matheus and
A Camila Florêncio pelo companheirismo no dia a dia em um país estrangeiro e pela competência e praticidade na realização dos trabalhos;
Aos funcionários da Seção de Pós-Graduação pela dedicação no atendimento;
Ao CNPq e à CAPES pelo apoio financeiro e concessão da bolsa (Bolsista CAPES processo n°99999.000218/2014-06);
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho.
Lista de Figuras
Capítulo 1: Considerações Gerais
Figura 1: Representação esquemática da parede celular secundária de um vegetal... 15
Figura 2: Estrutura representativa das cadeias de celulose ... 16
Figura 3: Precursores da Lignina ... 17
Figura 4: Representação esquemática de um sistema celulolítico. ... 21
Figura 5: Sítio ativo de GH1 e GH3 - Mecanismo proposto para a tolerância à glicose ... 25
Figura 6: Mecanismo de tolerância e estimulação da glicose à β-glicosidase de GH1. 26 Capitulo 2: Efeito da lignina do bagaço de cana de açúcar sobre as celulases e β -glicosidases fúngicas Figura 1: Eletromicrografia (MEV) de bagaço de cana pré-tratado hidrotérmicamente. ... 48
Figura 2: Eletromicrografia (MEV) da LDHE. ... 49
Figura 3: Eletromicrografia (MEV) da LDHA. ... 50
Figura 4: Espectro de absorção no infravermelho com transformada de Fourier. ... 51
Figura 5: Efeito do tempo sobre a distribuição das cellulases residuais de T.reesei (Cellic Ctec 2) à 45˚C com lignina isolada do bagaço de cana pré-tratado. ... 56
Figura 6: Efeito do tempo sobre a distribuição da β-glicosidase de Aspergillus niger (Novozymes 188) à 45°C com lignina isolada do bagaço de cana pré-tratado. ... 60
Figura 7: Efeito da lignina sobre a distribuição da β-glicosidase residual Aspergillus niger, (β-glicosidase presente no coquetel comercial Novo 188) e (β-glicosidase purificada) à 45°C ... 64
Figura 8: Efeito do tempo de incubação sobre as atividades das celulases e β -glicosidasesde Trichoderma reesei (Cellic Ctec 2) a 30˚C com LDHE ... 67
Figura 9: Efeito do tempo de incubação na distribuição da β-glicosidase residuais de Aspergillus niger(Novozymes 188) a 30˚C com LDHE. ... 68
Figura 10: Efeito da lignina sobre a distribuição da β-glicosidase residual Aspergillus niger, (β-glicosidase presente no coquetel comercial Novo 188) e (β-glicosidase purificada) a 30°C com LDHE. ... 69
Figura 2: Efeito do pH e temperatura sobre a atividade da β-glicosidase produzida a 37°C por fermentação em estado sólido em farelo de trigo pelo fungo Lichtheimia ramosa GF1.5. ... 92
Figura 3: Efeito do pH e temperatura sobre a estabilidade da β-glicosidase produzida a 37°C por fermentação em estado sólido em farelo de trigo pelo fungo Lichtheimia
ramosaGF1.5. Após (●) 1h de incubação (○) 24h de incubação... 93
Figura 4: Eletroforese em gel de poliacrilamida 10% da solução enzimática bruta produzida por Lichtheimia ramosa GF1.5. Coluna 1. Marcador molecular, Coluna
2.Solução enzimática bruta corada com esculina (atividade de β-glicosidase) ... 94
Figura 5: Gráfico do logaritmo da massa molecular dos marcadores de massa molecular no gel de poliacrilamida vs. a migração relativa dos mesmos...95 Figura 6: SDS-PAGE 10% da solução enzimática bruta produzida por Lichtheimia ramosa GF1.5 após tratamento com clarificantes. ... 96
Figura 7: SDS-PAGE 10% da solução enzimática produzida por Lichtheimia ramosa
GF1.5. ... 97 Figura 8: SDS-PAGE 10% da solução enzimática bruta produzida por Lichtheimia ramosa GF1.5 após purificação em colunas ... 98
Figura 9: Efeito dos compostos fenólicos do líquido residual do pré-tratamento
hidrotermico do bagaço de cana de açúcar sobre a atividade da β-glucosidase de
L.ramosa GF1.5 ... 100
Figura 10: Efeito do tempo sobre a distribuição da β-glicosidase de Lichtheimia
ramosa GF1.5 no sobrenadante, após incubação a 45˚C com lignina isolada do bagaço
Lista de Tabelas
Capítulo 2: Efeito da lignina do bagaço de cana de açúcar sobre as celulases e β -glicosidases fúngicas
Tabela 1: Análise composicional do bagaço de cana de açúcar não tratado e pré-tratado hidrotérmicamente ... 43 Tabela 2: Mudanças no conteúdo da lignina durante os tratamentos ... 45 Tabela 3: Conversão dos carboidratos à açúcares monoméricos durante o processo de isolamento da lignina do bagaço de cana por hidrólise enzimática (LDHE) e hidrólise ácida (LDHA)...45 Tabela 4: Conteúdo de nitrogênio do bagaço de cana de açúcar antes do isolamento da lignina e da lignina isolada através da hidrólise enzimática ... 46 Tabela 5: Área superficial específica do bagaço de cana e das preparações de lignina 47
Capítulo3: Produção e caracterização de β-glicosidases de fungos termofílicos e termotolerantes
Tabela 1: Produção de β-glicosidases dos fungos cultivados em farelo de trigo em fermentação em estado sólido ... 87 Tabela 2: Produção de β-glicosidase por Lichtheimia ramosa GF1.5 por fermentação
submersa em diferentes substratos ... 90 Tabela 3: Efeito da temperatura de cultivo do fungo L. ramosa GF1.5 na produção de β-glicosidase e da proporção água:material fermentado na extração da enzima ... 92 Tabela 4: Clarificação da β-glicosidase produzida por Lichtheimia ramosa GF1.5 ... 96
Tabela 5: Resumo dos processos de purificação da β-glicosidase produzida por
Lichtheimia ramosa GF1.5 ... 98
Tabela 6: Resumo dos processos de purificação da β-glicosidase produzida por
Lista de abreviações
BET: Brumaer – Emmelt-Teller
BSA: Soro albumina Bovina
CBM: Módulo de ligação ao carboidrato
DTT: 2-mercaptoetanol
FES: Fermentação em estado sólido
FTIR: Espectroscopia no infravermelho com transformada de Fourier
LAI: Lignina ácida insolúvel
LAS: Lignina ácida solúvel
LDHA: Lignina isolada do bagaço de cana pré-tratado, através da hidrólise ácida;
LDHE: Lignina isolada do bagaço de cana pré-tratado, através da hidrólise enzimática dos carboidratos;
LDHEC: Lignina durante o isolamento enzimático, antes do tratamento com a protease
MEV: Microscopia Eletrônica de Varredura
PEI: Polietilenoimina
pI: Ponto isoelétrico
SUMÁRIO
Estrutura da Tese ... 16
Capítulo 1: Considerações Gerais ... 11
1 INTRODUÇÃO... 12
2 OBJETIVOS ... 13
2.1 Objetivos Gerais ... 13
2.2 Objetivos específicos ... 13
3 REVISÃO DE LITERATURA: ... 14
3.1 Biomassa lignocelulósica ... 14
3.2 Celulases ... 17
3.3 Pré-tratamento ... 17
3.4 Compostos fenólicos... 19
3.5 Celulases ... 20
3.6 β-glicosidases ... 22
3.7 Efeito da glicose sobre a atividade da β-glicosidase ... 24
3.8 Interação das celulases à lignina e seu efeito sobre a hidrólise da celulose ... 26
4 REFERÊNCIAS BIBLIOGRAFICAS ... 28
Capítulo 2: Efeito da lignina do bagaço de cana de açúcar sobre celulases e β -glicosidases fúngicas ... 35
Resumo ... 36
1 INTRODUÇÃO... 37
2 MATERIAIS E MÉTODOS ... 38
2.1 Enzimas ... 38
2.2 Pré-tratamento hidrotérmico ... 39
2.3 Isolamento da lignina do bagaço de cana pré-tratado por meio de hidrólise enzimática40 2.4 Isolamento da lignina do bagaço de cana pré-tratado por meio de hidrólise ácida ... 40
2.5 Determinação da área superficial (BET-Brunauer, Emmett, e Teller) ... 41
2.6 Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ... 41
2.7 Espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ... 42
2.8 Avaliação da adsorção das enzimas à lignina de bagaço de cana ... 42
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 43
3.2 Perfil da lignina isolada do bagaço de cana de açúcar pré-tratado hidrotermicamente 44
3.3 Microscopia eletrônica de Varredura (MEV) ... 47
3.4 Espectroscopia na região do infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) ... 51
3.5 Avaliação da adsorção das celulases e beta glicosidases de Trichoderma reesei à lignina isolada do bagaço de cana ... 54
3.6 Avaliação da adsorção da β-glicosidase de A. niger à lignina isolada do bagaço de cana ...59
3.7 Adsorção da β-glicosidase purificada e do coquetel enzimático comercial de Aspergillus niger ... 63
3.8 Efeito da temperatura na adsorção de celulases e β-glicosidases... 66
4 CONCLUSÕES ... 70
5 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 71
Capítulo 3: Produção e Caracterização de β-glicosidase de fungos termofílicos e termotolerantes ... 76
1 INTRODUÇÃO... 78
2 MATERIAIS E MÉTODOS ... 79
2.1 Micro-organismos... 79
2.2 Processos Fermentativos ... 79
2.2.1 Meio nutriente sólido utilizado como pré-inóculo ... 79
2.2.2 Fermentação em estado sólido (FES) ... 80
2.2.3 Fermentação submersa ... 81
2.3 Determinação da atividade de β-glicosidase ... 82
2.4 Eletroforese em gel de poliacrilamida ... 82
2.4.1 Eletroforese em gel desnaturante ... 82
2.4.2 Eletroforese em gel não desnaturante ... 82
2.4.3 Determinação da atividade de β-glicosidase em gel de poliacrilamida corado com esculina e cloreto férrico... 83
2.4.4 Estimativa da massa molecular da β-glicosidase de Lichtheimia ramosa GF1.5 produzida à 37°C por FES em farelo de trigo ... 83
2.5 Efeito da glicose na atividade de β-glicosidase... 83
2.6 Caracterização da β-glicosidase ... 84
2.6.2 Efeito das variações no pH de reação e da temperatura de incubação sobre a
estabilidade da enzima ... 84
2.7 Purificação da β-glicosidase produzida por Lichtheimia ramosa GF1.5 ... 84
2.7.1 Clarificação da solução enzimática bruta ... 84
2.7.2 Concentração da solução enzimática bruta ... 85
2.7.3 Cromatografia de filtração em gel ... 85
2.7.4 Cromatografia de Troca-iônica... 85
2.8 Efeitos dos compostos fenólicos liberados durante o pré-tratamento hidrotérmico do bagaço de cana de açúcar sobre a atividade da β-glicosidase de Lichtheimia ramosa GF1.5... ... 86
2.9 Isolamento da lignina do bagaço de cana pré-tratado... 86
2.10Adsorção da β-glicosidase de Lichtheimia ramosa GF1.5 à lignina de bagaço de cana86 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO ... 87
3.1 Produção de β-glicosidases ... 87
3.2 Efeito da glicose na atividade de β-glicosidase... 88
3.3 Produção de β-glicosidase por fermentação submersa em diferentes substratos ... 90
3.4 Efeito da temperatura na produção de β-glicosidase por fermentação em estado sólido ... ... 91
3.5 Caracterização da β-glicosidase de L.ramosa GF1.5 ... 92
3.5.1-Efeito do pH e temperatura sobre a atividade e estabilidade da enzima ... 92
3.6 Pesquisa de isoformas de β-glicosidase na solução enzimática bruta obtida pelo cultivo de L. ramosa GF1.5 por meio de zimograma ... 94
3.7 Estimativa da massa molecular da β-glicosidase de Lichtheimia ramosa GF1.5 produzida à 37°C por FES em farelo de trigo ... 94
3.8 Purificação parcial da β-glicosidase produzida por L. ramosa GF1.5 ... 95
3.8.1 Clarificação da solução enzimática bruta ... 95
3.8.2 Concentração da solução enzimática bruta ... 96
3.8.3 Separação das proteínas por técnicas cromatográficas ... 97
3.9 Avaliação dos efeitos de compostos fenólicos e demais inibidores liberados durante o pré-tratamento hidrotérmico do bagaço de cana de açúcar sobre a atividade da β-glicosidase de L. ramosa GF1.5 ... 99
3.10Avaliação da adsorção da β-glicosidase de Lichtheimia ramosa GF1.5 à lignina de bagaço de cana ... 101
4 CONCLUSÕES: ... 104
Resumo geral do trabalho
A adsorção não-produtiva das celulases e β-glicosidases à lignina tem sido considerada um fator limitante da hidrólise do material lignocelulósico. Esse trabalho avaliou a interação entre celulases e β-glicosidases dos coquetéis comerciais de Trichoderma
reesei (Cellic Ctec2) e Aspergillus niger (Novo 188) com preparações de lignina
isoladas por hidrólise enzimática (LDHE) e hidrólise ácida (LDHA) do bagaço de cana pré-tratado hidrotermicamente. Também foi selecionada uma β-glicosidase tolerante à inibição pela glicose a partir da coleção de fungos de trabalho do Laboratório de Bioquímica e Microbiologia Ibilce/Unesp e o efeito da LDHE e dos compostos fenólicos derivados do pré-tratamento hidrotérmico sobre a mesma foram avaliados. A LDHA apresentou maior capacidade de adsorção das enzimas do que LDHE. A 45°C todas as enzimas de T. reesei se ligaram a LDHE e a LDHA. As atividades residuais de
endoglucanase, β-glicosidase e exoglucanase no sobrenante após a incubação com a LDHE foi de 28, 45 e 63%. Exoglucanase e β-glicosidase foram completamente adsorvidas a LDHA enquanto que a endoglucanase manteve 14% da atividade. A β -glicosidase de A.niger foi menos afetada mantendo 94 e 48% da atividade na presença
de LDHE e LDHA. A β-glicosidase de A. niger purificada apresentou 89 e apenas 2%
de atividade no sobrenadante quando incubada com LDHE e LDHA, contra 100 e 95% de atividade da enzima presente no coquetel. A diminuição da temperatura para 30°C provocou a redução da adsorção não-produtiva das enzimas à LDHE. Endoglucanases, exoglucanases e β-glicosidasesde de T. reesei apresentaram 93%, 70% e 83% da
atividade no sobrenadante, enquanto a β-glicosidase de A. niger manteve 98%. A β
-glicosidase de A. niger purificada e a enzima presente no coquetel não foram adsorvidas
à 30°C. Na busca por uma β-glicosidase com características desejáveis à hidrólise, os fungos T. indicae-seudaticae N31, A. fumigatus M.7.1, R. miehei GF3.3, L. ramosa
GF1.5, L. corymbifera GF1.2 e R. pusillus, foram avaliados com relação à produção de β-glicosidasese a tolerância dessas enzimas à glicose. A β-glicosidase do fungo L.
ramosa GF1.5 apresentou os melhores resultados, com 44,4% de atividade residual em
8,5% da atividade após 6h de ensaio. Entretanto, ela não foi adsorvida à LDHE, apresentando aumento de até 14% da atividade no sobrenadante quando na presença deste composto aromático.
Palavras-chave: Adsorção, lignina, β-glicosidase, celulases, compostos fenólicos
Abstract
Non-productive adsorption of cellulase and beta-glucosidase enzymes onto lignin is shown to be a limiting factor to enzymatic hydrolysis of lignocellulosic. This study evaluated the interaction of cellulases and beta-glucosidase from Trichoderma reesei
(Cellic Ctec2) and Aspergillus niger (Novo 188) commercial cocktail with lignin
preparations isolated from liquid hot water sugarcane bagasse by enzymatic (LDHE) and acid hydrolysis (LDHA). Furthermore, a glucose tolerant β-glucosidase was selected from the collection of working fungi of Laboratório de Bioquímica e Microbiologia (Ibilce/Unesp), effect of LDHE and liquid hot water pretreatment-derived phenolic compounds were evaluated. LDHA had higher adsorption capacity on enzymes than LDHE. At 45°C T. reesei enzymes bound to both LDHE and LDHA.
Endoglucanase, beta-glucosidase and exoglucanase remained activities in the supernatant after incubation with LDHE were 28, 45 e 63%. Exoglucanase and beta-glucosidase were completely adsorbed onto LDHA while endoglucanase activity remained in the supernatant was 14%. A. niger beta-glucosidase was less adsorption
than enzymes from T. reesei, it maintained 94 and 48% of the activity in the presence of
LDHA and LDHE. Purified beta-glucosidase from A. niger showed 89 and only 2%
activity in the supernatant after incubation with LDHE LDHA, while beta-glucosidase from enzymatic cocktail showed 100 and 95% of the enzyme activity. The decrease of temperature to 30°C decreased non-productive adsorption of the enzymes onto LDHE. Endoglucanases, exoglucanases and beta-glucosidase from T. reesei showed 93%, 70%
and 83% of the activity in the supernatant, while A. niger beta-glucosidase exhibited
98% of activity. Purified beta-glucosidase from A. niger and the enzyme from
enzymatic cocktail weren’t adsorbed at 30°C. In the search for a beta-glucosidase with desirable properties to hydrolysis, T. indicae-seudaticae N31, A. fumigatus M.7.1, R.
miehei GF3.3, L. ramosa GF1.5, L. corymbifera GF1.2 e R. pusillus fungi were
beta-glucosidase from L. ramosa GF1.5 showed the best results with 44.4% residual activity
at 80 mM glucose and 6.4 IU/mL of glucosidase. The fungus only produces a beta-glucosidase with estimated molecular weight in 57 kDa, which was characterized with regard to optimum pH and temperature and pH and thermal stability, and then partially purified. The enzyme was strongly inhibited by phenolic compounds and inhibitors from liquid fraction of the liquid hot water pretreatment of sugarcane bagasse. The remaining activity was only 8.5% after 6h of incubation. However, the enzyme wasn’t absorbed onto LDHE, showing increase of up to 14% of the activity in the supernatant.
Estrutura da Tese
A tese foi dividida em três capítulos, sendo:
Capítulo 1 - Considerações Gerais: Contendo a revisão bibliográfica, a introdução e os objetivos gerais e específicos de todo o trabalho;
Capítulo 2 – Efeito da lignina do bagaço de cana de açúcar sobre celulases e β-glicosidases fúngicas: Referente ao período sanduíche realizado no Laboratory of Renewable Resources Engineering (LORRE) – Purdue University, sob a orientação do Prof. Dr. Michael Ladisch e Prof. Dr. Eduardo Ximenes. Contém os estudos sobre a adsorção de celulases e β-glicosidases de diferentes fungos sobre duas preparações de lignina isoladas do bagaço de cana;
Capítulo 3 – Produção e caracterização de uma β-glicosidase fúngica: Referente à parte do trabalho realizado no Brasil. Contém os estudos sobre o screening e caracterização de uma nova β-glicosidase fúngica e os efeitos dos compostos fenólicos e da lignina sobre essa enzima.
11
Capítulo 1
12
1 INTRODUÇÃO
O aumento no consumo de energia e a limitação das reservas de combustíveis fósseis têm despertado o interesse por pesquisas para o desenvolvimento de combustíveis a partir de fontes renováveis, como o material lignocelulósico. Apesar de promissora, a hidrólise enzimática da biomassa vegetal encontra alguns obstáculos para seu melhor rendimento como as características físico-químicas do material e a inibição das enzimas por compostos originados durantes as etapas do processo (MORETTI et al., 2014).
A biomassa vegetal é composta principalmente por celulose, hemicelulose e lignina que estão intimamente associadas formando uma estrutura complexa e resistente à degradação enzimática (PRASAD et al., 2006). Para romper essa resistência e aumentar o rendimento da hidrólise, o material é desestruturado pelas técnicas de pré-tratamento, os quais solubilizam e/ou degradam parte da hemicelulose e da lignina e diminuem a cristalinidade da celulose, tornando as fibras mais acessíveis a ação das celulases (MOSIER et al., 2005; KIM et al., 2013). Entretanto essa alteração causada pelo pré-tratamento pode afetar a interação entre a lignina residual que permanece sobre as fibras e as celulases e β-glicosidases (DONOHOE et al., 2008; KO et al., 2015; KAPARAJU, FELBY, 2010).
A lignina é um dos principais obstáculos para a hidrólise da celulose. Ela pode reduzir o rendimento da hidrólise pelo impedimento estérico da celulose e adsorção não produtiva das celulases à lignina ao invés da celulose (KO et al., 2014). Além disso, celulases e β-glicosidases podem ser inibidas e/ou desativadas pelos compostos fenólicos solúveis derivados da degradação da lignina (XIMENES et al., 2011; XIMENES et al., 2010; KIM et al., 2011).
13
Uma vez que a adsorção das enzimas à lignina depende do tipo de biomassa utilizada, dos processos de pré-tratamento e isolamento pelos quais ela tenha passado e que as enzimas diferem em sua sensibilidade à lignina, a seleção de enzimas com reduzida afinidade à lignina e tolerantes a glicose pode ser uma estratégia para melhorar a hidrólise enzimática dos substratos lignocelulósicos e dessa forma viabilizar o processo de produção do etanol celulósico.
108
Capítulo 4
109
1. Conclusões
- As interações entre as enzimas (celulases e β-glicosidases) e lignina (LDHE e
LDHA) foram dependentes da natureza das enzimas e das características físico-químicas das ligninas estudadas;
- Celulases e β-glicosidases apresentaram diferentes sensibilidades de ligação à
mesma preparação de lignina, em função da origem;
- Celulases e β-glicosidases de T. reesei foram fortemente adsorvidas às ligninas
de diferentes preparações sendo a endoglucanase a mais afetada pela LDHE e a única enzima que não sofreu completa adsorção à LDHA. A exoglucanase apresentou menor grau de adsorção à LDHE do que a β-glicosidase e, ambas foram totalmente adsorvidas à LDHA;
- Celulases de A. niger apresentaram excelente estabilidade à lignina. A enzima
quase não foi adsorvida à LDHE e mesmo tendo sido afetada pela LDHA, a extensão de adsorção foi muito pequena se comparada à adsorção das celulases e beta-glicosidase de
T. reesei.
- β-glicosidase do coquetel comercial de A. niger apresentou excelente
estabilidade frente à lignina não sendo adsorvida à LDHE e pouco afetada pela LDHA;
- β-glicosidase purificada de Aspergillus niger apresentou pouca interação com a
LDHE, mas foi adsorvida à LDHA sugerindo que outros componentes do meio possam estar protegendo a enzima da interação com a lignina.
- Ligninas extraídas por aplicações ácidas e enzimáticas (LDHA e LDHE) apresentaram diferenças físicas e químicas acentuadas, o que provavelmente resultou na diferença de adsorção das enzimas. A LDHA além de maior área superficial também apresentou uma natureza mais hidrofóbica, com menor quantidade de grupamentos hidroxilas e carboxílicos, maior razão LAI/LAS, estrutura mais condensada e ausência de carboidratos;
110
- A β-glicosidase de L. ramosaGF1.5 apresentou boa produção de β-glicosidase
com tolerância a ate 80 mM de glicose, estável em ampla faixa de pH e temperatura;
- A maior produção de β-glicosidase, foi observada nos cultivos por fermentação
em estado sólido a 37°C em meio contendo farelo de trigo como fonte de carbono;
- A β-glicosidase de Lichtheimia ramosa GF1.5 foi inibida pelos compostos
fenólicos e demais inibidores liberados durante o pré-tratamento do bagaço de cana de açúcar;
- A enzima não sofreu adsorção à LDHE, apresentando grande estabilidade com relação a esse composto;
- Novos estudos com a β-glicosidase de Lichtheimia ramosa GF1.5 devem ser
realizados não só com relação ao papel da lignina em uma possível estabilização da enzima, como também estudos bioquímicos e cinéticos para melhor caracterização da β -glicosidase e posterior aplicação dessa enzima em processos industriais.
2. Considerações gerais
Os resultados apresentados podem contribuir para o esclarecimento das interações entre as enzimas envolvidas no processo de hidrólise e a biomassa lignocelulósica. Além de confirmar que a interação entre enzimas e lignina depende não somente da biomassa em questão, mas também da fonte da qual a enzima é originada. O trabalho também traz informações interessantes a respeito do comportamento de cada enzima com relação a determinada preparação de lignina, o que pode ser exemplificado pelos resultados observados para a endoglucanase. Tais observações incentivam estudos a respeito da ação de determinados grupos funcionais e das cargas apresentadas por cada material sobre as enzimas, bem como da importância da sequência primária e das características estruturais dessas enzimas sobre o processo de adsorção.
As diferentes respostas observadas para as β-glicosidases de T. reesei, A. niger e
L. ramosa com relação à LDHE também se mostram interessantes e incentivam a busca
por linhagens promissoras que possam apresentar menos interação com a lignina e maior tolerância aos compostos fenólicos.
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Campus de São José do Rio Preto
TERMO DE REPRODUÇÃO XEROGRÁFICA
Autorizo a reprodução xerográfica do presente Trabalho de Conclusão, na íntegra ou em
partes, para fins de pesquisa.
São José do Rio Preto, 06/05/2016
